BR112012005763B1

BR112012005763B1 - método de preparação para materiais bio-combustíveis

Info

Publication number: BR112012005763B1
Application number: BR112012005763A
Authority: BR
Inventors: Young Seung Do; Choi Gi-Wook; Hak Song Hyo; Lee Julia; Hee Cho Jung; Hee Han Min; Ho Ueom Moon; Moon Se-Kwon; Hoon Park Sung; Kim Yule
Original assignee: Changhae Ethanol Co Ltd; Gs Caltex Corp
Priority date: 2009-09-14
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2020-06-09
Also published as: WO2011031104A2; BR112012005763A2; CN102597252A; CN106893744A; US8685684B2; US20120231511A1; WO2011031104A3

Abstract

método de preparação para materiais bio-combustíveis é divulgado um método de preparação para materiais biocombustíveis e produtos bioquímicos compreendendo as seguintes etapas: a preparação de um meio compreendendo o resíduo de fermentação gerado em um processo de produção de álcool; a inoculação de um primeiro micro-organismo no meio; e o cultivo do meio em que o primeiro micro-organismo foi inoculado. mais especificamente, o método de preparação para materiais bio-combustíveis e produtos bioquímicos compreende as seguintes etapas: a fermentação de hexoses a partir de uma mistura de pentoses e hexoses para produzir um caldo de fermentação de etanol; a separação e purificação do caldo de fermentação de etanol; a preparação de um meio que compreende o resíduo de fermentação produzido na etapa de separação e purificação; a inoculação de um primeiro micro-organismo no meio; e o cultivo do meio em que o primeiro micro-organismo foi inoculado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO DE PREPARAÇÃO PARA MATERIAIS BIO-COMBUSTÍVEIS. CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se a um método para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos, e mais particularmente, a um método para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos econômicos e ecológicos que podem notavelmente reduzir o custo da carga de alimentação e energia envolvidas no processo de preparação.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Os micro-organismos de cultura artificial em um ambiente específico requerem vários componentes de nutriente a serem adicionados a um meio de cultura, e os componentes de nutriente requeridos variam dependendo dos tipos de micro-organismos a serem cultivados. Para satisfazer os requisitos de nutrientes, geralmente vários meios de cultura contendo componentes de nutriente de minerais, aminoácidos, vitaminas, peptonas, substância líquida de maceração de milho, extrato de levedura, e outros mais, têm sido desenvolvidos e usados. Um meio de cultura para os micro-organismos é grandemente classificado em um meio sintético contendo apenas componentes de nutriente quimicamente definidos tais como minerais, aminoácidos, vitaminas, e outros mais, e um meio complexo contendo componentes de nutriente quimicamente indefinidos tais como peptonas, substância líquida de maceração de milho, extrato de levedura, e semelhantes.

[003] Para desenvolver um meio sintético, a identificação de todos os componentes de nutriente por um tipo correspondente de micro-organismo é necessária, uma vez que os componentes de nutriente variam dependendo dos tipos de micro-organismos como acima descritos. Geralmente, a fim de identificar todos os componentes de nutriente requeridos, todos os aminoácidos e vitaminas são adiciona

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2/38 dos a um meio de cultura contendo minerais, de modo a cultivar um dado micro-organismo no meio de cultura, e verificar se o microorganismo se desenvolve. Quando o desenvolvimento do microorganismo for observado, após preparar um meio de cultura novo através da remoção de um dos componentes de nutriente adicionados ao meio de cultura, o micro-organismo é cultivado no meio de cultura a partir do qual um componente de nutriente específico é removido e, em depois, uma verificação é executada para determinar se o microorganismo se desenvolve. Quando o desenvolvimento do microorganismo for observado, outro meio de cultura novo é preparado pela remoção de outro componente de nutriente dentre os componentes de nutriente adicionados ao meio de cultura inicial. Inversamente, quando o desenvolvimento do micro-organismo não for observado, o componente de nutriente removido é determinado ser um componente de nutriente essencial que é para ser adicionado durante a preparação de um meio sintético, e depois, é necessariamente adicionado quando se prepara um meio de cultura. Recentemente, um meio sintético foi desenvolvido pela frequente execução deste método de identificação de todos os componentes de nutriente necessários para o cultivo de micro-organismos (Zhang et al., App. Microbiol. Biotechnol., 51:407, 1997). No entanto, visto que este método se baseia em uma técnica de simples omissão que envolve métodos de tentativas repetidos, ele requer uma grande quantidade de tempo, esforço humano, e não é rentável. Para compensar as deficiências da técnica omissão única, várias técnicas estatísticas foram recentemente sugeridas para o desenvolvimento de um meio de cultura, mas não são amplamente utilizados devido a uma baixa probabilidade de sucesso associada com estas técnicas estatísticas.

[004] Depois de identificar todos os componentes de nutriente necessários para o cultivo de micro-organismos utilizando uma técnica

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3/38 de simples omissão ou uma técnica de estatística, a determinação de uma quantidade ideal de cada componente de nutriente a ser adicionada ao meio de cultura, necessária para promover o desenvolvimento de micro-organismo, é requerida. Isso também requer uma grande quantidade de tempo, esforços humanos, e não é rentável. Em particular, uma desvantagem em que um considerável número de microorganismos desvantajosamente não pode crescer em um meio sintético contendo todos os aminoácidos e vitaminas, tem sido relatada, e uma maioria dos micro-organismos se desenvolve melhor em um meio de cultura contendo peptonas ou extrato de levedura adicionado, como um componente de nutriente, em um meio complexo em vez de um meio sintético. Em primeiro lugar, visto que os componentes de nutriente quimicamente definidos adicionados a um meio sintético tal como o aminoácido ou vitamina são caros, existe uma limitação na utilização de um meio sintético contendo tais componentes de nutriente caros na produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos em uma escala industrial através do cultivo de micro-organismo.

[005] Na produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos através do cultivo de micro-organismo, um meio complexo contendo peptonas, substância líquida de maceração de milho, ou extrato de levedura que inclui a maior parte de todos os componentes de nutriente necessários para o cultivo de micro-organismos, embora os componentes de nutriente sejam quimicamente indefinidos, está sendo amplamente utilizado. Uma peptona é um produto obtido na hidrólise de proteína, e quando convertida no aminoácido por peptidase, pode ser usada como uma fonte de carbono no cultivo de micro-organismos. No entanto, a utilização de peptonas para produzir biocombustíveis e produtos bioquímicos em uma escala industrial, através do cultivo de micro-organismos, é muito cara. A substância líquida de maceração de milho é um subproduto derivado da moagem úmida de milho, e devido

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4/38 a um custo muito baixo, tem sido amplamente utilizada como um componente importante de nutrientes de um meio de cultura para microorganismo (Liggett et al., Bacteriol. Rev., 12:297, 1948; Liggett et al., Bacteriol. Rev., 12:300, 1948). Da mesma forma, a substância líquida de maceração de milho é uma boa fonte de carbono para o cultivo de micro-organismos e possui uma vantagem de incluir outros componentes de nutrientes, assim como vitaminas e aminoácidos (Atkinson et al., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, The Nature Press, NY, 57, 1983; Miller et al., Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, American Society of Microbiology, Washington DC, 122, 1986; Akhtar et al., Tapi J. 80:161, 1997). Embora a substância líquida de maceração de milho seja um componente de nutriente adequado de baixo custo no cultivo de micro-organismos, a substância líquida de maceração de milho possui uma desvantagem de ter de ser adicionada a um meio de cultura em quantidades maiores, quando comparada com as peptonas ou extrato de levedura. Também, visto que substância líquida de maceração de milho inclui um componente desconhecido que inibe o desenvolvimento de micro-organismos, quando comparado com a mesma quantidade de extrato de levedura, a substância líquida de maceração de milho é inferior em termos de taxa de desenvolvimento de micro-organismo, concentração de microorganismos, e produtividade de uma substância alvo (Amartey et al., Bullet. Chem. Technol., Macedonia, 19:65, 2000; Silveira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 55:442, 2001; Underwood et al., Appl. Environ. Microbiol., 70:2734).

