CN109402283B - 玉米隐性核雄性不育突变基因ms20新等位基因的发现及其功能标记的开发与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种玉米核雄性不育基因ms20的新的等位基因的发现、突变位点分析及其功能标记的开发和应用。本发明利用F2群体和SSR分子标记对突变基因ms20进行定位和图位克隆，发现突变ms20基因是IPE1基因的一种新的等位突变基因，其突变是由于ms20基因启动子区一段891bp的序列插入引起。根据其突变位点设计了包括但不限于ms20‑IN1和ms20‑IN2两个功能标记，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测即能快速、准确检测和标记玉米核雄性不育基因ms20或可育基因ZmMs20的等位基因型，可用于雄性不育株系的鉴定、目标单株的筛选，在玉米雄性不育系培育、不育化杂交制种和分子标记辅助选择中具有重要的应用价值，对提高玉米杂交育种和制种效率、保障制种质量等方面具有重要意义。

Description

玉米隐性核雄性不育突变基因ms20新等位基因的发现及其功 能标记的开发与应用
技术领域
一般地，本发明属于作物分子育种、分子生物学和基因工程领域。具体涉及一种玉米核雄性不育突变基因ms20的定位、克隆、功能标记的开发及其应用。
背景技术
植物雄性不育(male sterility, MS)是指在高等植物中，雄性器官发育异常，无法产生有功能的雄配子(花粉)，但雌性器官发育正常，能接受正常雄配子而受精结实，并能将该不育性遗传给后代的现象。对雄性不育的研究有助于理解复杂的植物生殖生长过程，并对作物生产中杂种优势利用和杂交种制种效率的提高具有巨大的应用和经济价值。
玉米是重要的禾本科粮食作物，具有重要的科研和经济价值。因为其雌雄异花的特点而成为理想的植物生殖生长的研究对象。目前国内通过各种右边手段发现了大量的玉米雄性不育突变体，这为我们通过正向遗传学手段分析和研究植物花器官的发育调控提供了丰富的实验材料。
玉米雄性不育按照不育性遗传方式的差异，可分为3类：细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和质核互作雄性不育，其中细胞核雄性不育还可分为显性核不育和隐性核不育，而且以后者为主。由于细胞质母体遗传的原因，细胞质不育基因的F1不能自交结实，因而不能在育种和生产上利用；利用常规杂交育种技术，细胞核雄性不育系的保持和繁殖存在困难，也不能在育种和生产上有效利用；质核互作不育基因，理论和实践上都可以被育种利用，但是该类基因的广泛利用会导致杂交种细胞质单一化，易受专一性病原小种的侵染而导致杂交玉米生产存在巨大的风险。因此，目前国内外玉米杂交育种的父母本大多是可育的自交系，杂交制种时需要对母本进行人工或机械除雄，大大增加了制种成本，同时杂交种纯度也难以得到保障。随着现代生物技术的快速发展，利用作物分子设计技术，并结合常规育种方法，有望将隐性核不育基因有效利用起来。为了能够使核不育基因得到育种利用，必须找到核不育后代早期诊断不育性的标记性状从而尽早区分核不育系。因此，从发现玉米隐性核不育材料时起，人们就利用传统育种技术途径，对核不育基因进行了多种标记性状的探索研究，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。分子标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特定DNA片段。随着分子标记技术的发展，通过定位克隆获得与玉米重要性状连锁的分子标记或者功能性共分离分子标记，对玉米的基因型鉴定、品种的遗传背景选择、目标单株筛选、品种的遗传改良和纯度鉴定以及克隆雄性器官分化控制基因等方面有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种调控玉米花粉发育基因ZmMs20的突变体ms20，通过基因定位、图位克隆，获得ms20突变基因的突变位点，并提供了一组能够准确检测和标记玉米隐性核雄性不育基因ms20的分子标记，所提供的分子标记是根据不育突变体的基因突变位点设计，属于功能性共分离分子标记，与不育基因ms20共分离，可用于植株的育性等位基因鉴定、分子标记辅助育种中目标单株的筛选和种子纯度鉴定等。
