CN114214450A - 一种西兰花花青素合成酶基因的snp_033分子标记及其应用 - Google Patents

一种西兰花花青素合成酶基因的snp_033分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种西兰花花青素合成酶基因的SNP_033分子标记及其应用。本发明的西兰花花青素合成酶基因的的SNP_033分子标记，位于甘蓝基因组TO1000的7号染色体的52,342,033位置，该处碱基为C的西兰花花球表现为绿色，该处碱基为G的西兰花花球表现为紫色。本发明还提供了用于检测SNP_033分子标记的特异性引物组合。本发明提供的用于西兰花花青素合成酶基因的SNP_033分子标记及特异性引物组合，可用于西兰花辅助选择育种，对于加快西兰花育种的遗传改良进程，对于提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

Description

一种西兰花花青素合成酶基因的SNP_033分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物多态性领域，具体的说涉及一种西兰花花青素合成酶基因的SNP_033分子标记及其应用。
背景技术
花青素，属于生物类黄酮类物质，是构成植物颜色的主要水溶性色素之一。花青素在植物中扮演着不同的角色，包括提供对紫外线和病原体的保护，以及吸引动物传粉者。作为饮食成分，提供了抗氧化剂，降低了冠心病的发病率，并显示出抗癌活性，对人类健康有好处。
西兰花(Brassica oleracea var.italica)是在世界各地被广泛种植为经济作物，颜色为明亮的绿色或紫色。然而，由于缺乏新的天然突变体，人们对富含花青素的西兰花花球很感兴趣。花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)是类黄酮生物合成的重要催化酶，位于花色苷合成通路末端，它是酮戊二酸依赖型的双加氧酶，能催化无色花色素转变成花青素。花青素合成酶基因ANS2是目前发现参与果实花青素积累的重要基因位点。
单个核苷酸变异(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)在物种的基因组上广泛存在，包括：单个碱基的转换或颠换、单个碱基(片段)插入或是缺失等形式，针对这些多态性位点逐步兴起了新一代的SNP分子标记技术。针对控制目标性状的基因开发功能SNP标记，将性状与基因型相关联，进而实现高效、精准育种。
因此，开发适用于西兰花颜色与花青素紧密连锁的SNP分子标记，有助于快速、有效地检测西兰花的花青素基因，有助于富含花青素的西兰花育种。
发明内容
本发明首先提供了一种西兰花花青素合成酶基因(ANS2)的SNP_033分子标记，该SNP分子标记位于甘蓝基因组TO1000的7号染色体52,342,033位置(ANS2基因的第184位点处)，该处碱基为C的西兰花花球表现为绿色，该处碱基为G的西兰花花球表现为紫色。
所述的SNP_033分子标记，其序列如SEQNO.1所示，SEQNO.1的序列为ANS2 基因的前328位碱基序列：其中，第184位点处的碱基r为c或g，即为本发明的SNP 分子标记。SEQNO.1：
atggttgaagtggaaagagtcgagaatttagcaaagagcggaatcaaatcgatcccaaaagaatacatccgtcca aaagaagagctggagagcatcaacgacgttttccaagaagagaagaaagaagacggccctcaagtccccaccatc gacctacaaaacatcgagtccgaagacgaaacgrtccgtgaccaatgcatagaggagctcaagaaggctgctatg gactggggagtgatgcatctgatcaaccacggcgtaccggttgacctgatggagcgtgtgaagaaagcaggagaa gagttcttcggtttgcccgtggaggaga
本发明还提供了用于检测上述SNP分子标记的特异性引物组合，包括：
(1)两条特异引物Primer X和Primer Y，Primer X的序列如SEQNO.2所示，PrimerY的序列如SEQNO.3所示；
(2)一条通用引物Primer C，PrimerC的序列如SEQNO.4所示
表1 SNP_033标记引物序列表1
Figure BDA0003414801060000021
本发明还提供了上述特异性引物组合在预测西兰花花球颜色性状中的应用(还提供了上述特异性引物组合在西兰花育种中的应用)，该应用包括如下步骤：
提取西兰花苗期叶片的基因组DNA；
以西兰花苗期叶片基因组DNA为模板，利用上述表1的特异性引物组合进行KASP反应检测；
其中G:G为紫色花球纯合基因型，C:C为绿色花球纯合基因型，G:C为杂合型；
应用上述方法可以检测西兰花苗期叶片DNA的基因型，用于西兰花苗期选育；
其中KASP反应测试在LCG SNPline基因分析平台上进行；具体步骤为：在微孔板反应板中加入1.0-1.5μL的20ng/μL DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液； PCR扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃ 60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共 26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar。
本发明还提供了上述特异性引物组合用于检测所述SNP-033分子标记的方法，该方法为：
应用上述特异性引物组合对待测西兰花基因组DNA进行KASP检测，其中G:G为紫色花球纯合基因型，C:C为绿色花球纯合基因型，G:C为杂合型；
本发明还提供了包含所述特异性引物组合的试剂盒。
本发明还提供了上述试剂盒在西兰花育种中的应用；所述的应用实际上是应用上述特异性引物组合检测待测西兰花基因的SNP-033位点。
本发明的创新点为：
本发明提供的用于检测西兰花花青素的SNP分子标记SNP-033以及用于检测该分子标记的特异性引物组合，可用于西兰花花青素含量，辅助选择育种，对于加快西兰花育种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。本发明的用于检测西兰花花青素SNP分子标记的方法，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。
本发明提供的SNP-033分子标记，为花青素合成酶基因ANS2的基因位点，位于甘蓝基因组TO1000的7号染色体，为功能获得性突变，呈显性，含有此突变基因，植株花球能积累大量花青素呈紫色。因此，ANS2相应分子标记的研究开发对苗种选育富含花青素西兰花，缩短育种周期，提高紫色西兰花育种效率具有重要意义。
附图说明
