CN108588273B - 玉米隐性核雄性不育突变基因ms30的功能标记及其应用 - Google Patents

玉米隐性核雄性不育突变基因ms30的功能标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种玉米核雄性不育基因ms30的功能标记、功能标记开发方法及其应用。本发明根据突变体基因ms30的突变位点设计了包括但不限于ms30‑IN1、ms30‑IN2、ms30‑IN3、ms30‑IN4和ms30‑IN5等五个功能标记，其中ms30‑IN1、ms30‑IN2、ms30‑IN3和ms30‑IN4四个功能标记能够特异性检测玉米突变体ms30‑6028及由其转育的玉米不育材料中的突变基因ms30，并能同时区分野生型Ms30基因和突变型ms30基因。而功能标记ms30‑IN5为野生型Ms30基因特异的显性标记。利用本发明设计的功能标记能够准确检测和标记玉米核雄性不育基因ms30或可育基因Ms30的等位基因型，可用于雄性不育株系的鉴定、目标单株的筛选，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值，对提高玉米杂交育种和制种效率、保障制种质量等方面具有重要意义。

Description

玉米隐性核雄性不育突变基因ms30的功能标记及其应用
技术领域
一般地，本发明属于作物分子育种、分子生物学和基因工程领域。具体涉及一种玉米隐性核雄性不育基因ms30的功能标记、功能标记开发方法及与应用。
背景技术
植物雄性不育（male sterility，MS）是指在高等植物中，雄性器官发育异常，无法产生有功能的雄配子（花粉），但雌性器官发育正常，能接受正常雄配子而受精结实，并能将该不育性遗传给后代的现象。
玉米是重要的粮食作物，其雄性不育材料对玉米的雄花发育机理研究、遗传育种应用、杂种优势研究和应用方面都有重要价值。玉米雄性不育按照不育性遗传方式的差异，可分为3类：细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和质核互作雄性不育，其中细胞核雄性不育还可分为显性核不育和隐性核不育，而且以后者为主。由于细胞质母体遗传的原因，细胞质不育基因的F1不能自交结实，因而不能在育种和生产上利用；利用常规杂交育种技术，细胞核雄性不育系的保持和繁殖存在困难，也不能在育种和生产上有效利用；质核互作不育基因，理论和实践上都可以被育种利用，但是该类基因的广泛利用会导致杂交种细胞质单一化，易受专一性病原小种的侵染而导致杂交玉米生产存在巨大的风险。因此，目前国内外玉米杂交育种的父母本大多是可育的自交系，杂交制种时需要对母本进行人工或机械除雄，大大增加了制种成本，同时杂交种纯度也难以得到保障。
随着现代生物技术的快速发展，利用作物分子设计技术，并结合常规育种方法，有望将隐性核不育基因有效利用起来。为了能够使核不育基因得到育种利用，必须找到核不育后代早期诊断不育性的标记性状从而尽早区分核不育系。因此，从发现玉米隐性核不育材料时起，人们就利用传统育种技术途径，对核不育基因进行了多种标记性状的探索研究，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。分子标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特定DNA片段。随着分子标记技术的发展，通过定位克隆获得与玉米重要性状连锁的分子标记或者功能性共分离分子标记，对玉米的基因型鉴定、品种的遗传背景选择、目标单株筛选、品种的遗传改良和纯度鉴定以及克隆雄性器官分化控制基因等方面有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一组能够准确检测和标记玉米隐性核雄性不育基因ms30的分子标记，所提供的分子标记是根据不育突变体的基因突变位点设计，属于功能性共分离分子标记，与不育基因ms30共分离，可用于植株的育性等位基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。
本发明的目的之一：在于提供一种由于育性相关基因Ms30突变获得的完全雄性不育材料。
本发明的目的之二：在于提供这种突变材料的基因突变位点。具体的，其基因突变是由于+1214位点开始的一段464bp的序列缺失引起。
本发明的目的之三：在于提供根据上述ms30突变位点开发ms30功能性分子标记的方法。
本发明的目的之四：在于提供根据上述突变位点开发的一组功能性分子标记，包括但不限于ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5。其中ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4四个功能标记都能同时检测突变等位基因ms30和野生型等位基因Ms30，ms30-IN5是野生型Ms30基因的显性标记。
进一步地，开发的分子标记ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5以及其它类似的功能性共分离标记包括但不限于以下9条引物序列：