[006] O extracto de levedura é comprovado como um componente de nutriente superior para o cultivo de micro-organismos por muitos pesquisadores, e em particular, o extrato de levedura tem sido relatado de melhorar a produtividade de uma substância alvo através do cultivo de micro-organismo mediante a promoção do desenvolvimento de mi

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5/38 cro-organismos (Laube et al., Biotechnol. Lett., 6:535, 1984; Bibal et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 30:630, 1989; Aeschlimann et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 32:398, 1990; Norton et al., J. Dairy Sci., 77:2494, 1994; Kazamias et al., Appl. Environ. Microbiol., 61:2425, 1995; Potvin et al., J. Microbiol. Methods, 29:153, 1997; Bafrncova et al., Biotechnol. Lett., 21:337, 1999; Bury et al., Czech J. Food Sci., 19:166, 2001). Além disso, visto que o extrato de levedura inclui uma quantidade considerável de carboidratos e açúcares solúveis, o extrato de levedura fornece tanto um componente de nutriente quanto uma fonte de carbono no cultivo de micro-organismos (Revillion et al., Braz. Arch. Biol. Technol., 46:121, 2003; Ojokoh et al., Afr. J. Biotechnol., 4:1281, 2005). Devido a esta característica superior, o extrato de levedura está a ser amplamente usado como um aditivo na indústria alimentar. Geralmente, o extrato de levedura é produzido por artificialmente desenvolver uma cepa de Saccharomyces cerevisiae que é uma espécie de levedura usada na produção de cerveja e pão, seguido por autólise. No entanto, por uma questão de fato, o extrato de levedura produzido por este processo é impróprio como um componente de nutriente de um meio de cultura para a produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos em uma escala industrial por causa de um custo muito elevado. Quando se produz ácido láctico usando substancialmente 2 g/L de extrato de levedura como um componente de nutriente, é relatado que o custo do extrato de levedura corresponde a 32 % do custo total de produção do ácido láctico (Mulligan et al., Biotechnol. Bioeng., 38:1173, 1991).

[007] Estudos sobre a produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos através do cultivo de micro-organismos são direcionados para o desenvolvimento de fontes de carbono e meios de cultura de baixo preço, desenvolvimento de um processo de fermentação, desenvolvimento de um processo de separação e purificação, e desen

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6/38 volvimento de uma cepa superior. Atualmente, quando se produz biocombustíveis e produtos bioquímicos em uma escala industrial através do cultivo de micro-organismos, um meio complexo contendo substância líquida de maceração de milho, extrato de levedura, e peptonas como os principais componentes de nutriente está sendo amplamente utilizado. Como descrito no que precede, a substância líquida de maceração de milho tem um custo baixo, mas não pode garantir a produtividade de uma substância alvo, visto que inibe o desenvolvimento de micro-organismos. O extrato de levedura e as peptonas são componentes de nutriente superiores, mas não podem garantir a eficiência econômica, uma vez que são caros. Consequentemente, existe uma procura urgente para o desenvolvimento de um meio de cultura, de baixo custo, que suficientemente contenha componentes de nutriente superiores e possa garantir a produtividade e a eficiência econômica da produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos em uma escala industrial.

[008] Alguns estudos foram conduzidos sobre a reciclagem de um subproduto produzido na fermentação de micro-organismos. Por exemplo, a Patente US no 4.578.353 divulga um processo em que um resíduo de carboidrato sólido não fermentado gerado na fermentação do álcool é hidrolisado em um tanque de sedimentos outra vez e o hidrolisado é re-fornecido como uma fonte de carbono para o mesmo tanque de fermentação de álcool. A WO 2008/115080 divulga um processo em que dois tanques de fermentação de álcool são ligados e um ácido orgânico e um componente gasoso produzido como um subproduto em cada tanque de fermentação são seletivamente separados e reciclados. No entanto, estas técnicas são limitadas pelo fato de que elas seletivamente reciclam apenas alguns componentes de um material fornecido como uma matéria-prima ou uma substância produzida como um subproduto em um tanque de fermentação por microPetição 870180130515, de 14/09/2018, pág. 15/55

7/38 organismos.

[009] Ao contrário dos combustíveis e produtos químicos produzidos utilizando recursos fósseis como uma matéria-prima, os biocombustíveis e produtos bioquímicos podem ser obtidos utilizando, como uma matéria-prima, a biomassa que é um recurso biológico que permite a circulação completa de recursos. Recentemente, em um esforço para superar a crise energética provocada pelo esgotamento dos combustíveis fósseis e as crises ambientais tais como a mudança climática causada por um acúmulo de gases de efeito estufa na atmosfera, a demanda é crescente por biocombustíveis e produtos bioquímicos de carbono neutro ou carbono zero ecológicos que permitem a circulação completa de recursos e dióxido de carbono. Em particular, visto que a liberação e armazenagem de combustíveis líquidos tais como etanol e butanol são fáceis e assim adequados para a utilização como combustíveis de transporte, os biocombustíveis líquidos estão ganhando atenção.

[0010] Até esta data, os biocombustíveis e produtos bioquímicos foram em primeiro lugar produzidos através da fermentação de microorganismos proveniente da glicose obtida pela hidrólise de amido de milho ou trigo, ou a sacarose incluída na cana de açúcar. No entanto, visto que os custos de lavoura continuam a aumentar e o uso de recursos alimentares na produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos está sendo levantado como uma questão moral, tentativas têm sido feitas ativamente em uma escala global, para produzir de forma eficiente biocombustíveis e produtos bioquímicos mediante o uso, como uma matéria-prima, de biomassa lignocelulósica visto que é um recurso biológico não alimentar abundante que está facilmente disponível em todo o mundo.

[0011] A biomassa lignocelulósica pode ser dividida em grande parte em uma biomassa lenhosa e uma biomassa gramínea, e contém

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8/38 celulose, hemicelulose e lignina como componentes principais. Depois que a biomassa lignocelulósica é removida através do préprocessamento físico e químico utilizando um ácido, uma base, ou um vapor, a biomassa lenhocelulósica pré-processada é hidrolisada por uma hidrolase de modo que a celulose seja convertida em hexose incluindo glicose, e a hemicelulose é convertida em pentose incluindo xilose e arabinose, assim como hexose. Sabe-se que a maior parte dos micro-organismos é capaz de utilizar hexose, em particular, glicose, como uma fonte de carbono e uma fonte de energia durante a fermentação, no entanto, alguns micro-organismos são incapazes de se utilizar pentose como uma fonte de carbono e uma fonte de energia. [0012] Consequentemente, quando se produz biocombustíveis e produtos bioquímicos através da fermentação de um micro-organismo tendo a incapacidade ou tendo a capacidade notavelmente baixa de utilizar pentose, é impossível usar pentose que esteja ao redor de 35 % do total de açúcar derivado da biomassa lignocelulósica. Como um resultado, um aumento subsequente do custo de matéria-prima tornaria difícil garantir a eficiência econômica. Além disso, devido à pentose estar presente nas águas residuais produzidas após a fermentação que leva a um aumento rápido na demanda de oxigênio químico e demanda de oxigênio biológico, um processo separado para o tratamento das águas residuais é requerido.

[0013] Consequentemente, existe uma necessidade para o desenvolvimento de um método para a preparação biocombustíveis e produtos bioquímicos de uma forma econômica e ecológica, enquanto se faz uso eficiente da pentose e hexose derivadas da biomassa lignocelulósica.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

OBJETIVOS TÉCNICOS

[0014] Um aspecto da presente invenção fornece um método para

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9/38 a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos ecológicos e econômicos, que possa notavelmente reduzir os custos de matériaprima, um meio de cultura, e energia envolvida no processo de preparação.

SOLUÇÕES TÉCNICAS

[0015] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a preparação de biocombustíveis incluindo a preparação de um meio de cultura contendo um resíduo de fermentação gerado na produção de álcool, inoculação de um primeiro microorganismo no meio de cultura, e cultivo do primeiro micro-organismo sobre o meio de cultura. O resíduo de fermentação pode ser um resíduo de fermentação com ou sem sólidos. O método para a preparação de biocombustíveis pode incluir a preparação de um meio de cultura contendo um resíduo de fermentação gerado na produção de álcool ou um resíduo produzido pela autólise do resíduo de fermentação, e adição de pelo menos um selecionado do grupo consistindo em água, uma fonte de carbono e um componente de nutriente no meio de cultura preparado, antes de inocular o primeiro micro-organismo no meio de cultura.