图1西兰花花青素合成酶基因ANS2所在的7号染色体的紧密连锁区间
其中，左边为连锁群的遗传距离(CM)；右边为标记的编号，BoPur7.1为花青素基因所在位点
图2与西兰花花青素合成酶基因ANS2紧密连锁的SNP分子标记SNP-033在群体中的基因分型测试图
其中G:G为紫色花球纯合基因型，C:C为绿色花球纯合基因型，G:C为杂合型，NTC为无模板对照
图3 F2群体的西兰花球颜色的表型鉴定情况
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下列实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
利用田间获得的紫色花球西兰花材料自交系BT126为母本，绿色花球西兰花材料自交系SN60为父本(BT126和SN60均来自上海奉贤庄行农场)，母本BT 126为高花青素含量，花球颜色为紫色，父本SN 60为低花青素含量，花球颜色为绿色。
通过杂交、自交得到F2分离群体302个单株，通过田间表型鉴定，根据花球紫色颜色的深浅，将植株花球颜色等级分为1级(绿色)、2级、3级、4级、5级(深紫)。F2 群体的302个单株的花球颜色分级情况为：1级63株，2级79株，3级75株、4级52 株和5级33株。
将F2群体花球颜色等级为1级(绿色)的30个单株构建极端基因池LAB-pool，花球颜色等级5级的30个单株构建基因池HAB-pool进行基因组的重测序，然后进行 BSA定位分析，定位到2个QTL，分别命名为BoPur7.1和BoPur9.1，其中BoPur7.1 在第7号染色体区域36M-44M的区域。
图1西兰花花青素基因ANS2所在的7号染色体的紧密连锁区间，左边为连锁群的遗传距离(CM)；右边为标记的编号，BoPur7.1为花青素基因所在位点。
实施例2
根据实施例1中的亲本多态性SNP位点(甘蓝基因组TO1000的7号染色体52,342,033 位置)进行引物设计，用于检测SNP分子标记的引物组合为：
两条特异性引物：
Primer X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATCGAGTCCGAAGACGAAACGG
Primer Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATCGAGTCAGAAGACGAAACGC
以及一条通用引物：
Primer C：CATCACTCCCCAGTCCATAGCA
引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例3开发的SNP分子标记SNP_033的KASP反应的检测
1、采用CTAB法，从西兰花叶片中提取基因组DNA。
(1)取适量西兰花叶片鲜样或冻样，放入2ml离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；
(2)加入750μL CTAB溶液，震荡均浆，65℃震荡温浴0.5-1h；
(3)冷却至室温，在通风橱中加入700μL氯仿：异戊醇(24：1)，手动轻轻上下颠倒混匀 15～20min；
(4)12000rpm离心12min，取上清液400μL至新的1.5mL离心管中；
(5)向上清液中加入2倍体积(800μL)的冰乙醇，盖上离心管盖子，再轻轻摇晃几下，将冰乙醇与上清液充分混匀，放入-20℃的冰箱中静置20～30min；
(6)将静置后的离心管在12000rpm下离心5min，再倒掉上清液，加入500μL 75％的乙醇后静置5～6min，10000rmp离心3min，弃上清；
(7)加入100mL H2O,溶解备用。
2、KASP反应测试：下列实施例中使用的LCG SNPline基因分型平台与其配套试剂和耗材均购于英国LCG公司。
其中KASP反应测试在LCG SNPline基因分析平台上进行；具体步骤为：在微孔板反应板中加入1.0-1.5μL的20ng/μL DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见如下表2；PCR扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件为：94℃15min；95℃ 20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec， 57℃60sec，共26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar。
表2花青素合成基因ANS2的SNP分子标记的PCR扩增反应体系
Figure BDA0003414801060000051
结果参见图2，为与西兰花花青素ANS2基因紧密连锁的SNP分子标记SNP_033 在群体中的基因分型测试图；其中G:G为紫色花球纯合基因型，C:C为绿色花球纯合 基因型，G:C为杂合型，NTC为无模板对照。
实施例4
对本发明中的SNP分子标记SNP_033进行表型验证，具体步骤如下：
1)将F2群体植株种在温室大棚的，待花球成熟，对每个单株的表型鉴定至少三次。花球颜色从绿色到紫色显示颜色分布，分为5个等级，分别从1到5：1-绿色，2-微紫色，3-浅紫色，4-稍深紫色和5-紫色
2)根据调查的花球颜色，统计F2群体花球颜色的分布情况。参见图3，为F2群体的花球颜色的表型鉴定情况：1级63株，2级79株，3级75株，4级52株，5级33 株。
3)参照实施例3的KASP方法，检测紫色花球西兰花亲本BT126、绿色花球西兰花亲本SN60，以及杂交的F2分离群体单株花球颜色的基因型，具体的数据结果如表3。 F2分离群体单株表型鉴定结果与基因分型结果高度对应，在F2群体中与紫色花球西兰花亲本BT126的纯合基因型G:G一致的有7株1级，14株2级，25株3级，19株4 级，27株5级；与绿色花球西兰花亲本SN60纯合基因型C:C一致的有31株1级，45 株2级，14株3级，5株4级，2株5级，G:C碱基型为杂合型植株共113株，其中25 株1级，20株2级，36株3级，28株4级，4株5级。
4)对F2群体的基因型和表型相关性验证结果进行t-test分析，结果为p＝0.0077(p <0.05)，显示SNP_033分子标记与西兰花的花球颜色紧密相关。
表3F2群体基因型与表型对比
Figure BDA0003414801060000061
Figure BDA0003414801060000071
Figure BDA0003414801060000081
实施例5
SNP_033标记在自然群体检测结果，具体见表4。其中40株不同材料编号的西兰花均来自上海奉贤庄行种植基地的西兰花自然群体。
群体单株表型鉴定结果与基因分型结果高度对应，紫色西兰花为纯合基因型G:G，绿色西兰花分别为纯合基因型C:C，低温条件下花球变紫，有花青素合成，基因型有分离。
表4SNP_033标记在自然群体检测结果
Figure BDA0003414801060000091