ms30-IN-1F：ACGAGCTGATCCAAGGGTAC
ms30-IN-1R：CGTCTCCTCGAACCCTGTAA
ms30-IN-2F：GGTTTAGAACATCACATAGTTCGGAT
ms30-IN-2R：ACGCACCGTTCGTAGTCAT
ms30-IN-3F：CATCTCCAACCCGACCACGTATG
ms30-IN-3R：CCTCGAACCCTGTAATTAGAG
ms30-IN-4F：CACGTATGGTAACCTTTCGCTCCA
ms30-IN-5F：AATTGCCCAGCGACTACCGT
ms30-IN-5R：CAGTGCTAAAGGCCATTGAAAA
其中四条正向引物序列ms30-IN-1F、ms30-IN-2F、ms30-IN-3F、ms30-IN-4F根据ms30基因的缺失序列的上游序列设计，正向引物序列ms30-IN-5F根据缺失序列内部序列设计，而四条反向引物序列ms30-IN-1R、ms30-IN-2R、ms30-IN-3R、和ms30-IN-5R根据缺失序列下游序列设计。分子标记ms30-IN1（ms30-IN-1F/ms30-IN-1R）可分别从野生型Ms30基因和突变型ms30基因中扩增出859bp和396bp的条带，分子标记ms30-IN2（ms30-IN-2F/ms30-IN-2R）可分别从野生型Ms30基因和突变基因ms30中扩增出1013bp和549bp的条带，分子标记ms30-IN3（ms30-IN-3F/ms30-IN-3R）可分别从野生型Ms30基因和突变基因ms30中扩增出739bp和276bp的条带，分子标记ms30-IN4（ms30-IN-4F/ms30-IN-2R）可分别从野生型Ms30基因和突变基因ms30中扩增出1076bp和612bp的条带，因此，分子标记ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4都能够特异性检测野生型Ms30基因和突变型不育基因ms30。而分子标记ms30-IN5（ms30-IN-5F/ms30-IN-5R）只能从野生型Ms30基因中扩增出747bp的条带，在突变基因ms30中无扩增产物，可作为野生型Ms30基因的显性标记。
本发明的目的之五：在于提供一种利用上述突变材料开发和选择不同遗传背景下的玉米雄性不育材料的方法。具体的，利用带有上述突变基因ms30的材料做母本，不同优良遗传背景的自交系作为父本，杂交后代与父本自交系连续回交多代，每次回交之前用标记选择带有ms30基因的单株，以获得不同遗传背景下的玉米ms30雄性不育材料，提高杂种优势的利用范围。
本发明的目的之六：在于在开发和选择不同遗传背景下ms30雄性不育材料过程中，利用上述开发的分子标记进行分子标记辅助选择，加快玉米不育材料的选育进程和提高选择效率。
本发明的目的之七：在于利用上述开发的分子标记在上一批种子收获后或下一代苗期快速检测玉米Ms30等位基因，筛选特定ms30雄性不育单株。
本发明的目的之八：在于上述开发的功能性分子标记在玉米ms30雄性不育亲本纯度鉴定中的应用，以及检测玉米杂交种是否带有ms30不育等位基因，以判断杂交种的纯度。
附图说明
图1为玉米Ms30野生型（左）和ms30突变体ms30-6028（右）的雄穗、小花（花药）表型比较图及花粉碘-碘化钾染色对比图。
图2为玉米Ms30野生型和ms30-6028突变型基因的结构示意图。ms30-6028的突变基因ms30在+1214位点开始有一段464bp序列的缺失。
图3为本发明中开发的分子标记ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5涉及到的9条引物在Ms30基因中的位置示意图（3A）、玉米Ms30与ms30 DNA序列比对图中的具体位置标识（3B）以及各标记名称对应的引物序列及扩增产物大小（3C）。
图4为分子标记ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5的可行性验证。利用Ms30/Ms30纯合野生型（B73）、Ms30/ms30杂合型（H）和ms30/ms30纯合突变型材料（S）进行五个功能性分子标记的多态性验证。ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3和ms30-IN4在Ms30/Ms30纯合野生型（B73）DNA中分别能扩增出859bp、1013bp、739bp、1076bp的条带，在ms30/ms30纯合突变型材料（S）DNA中分别扩增出396bp、549bp、276bp、612bp的条带，而在Ms30/ms30杂合型（H）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。ms30-IN5为Ms30基因的显性标记，能够在Ms30/Ms30纯合野生型（B73）和Ms30/ms30杂合型（H）材料中扩增出747bp的条带，而在ms30/ms30纯合突变型材料（S）中无扩增产物。