本发明的目的之一：在于提供一种由于育性相关基因ZmMs20的突变获得的完全雄性不育材料。
本发明的目的之二：在于提供这种突变材料的基因突变位点。具体的，其基因突变是由于在转录起始位点之前-68位点处的启动子区有一段891bp的序列插入引起。
本发明的目的之三：在于提供根据上述ms20突变位点开发ms20功能性分子标记的方法。
本发明的目的之四：在于提供根据上述突变位点开发的一组功能性分子标记，包括但不限于ms20-IN1和ms20-IN2等分子标记，能特异检测突变等位基因ms20基因和野生型ZmMs20。
进一步地，开发的分子标记ms20-IN1和ms20-IN2以及其它类似的功能性共分离标记包括但不限于以下三条引物序列：
ms20-IN-1F：TCACGCATATTCGTCATCCAG
ms20-IN-1R：TGGGAGTTAGCTCATGGGTAGA
ms20-IN-2R：AAGTGATAGGAAACAGGAAACCC
其中ms20-IN-1F设计在插入序列的上游，ms20-IN-1R设计在插入序列的下游，因此分子标记ms20-IN1（ms20-IN-1F/ms20-IN-1R）能够同时检测野生型ZmMs20基因和突变型ms20基因，ms20-IN1从野生型ZmMs20基因组和突变型ms20基因组DNA中分别扩增出204bp和1096bp大小的条带。
ms20-IN-2R设计在突变基因ms20插入序列的内部，因此ms20-IN2（ms20-IN-1F/ms20-IN-2R）为突变ms20基因的特异标记，ms20-IN2能够从突变ms20中扩增出487bp的产物，在野生型ZmMs20基因中没有扩增产物。
本发明的目的之五：在于提供一种利用上述突变材料开发和选择不同遗传背景下的玉米雄性不育材料的方法。具体的，利用带有上述突变ms20基因的材料做母本，不同优良遗传背景的自交系作为父本，杂交后代与父本自交系连续回交多代，每次回交之前用标记选择带有ms20基因的单株，以获得不同遗传背景下的玉米ms20雄性不育材料，提高杂种优势的利用范围。
本发明的目的之六：在于在开发和选择不同遗传背景下ms20雄性不育材料过程中，利用上述开发的分子标记进行分子标记辅助选择，加快玉米不育ms20材料的选育进程和提高选择效率。
本发明的目的之七：在于利用上述开发的分子标记在上一批种子收获后或下一代苗期快速检测玉米ZmMs20等位基因，筛选特定ms20雄性不育单株；
本发明的目的之八：在于上述开发的功能性分子标记在玉米ms20雄性不育亲本纯度鉴定中的应用，以及检测玉米杂交种是否带有ms20不育等位基因，以判断杂交种的纯度。
附图说明
图1为玉米ZmMs20野生型和ms20突变体的雄穗表型比较图。
图2为ZmMs20基因的定位和图位克隆示意图。（a）不育ms20群体DNA与可育群体DNA的多态性标记分离比；（b）F2群体中48个雄性不育突变体植株和48个雄性可育株用于玉米ms20基因的定位研究，初步将ms20基因定位于1号染色体SSR标记 bnlg2295和P2-04之间；（c）ms20基因精细定位于SSR标记 P9-08和P9-12之间约190kb的区段；（d）此区间内推断的7个基因模型，其中Zm00001d029683类似于玉米IPE1基因，为ZmMs20的候选基因。
图3为玉米ZmMs20候选基因(Zm00001d029683)及突变ms20基因的结构示意图。突变ms20基因的突变位点在5’ UTR区-68位点处，有 891bp DNA片段的插入。
图4为预测的野生型ZmMs20 和突变ms20编码的氨基酸序列。ZmMs20包含一段28个氨基酸的信号肽和一段553个氨基酸的GMC氧化还原酶功能域。
图5为GMC氧化还原酶功能域在不同物种中的同源性对比。
其中，SbHOTHEAD：Sorghum, Sobic.001G320300; AeHOTHEAD: Aegilopstauschii, XP_020175885.1; BdHOTHEAD: Brachypodium distachyon, Bradi3g31630;HvHOTHEAD: Barley, HORVU1Hr1G048960; OsHOTHEAD:rice, Os10g38050.
