CN110042089B - 芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用 - Google Patents

芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芥蓝2‑含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用，所述Ba2ODD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明研究发现，通过RNAi沉默Ba2ODD1基因对芥蓝硫苷组分与含量的影响，验证Ba2ODD1基因在有害硫苷PRO合成中的功能。结果显示，Ba2ODD1基因RNAi转基因植株中PRO硫苷的含量降低，表明沉默Ba2ODD1基因的表达，可降低转基因材料中有害硫苷含量，创制得到有害硫苷含量低的芥蓝新材料，该材料可进一步用于培育有害硫苷含量低的芥蓝新品种。

Description

芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用。
背景技术
硫代葡萄糖苷(glucosinolates，简称硫苷)是广泛存在于白花目植物中的含硫次级代谢产物，到目前已发现120多种(Fahey et al.,2001)，其降解产物具有活跃的生化特性，能在食品中赋予产品特殊风味，对植物本身起到抗病虫作用。同时它还是化学保护剂，能防止多种癌症的发生(Halkier and Gershenzon,2006)。但除了对人类有益的硫苷外，几乎所有重要芸薹属蔬菜中都存在数量不等的2-羟基-3-丁烯基硫苷(PRO)，该硫苷是芸薹属蔬菜苦味的主要来源(Peterson et al.,2000)，其降解产物5-乙烯唑烷-2-硫酮能引起猪和家禽甲状腺肿(Hansen et al.,2008)。因此高含量的PRO严重影响芸薹属蔬菜的营养品质和潜在的商品价值(Liu et al.,2012)。PRO位于硫苷合成途径C4支链的最末端。一个位于GSK-OH位点的2-含氧依赖性双加氧酶基因(ODD)编码的酶催化3-丁烯基硫苷(NAP)羟基化形成PRO(图1)。目前芸薹属植物中还未见该基因在PRO合成中的功能分析。
芥蓝属芸薹属，是我国华南地区特色蔬菜之一，主要以花薹为产品，有着悠久栽培历史和丰富种质资源(张海峰,2006)。芥蓝具有很高的营养价值，含有丰富的维生素、矿物质和硫代葡萄糖苷等(何洪巨等,2002；张慎好等,2004；张海峰,2006)。大量研究表明芥蓝是抗癌硫苷4-甲基亚磺酰丁基硫苷(RAA)含量最丰富的蔬菜之一，某些芥蓝品种的RAA含量甚至超过具有良好保健和营养价值的青花菜。目前已经在芥蓝各基因型中鉴定到的硫苷约有14种(司雨等,2009；)，其中主要为3-丁烯基硫苷(NAP)，约占总硫苷的40％～60％。NAP与PRO同位于脂肪族硫苷合成途径C4支链(图1)，然而不同的基因型中NAP向PRO转化效率(PRO/NAP值)差异极大，发明人前期通过测定42个芥蓝基因型花薹中的硫苷组分，发现不同基因型PRO/NAP差异显著，最多达到50倍，说明在芥蓝不同基因型中可能存在不同的ODD表达模式；由于PRO含量过高会严重影响芸薹属蔬菜的营养品质和潜在的商品价值且PRO的降解产物会影响牲畜健康，因此如何找寻一种可有效降低芸薹属蔬菜中有害硫苷含量的方法已成为目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中还未见有可降低芸薹属蔬菜有害硫苷含量的方法的缺陷和不足，提供一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，并通过构建该基因的沉默表达载体，遗传转化至芸薹属蔬菜中，获得了有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种。
本发明的第一个目的是提供一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1。
本发明的第二个目的是提供一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶Ba2ODD1。
本发明的第三个目的是提供所述芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1在制备有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明在前期对42个芥蓝基因型硫苷组分及含量分析的基础上，以芥蓝基因型矮脚香菇为材料，克隆得到了芥蓝Ba2ODD1基因，大小为1070bp，编码358个氨基酸。
一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶Ba2ODD1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种含芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1的表达载体。