图5为同时利用分子标记ms30-IN1和ms30-IN2对ms30的杂合型材料Ms30ms30自交获得的F2群体的Ms30等位基因进行检测的部分电泳结果。每个材料的A泳道为ms30-IN1的检测结果，B泳道为ms30-IN2的检测结果。ms30-IN1和ms30-IN2分别只检测出859bp和1013bp的材料为纯合可育系（Ms30/Ms30），标记为F，分别只检测出396bp和549bp的材料为纯合不育系（ms30/ms30），标记为S，检测出两条带的为杂合可育型（Ms30/ms30），标记为H。两个标记对每个材料的检测结果都一致。经过后期育性鉴定发现，材料8、11、18、19、23、24、30、31、32、33和34检测为完全雄性不育，而其它材料的植株都雄性可育，与苗期基因型鉴定结果一致，证明共分离标记的有效性。
图6为利用分子标记ms30-IN3对ms30的杂合型材料Ms30ms30自交获得的F2群体的Ms30等位基因进行检测的部分电泳结果。其中，1、10、12、19和22号材料的DNA中只能扩增出739bp的条带，为纯合可育系（Ms30/Ms30）标记为F；4、9、11、13、15、18、21和23号材料的DNA中只能扩增出276bp的条带，为纯合不育系（ms30/ms30），标记为S；而2、3、5、6、7、8、14、16、17、20和24号材料的DNA中能同时扩增出739bp和276bp的条带，为杂合可育型（Ms30/ms30）材料，标记为H。经过后期育性鉴定发现，在苗期基因型鉴定为纯合不育的材料检测为完全雄性不育，而其它材料的植株都雄性可育，与基因型鉴定结果一致，证明共分离标记的有效性。
图7为同时利用分子标记ms30-IN4和ms30-IN5对杂合型材料Ms30ms30自交获得的F2群体的Ms30等位基因进行检测的部分电泳结果。功能性标记ms30-IN4在纯合可育系（Ms30/Ms30）DNA中能够扩增出1076bp的条带，在纯合不育系（ms30/ms30）DNA中能够扩增出612bp的条带，而在杂合可育型（Ms30/ms30）材料的DNA中能同时扩增出1076bp和612bp的条带。ms30-IN5为野生型Ms30基因的显性标记，只能在纯合可育系（Ms30/Ms30）和杂合可育系（Ms30/ms30）DNA中扩增出747bp的条带，而在纯合不育系（ms30/ms30）DNA中没有扩增产物。结果表明，分子标记ms30-IN4和ms30-IN5对所检测的材料获得的结果均一致，图7中1、5、8、13、14、15、17和23号材料在ms30-IN4标记检测中只能检测到612bp的条带，为纯合不育系（ms30/ms30），在ms30-IN5的检测中没有扩增条带，标记为S。而ms30-IN4检测为纯合可育系（Ms30/Ms30）的4、7、11、12、18、19号材料（标记为F）与检测为杂合可育型（Ms30/ms30）的2、3、6、9、10、16、20、21、22和24号材料（标记为H）在ms30-IN5的检测中都能扩增出747bp的条带，两个标记获得的结果一一对应完全一致。而且，经过后期育性鉴定发现，在苗期基因型鉴定为纯合不育的1、5、8、13、14、15、17和23号材料检测为完全雄性不育，而其它材料的植株都雄性可育，与基因型鉴定结果一致，进一步证明共分离标记的有效性。
图8为利用分子标记辅助选择的方法通过回交转育创制新遗传背景的玉米ms30核雄性不育系的过程示意图。
图9为利用分子标记ms30-IN1和ms30-IN2检测回交转育过程中带有ms30突变等位基因材料（Ms30/ms30）的部分结果。本发明中，使用开发的两个分子标记ms30-IN1和ms30-IN2进行了双重验证。每个材料A泳道为ms30-IN1扩增结果，B为ms30-IN2扩增结果。两个标记都检测到材料2、5、7、8、9、10、12含有ms30等位基因，为带有ms30的杂合型材料(Ms30/ ms30)。
图10为利用开发的功能标记进行ms30不育系种子纯度鉴定的部分材料的检测结果。利用本发明开发的功能标记ms30-IN1对每一个材料进行检测，其中，箭头标记的2、5、6、8、10、12、13和18号材料中都检测到859bp的Ms30基因的特异条带，为不育系（ms30/ms30）种子中混入的杂合型可育种子（Ms30/ms30）。
具体实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：获得玉米雄性不育突变材料
本发明的供试材料是玉米正常可育自交系的Ms30基因突变获得的不育株，表现为完全无花粉型雄性不育，如图1所示，其表现具体为：花药变小、发白、花粉不能被碘-碘化钾染色。该不育系材料命名为ms30-6028。
实施例2：ms30突变位点分析及其功能标记的开发
雄性不育材料ms30-6028是Ms30位点突变所致。如图2所示，突变基因ms30在+1214位点开始有一段464bp序列的缺失。