Claims (7)

1.一种西兰花花青素合成酶基因的SNP_033分子标记，其特征在于该SNP分子标记位于甘蓝基因组TO1000的7号染色体52,342,033位置，该处碱基为C的西兰花花球表现为绿色，该处碱基为G的西兰花花球表现为紫色；
所述的SNP_033分子标记，其序列如SEQNO.1所示，其中，第184位点处的碱基r为c或g，即为本发明的SNP分子标记。
2.一种用于检测权利要求1所述SNP_033分子标记的特异性引物组合，包括：
(1)两条特异引物Primer X和Primer Y，Primer X的序列如SEQNO.2所示，Primer Y的序列如SEQNO.3所示；
(2)一条通用引物Primer C，PrimerC的序列如SEQNO.4所示。
3.权利要求2所述特异性引物组合在西兰花育种中的应用，该应用包括如下步骤：
提取西兰花苗期叶片的基因组DNA；
以西兰花苗期叶片基因组DNA为模板，利用特异性引物组合进行KASP反应检测；
其中G:G为紫色花球纯合基因型，C:C为绿色花球纯合基因型，G:C为杂合型。
4.根据权利要求3所述的特异性引物组合在西兰花育种中的应用，
其中KASP反应测试在LCG SNPline基因分析平台上进行；具体步骤为：在微孔板反应板中加入1.0-1.5μL的20ng/μL DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液；PCR扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件为：94℃15min；95℃20sec，65-56℃60sec，每个循环退火延伸温度降低0.8℃，共10个循环；94℃20sec，57℃60sec，共26个循环；反应完成后利用扫描仪Pherastar。
5.一种权利要求2所述的特异性引物组合用于检测权利要求1所述SNP-033分子标记的方法，该方法为：
应用特异性引物组合对待测西兰花基因组DNA进行KASP检测，其中G:G为紫色花球纯合基因型，C:C为绿色花球纯合基因型，G:C为杂合型。
6.一种包含权利要求2所述特异性引物组合的试剂盒。
7.权利要求6所述的试剂盒在西兰花育种中的应用；所述的应用是应用权利要求2所述的特异性引物组合检测待测西兰花基因的SNP-033分子标记。
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