CN112029778A - 马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13及其应用，属于基因工程技术领域，StWRKY13基因是筛选花青素合成相关转录组中差异表达基因得到。通过分析StWRKY13在不同表型马铃薯块茎中的表达模式发现，该基因的表达与块茎中花青素含量相关。通过构建超量表达载体，在烟草中过表达可以促进烟草叶片花青素的合成，说明马铃薯StWRKY13基因在花青素合成过程中起重要作用。因此，从马铃薯中分离StWRKY13基因并鉴定其在花青素合成过程中的作用，对于培育高花青素含量马铃薯新品种具有重要意义。

Description

马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13及其应用。

背景技术

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物，粮、菜、饲和工业原料兼用，营养丰富，适种区域广，增产潜力大，经济效益高。彩色马铃薯除了含有一般马铃薯所含有的淀粉、蛋白质、多种微量元素和氨基酸外，其抗氧化活性是白肉或黄肉马铃薯的3-5倍（Brown et al., 2003），其中抗氧化活性物质主要是花青素。花青素是植物次生代谢过程中产生的类黄酮物质，广泛存在于植物的花、果实、种子、茎、叶和根的细胞液中，使其呈现从红、紫到蓝等不同的颜色（Brenda, 2002）。花青素作为一种具有天然生物活性的植物色素，不仅具有强抗氧化性，其在营养器官中的合成和积累对植物适应和抵抗恶劣环境条件至关重要，可以增强植物对不同生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力（王鸿雪等，2020；Zhang et al., 2018; Chen et al., 2016）。花青素的合成途径比较明确，需要一系列酶的参与（Holton and Cornish, 1995; Liu et al., 2018），如CHS（查尔酮合酶基因）、CHI（查尔酮异构酶基因）、F3H（黄烷酮-3-羟基化酶基因）、F3’H（类黄酮3’-羟化酶）、F3’5’H（类黄铜3’-羟化酶）、FLS（黄酮醇合成酶）、DFR（二氢黄酮醇还原酶基因）、ANS（花青素合成酶）、3GT（类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶）、GST（谷胱甘肽S-转移酶）等。这些酶基因的表达主要受转录因子的调控，目前研究比较多的是由R2R3-MYB, basic helix-loop-helix (bHLH) 和 WD40-repeat (WDR) 蛋白组成的MBW蛋白复合体对花青素合成的调控（Grotewold, 2006）。

WRKY是植物体内最重要的转录因子之一，在植物生长、发育、抵抗生物与非生物胁迫等多种途径中发挥重要作用。近些年，有研究表明WRKY基因还参与花青素生物合成的调控网络。利用基因工程技术将油菜WRKY基因WRKY41-1转入到拟南芥中，转基因植株中花青素的含量与非转基因对照相比显著提高（Duan et al., 2018）。PyWRKY26可以与PybHLH3共同作用于PyMYB114的启动子，增强花青素合成相关结构基因的表达，从而调节红皮梨中花青素的合成与运输（Li et al., 2020）。这些结果说明了WRKY转录因子可以参与植物花青素的生物合成。目前WRKY基因在马铃薯花青素合成中的作用还未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的一在于提供马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13、包含该基因的重组载体以及包含该重组载体的转化体，目的二在于提供所述基因StWRKY13在培育高花青素含量的植物品种中的应用，目的三在于提供所述基因StWRKY13和StAN1协同作用在促进烟草叶片花青素合成和累积中的应用。本发明所述基因StWRKY13能显著增强马铃薯花青素合成，为育高花青素含量马铃薯（植物）新品种提供了基因和载体资源。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种重组载体，包含如上述所述的基因StWRKY13。

一种转化体，包含上述所述的重组载体。

本发明还请求保护所述基因StWRKY13在培育高花青素含量的植物品种中的应用。进一步地， 所述植物品种为马铃薯。

本发明还另外保护所述基因StWRKY13和StAN1协同作用在促进烟草叶片花青素合成和累积中的应用。

有益效果：

1、本发明涉及的StWRKY13基因是筛选花青素合成相关转录组中差异表达基因得到。通过分析StWRKY13在不同表型马铃薯块茎中的表达模式发现，该基因的表达与块茎中花青素含量相关。通过构建超量表达载体，在烟草中过表达可以促进烟草叶片花青素的合成，说明马铃薯StWRKY13基因在花青素合成过程中起重要作用。因此，从马铃薯中分离StWRKY13基因并鉴定其在花青素合成过程中的作用，对于培育高花青素含量马铃薯新品种具有重要意义。