根据突变体ms30-6028的突变基因ms30缺失的序列及其位置，利用引物设计软件，可开发出一系列针对野生型Ms30和突变型ms30基因的特异的功能性共分离分子标记。例如，引物序列全部或部分设计在缺失序列中，可作为野生型Ms30基因的特异标记。引物序列分别设计在缺失序列的两侧，从野生型Ms30基因和突变型ms30基因中扩增的条带大小不同，可以同时检测野生型Ms30基因和突变型ms30基因。
实施例3：功能标记ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5的开发
在本发明中，针对ms30突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出五对功能性分子标记：ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5，其中ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3和ms30-IN4能够特异性检测玉米突变体ms30-6028及由其转育的玉米不育材料中的突变基因ms30，并能同时区分野生型Ms30基因和突变型ms30基因。而ms30-IN5为野生型Ms30基因的特异标记。开发的五对功能性标记ms30-IN1、ms30-IN2 、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5的扩增引物的位置示意图如图3A所示，各个标记的扩增引物在Ms30和ms30基因比对序列中对应的具体位置如图3B所示，各标记名称对应的引物序列及扩增产物大小如图3C所示。
突变体功能标记ms30-IN1包括第一引物ms30-IN-1F和第二引物ms30-IN-1R，能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出396bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出859bp的条带：
ms30-IN-1F：ACGAGCTGATCCAAGGGTAC
ms30-IN-1R：CGTCTCCTCGAACCCTGTAA
突变体功能标记ms30-IN2包括第一引物ms30-IN-2F和第二引物ms30-IN-2R，能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出549bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出1013bp的条带：
ms30-IN-2F：GGTTTAGAACATCACATAGTTCGGAT
ms30-IN-2R：ACGCACCGTTCGTAGTCAT
突变体功能标记ms30-IN3包括第一引物ms30-IN-3F和第二引物ms30-IN-3R，能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出276bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出739bp的条带：
ms30-IN-3F：CATCTCCAACCCGACCACGTATG
ms30-IN-3R：CCTCGAACCCTGTAATTAGAG
突变体功能标记ms30-IN4包括第一引物ms30-IN-4F和第二引物ms30-IN-2R，能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出612bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出1076bp的条带：
ms30-IN-4F：CACGTATGGTAACCTTTCGCTCCA
ms30-IN-2R: ACGCACCGTTCGTAGTCAT
突变体功能标记ms30-IN5包括第一引物ms30-IN-5F和第二引物ms30-IN-5R，能够在野生型Ms30基因中扩增出747bp的条带，而在ms30-6028突变基因ms30中无扩增产物：
ms30-IN-5F：AATTGCCCAGCGACTACCGT
ms30-IN-5R：CAGTGCTAAAGGCCATTGAAAA
开发的5个功能标记ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5在Ms30纯合可育株（基因型Ms30/Ms30）、杂合可育株（基因型Ms30/ms30）和纯合不育株（基因型ms30/ms30）基因组DNA的Ms30等位基因位点扩增的条带大小总结如下（表1）。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小情况即可判断Ms30位点等位基因的情况。
表1. 五个功能标记扩增的条带大小总结
<i>Ms30/Ms30</i> <i>Ms30/ms30</i> <i>Ms30/ms30</i>
ms30-IN1 859bp 859bp/396bp 396bp
ms30-IN2 1013bp 1013bp/549bp 549bp
ms30-IN3 739bp 739bp/276bp 276bp