图6为玉米ZmMs20与ms20 DNA序列比对图及本发明中开发的分子标记ms20-IN1、ms20-IN2涉及的3条引物在基因中的位置示意图（6A），3条引物对应的基因中的位点（6B），引物序列及扩增产物大小（6C）。
图7为分子标记ms20-IN1、ms20-IN2的可行性验证。利用Ms20/Ms20纯合野生型、Ms20/ms20杂合型和ms20/ms20纯合突变型材料进行分子标记的多态性验证。分子标记ms20-IN1（引物组合ms20-IN-1F/ms20-IN-1R）在ms20纯合隐性不育株（基因型ms20/ms20）（标记为S）DNA中可特异扩增一条1096bp的条带，在ZmMs20纯合可育株（基因型Ms20/Ms20）基因组DNA中（标记为F）的PCR扩增产物分子量大小为204bp的条带，在杂合可育株（基因型Ms20/ms20）中（标记为H）则同时检测出上述两种分子量大小的条带。分子标记ms20-IN2是突变型ms20的特异性标记，能在ms20纯合隐性不育株（基因型ms20/ms20）（标记为S）和杂合可育株（基因型Ms20/ms20）（标记为H）DNA中特异扩增一条487bp的条带，而在野生型Ms20/ Ms20基因组中没有扩增产物。
图8为同时利用分子标记ms20-IN1和ms20-IN2对杂合可育株（基因型Ms20/ms20）自交F2群体部分材料在苗期进行ZmMs20等位基因的检测结果。在ZmMs20纯合可育株（基因型Ms20/Ms20）基因组DNA（标记为F）中，分子标记ms20-IN1可扩增出204bp的条带，ms20-IN2没有扩增产物；在杂合可育株（基因型Ms20/ms20）（标记为H）DNA中，分子标记ms20-IN1可扩增出204bp和1096bp两条带，ms20-IN2能扩增出487bp条带；在ms20纯合隐性不育株（基因型ms20/ms20）（标记为S）DNA中，分子标记ms20-IN1可扩增出1096bp的条带，ms20-IN2能扩增出487bp条带；由图8可见，分子标记ms20-IN1和ms20-IN2在F2群体中的检测结果都是一致的。
图9为利用分子标记辅助选择的方法通过回交转育创制新遗传背景的玉米ms20核雄性不育系的过程示意图。
图10为同时利用分子标记ms20-IN1和ms20-IN2检测回交转育过程中带有ms20突变等位基因材料（Ms20/ms20）的部分结果。本发明中，需要检出的是带有ms20等位基因的杂合基因型材料，因此使用开发的两个分子标记ms20-IN1和ms20-IN2进行了双重验证。检测出带有ms20等位基因的材料为杂合型植株(Ms20/ms20)，即利用ms20-IN1检测出1096bp和204bp两条带型，利用ms20-IN2检测出一条487bp的带型，标记为H，没有检测出ms20的材料为纯合可育Ms20/Ms20基因型植株，即利用ms20-IN1只检测出204bp的条带，利用ms20-IN2没有检测到条带，标记为F。
图11为利用开发的功能标记ms20-IN1和ms20-IN2进行ms20不育系种子纯度鉴定的部分材料的检测结果。图中，检测出混入不育系种子中的两个纯合可育系材料（基因型为Ms20/Ms20，标记为F）和两个杂合可育材料（基因型为Ms20/ms20，标记为H）。两个标记ms20-IN1和ms20-IN2检测结果是一致的。
具体实施方式
下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如无特殊说明，实施例中所用引物及基因的合成和测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：ms20玉米雄性不育突变体的获得、表型描述及细胞学观察
玉米雄性不育突变体ms20是本专利申请人北京科技大学和北京首佳利华科技有限公司发明人利用EMS诱变玉米正常可育自交系的方法获得。突变体ms20的营养生长没有表现出明显差异，进入散粉期后，发现突变体花药不能从小花中吐出，花药表现为变小、萎缩、呈棕褐色，不能生成成熟的花粉粒（图1）。
细胞学观察表明，突变体ms20不能形成花粉外壁的中间层，绒毡层出现更多的液泡，因而花粉壁不能正常形成，小孢子形状不规则，排列紊乱，直至完全降解。
以自交系昌7-2（C7-2）为父本与突变体ms20杂交，F1代育性正常，F2代出现育性分离，如表1所示，F2群体中正常可育株（F）与不育株（S）的分离符合单基因3:1的分离比，即突变体的雄性不育表型表现为明显的单基因隐性遗传。
