CN114836559B - 与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的snp标记及引物和应用 - Google Patents

与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的snp标记及引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与西兰花中2‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记及引物和应用，该SNP标记位于拟南芥GSL‑OH基因在西兰花中的同源基因BolC3t13531H的第3个外显子中，在西兰花HDEM参考基因组C3染色体第5096634位置的碱基G或C，当碱基序列由G突变为C时，对应合成的氨基酸由甘氨酸变为精氨酸，使得2‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷含量显著提高。本发明针对西兰花GSL‑OH位点开发KASP分子标记，通过关联分析，获得了与2‑羟基‑3‑丁烯基芥子油苷紧密连锁的KASP标记，并将该标记成功应用于西兰花芥子油苷育种中。

Description

与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记及 引物和应用
技术领域
本发明涉及一种SNP标记，具体涉及一种与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记及引物和应用。
背景技术
西兰花(Brassica oleracea L.var.italica)中一些芥子油苷降解产生的异硫代腈酸盐具有人体有益的生物活性，特别是萝卜硫苷降解产生的异硫代腈酸盐即萝卜硫素，它不仅可以降低多种癌症的发生，如结肠癌、胰腺癌、膀胱癌等，还可以降低心血管疾病的发生。
十字花科植物中芥子油苷的组成主要受到基因型决定。芥菜、白菜、甘蓝、榨菜、萝卜和油菜中主要以烯基化的2-丙烯基芥子油苷、3-丁烯基芥子油苷和2-羟基-3-丁烯基芥子油苷为主，与萝卜硫素相比，这些修饰后的芥子油苷代谢产生的异硫代腈酸盐抗癌活性有限。特别是2-羟基-3-丁烯基芥子油苷水解产物唑烷-2-硫酮对人体和一些哺乳动物有害，主要是引起甲状腺肿大，因此在油菜育种中低硫苷育种成为必须育种目标。研究表明，植物体内萝卜硫苷在GSL-ALK的作用下合成3-丁烯基芥子油苷，然后经GSL-OH羟化酶催化产生2-羟基-3-丁烯基芥子油苷。
基于芥子油苷及其代谢产物的营养功能，国内外科学家开展了西兰花芥子油苷育种，其主要目标是提高西兰花中萝卜硫苷含量，降低或消除2-羟基-3-丁烯基芥子油苷。然而，大量研究发现，西兰花部分种质资源以及某些栽培种中含有负营养芥子油苷组分2-羟基-3-丁烯基芥子油苷。
目前，西兰花中芥子油苷的检测主要采用液相检测法，步骤较繁琐，检测时间长，极其不利于大规模种质筛选和育种。
发明内容
本发明的目的是提供一种与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记及引物和应用，解决了传统液相检测法西兰花中芥子油苷检测时间长的问题，通过KASP技术快速对西兰花进行检测，能够成功应用于西兰花高芥子油苷育种中。
为了达到上述目的，本发明提供了与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记，该SNP标记位于西兰花基因BolC3t13531H的第3个外显子中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，AGTACAGGGAAACCACTCCGGAAGCCTCCAACCACTATGTGGCTAGAAAAGGTGATGGGAACAATTCGTTGAGCCATTTAAGGATCTGAACAAAATTGGTG，其具有G/C多态性(序列中第51位)。
本发明的另一目的是提供与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记引物，该SNP标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示。
优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物的5'端分别增加通用接头序列。
优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物的5'端增加核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的通用接头序列；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物的5'端增加核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的通用接头序列。
本发明的另一目的是提供所述的SNP标记引物的应用，该应用选自以下任意一种：
(1)在西兰花分子标记辅助育种方面的应用；
(2)在西兰花改良育种中的应用；
(3)在西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量性状鉴定中的应用；
(4)在研究西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量方面的应用。
本发明的另一目的是提供一种筛选高2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量西兰花的方法，该方法包含：采用所述的SNP标记引物对待检测西兰花通过KASP技术进行基因分型：基因分型为GG的西兰花的2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量<基因分型为CG的西兰花的2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量<基因分型为CC的西兰花的2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量。
优选地，所述KASP技术，以待检测西兰花的基因组DNA为DNA模板，与所述的SNP标记引物和KASP Mastermix进行PCR扩增。
优选地，所述KASP Mastermix包含：FRET cassette荧光引物、ROX内参染料、KlearTaq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2。
本发明的另一目的是提供含有所述的SNP标记引物的KASP分型检测试剂盒。
本发明的与西兰花中芥子油苷含量相关的SNP标记及引物和应用，解决了传统液相检测法西兰花中芥子油苷检测时间长的问题，具有以下优点：
本发明基于拟南芥中芥子油苷生物合成研究和西兰花自有种质资源基因组重测序结果，利用高通量测序技术和含不同芥子油苷组分与含量变异的自然群体，通过候选基因关联分析挖掘潜在的与芥子油苷组分和含量相关的SNP，针对西兰花GSL-OH位点开发KASP分子标记，通过关联分析，获得了与2-羟基-3-丁烯基芥子油苷紧密连锁的KASP标记，并将该标记成功应用于西兰花芥子油苷育种中。
本发明的SNP标记位于拟南芥GSL-OH基因在西兰花中的同源基因BolC3t13531H的第3个外显子中，在西兰花HDEM参考基因组C3染色体第5096634位置的碱基G或C。当碱基序列由G突变为C时，对应合成的氨基酸由甘氨酸(GGU)变为精氨酸(CGU)，使得2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量显著提高。
附图说明
图1为2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量候选基因关联分析的Manhattan Plot图；x轴代表西兰花9条染色体的物理位置，单位为bp；y轴代表相应SNP的P值的log10的负对数。
图2为基于KASP技术的GSL-OH基因SNP引物的基因分布散点图；其中，横坐标为FAM荧光值，纵坐标为HEX荧光值。
图3为GSL-OH基因紧密连锁的SNP标记基因型在西兰花材料中的分布箱型图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1基于候选基因关联分析和KASP技术开发GSL-OH基因内分子标记
1、西兰花中芥子油苷相关SNP位点的筛选
本发明利用23份西兰花核心种质、野生种、近缘种等材料进行基因组重测序，与最新发表的西兰花参考基因组HDEM(www.genoscope.cns.fr/projet_BKL/cgi-bin/gbrowse/boleracea/)比对，获得数百万计的SNP位点，平均测序深度为20×。