2、StAN1是已知的马铃薯MYB转录因子，它可以促进马铃薯花青素的合成。在烟草中同时注射StAN1和StWRKY13，StWRKY13基因的表达量高于只注射StWRKY13的叶片。进一步检测花青素合成相关基因基因表达量，共同注射StAN1和StWRKY13的叶片中结构基因NtCHS、NtF3H和NtANS的表达量要显著高于单独注射StAN1或者StWRKY13的叶片，结果说明StWRKY13基因可以与StAN1相互协调，增强结构基因NtCHS、NtF3H和NtANS的表达量，从而促进烟草叶片花青素的合成与累积。

附图说明

图1是StWRKY13基因在不同表型块茎中的表达模式图；

图2是 StWRKY13基因在FT033-5和FT033-7 块茎中的表达模式图；

图3是转StWRKY13基因烟草叶片的表型鉴定对比图；其中，左图为注射2天时的叶片表型，右图为注射3天的叶片表型；1表示注射StAN2，2表示注射StAN2+StWRKY13，3表示注射StWRKY13；

图4是转StWRKY13基因烟草叶片的花青素含量

图5 转StWRKY13基因烟草叶片中StWRKY13基因的表达模式分析

图6 转StWRKY13基因烟草叶片中花青素合成相关基因的表达模式分析

具体实施方式

本发明的StWRKY13基因是从马铃薯FT033-5块茎cDNA中克隆得到。FT033-5块茎见光之前表皮是黄色，见光12小时块茎表皮颜色开始出现紫色（有花青素累积），随光照时间延长，花青素累积增加。分别利用光照处理0h，12h，72h的FT033-5块茎表皮样品进行转录组测序得到差异表达基因StWRKY13。利用不同表型块茎样品对StWRKY13基因进行表达模式分析，发现该基因在有色（红色和紫色）基因型中的表达量显著高于无色（白色和黄色）基因型。在烟草中超量表达研究基因功能，发现该基因可以促进花青素的合成。

本发明从马铃薯FT033-5块茎中克隆得到WRKY基因成员StWRKY13，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ORF序列全长1401bp，编码467个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将该基因在烟草中超量表达，能有效促进花青素的合成，提高植物花青素含量。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

1、StWRKY13基因的表达分析

本发明中的StWRKY13基因是在花青素合成相关转录组差异基因中得到，利用不同表型块茎对该基因进行表达分析，发现该基因在有色（红色和紫色）基因型中的表达量显著高于无色（白色和黄色）基因型。

8个不同表型块茎材料，Adirondack和Congo块茎表皮是紫色，Redsen、PA99P20-2和Huashu No.1块茎表皮是红色，Huaen No.1和393160-4块茎表皮是黄色。FT033-5和FT033-7块茎见光之前表皮是黄色，见光12小时块茎表皮颜色开始出现紫色，随光照时间延长，花青素累积增加。分别以光照处理0h，12h，24h，48h，72h的FT033-5和FT033-7块茎表皮样品和以上8个不同表型块茎表皮样品cDNA为模板对StWRKY13进行Real-time PCR表达分析。Real-time PCR按照TAKARA公司的SYBR Premix Ex ^TMTaq II 试剂盒进行操作。反应体系为： SYBR Mix 12.5 μl，正反向引物各1 μl，模板1 μl，灭菌蒸馏水补齐至25 μl。反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 S，60 ℃ 30 S，72 ℃ 30 S，40个循环；72 ℃ 5 min。StWRKY13正向引物为5’- ATGGAGGTCAATGAAACCGC -3’，反向引物为5’-ATCCACCGCACCAGCTAAGA -3’。Stef1α作为内参基因，正向引物为5’-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3’，反向引物为5’- TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3’。PCR反应在Bio-Rad 公司的iCycler iQ5 Real-time PCR 仪上进行。用2^-△△Ct法对不同样品中StWRKY13基因的相对表达量进行规一化。