表1 玉米ms20突变体育性分离的适合性检验
F<sub>2 </sub>populationcombination Totalplants Fertile plants(F) Sterile plants(S) F/Sratio X<sup>2</sup> P Significant test （p>0.05）
ms20×Chang7-2 1365 1065 300 3.55:1 3.468 0.06257 ns*
实施例2：ms20基因的定位、克隆和ms20基因的突变位点分析
选取ms20×Chang7-2 F2群体中48个雄性不育突变体植株和48个雄性可育株用于玉米ms20基因的定位研究。所使用的SSR标记如表2所示，基因定位情况如图2所示。
表2 用于ms20定位的SSR标记
Figure DEST_PATH_IMAGE001
ZmMs20基因初步定位于1号染色体SSR标记 bnlg2295和P2-04之间（图2b），进一步精细定位于SSR标记 P9-08和P9-12之间约190kb的区段（图2c）, 此区间内推断的7个基因模型，其中Zm00001d029683类似于玉米IPE1基因，为ZmMs20的候选基因（图2d），不育等位性测验证明，ZmMs20基因确实是IPE1基因。
对ZmMs20 (Zm00001d029683)及突变ms20基因进行克隆、测序分析。结果表明，突变ms20基因的突变位点在5’ UTR区-68位点处，有891bp DNA序列的插入，在基因编码区没有突变位点（图3）。ZmMs20基因包含三个外显子和两个内含子，蛋白序列预测表明，ZmMs20含有581个氨基酸，包含一段28个氨基酸的信号肽和含有553个氨基酸的GMC氧化还原酶（图4）。
实施例3：ZmMs20蛋白在不同物种中的同源性分析
对玉米、高粱、山羊草、短柄草、大麦和水稻中的GMC氧化还原酶的功能域进行同源性分析，其中SbHOTHEAD为高粱Sobic.001G320300， AeHOTHEAD为山羊草XP_020175885.1，BdHOTHEAD为短柄草Bradi3g31630，HvHOTHEAD为大麦 HORVU1Hr1G048960，OsHOTHEAD为水稻Os10g38050。同源性分析结果如图5所示，ZmMs20蛋白质序列在不同物种中表现高度保守性。因此，该蛋白对植物保持正常的雄花生育力具有关键作用，当基因发生序列变异时会极大地影响雄花育性。
实施例4：ms20基因功能标记的开发
根据在ZmMs20基因启动子区域（5’UTR上游-68bp处）插入891bp片段的位置和插入的DNA序列信息，利用引物设计软件，可开发出一系列针对野生型ZmMs20基因（SEQ ID NO.4）和突变型ms20基因（SEQ ID NO.5）的特异的功能性共分离分子标记。引物序列包含在插入DNA片段序列中或者跨越插入片段的边界都能够作为ms20突变基因的分子标记。PCR产物跨越整个插入片段的引物序列，从野生型ZmMs20基因和突变型ms20基因中获得的PCR产物大小不同，从而可以同时区分野生型ZmMs20基因和突变ms20基因。
在本发明中，针对突变ms20基因插入片段的位置，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出两对功能性分子标记：ms20-IN1和ms20-IN2。两个标记共用一条正向引物ms20-IN-1F，位于插入序列的上游，ms20-IN1的反向引物在插入序列的下游，因此功能标记ms20-IN1为共显性标记，能够同时区分出野生型ZmMs20基因和突变型ms20基因，而功能标记ms20-IN2的反向引物位于插入序列的内部，因此，ms20-IN2为突变ms20基因的特异性标记，在野生型ZmMs20基因中没有扩增产物。
两个功能标记ms20-IN1和ms20-IN2涉及的3条引物的位置示意图如图6A所示，两个标记扩增引物在ZmMs20和ms20基因比对序列中对应的具体位置如图6B所示，标记名称对应的引物序列及扩增产物大小如图6C所示。
突变体功能标记ms20-IN1包括第一引物ms20-IN-1F和第二引物ms20-IN-1R，能够在野生型ZmMs20基因组DNA中扩增出204bp的条带，在ms20突变基因组DNA中扩增出1096bp的条带：
ms20-IN-1F：TCACGCATATTCGTCATCCAG
ms20-IN-1R：TGGGAGTTAGCTCATGGGTAGA