根据西兰花参考基因组结构注释和基于拟南芥的功能注释信息，筛选位于西兰花中芥子油苷相关基因内的SNP位点。根据Brassica Database数据库(http:// brassicadb.cn/#/GlucosinolateGene/)提供的拟南芥芥子油苷基因共计52个，通过与HDEM参考基因组同源比对后，获得西兰花中芥子油苷基因241个(多个基因存在同源拷贝现象)。在241个基因的外显子区域获得1276个SNP位点，且这些SNP能引起基因的非同义突变，即可能对芥子油苷表型产生影响。
2、基于SNP位点的KASP标记开发
根据这些SNP对23份重测序材料的基因分型结果，发现同一基因内，或距离比较近的不同基因之间，常常存在相同的基因分型结果，即多个SNP对所有材料的基因分型结果一致。为了节省KASP标记开发和基因分型的成本，利用具有代表性的一个SNP代表多个SNP，开发成KASP标记，用于待测样本的基因分型。此外，在筛选代表性SNP的同时，考虑到KASP目标位点的前后50bp不能存在其它变异，且每条引物GC含量需要30％以上。最终，筛选获得108个KASP标记，用于候选基因关联分析，经过KASP标记与芥子油苷性状的关联分析，获得了GSL-OH基因内与2-羟基-3-丁烯基芥子油苷紧密连锁的1个KASP标记(GSL024)，该标记位于拟南芥GSL-OH基因在西兰花中的同源基因BolC3t13531H的第3个外显子中，在西兰花HDEM参考基因组C3染色体第5096634位置的碱基G或C。当碱基序列由G突变为C时，对应合成的氨基酸由甘氨酸(GGU)变为精氨酸(CGU)，使得2-羟基-3-丁烯基含量显著提高。
GSL024的引物，具体如下：
正向引物FAM的核苷酸序列为(SEQ ID NO.1)：
CCAACCACTATGTGGCTAGAAAAG；
正向引物HEX的核苷酸序列为(SEQ ID NO.2)：
CCAACCACTATGTGGCTAGAAAAC；
反向引物(SEQ ID NO.3)：
CCAATTTTGTTCAGATCCTTAA。
2条上游引物的5'端分别增加通用接头序列，具体如下：
正向引物FAM增加的通用接头序列为(SEQ ID NO.4)：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
正向引物HEX增加的通用接头序列为(SEQ ID NO.5)：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
上述引物对中两条正向引物在3’末端存在碱基差异性，可以竞争性地与目标位点结合，显示相应的FAM或HEX荧光，经信号放大后可判读目标位点基因型。
实验例2利用KASP标记对西兰花材料基因分型
1、DNA的提取与纯化
搜集和检测了西兰花材料110份，利用简化CTAB法提取DNA。
2、利用KASP技术进行基因分型
利用开发的芥子油苷相关KASP标记对收集材料进行基因分型，具体步骤如下：
(1)提取待测西兰花基因组DNA；
(2)向步骤(1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix(KASP引物混合液)和通用的KASP Mastermix，进行PCR扩增；其中，KASP Master mix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物、ROX内参染料、Klear Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2；KASP检测的PCR反应体系为：PCR预混液5μL、KASP引物混合液0.14μL(其中各引物的终浓度均为5nM)和20ng/μL模板DNA 5μL；PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61～55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环；
(3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
结果如图3所示，基因型为CC的材料有16份，平均值为147.9，其中有81.25％的材料超过36；基因型为CG的材料有7份，平均值为8.8，其中有71.4％的材料含量为0；基因型为GG的材料有87份，平均值为2.0，其中有97.7％的材料含量小于5。
3、西兰花材料的芥子油苷含量和组分检测
西兰花材料的芥子油苷含量和组分检测参考文献“Genotypic variation ofglucosinolates in broccoli(Brassica oleracea var.italica)florets from China”(Food Chemistry,2012,133(3),735-741)和“青花菜不同器官生物活性物质和营养成分的研究”(园艺学报,2010,37(1),59-64)，具体如下：
在10mL dd H2O中加适量冻干粉置于离心管中，沸水浴10min，离心将提取液吸出再加入10mL dd H2O，沸水浴10min，合并提取液，于-20℃冰箱保存。然后，将提取液通过DEAE-Sephadex柱吸附、洗脱得到纯化样品。将纯化样品过滤进行HPLC(WatersUSA)分析，以oNPG为内标(响应因子为0.7)以内标法计算芥子油苷的含量。HPLC条件为：检测波长226nm，流速为1.0mL·min-1，色谱柱为C18反相色谱柱。
4、KASP标记与芥子油苷性状的关联分析
基于表型数据和基因分型结果，运用Tassel 2.1软件的混合线性模型(mixedlinear model，MLM)程序进行西兰花芥子油苷和KASP标记的关联分析。
如图1所示，为2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量候选基因关联分析的ManhattanPlot图，如图2所示，为基于KASP技术的GSL-OH基因SNP引物的基因分布散点图，基于关联分析，获得了GSL-OH基因内与2-羟基-3-丁烯基芥子油苷紧密连锁的1个KASP标记，该标记位于拟南芥GSL-OH基因在西兰花中的同源基因BolC3t13531H的第3个外显子中，在西兰花HDEM参考基因组C3染色体第5096634位置的碱基G或C。当碱基序列由G突变为C时，对应合成的氨基酸由甘氨酸(GGU)变为精氨酸(CGU)，使得2-羟基-3-丁烯基含量显著提高。
实验例3 GSL-OH基因内2-羟基-3-丁烯基芥子油苷标记在分离群体中的验证
利用从荷兰瓦赫宁根大学收集的野生型甘蓝种Brassica villosa(CGN010)为母本，浙江省农科院蔬菜所自主培育的西兰花DH系B58-6为父本，构建了208个株系的F2群体。为检测本发明中标记的特异性和实用性，利用标记GSL024对亲本和F2群体进行检测和验证。野生型CGN010的基因型为CC，2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量为233.8μmol·g-1；B58-6的基因型为GG，2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量为0。在F2群体中，2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量与GSL024对群体的基因型结果有显著相关性，部分基因型和表型信息如下表1：
表1为2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量与GSL024对群体的基因型结果
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序 列 表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记及引物和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccaaccacta tgtggctaga aaag 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccaaccacta tgtggctaga aaac 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccaattttgt tcagatcctt aa 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agtacaggga aaccactccg gaagcctcca accactatgt ggctagaaaa ggtgatggga 60
acaattcgtt gagccattta aggatctgaa caaaattggt g 101