检测StWRKY13基因在不同表型块茎皮中的表达模式，结果显示该基因在紫皮（Adirondack，Congo）和红皮（Redsen，PA99P20-2和Huashu No.1）中的表达量显著高于白皮（Huaen No.1和393160-4）（图1）。进一步利用光诱导变色材料（FT033-5和FT033-7）检测基因在块茎花青素合成过程中的表达模式。两个材料块茎皮见光之前是黄色，光照处理24小时可以观察到明显的花青素积累，块茎皮由黄色逐渐变成紫色，随着光照时间延长，紫色逐渐加深。StWRKY13基因在光照24小时内，随着光照时间的增长表达量逐渐升高（图2），说明在光照前期该基因的高表达可以提高块茎花青素含量。

2、StWRKY13基因克隆及表达载体构建

以马铃薯FT033-5光照处理72h的块茎表皮cDNA为模板，以5’- TAGTGGATCCAAAGAATTCATGGAGGTCAATGAAACCG-3’为正向引物，5’- CGAGAAGCTTTTTGAATTCCTATGATTTCTCTTTCATAGCTGAA-3’为反向引物，扩增StWRKY13基因。将基因片段利用ligation-free cloning kit试剂盒与植物表达载体pSAK-277（EcoRⅠ单酶切）重组，重组反应体系：3µL 目的基因回收产物，2µL pSAK-277(切)，2µL 5×Master Mix，3µL dH2O。将配好的反应体系放置在冰盒中冰浴30min进行重组，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经Spe抗生素筛选，挑取单克隆摇菌，阳性克隆送公司测序，形成植物表达载体pSAK-StWRKY13。提取pSAK-StWRKY13载体质粒，转化农杆菌GV3101，经Spe和Rif抗生素筛选，得到阳性克隆，为植物表达载体pSAK-StWRKY13农杆菌。

3、在烟草中超量表达StWRKY13基因

将含有重组植物表达载体pSAK-StWRKY13和pSAK-StAN1（Liu et al., 2016）的农杆菌划线培养在LB平板（含50 mg/L的Spe，50 mg/L的Rif）上，置于28℃条件下培养48 h；挑取单克隆在10 ml YEB液体培养基（附加相应的抗生素）中，28℃，250r/min条件下培养24 h；取5ml菌液转移至50 ml新鲜的LB液体培养基中，28℃，250r/min条件下继续培养，至菌液OD600达到0.6左右。转移菌液至离心管中，室温条件下，5000r/min离心10min，收集沉淀，重悬于MMA缓冲液（10mM MES，10mM MgCl2）。调OD600至0.4，室温静置2h。一次性注射器将溶液注射烟草叶片（生长4W左右），以pSAK277空载体为阴性对照，暗室培养12h，再移入26℃，16h光照和8h黑暗的光周期下进行培养。

StAN1是马铃薯MYB转录因子，它可以促进马铃薯花青素的合成。

4、超量表达StWRKY13基因烟草叶片花青素含量鉴定

烟草叶片注射2天时，可观察到同时注射StAN1和StWRKY13，叶片中有花青素积累，比单独注射StAN1的叶片红色更深（图3），花青素含量更高（图4）。说明StWRKY13可以协同StAN1促进花青素的合成。

收集注射叶片样品，采用分光光度PH示差法测定花青素含量：取0.5g左右样品与10ml 甲醇盐酸溶液（甲醇与0.05mol/L的盐酸按85:15的比例混匀）混匀，50度水浴2h。将浸提液移到另一15毫升离心管中，在滤渣中加入5ml甲醇盐酸溶液，50度水浴2h，合并2次提取液。提取液7000r/min离心10分钟，收集上清液，定容为25ml。上清液用注射器过滤膜（0.45um）过滤，用来做实验样品。1ml样品分别用3ml 0.025mol/L KCl-HCl 溶液（pH 1.0）和3ml 0.4mol/L 醋酸钠溶液（pH4.5）稀释，然后颜色反应30分钟。分别测定530和700 nm的吸光度。