突变体功能标记ms20-IN2包括第一引物ms20-IN-1F和第二引物ms20-IN-2R，仅能够在ms20突变基因中扩增出487bp的条带，在野生型ZmMs20基因中没有扩增产物。ms20-IN-1F：TCACGCATATTCGTCATCCAG
ms20-IN-2R：AAGTGATAGGAAACAGGAAACCC
开发的两个功能标记ms20-IN1和ms20-IN2在ZmMs20纯合可育株（基因型Ms20/ Ms20）、杂合可育株（基因型Ms20/ms20）和纯合不育株（基因型ms20/ms20）基因组DNA的Ms20等位基因位点扩增的条带大小总结如表3所示。
表3. 两个功能标记ms20-IN1和ms20-IN2扩增的条带大小总结
<i>Ms20/Ms20</i> <i>Ms20/ms20</i> <i>ms20/ms20</i>
ms20-IN1 204bp 204bp , 1096bp 1096bp
ms20-IN2 - 487bp 487bp
实施例5：功能标记ms20-IN1和ms20-IN2的可行性验证
对实施例4中开发的两个功能标记ms20-IN1和ms20-IN2进行可行性验证。所用材料包括：纯合野生型自交系材料昌7-2、以ms20（母本）×昌7-2（父本）获得的杂交F1代、纯合ms20突变材料。
提取玉米叶片DNA，提取方法如下。1）剪取适量叶片并剪碎，放入事先写好编号的2.0ml离心管中，加入一颗钢珠。2）按顺序将已放入叶片和钢珠的离心管摆放在打样仪专用的离心管架（8×5）上，整体浸泡在盛有液氮的保鲜盒中1-2min（注：液氮以刚没过离心管架少许为宜）。3）将冷冻好的离心管架放入打样仪（Thmorgan cell killer ck-1000）的卡槽中，拧紧，关盖，1200转/min的速度打样20s。4）用吸铁石吸出离心管中的钢珠。5）加入700μLCTAB提取液（65℃预热），65℃水浴30min，中间取出颠倒1-2次。6）加入700μL氯仿：异戊醇（24:1）萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀，小心标记不要被擦掉（注：氯仿为腐蚀性试剂，需要带PE一次性手套在通风橱中操作）。7）12000 rpm离心5min至清晰分相。吸取上清液400μL，转入新的1.5mL微量离心管中(预先加入800μl预冷的无水乙醇)，弃枪头，盖紧盖子，写好编号并检查无误，上下颠倒混匀。-20℃冰箱中放置30min。8）12000 rpm离心10min至沉淀附于离心管底部，弃上清液。9）70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5mL微量离心管倒置于平铺于桌上的纸上，自然干燥。10）加入100-200μL的1×TE缓冲液或ddH2O溶解沉淀。11）样品置于-20℃冰箱中保存备用。
利用设计的引物对所获得的DNA进行PCR扩增，方法和程序如下：1）先打开制冰机的水源开关，再打开制冰机的电源开关，制冰。2）将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：PCR缓冲液、dNTP溶液、正反向引物溶液以及模板DNA（注：当某一试剂完全解冻，即放置于冰上。经常用的ddH2O、引物工作液、模板DNA 以及少量PCR缓冲液、dNTP溶液可放于4℃冰箱中）。3）所有试剂解冻完毕后，8000 rpm离心数秒，放回冰上待用。4）配制PCR反应的混合液，按照下表依次加入各试剂（反应体系为10μL）。下表4同时列出了1个反应（1R´）、10个反应（10R´）、50个反应（50R´）、100个反应（100R´）的混合液配方。配好后将所有试剂放回4℃或-20℃冰箱（注：Taq聚合酶需小心操作，临用前从-20℃冰箱中取出，用时需置于冰上，用完后立即放回-20℃冰箱中）。5）混匀，8000 rpm离心数秒。6）将混合液分装至200μL PCR反应管中，再加入1μL模板DNA，做好标记（注：如果不使用热盖功能，为防止样品蒸干，需最后加入约20μL石蜡油或盖上PCR管盖）。7）将PCR反应板（管）插入PCR扩增仪的200μL 孔中，合上热盖，旋紧。8）打开PCR扩增仪电源开关，选择预设的反应程序(如表5)，开始扩增。9）扩增完后，退出反应程序，回到主菜单，关闭电源开关。打开热盖，取出PCR反应管，置于PCR管架上，放入4℃冰箱中，待用。
表4. PCR反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表5. PCR扩增条件