[0016] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a preparação de biocombustíveis incluindo a preparação uma solução fermentada de etanol mediante a fermentação de hexose a partir de uma mistura de pentose e hexose, separação e purificação da solução fermentada de etanol, preparação de um meio de cultura contendo um resíduo de fermentação gerado pela separação e pela purificação, inoculação de um primeiro microorganismo no meio de cultura, e cultivo do primeiro micro-organismo no meio de cultura.

[0017] A mistura de pentose e hexose pode ser obtida por física e quimicamente pré-processar e sacarificar pelo menos um selecionado

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10/38 do grupo consistindo em biomassa lignocelulósica e biomassa celulósica. O resíduo de fermentação pode conter pelo menos um açúcar selecionado do grupo consistindo em hexose incluindo glicose, galactose e manose, e pentose incluindo xilose e arabinose.

[0018] No método para a preparação de biocombustíveis de acordo com uma forma de realização da presente invenção, o primeiro micro-organismo pode incluir pelo menos um selecionado do grupo consistindo em levedura, Clostridium, Colon bacillus, Bacillus, Anaeromyxobacter, Alcaligenes, Bacteroides, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Pichia, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Saccharomyces, Streptomyces, Thermus thermophilus (Thermus), Thermotoga, Thermoanaerobacter, Klebsiella, Streptomycetaceae, Actinomycetaceae, Colinebacterium, Zymomonas, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, e Mannheimia. O primeiro micro-organismo pode ser cultivado no meio de cultura em pelo menos uma operação selecionada do grupo que consiste em batelada, batelada alimentada e operações contínuas, e o método pode ainda incluir a separação e purificação dos biocombustíveis produzidos após o cultivo do primeiro micro-organismo no meio de cultura.

[0019] Os biocombustíveis podem ser bio-gás, álcool, um composto com bas em alcano, ou um composto baseado em alqueno que pode ser usado como combustíveis. O biogás pode incluir metano e hidrogênio. O álcool pode incluir etanol, propanol, butanol, pentanol e hexanol.

[0020] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a preparação de produtos bioquímicos incluindo a preparação de um meio de cultura contendo um resíduo de fermentação gerado na produção de álcool, inoculação de um segundo microorganismo no meio de cultura, e cultivo do segundo micro-organismo no meio de cultura.

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[0021] De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a preparação de produtos bioquímicos incluindo a preparação de uma solução fermentada de etanol mediante a fermentação de hexose a partir de uma mistura de pentose e hexose, separação e purificação da solução fermentada de etanol, preparação de um meio de cultura contendo um resíduo de fermentação gerado na separação e purificação, inoculação de um segundo micro-organismo no meio de cultura, e cultivo do segundo micro-organismo no meio de cultura.

[0022] A mistura de pentose e hexose pode ser obtida por física e quimicamente pré-processar e sacarificar pelo menos um selecionado do grupo consistindo em biomassa lignocelulósica e biomassa celulósica. O resíduo de fermentação pode conter pelo menos um açúcar selecionado do grupo consistindo em hexose incluindo glicose, galactose e manose, e pentose incluindo xilose e arabinose.

[0023] No método para a preparação de produtos bioquímicos de acordo com uma forma de realização da presente invenção, o segundo micro-organismo pode incluir pelo menos um selecionado do grupo consistindo em levedura, Clostridium, Colon bacillus, Bacillus, Anaeromyxobacter, Alcaligenes, Bacteroides, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Pichia, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Saccharomyces, Streptomyces, Thermus, Thermotoga, Thermoanaerobacter, Klebsiella, Streptomycetaceae, Actinomycetaceae, Colinebacterium, Zymomonas, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, e Mannheimia.

[0024] Os produtos bioquímicos podem incluir pelo menos um selecionado do grupo que consiste em aminoácidos, ácidos orgânicos, levedura, polímeros biodegradáveis, e um álcool. Os aminoácidos podem incluir metionina e treonina. Os ácidos orgânicos podem incluir pelo menos um selecionado do grupo consistindo em ácido láctico, ácido butírico, ácido succínico e ácido hidroxipripiônico. Os polímeros

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12/38 biodegradáveis podem incluir biopoliéster.

EFEITO DA INVENÇÃO

[0025] De acordo com o método para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos de acordo com a presente invenção, o resíduo de fermentação gerado na produção de álcool é usado como um meio de cultura para os micro-organismos para preparar biocombustíveis e produtos bioquímicos de uma forma econômica e ecológica.

[0026] Visto que o resíduo de fermentação gerado na produção de álcool é usado como um meio de cultura para os micro-organismos, é possível reduzir ou eliminar o uso de uma variedade de produtos químicos e componentes de nutriente adicionados a um meio de cultura convencional. Também, é possível reduzir uma quantidade de uma fonte de carbono convencional utilizada tal como glicose, sacarose, glicerol, e outros mais. Além disso, uma vez que o micro-organismo é esterilizado durante a destilação do álcool, é possível reduzir uma grande quantidade de custos de energia envolvidos na esterilização.

[0027] Além disso, o derivado tanto de hexose quanto de pentose da biomassa lignocelulósica é eficazmente utilizado na fermentação de micro-organismos, reduzindo assim notavelmente um custo de matéria-prima.

[0028] Consequentemente, o método para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos de acordo com a presente invenção pode notavelmente reduzir o custo de matéria-prima e o custo de energia envolvido no processo de preparação. Da mesma forma, o método da presente invenção pode ter efeitos de proteção ambiental e economia de recursos, mediante a reciclagem do resíduo gerado na fermentação de álcool e fazer uso tanto de hexose quanto de pentose. [0029] A presente invenção fornece um método para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos que podem eficientemente

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13/38 fazer uso da biomassa lignocelulósica e reduzir o custo do tratamento de águas residuais e um componente de nutriente adicional, assim como a energia envolvida no processo de preparação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0030] A FIG. 1 é um diagrama que ilustra um processo para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0031] A FIG. 2 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824.

[0032] A FIG. 3 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824.

[0033] A FIG. 4 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824.

[0034] A FIG. 5 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium beijerinckii NCIMB 8052.

[0035] A FIG. 6 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de etanol produzido pela cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601.

[0036] A FIG. 7 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido butírico produzido pela cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755.

[0037] A FIG. 8 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido láctico produzido pela cepa de Lactobacillus acidophilus NCFM.

[0038] A FIG. 9 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido succínico produzido pela cepa de Actinobacillus

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14/38 succinogenes ATCC 55618.

[0039] A FIG. 10 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido 3-hidroxipropiônico produzido pela cepa de E. coli.

[0040] A FIG. 11 é um diagrama que ilustra um processo para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0041] A FIG. 12 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium beijerinckii ATCC 35702.

[0042] A FIG. 13 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido butírico produzido pela cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755.

MELHOR MODO PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0043] Os estudos estão sendo conduzidos sobre a reciclagem de um subproduto produzido na fermentação de micro-organismos, mas são muito limitados em que apenas alguns componentes de uma substância produzida como um subproduto são seletivamente separados e depois reciclados. Até esta data, poucas tentativas, se houver, estão sendo feitas na preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos usando um resíduo de fermentação gerado na produção de álcool como um meio de cultura para os micro-organismos.

[0044] Em seguida a presente invenção é descrita com maiores detalhes com referência aos desenhos acompanhantes.

[0045] Um método para a preparação de biocombustíveis de acordo com uma forma de realização da presente invenção pode incluir a preparação de um meio de cultura contendo um resíduo de fermentação gerado na produção de álcool, inoculação de um primeiro microorganismo no meio de cultura, e cultivo do primeiro micro-organismo no meio de cultura.

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[0046] Um método para a preparação de produtos bioquímicos de acordo com outra forma de realização da presente invenção pode incluir a preparação de um meio de cultura contendo um resíduo de fermentação gerado na produção de álcool, inoculação de um segundo micro-organismo no meio de cultura, e cultivo do segundo microorganismo no meio de cultura.

[0047] A FIG. 1 é um diagrama que ilustra um processo para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Referindo-se à FIG. 1, uma solução fermentada é preparada através da fermentação de micro-organismos em um fermentador de etanol. Vários microorganismos são conhecidos por serem capazes de produzir etanol, mas um micro-organismo sendo principalmente usado no campo industrial, no momento, é Saccharomyces cerevisiae, que é uma espécie de levedura. Também, várias fontes de carbono podem ser utilizadas na fermentação de etanol. Um micro-organismo capaz de produzir etanol é implantado em um meio de cultura contendo uma fonte de carbono gerada através do pré-processamento da biomassa, seguido pela fermentação em uma batelada, batelada alimentada, ou operação contínua.