ms30-IN4 1076bp 1076bp/612bp 612bp
ms30-IN5 747bp 747bp -
实施例4：功能标记ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5的可行性验证
对实施例3中开发的5个功能标记进行验证。验证5个功能标记所用的试验材料包括：纯合ms30突变材料ms30-6028（ms30ms30）、以ms30-6028（母本）×B73（父本）获得的杂交F1代（Ms30ms30）、纯合野生型材料B73（Ms30Ms30）。利用ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3、ms30-IN4和ms30-IN5五个功能标记分别对上述材料进行Ms30等位基因的检测。
其中，玉米叶片DNA提取方法如下。1）剪取适量叶片并剪碎，放入事先写好编号的2.0ml离心管中，加入一颗钢珠。2）按顺序将已放入叶片和钢珠的离心管摆放在打样仪专用的离心管架（8×5）上，整体浸泡在盛有液氮的保鲜盒中1-2min（注：液氮以刚没过离心管架少许为宜）。3）将冷冻好的离心管架放入打样仪（Thmorgan cell killer ck-1000）的卡槽中，拧紧，关盖，1200转/min的速度打样20s。4）用吸铁石吸出离心管中的钢珠。5）加入700μLCTAB提取液（65℃预热），65℃水浴30min，中间取出颠倒1-2次。6）加入700μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀，小心标记不要被擦掉（注：氯仿为腐蚀性试剂，需要带PE一次性手套在通风橱中操作）。7）12000 rpm离心5min至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的1.5mL微量离心管中（预先加入800μl预冷的无水乙醇），弃枪头，盖紧盖子，写好编号并检查无误，上下颠倒混匀。-20℃冰箱中放置30min。8）12000 rpm离心10min至沉淀附于离心管底部，弃上清液。9）70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5mL微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥。10）加入100-200μL的1×TE缓冲液或ddH2O溶解沉淀。11）样品置于-20℃冰箱中保存备用。
利用设计的引物对所获得的DNA进行PCR扩增，方法和程序如下：1）先打开制冰机的水源开关，再打开制冰机的电源开关，制冰。2）将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：PCR缓冲液、dNTP溶液、正反向引物溶液以及模板DNA（注：当某一试剂完全解冻，即放置于冰上。经常用的ddH2O、引物工作液、模板DNA 以及少量PCR缓冲液、dNTP溶液可放于4℃冰箱中）。3）所有试剂解冻完毕后，8000 rpm离心数秒，放回冰上待用。4）配制PCR反应的混合液，按照下表依次加入各试剂（反应体系为10μL）。下表2同时列出了1个反应（1R）、10个反应（10R）、50个反应（50R）、100个反应（100R）的混合液配方。配好后将所有试剂放回4℃或-20℃冰箱（注：Taq聚合酶需小心操作，临用前从-20℃冰箱中取出，用时需置于冰上，用完后立即放回-20℃冰箱中）。5）混匀，8000 rpm离心数秒。6）将混合液分装至200μL PCR反应管中，再加入1μL模板DNA，做好标记（注：如果不使用热盖功能，为防止样品蒸干，需最后加入约20μL石蜡油或盖上PCR管盖）。7）将PCR反应板（管）插入PCR扩增仪的200μL 孔中，合上热盖，旋紧。8）打开PCR扩增仪电源开关，选择预设的反应程序（如表3），开始扩增。9）扩增完后，退出反应程序，回到主菜单，关闭电源开关。打开热盖，取出PCR反应管，置于PCR管架上，放入4℃冰箱中，待用。
表2. PCR反应体系
成分 母液浓度 终浓度 1 R 10R 50R 100R
DNA模板 1μL 10μL 50μL 100μL
PCR缓冲液 10倍 1倍 1.5μL 15μL 75μL 150μL
dNTP溶液 10mM 0.2 mM 0.3μL 3μL 15μL 30μL
正向引物 10um/L 0.2um/L 0.3μL 3μL 15μL 30μL
反向引物 10um/L 0.2um/L 0.3μL 3μL 15μL 30μL
DMSO 0.1μL 1μL 5μL 10μL
<i>Taq</i>聚合酶 5U/μL 0.05U 0.2μL 2μL 10μL 20μL
灭菌水 11.3μL 113μL 565μL 1130μL
总共 15.0μL 150μL 750μL 1500μL
表3. PCR扩增条件
步骤 温度（℃） 时间 循环数 作用
1 94 5min 1 变性
2 94 30s 1 变性
3 56 30s 1 退火
4 72 30s 1 延伸