Figure DEST_PATH_IMAGE003
PCR结果如图7所示。在ZmMs20纯合可育株（基因型Ms20/Ms20）基因组DNA中，分子标记ms20-IN1（引物组合ms20-IN-1F/ms20-IN-1R）的PCR扩增产物分子量大小为204bp，标记为F；在ms20纯合隐性不育株（基因型ms20/ms20）基因组DNA中，可特异扩增一条1096bp的条带，标记为S; 在杂合可育株（基因型Ms20/ms20）DNA中则能够同时检测出上述两种分子量大小的条带，标记为H。相对应的，标记为F的纯合可育株，在分子标记ms20-IN2（引物组合ms20-IN-1F/ms20-IN-2R）的检测中没有产物，而标记为H杂合可育株和标记为S的纯合不育株中，由于ms20不育等位基因的存在，分子标记ms20-IN2能特异扩增出487bp的条带，此结果与ms20-IN1的检测结果一致。PCR条带表现与预期完全相符，证明开发的分子标记ms20-IN1和ms20-IN2具有很好的特异性，完全可用。
实施例6：同时利用功能标记ms20-IN1和ms20-IN2在苗期鉴定ZmMs20位点的纯合野生型、杂合型和纯合不育系材料
将ms20的杂合型材料Ms20/ms20自交，理论上可获得分离比为1:2:1的Ms20/Ms20、Ms20/ms20和ms20/ms20单株，其中ms20/ms20为纯合隐性不育系。本发明同时利用功能性分子标记ms20-IN1和ms20-IN2对上述材料在苗期进行了基因型鉴定。
杂合型Ms20/ms20自交获得F2群体。取叶片提取基因组DNA，利用诊断标记ms20-IN1和ms20-IN2对458份材料进行了PCR鉴定，图8为部分材料的鉴定结果。结果发现Ms20/ Ms20、Ms20/ms20和ms20/ms20分离比为99:241:118，卡方检验结果X2=1.484，P=0.4762，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms20/Ms20、Ms20/ms20和ms20/ms20分离比符合1：2：1规律。而且，标记为S的单株在后期育性检测中表现为完全雄性不育，而标记为F和H的单株在后期表现为可育，证明ms20-IN1和ms20-IN2两个功能标记可以准确鉴定ZmMs20和ms20的基因型。
实施例7：利用功能标记ms20-IN1和ms20-IN2进行分子标记辅助选择
利用所述玉米核雄性不育突变材料，培育不同遗传背景下的优良不育系，具体方法如下：以具有玉米隐性核雄性不育基因ms20的玉米材料为母本，以不同遗传背景材料为父本进行杂交，杂交F1代（Ms20/ms20）与父本材料（Ms20/Ms20）进行回交，每一轮回交都利用上述开发的功能标记ms20-IN1或ms20-IN2选择带有ms20基因的后代进行回交，重复回交4-5次后，可获得既带有ms20基因同时又具有轮回亲本遗传背景的新材料（Ms20/ms20），再进行自交一次，利用功能标记ms20-IN1或ms20-IN2结合表型选择ms20纯合不育系，即可获得新的遗传背景下的ms20核雄性不育系（回交转育示意图如图9所示）。
本发明利用645份优良玉米自交系与不育系ms20/ms20进行杂交，获得的杂交一代Ms20/ms20继续与相应的优良自交系回交。本发明中检测了回交1代BC1F1中289份材料，并利用本发明开发的功能标记ms20-IN1和ms20-IN2同时进行了重复检测。部分代表结果如图10所示，其中，功能标记ms20-IN1仅能检测到204bp条带的是纯合可育株Ms20/Ms20，标记为F；204bp和1096bp两条条带都能检测到的是带有突变ms20等位基因的杂合可育株Ms20/ ms20，标记为H。相对应的，在标记为F的材料中，ms20-IN2没有检测到条带，而在标记为H的材料中，ms20-IN2检测到487bp的ms20基因的特异条带。结果表明，开发的两个分子标记ms20-IN1和ms20-IN2具有很好的重现性，说明二者都是稳定可靠的ms20特异性功能标记。进一步地，总结了289份材料的检测数据，Ms20/ms20和Ms20/Ms20分离比为139:150。卡方检验X2=0.209，P=0.6476，即实际频数与理论频数没有显著差异，表明Ms20/ms20与Ms20/Ms20分离比符合1：1规律。
实施例8：利用功能标记ms20-IN1和ms20-IN2进行玉米不育系材料的纯度鉴定