[0048] A solução fermentada resultante é transferida para uma torre de destilação onde o etanol é destilado e depois recuperado em um tanque de armazenamento de etanol. A destilação de etanol ocorre através do aumento da temperatura do meio de fermentação entre 80 e 90 °C, de modo que o etanol tendo uma pureza de cerca de 95 % ou mais é obtido e recuperado. Para obter etanol de uma pureza mais elevada, um processo de hidratação separado é requerido. Em um processo de fermentação geral, o gás de dióxido de carbono é gerado como um subproduto, e após a captura/compressão, pode ser utilizado para bebidas ou uso industrial.

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[0049] Depois que o etanol é recuperado no tanque de armazenamento de etanol, um resíduo de fermentação permanece. O resíduo de fermentação é os micro-organismos mortos durante a destilação de etanol em temperatura elevada de 80 °C a 90 °C, res íduos de carboidrato sólidos não hidrolizados, ou açúcares não fermentados. O resíduo de fermentação é gerado na produção de álcool através da fermentação após a inoculação do micro-organismo capaz de produzir álcool no meio de cultura contendo a fonte de carbono.

[0050] O resíduo de fermentação pode ser disperso diretamente sobre a terra cultivada como um composto para o cultivo de plantas para a agricultura ou floresta, ou pode ser utilizado como um alimento para animais domésticos. No entanto, quando o resíduo de fermentação for diretamente disperso sobre a terra de cultivo, existem riscos de contaminação do solo e da água. Para utilizar o resíduo de fermentação como uma ração para animais domesticados, o resíduo de fermentação necessita ser desidratado em temperatura elevada para se obter um concentrado sólido. Essa desidratação requer uma grande dose de energia. Visto que o resíduo de fermentação gerado após a destilação contém uma quantidade suficiente de componentes de nutriente necessários para um meio de cultura para os micro-organismos, a utilização do resíduo de fermentação como um meio de cultura pode notavelmente reduzir os custos relacionados com os componentes de nutriente a serem adicionados quando se prepara um meio de cultura convencional. Da mesma forma, uma vez que os açúcares remanescentes nos resíduo de fermentação podem ser usados como uma fonte de carbono, é possível reduzir o custo de uma fonte de carbono necessária para o cultivo de micro-organismos. Visto que os microorganismos são esterilizados em uma temperatura elevada durante a destilação, quando o resíduo de fermentação for utilizado diretamente como um meio de cultura, uma necessidade de esterilizar o meio de

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17/38 cultura em temperatura elevada é desnecessária, e consequentemente, uma grande quantidade de custos de energia envolvidos na esterilização de um meio de cultura pode ser economizada.

[0051] Mediante a transferência do resíduo de fermentação sem sólidos que foram separados por um separador de sólido/líquido para um fermentador de biocombustíveis e produtos bioquímicos ou mediante a transferência do resíduo de fermentação com sólidos para um fermentador de biocombustíveis e produtos bioquímicos, diretamente sem transferir para um separador de sólido/líquido, o resíduo de fermentação é preparado como um meio de cultura para a produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos de acordo com a presente invenção. Conforme considerado necessário, a água, uma fonte de carbono, e um componente de nutrientes podem ser adicionados ao fermentador de biocombustíveis e produtos bioquímicos. A glicose ou todas as fontes de carbono utilizáveis no cultivo de micro-organismo podem ser utilizadas como fonte de carbono. Todos os materiais capazes de promover o desenvolvimento de micro-organismo após a adição ao meio de cultura podem ser utilizados como o componente de nutriente.

[0052] O micro-organismo capaz de produzir biocombustíveis e produtos bioquímicos é implantado no meio de cultura. O primeiro micro-organismo capaz de produzir biocombustíveis e o segundo microorganismo capaz de produzir produtos bioquímicos, podem incluir levedura, Clostridium, Colon bacillus, Bacillus, Anaeromyxobacter, Alcaligenes, Bacteroides, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Pichia, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Saccharomyces, Streptomyces, Thermus, Thermotoga, Thermoanaerobacter, Klebsiella, Streptomycetaceae, Actinomycetaceae, Colinebacterium, Zymomonas, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, e Mannheimia, e suas cepas tipo silvestre, cepas mutantes e cepas recombinantes.

[0053] O micro-organismo é cultivado no meio de cultura em uma

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18/38 batelada, batelada alimentada, ou operação contínua. Logo que os biocombustíveis e produtos bioquímicos são produzidos através do cultivo de micro-organismos, os biocombustíveis e produtos bioquímicos resultantes são separados e purificados, e depois recuperados. Os biocombustíveis podem ser utilizados quando eles forem usados como um aditivo adicionado aos biocombustíveis. Os biocombustíveis podem incluir bio-gás, um álcool, um composto com base em alcano, e um composto com base em alqueno. O biogás pode incluir metano e hidrogênio. O álcool pode incluir etanol, propanol, butanol, pentanol e hexanol. Os produtos bioquímicos podem ser utilizados como uma matéria-prima para a produção de produtos químicos ou um aditivo adicionado à uma matéria-prima, e incluem aminoácidos, ácidos orgânicos, levedura, polímeros biodegradáveis, e um álcool que podem ser produzidos através do cultivo de micro-organismos. Os aminoácidos podem incluir metionina e treonina. Os ácidos orgânicos podem incluir ácido láctico, ácido butírico, ácido succínico e ácido hidroxipropiônico. Os polímeros biodegradáveis podem incluir biopoliéster.

[0054] De acordo com uma forma de realização da presente invenção, os biocombustíveis e os produtos bioquímicos podem ser eficazmente preparados pela fermentação integrada de açúcares principais extraídos da biomassa lignocelulósica, tais como pentose e hexose.

[0055] A FIG. 11 é um diagrama que ilustra um processo para a preparação de biocombustíveis e produtos bioquímicos de acordo com uma forma de realização da presente invenção.

[0056] Referindo-se à FIG. 11, a biomassa lignocelulósica é física e quimicamente pré-processada, seguido pela hidrólise usando levedura, para produzir uma solução sacarificada misturada de pentose e hexose. Durante a fermentação de etanol, a hexose é consumida, e através da separação e purificação, o etanol é produzido. Subsequen

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19/38 te à fermentação, o etanol é removido através da destilação. Os biocombustíveis e produtos bioquímicos são preparados utilizando um resíduo de fermentação contendo a pentose restante. A pentose pode ser utilizada na fermentação de butanol, ácido butírico, ácido succínico para fornecer uma fonte de carbono e um componente de nutrientes. [0057] Geralmente, visto que uma levedura de etanol comercial é incapaz ou possui uma capacidade notavelmente baixa de utilizar pentose como uma fonte de carbono, um processo adicional para o desenvolvimento de uma cepa é necessário, por exemplo, a manipulação genética, para utilizar a pentose restante. Em um caso em que a pentose e a hexose coexistem, uma maioria das cepas capazes de consumir a pentose durante a produção de biocombustíveis e produtos bioquímicos, não consome a pentose até que a hexose esteja completamente consumida, ou consume a pentose em uma solução sacarificada misturada em uma taxa notavelmente mais baixa do que quando apenas a pentose existe como uma única fonte de carbono. Consequentemente, dificuldade existe no uso de uma solução sacarificada de biomassa lignocelulósica a partir da qual tanto a pentose quanto a hexose são produzidas.

[0058] Através dos processos ligados descritos no precedente, a presente invenção pode eficientemente fazer uso da biomassa lignocelulósica mediante o consumo de hexose e pentose sequencialmente e assim, reduzir os custos de energia, tratamento de resíduos, e um componente de nutriente adicional envolvidos no processo de preparação.