5 回到步骤2 再加34个循环
6 72 5分钟 1 延伸
7 10 10分钟 低温保存
注：不同引物的退火温度不同，一般都在56℃-60℃之间。
理论上，ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3和ms30-IN4在Ms30/Ms30纯合野生型（B73）DNA中能分别扩增出859bp、1013bp、739bp、1076bp的条带，在ms30/ms30纯合突变型材料（S）DNA中分别扩增出396bp、549bp、276bp、612bp的条带，而在Ms30/ms30杂合型（H）材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。ms30-IN5为Ms30基因的显性标记，能够在Ms30/Ms30纯合野生型（B73）和Ms30/ms30杂合型（H）材料中扩增出747bp的条带，而在ms30/ms30纯合突变型材料（S）中无扩增产物。ms30-IN1、ms30-IN2、ms30-IN3和ms30-IN4和ms30-IN5等5个分子标记的验证结果如图4所示。可见，设计的5个功能性分子标记完全符合预期，在Ms30/ Ms30纯合野生型（B73）、Ms30/ms30杂合型（H）和ms30/ms30纯合突变型材料（S）中分别扩增出对应大小的条带，可以作为Ms30、ms30等位基因检测的理想标记。
实施例5：分别利用功能标记ms30-IN1和ms30-IN2在苗期鉴定Ms30位点的纯合野生型、杂合型和纯合不育系材料
将ms30的杂合型材料Ms30/ms30自交，理论上可获得分离比为1:2:1的Ms30/Ms30、Ms30/ms30和ms30/ms30单株，其中ms30/ms30为纯合隐性不育系。本发明分别利用功能性分子标记ms30-IN1和 ms30-IN2同时对上述材料在苗期进行了基因型鉴定。
对杂合型Ms30/ms30自交获得的F2群体取叶片提取基因组DNA，利用诊断标记ms30-IN1和 ms30-IN2同时对763份材料进行了PCR鉴定，图5为部分材料的鉴定结果。首先，两个标记对763份材料的扩增结果完全一致，图5中将鉴定的纯合可育材料标记为F，纯合不育材料标记为S，杂合材料标记为H。统计结果发现Ms30/Ms30、Ms30/ms30和ms30/ms30分离比为162:403:198，卡方检验结果X2=3.068，P=0.2157，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms30/Ms30、Ms30/ms30和ms30/ms30分离比符合1:2:1的规律。而且，后期育性检测表明，标记为S的材料的植株表现为完全雄性不育，标记为F和H的植株在后期表现为可育，其表型与苗期基因型检测完全一致。
实施例6：利用功能标记ms30-IN3在苗期鉴定Ms30位点的纯合野生型、杂合型和纯合不育系材料
将ms30的杂合型材料Ms30/ms30自交，理论上可获得分离比为1:2:1的纯合可育型Ms30/Ms30、杂合可育型Ms30/ms30和纯合不育型ms30/ms30三种基因型的单株。本发明利用功能性分子标记ms30-IN3对部分上述材料在苗期进行了基因型鉴定。
取叶片提取基因组DNA，利用诊断标记ms30-IN3对132份材料进行了PCR鉴定，图6为部分材料的鉴定结果，其中，1、10、12、19和22号材料的DNA中只能扩增出739bp的条带，为纯合可育系（Ms30/Ms30），4、9、11、13、15、18、21和23号材料的DNA中只能扩增出276bp的条带，为纯合不育系（ms30/ms30），而2、3、5、6、7、8、14、16、17、20和24号材料的DNA中能同时扩增出739bp和276bp的条带，为杂合可育型（Ms30/ms30）材料。统计结果发现，在鉴定的132份材料中，Ms30/Ms30、Ms30/ms30和ms30/ms30分离比为35:59:38，卡方检验结果X2=0.803，P=0.6693，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms30/Ms30、Ms30/ms30和ms30/ms30分离比符合1:2:1的规律。经过后期育性鉴定发现，在苗期鉴定为纯合不育的材料检测为完全雄性不育，而其它材料的单株都雄性可育，与基因型鉴定结果一致，证明共分离标记的有效性。
实施例7：利用功能标记ms30-IN4和ms30-IN5在苗期鉴定Ms30位点的纯合野生型、杂合型和纯合不育系材料
将ms30的杂合型材料Ms30/ms30自交，理论上可获得分离比为1:2:1的纯合可育型Ms30/Ms30、杂合可育型Ms30/ms30和纯合不育型ms30/ms30三种基因型的单株。本发明利用诊断标记ms30-IN4和ms30-IN5对部分上述材料进行了PCR鉴定。