Claims (9)

1.与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记，其特征在于，该SNP标记位于西兰花基因BolC3t13531H的第3个外显子中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，突变位置为序列中第51位，其具有G/C多态性。
2.与西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量相关的SNP标记引物，其特征在于，该SNP标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示。
3.根据权利要求2所述的SNP标记引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物的5'端分别增加通用接头序列。
4.根据权利要求3所述的SNP标记引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物的5'端增加核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的通用接头序列；核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的引物的5'端增加核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的通用接头序列。
5.如权利要求2-4中任意一项所述的SNP标记引物的应用，其特征在于，该应用选自以下任意一种：
（1）在西兰花分子标记辅助育种方面的应用；
（2）在西兰花改良育种中的应用；
（3）在西兰花中2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量性状鉴定中的应用。
6.一种筛选高2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量西兰花的方法，其特征在于，该方法包含：
采用如权利要求2-4中任意一项所述的SNP标记引物对待检测西兰花通过KASP技术进行基因分型：基因分型为GG的西兰花的2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量<基因分型为CG的西兰花的2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量<基因分型为CC的西兰花的2-羟基-3-丁烯基芥子油苷含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述KASP技术，以待检测西兰花的基因组DNA为DNA模板，与如权利要求2-4中任意一项所述的SNP标记引物和KASP Master mix进行PCR扩增。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述KASP Master mix包含：FRETcassette荧光引物、ROX内参染料、Klear Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2。
9.含有如权利要求2-4中任意一项所述的SNP标记引物的KASP分型检测试剂盒。
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