[0059] Em seguida, as formas de realização da presente invenção serão descritas com maiores detalhes. No entanto, deve ser observado que as descrições aqui propostas são simplesmente exemplos preferíveis apenas para o propósito de ilustração, e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

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MODALIDADE

RECUPERAÇÃO DO RESÍDUO DE FERMENTAÇÃO E ANÁLISE ELEMENTAR

[0060] O resíduo de fermentação foi diretamente obtido de uma fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd., que é especializada na produção de etanol em uma escala industrial. A Changhae ethanol Co., Ltd. produz e vende etanol comercial tendo uma pureza de 95 % ou mais mediante a produção de cerca de 100 gramas/litro (g/L) de etanol por meio de cultivo da cepa de Saccharomyces cerevisiae para a produção de etanol e destilação de uma cultura de fermentação em uma temperatura em uma faixa de 80 °C a 90 °C. O resíduo de fermentação com sólidos recuperados da fábrica de etanol industrial após a destilação do etanol foi utilizado na seguinte forma de realização.

[0061] Logo que o resíduo de fermentação foi separada por centrifugação a 12000 rotações por minuto (rpm), durante 10 minutos a 4 °C, as concentrações de etanol, ácido acético, e gl ucose presentes no sobrenadante foram analisadas usando cromatografia gasosa (GC) e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). A GC e a HPLC também foram utilizadas na análise das concentrações de etanol, butanol, ácido butírico, e ácido láctico produzidos através do cultivo de micro-organismos na seguinte forma de realização. Para testar o amido presente nos sólidos, 100 mililitros (ml) de ácido clorídrico a 5 % (HCl) foram adicionados a 50 ml da amostra, seguido pela sacarificação de ácido durante 2,5 horas a 95 °C e esfriamento. A solução sacarificada de ácido foi neutralizada com hidróxido de sódio a 28 % (NaOH), e depois uma quantidade total de açúcar presente no resíduo de fermentação foi analisada utilizando HPLC. Uma concentração de proteínas foi analisada utilizando um kit de proteína total (Cat. No. TP0200) da Sigma-Aldrich.

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[0062] As características obtidas pela análise do resíduo de fermentação recuperado da fábrica da Changhae ethanol Co., Ltd. são mostradas na Tabela 1.

TABELA 1

Componente	Concentração
Etanol	0,0 g/l
Ácido acético	2,1 g/l
Proteína	2,0 mg/ml
Açúcar no estado líquido	4,0 g/l
Total de açúcar (contendo sólidos)	6,8 g/l

PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS USANDO MEIO DE CULTURA

CONTENDO RESÍDUO DE FERMENTAÇÃO (1) Produção de biobutanol usando a cepa de Clostridium acetobutylicum

A. Produção de biobutanol através da utilização direta de resíduo de fermentação

[0063] O resíduo de fermentação recuperado a partir da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. foi utilizado como um meio de cultura, e neste exemplo, um meio de cultura contendo resíduo de fermentação sem sólidos e um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação com sólidos foram cada um usado como um meio de cultura para a produção de butanol. Uma cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 foi cultivada em um biorreator de 6,6 litros (L) em uma operação de batelada. Para determinar as características do resíduo de fermentação como um meio de cultura para a produção de butanol, um meio de cultura de Clostridium convencionalmente usado no cultivo de uma estirpe de Clostridium foi utilizado como um controle. Da mesma forma, um meio de cultura preparado pela mistura do meio de cultura de Clostridium com o resíduo de fermentação em uma relação volumétrica de de 50:50 foi utilizado como um meio de

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22/38 cultura para a produção de butanol.

[0064] Para cultivar uma cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824, 200 ml de uma cultura líquida foram implantados em um biorreator incluindo cada um do meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos dos 2,0 L do resíduo de fermentação recuperados da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd., o meio de cultura contendo o resíduo de fermentação com sólidos, o meio de cultura de Clostridium, e o meio de cultura preparado pela mistura do meio de cultura de Clostridium com o resíduo de fermentação em uma relação volumétrica de 50:50. Neste caso, as condições de cultura foram definidas de tal modo que uma concentração de glucose inicial foi de 40 g/L, um pH inicial foi de 6,0, uma temperatura de cultura foi de 37 °C , e uma taxa de agitação foi de 150 rpm. Para manter a condição anaeróbica durante o cultivo, gás de nitrogênio foi continuamente fornecido em uma taxa de fluxo de 50 ml/min, e um pH foi ajustado a 5,0 ou mais, usando 28 % (p/v) de solução de amônia durante o cultivo.

[0065] Quando o meio de cultura contendo o resíduo de fermentação foi utilizado, o meio de cultura de Clostridium foi usado, e o meio de cultura preparado pela mistura do meio de cultura de Clostridium com o resíduo de fermentação em uma relação volumétrica de 50:50 foi utilizado, após 70 horas de cultivo, a cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 completamente consumiu os 40 g/L de glicose adicionados no meio de cultura.

[0066] A FIG. 2 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Referindo-se à FIG. 2, a concentração de butanol produzido pela cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 no meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação sem sólidos, em que os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação gerado na produ

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23/38 ção de etanol e no meio de cultura (B) contendo o resíduo de fermentação com sólidos foi 9,2 ± 1,7 g/L. A concentração de butanol produzido no meio de cultura de Clostridium (C) utilizado como um controle foi de 5,5 ± 0,6 g/L.

[0067] A FIG. 3 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Referindo-se à FIG. 3, a concentração de butanol produzido no meio de cultura (A) preparado pela mistura do meio de cultura de Clostridium com o resíduo de fermentação em uma relação volumétrica de 50:50 foi 7,4 ± 0,7 g/L. Neste exemplo, a concentração é mais elevada do que a concentração de butanol produzido no meio de cultura de Clostridium (B) utilizado como um controlo, isto é, 5,5 ± 0,6 g/L.

[0068] A partir deste resultado, observou-se que o resíduo de fermentação apresentou pelo menos 67 % de melhora na produção de butanol, quando comparado com o meio de cultura de Clostridium convencionalmente utilizado na produção de butanol.

B. Produção de biobutanol usando autólise do resíduo de fermentação [0069] Um autolisado produzido pela autólise do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. foi utilizado como um meio de cultura para a produção de butanol. O resíduo de fermentação de etanol foi submetido a autólise por uma reação de batelada a 50 °C durante um período de 24 horas. Uma cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 foi cultivada em um biorreator de 6,6 L em uma operação de batelada. Para determinar as características do resíduo de fermentação como um meio de cultura para a produção de butanol, um meio de cultura de Clostridium convencionalmente usado no cultivo de uma cepa de Clostridium foi utilizado como um controle.

[0070] Para o cultivo de uma cepa de Clostridium acetobutylicum

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ATCC 824, após o autolisado do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. ter sido separado por centrifugação em 12000 rpm a 4 °C, 200 ml de uma cultura líquida foram implantados em um biorreator incluindo cada um de um meio de cultura contendo 1,0 L do sobrenadante e do meio de cultura de Clostridium. Neste caso, as condições de cultura foram definidas de tal modo que uma concentração de glicose inicial foi 60 g/L, um pH inicial foi 6,0, uma temperatura da cultura foi de 37 °C, e uma taxa de agitação foi 150 rpm. Para manter a condição anaeróbica durante o cultivo, gás de nitrogênio foi continuamente fornecido em uma taxa de fluxo de 50 mL/min, e um pH foi ajustado a 5,0 ou mais, usando 28 % (p/v) de solução de amônia durante o cultivo.

[0071] Quando o autolisado do resíduo de fermentação foi utilizado como um meio de cultura e o meio de cultura de Clostridium foi usado, após 72 horas de cultivo, a cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 completamente consumiu o 60 g/L de glicose adicionados no meio de cultura.

[0072] A FIG. 4 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Referindo-se à FIG. 4, quando o autolisado do resíduo de fermentação de etanol foi utilizado como um meio de cultura (A), a concentração de butanol foi de 8,9 ± 0,3 g/L que é quase igual à concentração de butanol produzido no meio de cultura de Clostridium (B) utilizado como um controle, isto é, 9,0 ± 0,1 g/L.

[0073] Consequentemente, observou-se através deste resultado que o resíduo de fermentação pode ser usado como um meio de cultura como está, ou depois da autólise.

(2) Produção de biobutanol usando a cepa de Clostridium beijerinckii

[0074] Mediante o uso de um meio de cultura contendo o resíduo

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25/38 de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd., uma cepa de Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 foi cultivada em um biorreator de 6,6 L em uma operação de batelada. Para determinar as características do resíduo de fermentação como um meio de cultura para a produção de butanol através do cultivo de micro-organismo, um meio de cultura de Clostridium convencionalmente usado no cultivo de uma cepa de Clostridium foi utilizado como controle.