优选地，所述表达载体为Ba2ODD1基因RNAi干涉载体。
一种含上述表达载体的重组体。
本发明以芥蓝基因型矮脚香菇为材料，通过RNAi沉默Ba2ODD1基因在芥蓝中的表达量，查看Ba2ODD1基因表达对芥蓝硫苷组分与含量的影响，验证Ba2ODD1基因在有害硫苷PRO合成中的功能。结果显示，Ba2ODD1基因RNAi转基因植株中PRO硫苷的含量降低，表明沉默Ba2ODD1基因的表达，可降低转基因材料中有害硫苷含量，创制得到有害硫苷含量低的芥蓝新材料，该材料可进一步用于培育有害硫苷含量低的芥蓝新品种。由于芥蓝为芸薹属蔬菜，且芸薹属蔬菜中普遍存在数量不等的有害硫苷，因此，所述Ba2ODD1基因在制备有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种中的应用也在本发明保护范围内。
优选地，所述有害硫苷为2-羟基-3-丁烯基硫苷。
优选地，所述应用为降低、敲除或沉默Ba2ODD1基因在芸薹属蔬菜中的表达，从而得到有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种。
优选地，所述应用为构建Ba2ODD1基因的沉默表达载体，再遗传转化至芸薹属蔬菜中，获得有害硫苷含量低的芸薹属蔬菜新品种。
优选地，所述芸薹属蔬菜为芥蓝。
优选地，所述芥蓝为矮脚香菇芥蓝。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，所述基因大小为1070bp，编码358个氨基酸。通过RNAi沉默Ba2ODD1基因在芥蓝中的表达量，发现Ba2ODD1基因RNAi转基因植株中PRO硫苷的含量降低，表明沉默Ba2ODD1基因的表达，可降低转基因材料中有害硫苷含量，创制得到有害硫苷含量低的芥蓝新材料，该材料可进一步用于培育有害硫苷含量低的芥蓝新品种。
附图说明
图1为芸薹属植物中脂肪族硫苷合成途径C4支链简图；(参考Li et al.,2001；Liuet al.,2012)。
图2为Ba2ODD1基因PCR扩增片段电泳检测图；M：DL2,000DNA Marker；1：Ba2ODD1基因条带。
图3为Ba2ODD1基因重组RNAi载体构建示意图。
图4为Ba2ODD1基因RNAi载体转化植株PCR鉴定和基因表达分析；A：为干涉载体插入正义片段PCR检测阳性克隆；B：干涉载体插入反义片段检测阳性克隆；C：抗性植株PCR鉴定图；D：植株形态图；E：转化植株Ba2ODD1基因qPCR分析图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
矮脚香菇芥蓝由华南农业大学芥蓝课题组提供；大肠杆菌：DH5a，农杆菌：EHA105，本实验室保存；pFGC5941载体由本实验室保存。
PCR mix由Tag酶和dNTP等混合而成，购自Genestar公司，pMD19-T购自TakaRa公司，引物合成交由生工生物技术有限公司合成。2％CTAB抽提液：1g CTAB，5ml 1M Tris，2ml500mM EDTA，4.1g NaCl至50ml；X-gal:20mg/ml，用二甲基甲酰胺溶解；IPTG：200mg/ml，200mg IPTG溶解于0.8ml水中，定容至1ml，并经过无菌的0.22μm的滤膜过滤除菌；凝胶电泳所需的0.5×TBE：Tris 54g,硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定容至1L。
实施例1芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1的克隆
一、方法
1、芥蓝DNA和RNA的提取
采用改良的CTAB法(Murry&Thomas，1980)对芥蓝实验材料进行总DNA的提取；RNA的提取参照Magen公司的提取试剂盒(货号R4151-02)进行，并反转成cDNA；
2、以芥蓝矮脚香菇cDNA为模板，使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增，PCR扩增引物如SEQ ID NO.3～4所示：
Ba2ODD1-F：5’-ACTAAAAAAAAGGTTGGAGTCCAAGTGTAC-3’(SEQ ID NO.3)；
Ba2ODD1-R：5’-GGAAACACAAAGGAAACAAC-3’(SEQ ID NO.4)。
PCR反应体系为：2×PCR Mix：10μL，上游引物(10μM)：1μL，下游引物(10μM)：1μL，cDNA单链模板：0.5μL，双蒸水：7.5μL，共20μL。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，38个循环；72℃延伸5min，12℃保存。
用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并回收送测序。
二、结果
在芥蓝矮脚香菇cDNA中分离得到1个ODD片段，命名为Ba2ODD1，其电泳检测图如图2所示：所述Ba2ODD1基因大约为1100bp；同时测序结果显示，所述Ba2ODD1基因为1077bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2芥蓝Ba2ODD1基因RNAi干涉载体的构建