不育系种子中混入可育材料会严重降低杂交制种获得的杂交种纯度。本发明利用开发的ms20功能标记ms20-IN1和ms20-IN2在苗期对一批纯合不育系材料进行了检测。功能标记ms20-IN1和ms20-IN2在纯合不育系ms20/ms20基因组DNA中扩增的条带分别为1096bp和487bp，如果其中混入了纯合可育系材料Ms20/Ms20，功能标记ms20-IN1只能扩增出204bp的条带，ms20-IN2没有扩增产物。而对于混入的杂合种子Ms20/ms20，功能标记ms20-IN1会扩增出1096bp和204bp两条带。功能标记ms20-IN2在杂合种子中检测的结果与纯合不育系中的结果一样。部分检测结果如图11所示。其中，箭头标记的材料为检出的不育系ms20/ ms20中混杂的两份纯合可育型（标记为F）种子和两份杂合型可育系种子（标记为H）。本实施例中共检测了179份不育系种子，检出混入的杂合型可育种子7份，纯合可育种子4份，表明该功能标记在种子纯度鉴定中具有重要应用价值。
总之，本发明开发的分子标记ms20-IN1和ms20-IN2为玉米核雄性不育基因ms20的功能性分子标记，可快速检测ZmMs20等位基因的情况。在回交转育过程中，利用分子标记辅助选择可在苗期直接检测出带有ms20基因的株系，快速筛选到目标单株，以加速回交转育进程，在利用分子标记辅助选择进行杂交种不育化制种中具有重要的应用价值。此外，开发的分子标记还可应用于杂交种不育亲本的纯度鉴定。
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<212> DNA
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<211> 3810
<212> DNA
<213> Zea mays
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atgttccata tgctccatct ctgtatggag cacctcatcc atatgctcca ccttcgtatg 120
gagcacctcc tccagttgca cctttatcag ttggatctaa aaaccaagct gaggaaaatc 180
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cggtgagtga atcatttctc atttatttaa tcttgatttt tttagtttac ttacattata 300
ggttttatta taggccaatg cttggattat gcattataat gatcccatct ccaacaacaa 360
taagagcgga tcaagtttct ggggtcaaat agtggcagca tataactcca tctccgaccc 420
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cgcaaaggca gctacgcgaa agacaaagac gaaggggaaa aggaaggaac ccacgacagc 840
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cgctggttct gaccgtcgtc cttggtctct ygtgccwcgt cgcgctctcg gaggatggtt 1980
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ccctggtgtc gcagtacaac tacatcgtga tcggcggcgg cacggcgggg tgcccgctgg 2160
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ctgagcggcg tcggcccgca ggcgcacctg gaggcgcacg gcgtccaggt gctggtggac 3900
cagcccatgg tcgggcaggg cgtggctgac aacccgatga actcggtgtt catcccgtcg 3960
ccggtgcccg tcacgctgtc gctcgtgcag gtcgtcggga tcacccggtc cggcagcttc 4020
atcgagggcg tgagcggctc cgagttcggc atccccgtct ccgagggcgc ccgtcgcctg 4080