[0075] Para o cultivo de uma cepa de Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, 200 ml de uma cultura líquida foram implantados em um biorreator incluindo cada um do meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos de 2,0 L de resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. e do meio de cultura de Clostridium. Neste exemplo, as condições de cultura foram definidas de tal modo que uma concentração de glicose inicial foi de 60 g/l, um pH inicial foi de 6,0, uma temperatura de cultura foi de 37 °C, e uma taxa de agitação foi de 150 rpm. Para manter a condição anaeróbica durante o cultivo, gás de nitrogênio foi continuamente fornecido em uma taxa de fluxo de 50 mL/min, e um pH foi ajustado a 5,0 ou mais, usando 28 % (p/v) de solução de amônia durante o cultivo. Após 24 horas de cultivo, uma quantidade de consumo de glicose foi 20 g/L, quando o meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos foi usado, e uma quantidade de consumo de glicose foi de 30 g/L quando o meio de cultura de Clostridium foi usado.

[0076] A FIG. 5 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium beijerinckii NCIMB 8052. Referindo-se à FIG. 5, quando o meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram

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26/38 removidos do resíduo de fermentação gerado na produção de etanol foi utilizado, a concentração de butanol foi de 9,2 ± 0,7 g/L, e quando o meio de cultura de Clostridium (B) foi utilizado, a concentração de butanol foi 9,8 ± 1,0 g/L.

(3) Produção de bioetanol

[0077] O resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. foi utilizado como um meio de cultura, e neste exemplo, um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos e um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação com sólidos foram cada um utilizado como um meio de cultura para a produção de etanol. Uma cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601 foi cultivada em um frasco de 250 ml. Para determinar as características do resíduo de fermentação, como um meio de cultura para a produção de etanol através do cultivo de microorganismo, um meio de mofo de levedura (YM Broth, Difco, Cat. No. 271120) convencionalmente utilizado como um meio de cultura para a fermentação de etanol foi utilizado como um controle. Os componentes do meio de mofo de levedura e seu teor são mostrados na Tabela 2.

TABELA 2

Componente	Teor (g/L)
Extrato de levedura	2,1
Extrato de malte	2,0
Peptona	4,0
Dextrose	6,8

[0078] Para o cultivo de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601, 3 ml de uma cultura líquida foram implantados em um frasco incluindo cada um de meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos de 100 ml do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd., o meio de cultura contendo o resí

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27/38 duo de fermentação com sólidos, e o meio YM. Neste exemplo, uma concentração inicial de glicose como uma fonte de carbono foi ajustada para 40 g/L. Além disso, um pH inicial do meio de cultura foi ajustado para 5. Uma incubadora de agitação capaz de ajustar a temperatura foi utilizada no cultivo, e a temperatura da cultura foi ajustada para 30 °C e a taxa de agitação foi ajustada para 200 rp m.

[0079] Quando o resíduo de fermentação foi utilizado como um meio de cultura e o meio YM foi utilizado, após 24 horas de cultivo, a cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601 completamente consumiu os 40 g/L de glicose adicionados no meio de cultura.

[0080] A FIG. 6 é um gráfico que ilustra a comparação das concentrações de etanol produzido pela cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601. Referindo-se à FIG. 6, a concentração de etanol produzido no meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos a partir do resíduo de fermentação gerado na produção de etanol e o meio de cultura (B) contendo o resíduo de fermentação com sólidos foi de 20,5 ± 0,3 g/L e

23,5 ± 1,3 g/L, respectivamente. A concentração de etanol produzido no meio YM (C) convencionalmente utilizado na produção de etanol foi de 17,7 ± 0,7 g/L. A partir deste resultado, observou-se que o meio de cultura de acordo com a presente invenção apresentou pelo menos uma melhora de 15 % na produção de etanol em comparação com o meio YM convencionalmente utilizado na produção de etanol.

PRODUÇÃO DE PRODUTOS BIOQUÍMICOS UTILIZANDO O MEIO DE CULTURA CONTENDO O RESÍDUO DE FERMENTAÇÃO (1) Produção de ácido butírico

[0081] Mediante o uso de um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação recuperado a partir da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd., uma cepa de Clostridium tyrobu

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28/38 tyricum ATCC 25755 foi cultivada em um biorreator de 6,6 L em uma operação de batelada. Para determinar as características do resíduo de fermentação como um meio de cultura para a produção de ácido butírico através do cultivo de micro-organismo, um meio de cultura de Clostridium convencionalmente usado no cultivo de uma cepa de Clostridium foi utilizado como controle.

[0082] Para cultivar uma cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755, 200 ml de uma cultura líquida foram implantados em um biorreator incluindo cada um de meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos a partir de 2,0 L de resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. e do meio de cultura de Clostridium. Neste exemplo, as condições de cultivo foram definidas de tal modo que uma concentração de glicose inicial foi de 40 g/L, uma temperatura de cultura foi de 37 °C, e uma taxa de agitação foi de 150 rpm. Para manter a condição anaeróbica durante o cultivo, gás de nitrogênio foi continuamente fornecido em uma taxa de fluxo de 50 ml/min, e um pH foi ajustado para 6,0 usando 28 % (p/v) de solução de amônia durante o cultivo.

[0083] Quando o resíduo de fermentação sem sólidos foi utilizado como um meio de cultura e o meio de cultura de Clostridium foi usado, após 22 horas de cultivo, a cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 completamente consumiu a glicose adicionada ao meio de cultura.

[0084] A FIG. 7 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido butírico produzido pela cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. Referindo-se à FIG. 7, a concentração de ácido butírico produzido no meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação gerado na produção de etanol foi de 19,0 ± 0,5 g/l,

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29/38 e a concentração de ácido butírico produzido no meio de cultura de Clostridium (B) foi de 14,5 ± 0,2 g/l. A partir deste resultado, observouse que o resíduo de fermentação apresentou pelo menos uma melhora de 31 % na produção de ácido butírico quando comparado com o meio de cultura de Clostridium convencionalmente utilizado na produção de ácido butírico.

(2) Produção de ácido lático

[0085] Mediante o uso de um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação com sólidos recuperados a partir da fábrica de etanol industrial de Changhae ethanol Co., Ltd. e um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos, uma cepa de Lactobacillus acidophilus NCFM foi implantada em um fermentador de 2,5 L, incluindo 1,5 L de uma cultura líquida e em seguida cultivada em uma operação de batelada. Para determinar as características do resíduo de fermentação como um meio de cultura para a produção de ácido láctico através do cultivo de micro-organismos, um meio MRS (caldo MRS, Difco, Cat. No. 288.130), convencionalmente utilizado para o cultivo de Lactobacillus foi utilizado como um controle. Os componentes do meio MRS e seu teor são mostrados na Tabela 3.

TABELA 3

Componente	Teor (g/L)
Proteose Peptona No. 3	10,0
Extrato de Carne	10,0
Extrato de Levedura	5,0
Dextrose	20,0
Polissorbato 80	1,0
Citrato de Amônio	2,0
Acetato de Sódio	5,0
Sulfato de Magnésio	0,1
Sulfato de Manganês	0,05
Fosfato de Dipotássio	2.0

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[0086] Para realizar o cultivo para a produção de ácido láctico, 60 ml de uma cultura líquida de Lactobacillus acidophilus foram implantados em 1,5 L do meio de cultura. Neste exemplo, uma concentração de glicose inicial foi ajustada para 50 g/L, e uma temperatura de cultura foi de 37 °C e uma taxa de agitação foi de 200 rpm. Da mesma forma, um pH para a produção de ácido láctico foi ajustado para 6,5 utilizando 10 M NaOH. Visto que a maioria das cepas para produção de ácido lático incluindo a cepa de Lactobacillus acidophilus é bactérias anaeróbicas, uma condição anaeróbica não foi especificamente definida.

[0087] Após 24 horas de cultura, a cepa de Lactobacillus acidophilus NCFM completamente consumiu a glicose inicial em cada um do meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação com sólidos, do meio de cultura (B) contendo o resíduo de fermentação sem sólidos, e do meio MRS (C).

[0088] A FIG. 8 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido láctico produzido pela cepa de Lactobacillus acidophilus NCFM. Referindo-se à FIG. 8, a concentração de ácido láctico produzido no meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação com sólidos gerados na produção de etanol foi de 48,2 ± 0,4 g/l, a concentração de ácido láctico produzido no meio de cultura (B) contendo o resíduo de fermentação sem sólidos foi de 41,2 ± 0,9 g/l, e a concentração de ácido láctico produzido no meio MRS (C) foi de 47,2 ± 0,5 g/l.