根据实施例1获得的芥蓝Ba2ODD1基因序列保守结构区段以及pFGC5941载体多克隆位点，设计338bp特异片段引物，载体结构示意图如图3。Ba2ODD1基因正义片段扩增引物Ba2ODD1-RNAi1和反义片段扩增引物Ba2ODD1-RNAi2如SEQ ID NO.5～8所示：
Ba2ODD1-RNAi1-F：5’-CGGATTTAAATGCAAGATCCAGAAGCGAGGA-3’(SEQ ID NO.5)；
Ba2ODD1-RNAi1-R：5’-CCGCCATGGGCTCAGGACACCGCGGGTAA-3’(SEQ ID NO.6)；
Ba2ODD1-RNAi2-F：5’-CATGGATCCGCAAGATCCAGAAGCGAGGA-3’(SEQ ID NO.7)；
Ba2ODD1-RNAi2-R：5’-CTACCCGGGGCTCAGGACACCGCGGGTAA-3’(SEQ ID NO.8)。
PCR反应体系为2×PCR Mix：15μL，上游引物(10μM)：1μL，下游引物(10μM)：1μL，cDNA单链模板：1μL，双蒸水：12μL，共30μL。
PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,38个循环；72℃延伸5min,
RNAi干涉载体的构建利用传统的双酶切体系，用Swa I和Nco I酶切pFGC5941载体和正义片段，对酶切后的载体和目的片段进行连接和转化，对鉴定正确的菌落摇菌提取质粒；用BamH I和Sma I对转入正义片段的质粒以及反义片段双酶切，对酶切后的载体和目的片段进行连接和转化，对鉴定正确的菌落摇菌提取质粒。
将鉴定到的阳性菌落提取质粒交由广州艾基生物技术有限公司测序，对获得的序列与原始序列进行比对，不存在碱基的缺失和突变，表明目的片段已经成功的插入到PFGC5941载体中，构建了Ba2ODD1基因重组RNAi载体。
实施例3农杆菌介导的遗传转化
1、方法
将实施例2构建成功的芥蓝Ba2ODD1基因RNAi干涉载体通过农杆菌介导，遗传转化至芥蓝中，以获得干涉Ba2ODD1抗性植株；具体方法与常规农杆菌转化方法相同，包括如下步骤：(1)种子的消毒和播种；(2)外植体的获得和预培养；(3)菌液的准备；(4)浸染；(5)抑菌培养；(6)初筛培养；(7)再筛培养；(8)生根培养；(9)炼苗移栽；(10)阳性苗的鉴定。
2、结果
对7000多个外植体进行浸染，除草剂草铵膦筛选浓度为10mg/L，最终获得45株抗性苗。根据除草剂草铵膦抗性基因bar基因序列，设计750bp左右的序列片段引物，其引物序列SEQ ID NO.9～10所示：
pFGC5941-1-F：5’-TATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’(SEQ ID NO.9)；
pFGC5941-1-R：5’-CCCCAACCCAAAAAGAGTGTGA-3’(SEQ ID NO.10)。
PCR反应体系为2×PCR Mix：10μL，上游引物(10μM)：1μL，下游引物(10μM)：1μL，cDNA单链模板：0.5μL，双蒸水：7.5μL，共20μL。
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，38个循环；72℃延伸5min。
提取抗性苗DNA，利用上述引物和PCR反应程序进行PCR鉴定以及电泳检测，其检测结果如图4-C所示，结果显示获得2株PCR阳性苗，编号RNAi-ODD-9及RNAi-ODD-26，阳性率为0.28％。对两株转基因植株与非转基因植株外表形态进行比较，叶型、株高、叶片数等方面并未发现有很明显的区别，(图4-D)。
对RNAi转基因植株进行qRT-PCR检测分析Ba2ODD1的基因表达量(图4-E)。比较分析表明，Ba2ODD1在RNAi-ODD-9中的表达水平均为对照的1/6，而在RNAi-ODD-26中，基因的表达水平为对照的0.625，都明显低于对照。
对RNAi转基因植株硫苷含量进行提取和HPLC检测，其结果如表1所示：PRO硫苷在非阳性苗中含量为0.074mg/g，而在RNAi-ODD-9中为0.04mg/g，在RNAi-ODD-26中为0.036mg/g，明显低于对照，而NAP在阳性苗和非阳性苗之间也存在明显的区别，在阳性苗中的含量分别为3.5和3.6mg/g显著高于WT的0.9mg/g。
表1 RNAi转基因植株硫苷含量
Figure BDA0001998660830000061
注：*p<0.05，**p<0.01
同时，本发明还构建了Ba2ODD1超表达载体，利用农杆菌介导法转化芥蓝，对Ba2ODD1功能进行鉴定。结果表明，在超表达Ba2ODD1植株中PRO/NAP的比值和PRO含量提高，而在RNAi植株中，PRO/NAP的比值和PRO含量降低，表明Ba2ODD1产物催化3-丁烯基硫苷向2-羟基-3-丁烯基硫苷转化，Ba2ODD1被敲除或沉默后，转基因植株中的有害硫苷PRO比值降低；表明可通过降低、敲除或沉默Ba2ODD1基因在芥蓝中的表达量，制得到有害硫苷含量低的芥蓝新材料。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1077