5、超量表达StWRKY13基因烟草叶片中花青素合成相关基因表达模式分析

烟草叶片注射2天时，收集样品。以注射pSAK277空载体的叶片为对照，提取烟草叶片总RNA，用Real-time PCR技术检测花青素合成相关基因的表达。检测StAN1基因表达量的正向引物为5'- GGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTG-3’，反向引物为5'-TCACATCGTTAGCTGTCCTTCCTGG-3'；检测NtCHS基因表达量的正向引物为5'-TTGTTCGAGCTTGTCTCTGC-3’，反向引物为5'-AGCCCAGGAACATCTTTGAG-3'；检测NtF3H基因表达量的正向引物为5'-CAAGGCATGTGTGGATATGG-3’，反向引物为5'-TGTGTCGTTTCAGTCCAAGG-3'；检测NtANS基因表达量的正向引物为5'-TGGCGTTGAAGCTCATACTG-3’，反向引物为5'-GGAATTAGGCACACACTTTGC-3'；内参基因NtEF正向引物为5'-TGAACCATCCAKGACAGATTGG，反向引物为5'- TGGGCTCCTTCTCAATCTCCTT-3’。 PCR反应在Bio-Rad 公司的iCycler iQ5 Real-time PCR 仪上进行。用2^-△△Ct法对不同样品中基因的相对表达量进行规一化。结果显示，共同注射StAN1和StWRKY13的叶片中基因的表达量高于只注射StAN1的叶片，并且StWRKY13基因的表达量高于只注射StWRKY13的叶片（图5）。共同注射StAN1和StWRKY13的叶片中结构基因NtCHS、NtF3H和NtANS的表达量要显著高于单独注射StAN1或者StWRKY13的叶片（图6）。这些结果说明StWRKY13基因可以与StAN1相互协调，增强结构基因NtCHS、NtF3H和NtANS的表达量，从而促进烟草叶片花青素的合成与累积。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技大学

<120> 马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13及其应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 马铃薯