[0089] Referindo-se à FIG. 8, observou-se que quando o resíduo de fermentação gerado na produção de etanol for utilizado como um meio de fermentação de ácido láctico, o resíduo de fermentação pode substituir um meio de produção de ácido láctico independente se os sólidos foram removidos. Em particular, quando se culiva uma cepa de Lactobacillus acidophilus para a produção de ácido láctico, uma con

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31/38 centração de ácido láctico produzido no meio de cultura contendo o resíduo de fermentação com sólidos em que os sólidos não foram removidos do resíduo de fermentação foi mais elevada.

(3) Produção de ácido succínico

[0090] Foi feita uma tentativa para produzir ácido succínico através do cultivo de uma cepa de Actinobacillus succinogenes ATCC 55618 em um frasco de 500 ml utilizando um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. Para determinar as características do resíduo de fermentação como um meio de cultura para a produção de ácido succínico através do cultivo de micro-organismos, um meio de cultura da Tabela 4 foi utilizado como um controle.

TABELA 4

Componente	Teor (g/L)
Extrato de Levedura	5,0
NaHCO3	10,0
NaH2PO4-H2O	8,5
K2HPO4	15,5
Glicose	18,0

[0091] Para cultivar uma cepa de Actinobacillus succinogenes ATCC 55618, os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial de Changhae ethanol Co., Ltd., e depois os componentes diferentes do extrato de levedura na Tabela 4 foram adicionados ao resíduo de fermentação sem sólidos. Neste exemplo, 10 ml de uma cultura líquida em um tubo foram inseridos em um frasco incluindo 200 ml do meio de cultura. Após o cultivo ter sido realizado no frasco a 39 °C durante 48 horas, a cepa de Actinobacillus succinogenes ATCC 55618 foi implantada em um fermentador de 6,5 L, incluindo 2 L da cultura líquida. 18 g/L de glicose foram

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32/38 adicionados no meio de cultura como uma fonte de carbono. Um pH do fermentador foi ajustado para 7,0 utilizando solução de amônia a 28 %. Durante a fermentação, 99,999 % de CO2 foi continuamente expurgado em uma taxa de 0,05 volume por volume por minuto (vvm) e uma temperatura de cultivo foi mantida em uma temperatura de 39 °C.

[0092] Após 40 horas de cultivo, a cepa de Actinobacillus succinogenes ATCC 55618 completamente consumiu os 18 g/L de glicose adicionados no meio de cultura.

[0093] A FIG. 9 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido succínico produzido pela cepa de Actinobacillus succinogenes. Referindo-se à FIG. 9, a concentração de ácido succínico produzido no meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação gerado na produção de etanol foi de 10,7 ± 0,8 g/L. A concentração de ácido succínico produzido sobre no controle (B) foi de 10,1 ± 0,8 g/L. A partir deste resultado, observou-se que a produção de ácido succínico utilizando o meio de cultura de acordo com o método de preparação da presente invenção foi maior ou igual àquela do controle convencionalmente utilizado na produção de ácido succínico.

(4) Produção de Ácido 3-Hidroxipropiônico

[0094] Foi feita uma tentativa para produzir ácido 3hidroxipropiônico mediante o cultivo de 50 ml de uma cepa recombinante desenvolvida para produzir ácido 3-hidroxipropiônico, cepa de E. coli BL21_pCDFDuet_dhaB_gdrAB_EcoRI_AflII#15_pQE80L_Kp_aldH_Ba mHI_HindIII#2 em um frasco de 250 ml mediante o uso de um meio de cultura contendo o resíduo de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial de Changhae ethanol Co., Ltd. Para determinar as características do resíduo de fermentação como um meio de cultura para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico através do cultivo de mi

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33/38 cro-organismos, um meio de cultura preparado pela adição dos componentes da Tabela 5 em sais M9 preparados para produzir o ácido 3hidroxipropiônico foi utilizado como um controle. 50 milimoles (mM) de glicerol foram utilizados como uma fonte de carbono.

TABELA 5

Componente	Concentração
Concentração de IPTG	0,1 mM
Extrato de levadura	0,2 g/L
Coenzima B12	20 μΜ
Glicerol	50 mM

[0095] Mais especificamente, uma cepa de E. coli foi cultivada no meio de cultura contendo 5 % das águas residuais de fermentação sem sólidos em que os sólidos foram removidos do resíduo de fermentação recuperado da fábrica de etanol industrial da Changhae ethanol Co., Ltd. em lugar de extrato de levedura sendo utilizado como uma fonte de carbono no controle, e sobre o controle, respectivamente. Neste caso, 5 ml de uma cultura líquida em um tubo foram implantados em um frasco que inclui 50 ml de cada meio de cultura, e agitados a 200 rpm durante 30 horas a 37 °C.

[0096] A FIG. 10 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido 3-hidroxipropiônico produzido pela cepa de E. coli. Referindo-se à FIG. 10, a concentração de ácido 3hidroxipropiônico produzido no meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação gerado na produção de etanol foi de 8,4 ± 0,7 g/L, e a concentração de ácido 3-hidroxipropiônico produzido no controle (B) foi 8,6 ± 0,0 g/L. Este resultado significa que a produção de ácido 3hidroxipropiônico usando o meio de cultura preparado de acordo com a presente invenção é quase igual àquela do controle convencionalmente utilizado na produção de ácido 3-hidroxipropiônico.

[0097] Pré-processamento e fermentação de etanol da biomassa

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34/38 lignocelulósica

[0098] Palha de cevada oferecida pelo National Institute of Crop Science, Rural Development Administration foi usada como uma biomassa lignocelulósica. A composição da palha de cevada foi de 37,2 % de celulose, 22,4 % de hemicelulose, 19,3 % de lignina, e 1,7 % de cinza, como mostrado na Tabela 6 abaixo.

TABELA 6

Componente	% Composição
Celulose (Glicose)	37,2
Hemicelulose (xilose)	22,4
Lignina	19,3
Água	7,9
Cinza	1,7
Outros	11,5

[0099] 10 % (p/v) de palha de cevada pulverizada menos do que 1 milímetro (mm) por uma máquina de compressão e uma máquina de moagem foi imerso em 15 % (v/v) de solução de amônia, seguido pela reação a 150°C durante 60 minutos.

[00100] A composição da palha de cevada pré-processada foi de 54,8 % de celulose, 21,9 % de hemiceluloses, e 12,7 % de lignina. 250 gramas (g) da palha de cevada pré-processada foram misturados com 1000 ml de tampão de citrato de sódio 0,1 M (pH 4,8) e 1000 ml de água destilada, e depois 30 FPU/g de celulose complexa (Novozyme, NS50015) e 30 CBU/g de β-glucosidase (Novozyme, NS50010) foram adicionados. Subsequentemente, a sacarificação foi realizada em uma incubadora com agitação a 150 rpm, durante um período de 72 horas em uma temperatura de 45 °C.

[00101] Após a sacarificação ter sido concluída, a solução sacarificado continha 54,9 g/L de glicose e 25,1 g/L de xilose, e após o préprocessamento, foi utilizada diretamente como um meio de cultura pa

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35/38 ra a fermentação de etanol. A solução sacarificada foi adicionada a um meio YPD contendo 10 g/L de extracto de levedura, 20 g/L de protease peptona e 10 g/L de dextrose, e depois cultivada em uma incubadora com agitação a 120 rpm, durante um período de 12 hora em uma temperatura de 32 °C para preparar uma cultura líquida de cepa de Saccharomyces cerevisiae CHY1011. Aqui, 5 % (v/v) da cultura líquida de cepa de Saccharomyces cerevisiae CHY1011 foi implantado e depois fermentado em uma incubadora com agitação a 150 rpm, durante um período de 24 horas em uma temperatura de 32 °C.