取叶片提取基因组DNA，同时利用功能性分子标记ms30-IN4和ms30-IN5对286份上述材料在苗期进行了基因型鉴定。图7为部分材料的鉴定结果。功能性标记ms30-IN4在纯合可育系（Ms30/Ms30）DNA中能够扩增出1076bp的条带，在纯合不育系（ms30/ms30）DNA中能够扩增出612bp的条带，而在杂合可育型（Ms30/ms30）材料的DNA中能同时扩增出1076bp和612bp的条带。ms30-IN5为野生型Ms30基因的显性标记，只能在纯合可育系（Ms30/Ms30）和杂合可育系（Ms30/ms30）DNA中扩增出747bp的条带，而在纯合不育系（ms30/ms30）DNA中没有扩增产物。分子标记ms30-IN4和ms30-IN5对所检测的材料获得的结果均一致，图7中1、5、8、13、14、15、17和23号材料在ms30-IN4标记检测中只能检测到612bp的条带，为纯合不育系（ms30/ms30），在ms30-IN5的检测中没有扩增条带。而ms30-IN4检测为纯合可育系（Ms30/ Ms30）的4、7、11、12、18、19号材料和杂合可育型（Ms30/ms30）的2、3、6、9、10、16、20、21、22和24号材料在ms30-IN5的检测中都能扩增出747bp的条带，两个标记获得的结果一一对应完全一致。统计结果发现，在鉴定的286份材料中，Ms30/Ms30、Ms30/ms30和ms30/ms30分离比为59:132:95，卡方检验结果X2=4.954，P=0.0839，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms30/Ms30、Ms30/ms30和ms30/ms30分离比符合1:2:1的规律。而且，经过后期育性鉴定发现，在苗期鉴定为纯合不育的1、5、8、13、14、15、17和23号材料检测为完全雄性不育，而其它材料的植株都雄性可育，与基因型鉴定结果一致，证明共分离标记的有效性。
实施例8 利用ms30-IN1和ms30-IN2进行分子标记辅助选择
利用所述玉米核雄性不育突变材料，培育不同遗传背景下的优良不育系，具体方法如下：以具有玉米隐性核雄性不育基因ms30的玉米材料为母本，以不同遗传背景材料为父本进行杂交，杂交F1代（Ms30/ms30）与父本材料（Ms30/Ms30）进行回交，每一轮回交都利用上述开发的功能标记ms30-IN1和ms30-IN2同时选择带有ms30基因的后代进行回交，重复回交4-5次后，可获得既带有ms30基因同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料（Ms30/ ms30），再进行自交一次，利用功能标记ms30-IN1或ms30-IN2结合表型选择ms30纯合不育系，即可获得新的遗传背景下的ms30核雄性不育系（回交转育示意图如图8所示）。
本发明利用1428份优良玉米自交系与不育系ms30/ms30进行杂交，获得的杂交一代Ms30/ms30继续与相应的优良自交系回交。本发明中检测了回交1代BC1F1（包含Ms30/ ms30和Ms30/Ms30两种基因型）中270份材料，并利用本发明开发的ms30特异性功能标记ms30-IN1和ms30-IN2同时进行了重复检测。ms30-IN1在Ms30和ms30等位基因中可分别扩增出859bp和396bp的条带，而ms30-IN2在Ms30和ms30等位基因中可分别扩增出1013bp和549bp的条带。本实施例获得的部分代表结果如图9所示。其中，两条带都能检测到的是带有ms30的杂合可育株Ms30/ms30，只能检测到分子量较大的一条带的是纯合可育株Ms30/ Ms30。结果表明，开发的两个分子标记ms30-IN1和ms30-IN2在检测的材料中都获得了一致结果，说明二者都是稳定可靠的ms30特异性功能标记。进一步地，总结了270份材料的检测数据，Ms30/ms30和Ms30/Ms30分离比为149:121。卡方检验X2=1.456，P=0.2257，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms30/ms30与Ms30/Ms30分离比符合1:1规律。
实施例9：利用功能标记ms30-IN1和ms30-IN2进行玉米不育系材料的纯度鉴定
不育系种子中混入可育材料会严重降低杂交制种获得的杂交种纯度。本发明利用开发的ms30功能标记ms30-IN1在苗期对每一个材料进行检测，纯合不育系ms30/ms30只能扩增出396bp的产物，而杂合型可育材料会另外多扩增出一条859bp的Ms30标记产物。部分结果如图10所示。其中，箭头标记的2、5、6、8、10、12、13和18号材料为检出的不育系ms30/ ms30中混杂的杂合型Ms30/ms30种子，在这些材料中，分子标记ms30-IN1除了检测出396bp的ms30特征条带，还检测出了859bp的Ms30基因的特征条带。本实施例中共检测了261份不育系种子，检出混入的杂合型可育种子22份，表明该功能标记在种子纯度鉴定中具有重要应用价值。
总之，本发明开发的分子标记为玉米核雄性不育基因ms30的功能性分子标记，结合野生型基因Ms30的分子标记可快速检测Ms30等位基因情况。在回交转育过程中，利用分子标记辅助选择可在苗期直接检测出带有ms30基因的株系，快速筛选到目标单株，以加速回交转育进程，在利用分子标记辅助选择进行杂交种不育化制种中具有重要的应用价值。此外，开发的分子标记还可应用于杂交种不育亲本的纯度鉴定。