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 1
atggcgggaa gattcgaccg tgcgggtgag gtaaaagcat tcgacgagat gaaaatcggc 60
gtgaagggtc tagtcgacaa cggaatcaca aaaatcccac gcatattcca taacccgcaa 120
gccacaataa ctaaccctaa acctccttct accttgacta tcccaacgat agatctcgga 180
ggtggcgtgt tcgagtccac ggtcacaagg aaggaagtga ctgagaaggt gaaaggcgcc 240
atggagaagt ttggtttctt ccaggcgata aatcatggga ttccactcga ggtcttggag 300
aagatgaaag atgggatccg tgcgtttcac gcgcaagatc cagaagcgag gaaaaggttc 360
tatagccgtg aaaaaaccaa agcgattaag tataactcta actctgatct ctatgactct 420
cctgctgcga gctggagaga taccttaagt tgttttatgt tccctgatgt tcccaaaacc 480
gatgacttac cagacatttg tagggagatc atgttggact actcaaagag agtgatgatg 540
tttggggagt taatatttga gcttatatca gaatccttag ggctgaagcc taaccacctc 600
aaagaaatgg attgtgcaaa aggcttgttg atgctctgtc attgttaccc gcggtgtcct 660
gagccagacc taacgctcgg cgccactcag catacagaca gatctttcat cactatactt 720
cttcaagacc atattggagg acttcaagtt ctccatgatg gatactggat cgatgttcct 780
cctaatccta atgctcttat ccttaatgtt ggagatctcc tacagcttat aacgaatgac 840
aagtttgtga gtgtggagca tagagttttg gcaaatggag gtaaagagcc acgcacttcg 900
gttgcatctt tctttgtgca tcctccttca ataagtccga gagtatatgg acccattaaa 960
gagcttttgt ctgaagaaaa ccctcccaag tacagggaaa ccactccgga agcctccaac 1020
cactatgtgg ctagaaaacg tgatgggaac aattcgttga gccatttaag gatctga 1077
<210> 2
<211> 358
<212> PRT
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 2
Met Ala Gly Arg Phe Asp Arg Ala Gly Glu Val Lys Ala Phe Asp Glu
1 5 10 15
Met Lys Ile Gly Val Lys Gly Leu Val Asp Asn Gly Ile Thr Lys Ile
20 25 30
Pro Arg Ile Phe His Asn Pro Gln Ala Thr Ile Thr Asn Pro Lys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Leu Thr Ile Pro Thr Ile Asp Leu Gly Gly Gly Val Phe
50 55 60
Glu Ser Thr Val Thr Arg Lys Glu Val Thr Glu Lys Val Lys Gly Ala
65 70 75 80
Met Glu Lys Phe Gly Phe Phe Gln Ala Ile Asn His Gly Ile Pro Leu
85 90 95
Glu Val Leu Glu Lys Met Lys Asp Gly Ile Arg Ala Phe His Ala Gln
100 105 110
Asp Pro Glu Ala Arg Lys Arg Phe Tyr Ser Arg Glu Lys Thr Lys Ala
115 120 125
Ile Lys Tyr Asn Ser Asn Ser Asp Leu Tyr Asp Ser Pro Ala Ala Ser
130 135 140
Trp Arg Asp Thr Leu Ser Cys Phe Met Phe Pro Asp Val Pro Lys Thr