[00102] Após a fermentação de etanol ter sido concluída, 20,7 g/L de etanol foram produzidos e um resíduo de açúcar continha 0 g/L de glicose e 20,1 g/L de xilose. A solução de etanol fermentada foi evaporada a 89 °C sob uma pressão reduzida de modo a sep arar o etanol, e o resíduo de fermentação remanescente foi utilizado como um meio de cultura para a produção de biocombustíveis ou produtos bioquímicos. PRODUÇÃO DE BIOBUTANOL USANDO RESÍDUO DE FERMENTAÇÃO APÓS A FERMENTAÇÃO DO ETANOL

[00103] Depois que a palha de cevada como biomassa lignocelulósica sofreu fermentação de etanol e destilação sob pressão reduzida, o resíduo de fermentação remanescente foi utilizado diretamente como um meio de cultura para a fermentação de butanol como está, ou utilizado após a separação por centrífuga a 12.000 rpm durante um período de 15 minutos.

[00104] Após o resíduo de fermentação ter sido separado por centrifugação a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C, as concentrações de etanol, ácido acético, glicose e xilose presentes no sobrenadante foram analisadas por GC e HPLC. GC e HPLC também foram utilizadas na análise das concentrações de etanol, butanol, ácido butírico, e ácido succínico, produzidos através do cultivo de micro-organismos na seguinte forma de realização. A concentração de proteína total foi ana

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36/38 lisada usando um kit de proteína total (Sigma TP200, Micro-Lowry, Onishi & Barr Modification) of Sigma-Aldrich.

[00105] α-Amino nitrogênio foi analisado através de USP XXI Procedure (1985). As características do resíduo de fermentação de etanol analisadas pelo método de análise acima são mostradas na Tabela 7.

TABELA 7

pH	3,7
Teor de glicose (g/L)	0
Teor de xilose (g/L)	17
Teor de etanol (g/L)	0
Proteína total (mg/mL)	1,3
α-amino nitrogênio (mg/mL)	0,16

[00106] Na fermentação butanol utilizando o resíduo de fermentação de etanol como um meio de cultura, uma cepa de Clostridium beijerinckii ATCC35702 foi usada. Neste exemplo, 50 ml do resíduo de fermentação de etanol foram colocados em um frasco de 250 ml, e 2 ml de uma cultura líquida de cepa de Clostridium beijerinckii ATCC35702 foi implantada no meio de cultura. Para o cultivo, o meio de cultura foi colocado em uma câmara anaeróbica (N2 90 %, CO2 5 %, H2 5 %) a 37 °C durante um período de 60 horas.

[00107] Como um controle, um meio de cultura de Clostridium contendo, como uma fonte de carbono, xilose da mesma concentração que a solução sacarificada foi usada. Os componentes do meio de cultura de Clostridium e seus teores são mostrados na Tabela 8.

TABELA 8

Componente	Teor (g/L)
KH2PO4	0,75
K2HPO4	0,75
MgSO4^H2O	0,4
MnSO4 · H2O	0,01

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Componente	Teor (g/L)
FeSO4 · 7H2O	0,01
NaCl	1,0
Asparagina	2,0
Extrato de Levedura	5,0
(NH4)2SO4	2,0

[00108] Quando o resíduo de fermentação de etanol contendo pentose foi utilizado como um meio de cultura e o meio de cultura de Clostridium foi usado, a cepa de Clostridium beijerinckii ATCC 35702 completamente consumiu os 17 g/L de xilose dentro de um período de 60 horas de cultura.

[00109] A FIG. 12 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de butanol produzido pela cepa de Clostridium beijerinckii ATCC 35702. Referindo-se à FIG. 12, quando o resíduo de fermentação de etanol contendo pentose gerado na produção de etanol foi utilizado como um meio de cultura (A), a concentração de butanol foi de 4,7 ± 0,2 g/L, e quando o meio de cultura de Clostridium (B) foi utilizado, a concentração de butanol foi de 3,3 ± 0,5 g/L. A partir deste resultado, observou-se que a produção de butanol utilizando o meio de cultura de acordo com o método de preparação da presente invenção foi melhorada em pelo menos 42 % quando comparada com a do controle convencionalmente utilizado na produção de butanol.

PRODUÇÃO DE ÁCIDO BUTÍRICO USANDO O RESÍDUO DE FERMENTAÇÃO APÓS A FERMENTAÇÃO DE ETANOL

[00110] Um resíduo de fermentação de etanol foi preparado da maneira anterior e utilizado na produção do ácido butírico. As concentrações de xilose e ácido butírico foram analisadas utilizando HPLC.

[00111] Na produção de ácido butírico, uma cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 foi usada. Depois que 50 ml do resíduo de fermentação de etanol foram colocados em um frasco de 250 ml, 2 ml

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38/38 de uma cultura líquida de cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 foram implantados. Para o cultivo, o meio de cultura foi colocado em uma câmara anaeróbica (N2 90 %, CO2 5 %, H2 5 %) a 37 °C durante um período de 60 horas.

[00112] Como um controle, um meio de cultura de Clostridium contendo, como uma fonte de carbono, xilose da mesma concentração quando a solução sacarificada foi usada. Durante o cultivo, um pH foi mantido em 6 ou mais usando a solução de amônia a 28 %.

[00113] Quando o resíduo de fermentação de etanol contendo pentose foi utilizado como um meio de cultura e o meio de cultura de Clostridium foi usado, a cepa de Clostridium beijerinckii ATCC 35702 completamente consumiu os 17 g/L de xilose dentro de 80 horas de cultivo. [00114] A FIG. 13 é um gráfico que ilustra uma comparação das concentrações de ácido butírico produzido pela cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. Referindo-se à FIG. 13, a concentração de ácido butírico produzido no meio de cultura (A) contendo o resíduo de fermentação de etanol contendo pentose gerada na produção de etanol foi de 7,3 ± 0,3 g/L, e a concentração de ácido butírico produzido no meio de cultura de Clostridium (B) foi de 7,0 ± 0,1 g/L.

[00115] A partir deste resultado, observou-se que a produção de ácido butírico usando o meio de cultura de acordo com uma forma de realização da presente invenção foi maior ou igual àquela do controle convencionalmente utilizado na produção de ácido butírico.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a preparação de biocombustíveis, o método caracterizado pelo fato de compreender:

a preparação de uma solução fermentada de álcool mediante a fermentação de hexose a partir de uma mistura compreendendo pelo menos um açúcar pentose e pelo menos um açúcar hexose;

a separação e purificação do álcool da solução fermentada para produzir um resíduo de fermentação compreendendo o pelo menos um açúcar pentose da mistura;

a preparação de um meio de cultura que compreende pelo menos uma porção do resíduo de fermentação;

a inoculação do micro-organismo no meio de cultura;

a cultura de micro-organismos no meio de cultura para gerar pelo menos um biocombustível.

2/3

Colinebacterium, Zymomonas, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Mannheimia, e combinações deles.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é cultivado no meio de cultura em uma operação selecionada do grupo que consiste em batelada, batelada alimentada, operações contínuas, e combinações dos mesmos.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende:

a separação e purificação dos biocombustíveis produzidos após o cultivo do micro-organismo no meio de cultura.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um biocombustível é selecionado do grupo que consiste em um bio-gás, um álcool, um composto à base de alcano, um composto à base de alqueno, e combinações dos mesmos.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o bio-gás é selecionado do grupo que consiste em metano, hidrogênio e combinações dos mesmos

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o álcool é selecionado do grupo consistindo em etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol e combinações dos mesmos.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a preparação do meio de cultura compreende remover sólidos do resíduo de fermentação.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a preparação do meio de cultura compreende a autólise do resíduo de fermentação.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um açúcar pentose é selecionado do grupo consistindo em xilose, arbinose, e combinações dos mesmos.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado

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2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mistura de pentose e hexose é produzida por préprocessar física e quimicamente e sacarificar pelo menos um material de biomassa selecionado do grupo consistindo em biomassa lignocelulósica e biomassa celulósica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um açúcar hexose é selecionado do grupo consistindo em glicose, galactose, manose e combinações dos mesmos.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é selecionado do grupo consistindo em levedura, Clostridium, Colon bacillus, Bacillus, Anaeromyxobacter, Alcaligenes, Bacteroides, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Pichia, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Saccharomyces, Streptomyces, Thermus thermophilus (Thermus), Thermotoga, Thermoanaerobacter, Klebsiella, Streptomycetaceae, Actinomicetaceae,

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3/3 pelo fato de que a preparação do meio de cultura compreende adicionar um componente selecionado do grupo consistindo em água, uma fonte de carbono, um componente de nutriente e combinações dos mesmos.