gctcgcagct tcggcctctt ctctccgcag acggggcagc tgggcacgtt gccgccgaag 4140
cagagaaccc cagaggccct ggagcgcgcg gcggaggcga tgcggcggct ggacaggcgg 4200
gcgttccggg gcggcttcat cctggagaag atcctgggcc ccgtctcctc gggccacgtc 4260
gagctgcgtt ccgccgaccc gcgcgcgaac ccggcggtga cgttcaacta cttccaggag 4320
tcggaggacc tgcagcggtg cgtgcgcggc atccagacga tcgagcgcgt gatccagtcc 4380
cgggccttcg ccaacttcac ctacgccaac gcttccacgg agtccatctt caccgactcc 4440
gccaacttcc ccgtcaacct cctgccgcgg cacgtcaatg actcccggac gcctgagcag 4500
tactgcaggg acaccgtcat gaccatctgg cattaccacg gcgggtgcca ggtcggcgcc 4560
gtcgtggacg acgattacag ggtgttcggc gtgcagcggc tgagggtgat cgacagctcc 4620
acgttcaagt actcccccgg caccaacccg caggccaccg tcatgatgct cggaaggtat 4680
atgggtgtga aaattcaggc cgagagatgg aggaaatga 4719

Claims (7)

1.一种新的玉米核雄性不育突变基因ms20，其特征在于，该突变基因是通过EMS诱变方法获得，其突变是由于在野生型ZmMs20转录起始位点之前-68位点处的启动子区插入一段长度为891bp的DNA序列引起，该突变基因序列如SEQ ID NO.5所示，由该基因突变获得的突变体花药不能从小花中吐出，花药表现为变小、萎缩、呈棕褐色，不能生成成熟的花粉粒。
2.一种权利要求1所述的玉米核雄性不育突变基因ms20的功能标记ms20-IN1，其特征在于：所述功能标记第一引物ms20-IN-1F序列为：tcacgcatattcgtcatccag，第二引物ms20-IN-1R序列为：tgggagttagctcatgggtaga，该功能标记是共显性标记，能够同时检测野生型ZmMs20基因和突变型ms20基因。
3.一种权利要求1所述的玉米核雄性不育突变基因ms20的功能标记ms20-IN2，其特征在于：所述功能标记第一引物ms20-IN-1F序列为：tcacgcatattcgtcatccag，第二引物ms20-IN-2R序列为：aagtgataggaaacaggaaaccc，该功能标记是特异检测突变型ms20基因的显性标记。
4.权利要求2和3所述的玉米雄性发育相关突变基因ms20的功能标记在检测野生型ZmMs20基因和突变型ms20基因中的应用。
5.权利要求2和3所述的玉米雄性发育相关突变基因ms20的功能标记和权利要求1所述的玉米核雄性不育基因ms20在玉米不育系育种和制种中的应用。
6.权利要求2和3所述玉米雄性发育相关突变基因ms20的功能标记应用于培育新的遗传背景下的玉米核雄性不育新品系的方法，其特征在于，以具有玉米核雄性不育基因ms20的玉米材料为母本，以其它优良性状玉米自交系为父本，通过杂交并经过多轮回交的方法获得新遗传背景下的玉米核雄性不育系，利用权利要求2和3所述的功能标记，在回交后代中选择同时具有玉米核雄性不育基因ms20、并且具有轮回亲本遗传背景的植株，经过多轮回交，最后通过自交和分子标记辅助筛选获得目标遗传背景下的ms20/ms20纯合隐性不育系，并利用该不育系与父本杂交培育玉米新品种。
7.权利要求2和3所述玉米雄性发育相关突变基因ms20的功能标记在快速检测玉米核不育基因ms20的等位基因中的应用，以及在玉米亲本纯度鉴定中的应用。
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玉米核雄性不育的分子机制研究与应用分析;柳双双等;《中国生物工程杂志》;20171215(第01期);第308-317页，结果、材料与方法，图6 *

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