145 150 155 160
Asp Asp Leu Pro Asp Ile Cys Arg Glu Ile Met Leu Asp Tyr Ser Lys
165 170 175
Arg Val Met Met Phe Gly Glu Leu Ile Phe Glu Leu Ile Ser Glu Ser
180 185 190
Leu Gly Leu Lys Pro Asn His Leu Lys Glu Met Asp Cys Ala Lys Gly
195 200 205
Leu Leu Met Leu Cys His Cys Tyr Pro Arg Cys Pro Glu Pro Asp Leu
210 215 220
Thr Leu Gly Ala Thr Gln His Thr Asp Arg Ser Phe Ile Thr Ile Leu
225 230 235 240
Leu Gln Asp His Ile Gly Gly Leu Gln Val Leu His Asp Gly Tyr Trp
245 250 255
Ile Asp Val Pro Pro Asn Pro Asn Ala Leu Ile Leu Asn Val Gly Asp
260 265 270
Leu Leu Gln Leu Ile Thr Asn Asp Lys Phe Val Ser Val Glu His Arg
275 280 285
Val Leu Ala Asn Gly Gly Lys Glu Pro Arg Thr Ser Val Ala Ser Phe
290 295 300
Phe Val His Pro Pro Ser Ile Ser Pro Arg Val Tyr Gly Pro Ile Lys
305 310 315 320
Glu Leu Leu Ser Glu Glu Asn Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Thr Thr Pro
325 330 335
Glu Ala Ser Asn His Tyr Val Ala Arg Lys Arg Asp Gly Asn Asn Ser
340 345 350
Leu Ser His Leu Arg Ile
355
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 3
actaaaaaaa aggttggagt ccaagtgtac 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 4
ggaaacacaa aggaaacaac 20
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 5
cggatttaaa tgcaagatcc agaagcgagg a 31
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 6
ccgccatggg ctcaggacac cgcgggtaa 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 7
catggatccg caagatccag aagcgagga 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 8
ctacccgggg ctcaggacac cgcgggtaa 29
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 9
tatccttcgc aagacccttc ctc 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)
<400> 10
ccccaaccca aaaagagtgt ga 22

Claims (5)

1.一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶基因Ba2ODD1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种芥蓝2-含氧依赖性双加氧酶Ba2ODD1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.权利要求1所述Ba2ODD1基因在制备2-羟基-3-丁烯基硫苷低的芥蓝新品种中的应用，通过降低、沉默或敲除Ba2ODD1基因在芥蓝中的表达，从而得到有2-羟基-3-丁烯基硫苷含量低的芥蓝新品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为构建Ba2ODD1基因的沉默表达载体，再遗传转化至芥蓝中，获得有害硫苷含量低的芥蓝新品种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述芥蓝为矮脚香菇芥蓝。
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