<400> 1

atggaggtca atgaaaccgc gaaaatagct atagttagac cagtagcttc aaggccaaga 60

tgtcctattt acaaatcttt ctctgagctc ttagctggtg cggtggatat atcatccaca 120

aatgttcatt ctgaaatggc gattaccgcc ataagaccaa agactgtaag gctgaagcct 180

gtaacaaacc atgctttagt tggagagcgt tcttcacagg ttgccatgtc tgaggcacca 240

gttggttgtc gatctgatta catcttgcaa tcggtagaga aacccaaggt tctgtataaa 300

cccatagcta aacttgcacc aaggaaaaca attcctctcc ttgaaaataa gggaagctct 360

gtatccgacc agcgacgaga aaaagctgag actaaggctg gtgttcaatc agcgaatgaa 420

gttaaacaac atcgcgacct gacgacagaa tctaaacgaa gtctcttagc aaaatcagga 480

gaggacaaaa aaatagtggg ttcaacaatt gtatcagaga gcacagaaga ggttccacag 540

tctttgatca acacaagtaa tgtcgatcgt cctagttatg atggatataa ttggagaaaa 600

tatggacaaa agcaagttaa aggaagtgaa tacccgagaa gttactataa gtgcacgcat 660

ctaaagtgtc ctgtgaaaaa gaaggttgaa agatcatatg atgctcagat tgcagaaatt 720

gtttacaggg gtgaacacaa ccacccaaag cctcagcctc caaagcgcaa cttgtcagac 780

gtacatgtgc gagcagccgt atgcaatgac acttctaaag aaacaaataa ccctgcatgg 840

agtaaccaac atcctcagac gagtgaagct tacgtctata ggatagaaaa tcagaatgat 900

tttgggttga ctatacattc agctcattct agcaaagcac catgctttta tgatcccatt 960

gcagctgcag gaatgcttac tgctgtcgga aattctgaag attccgctga aggaagtaaa 1020

aggttggaga ctacttgtga tgaaccaaaa actaaaagaa ggaaacttaa aggccaatgc 1080

aatagagcag gtacatcagg ggaaagtaca tttccttata taccaaacca aagtactact 1140

gactctgaaa ttaccgatga tggttttcgc tggagaaaat atggccagaa ggttgtcaag 1200

ggaagttcat atcccaggag ctattacaga tgcacaagtc ctaaatgcag catgcggaag 1260

tttgttgaaa gaaccatgga tgatccaaaa gcctttatta ctacatatga gggaaaacac 1320

aaccatgtcg ttccaaacag aagaccaaat tcagaggcgt ccaaaacgag ctcaaaatct 1380

tcagctatga aagagaaatc atag 1404

<210> 2

<211> 467

<212> PRT

<213> 马铃薯

<400> 2

Met Glu Val Asn Glu Thr Ala Lys Ile Ala Ile Val Arg Pro Val Ala

1 5 10 15

Ser Arg Pro Arg Cys Pro Ile Tyr Lys Ser Phe Ser Glu Leu Leu Ala

20 25 30

Gly Ala Val Asp Ile Ser Ser Thr Asn Val His Ser Glu Met Ala Ile

35 40 45

Thr Ala Ile Arg Pro Lys Thr Val Arg Leu Lys Pro Val Thr Asn His

50 55 60

Ala Leu Val Gly Glu Arg Ser Ser Gln Val Ala Met Ser Glu Ala Pro

65 70 75 80

Val Gly Cys Arg Ser Asp Tyr Ile Leu Gln Ser Val Glu Lys Pro Lys

85 90 95

Val Leu Tyr Lys Pro Ile Ala Lys Leu Ala Pro Arg Lys Thr Ile Pro

100 105 110

Leu Leu Glu Asn Lys Gly Ser Ser Val Ser Asp Gln Arg Arg Glu Lys

115 120 125

Ala Glu Thr Lys Ala Gly Val Gln Ser Ala Asn Glu Val Lys Gln His

130 135 140

Arg Asp Leu Thr Thr Glu Ser Lys Arg Ser Leu Leu Ala Lys Ser Gly

145 150 155 160

Glu Asp Lys Lys Ile Val Gly Ser Thr Ile Val Ser Glu Ser Thr Glu

165 170 175

Glu Val Pro Gln Ser Leu Ile Asn Thr Ser Asn Val Asp Arg Pro Ser

180 185 190

Tyr Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Gly

195 200 205

Ser Glu Tyr Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Leu Lys Cys Pro

210 215 220

Val Lys Lys Lys Val Glu Arg Ser Tyr Asp Ala Gln Ile Ala Glu Ile

225 230 235 240

Val Tyr Arg Gly Glu His Asn His Pro Lys Pro Gln Pro Pro Lys Arg

245 250 255

Asn Leu Ser Asp Val His Val Arg Ala Ala Val Cys Asn Asp Thr Ser

260 265 270

Lys Glu Thr Asn Asn Pro Ala Trp Ser Asn Gln His Pro Gln Thr Ser

275 280 285

Glu Ala Tyr Val Tyr Arg Ile Glu Asn Gln Asn Asp Phe Gly Leu Thr

290 295 300

Ile His Ser Ala His Ser Ser Lys Ala Pro Cys Phe Tyr Asp Pro Ile

305 310 315 320

Ala Ala Ala Gly Met Leu Thr Ala Val Gly Asn Ser Glu Asp Ser Ala

325 330 335

Glu Gly Ser Lys Arg Leu Glu Thr Thr Cys Asp Glu Pro Lys Thr Lys

340 345 350

Arg Arg Lys Leu Lys Gly Gln Cys Asn Arg Ala Gly Thr Ser Gly Glu

355 360 365

Ser Thr Phe Pro Tyr Ile Pro Asn Gln Ser Thr Thr Asp Ser Glu Ile

370 375 380

Thr Asp Asp Gly Phe Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys

385 390 395 400

Gly Ser Ser Tyr Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr Ser Pro Lys Cys

405 410 415

Ser Met Arg Lys Phe Val Glu Arg Thr Met Asp Asp Pro Lys Ala Phe

420 425 430

Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His Val Val Pro Asn Arg Arg

435 440 445

Pro Asn Ser Glu Ala Ser Lys Thr Ser Ser Lys Ser Ser Ala Met Lys

450 455 460

Glu Lys Ser

465

Claims (6)

1.马铃薯花青素合成调控基因StWRKY13，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种重组载体，包含如权利要求1所述的基因StWRKY13。

3.一种转化体，包含如权利要求2所述的重组载体。

4.根据权利要求1所述的基因StWRKY13在培育高花青素含量的植物品种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物品种为马铃薯。

6.根据权利要求1所述的基因StWRKY13和StAN1协同作用在促进烟草叶片花青素合成和累积中的应用。

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