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<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgagctgat ccaagggtac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtctcctcg aaccctgtaa 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtttagaac atcacatagt tcggat 26
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgcaccgtt cgtagtcat 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catctccaac ccgaccacgt atg 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcgaaccc tgtaattaga g 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacgtatggt aacctttcgc tcca 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattgcccag cgactaccgt 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagtgctaaa ggccattgaa aa 22

Claims (5)

1.引物ms30-IN-1F和ms30-IN-1R在玉米雄性不育系ms30-6028鉴定中的应用，其特征在于，引物ms30-IN-1F和ms30-IN-1R序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，第一引物ms30-IN-1F和第二引物ms30-IN-1R能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出396bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出859bp的条带。
2.引物ms30-IN-2F和ms30-IN-2R在玉米雄性不育系ms30-6028鉴定中的应用，其特征在于，引物ms30-IN-2F和ms30-IN-2R序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，第一引物ms30-IN-2F和第二引物ms30-IN-2R能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出549bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出1013bp的条带。
3.引物ms30-IN-3F和ms30-IN-3R在玉米雄性不育系ms30-6028鉴定中的应用，其特征在于，引物ms30-IN-3F和ms30-IN-3R序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，第一引物ms30-IN-3F和第二引物ms30-IN-3R能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出276bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出739bp的条带。
4.引物ms30-IN-4F和ms30-IN-2R在玉米雄性不育系ms30-6028鉴定中的应用，其特征在于，引物ms30-IN-4F和ms30-IN-2R序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.4所示，第一引物ms30-IN-4F和第二引物ms30-IN-2R能够在ms30-6028突变基因ms30中扩增出612bp的条带，而在野生型Ms30基因中扩增出1076bp的条带。
5.引物ms30-IN-5F和ms30-IN-5R在玉米雄性不育系ms30-6028鉴定中的应用，其特征在于，引物ms30-IN-5F和ms30-IN-5R序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，第一引物ms30-IN-5F和第二引物ms30-IN-5R能够在野生型Ms30基因中扩增出747bp的条带，而在ms30-6028突变基因ms30中无扩增产物。
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