CN104293806A - 大豆shmt新等位基因及其分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大豆SHMT新等位基因及其分型方法，属于植物基因资源和基因分型方法，其特征在于：野生大豆种质ZYD03685中的 SHMT 新等位基因型C的基因序列及检测该等位基因的分子标记的方法，本发明公开了 SHMT （Genbank登录号为JQ714083.1）3504SNP位点为三等位性位点（T/A/C），野生大豆种质ZYD03685为新SNP等位基因型C；通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳即可检测出C基因型的纯合体或杂合体。野生大豆种质ZYD03685高抗胞囊线虫3号和6号生理小种，其根系胞囊数分别为1.3和0.7，换算成胞囊指数分别为1.4和0.7。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆SHMT新等位基因及其分型方法，属于植物基因资源和基因分型的方法。
背景技术
大豆胞囊线虫病是世界大豆生产上的重要病害之一，给大豆生产带来巨大经济损失。发掘与利用新基因资源成为拓宽抗病品种遗传基础的重要途径。
SHMT（丝氨酸羟基转移酶），在高等植物的一碳代谢和光呼吸中起着非常重要的作用，其主要功能是在蛋白质和嘌呤的生物合成中提供甘氨酸，并为C1库提供N5,N10-亚甲基四氢叶酸。大豆SHMT的2个SNP位点（389 G/C和1165 T/A）发生在编码区，与大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性有关。上述SHMT的2个SNP位点（389 G/C和1165 T/A）对应于SHMT参照序列（Genbank登录号为JQ714083.1）的2728 G/C和3504 T/A。3504 SNP位点为T/A，发生在密码子的第一位（t/a）AT，导致了氨基酸发生变化，为Asn/Tyr。
野生大豆是栽培大豆的祖先，具有比栽培大豆更为广泛的遗传变异，发掘其中的抗病基因是拓宽抗病品种遗传基础的重要途径。
发明内容
本发明公开了大豆SHMT的一个新等位基因型，并提供了检测这种新等位基因型的方法，其目的是为拓宽抗病品种遗传基础提供新基因资源和检测技术。SHMT新等位基因型是在高抗大豆胞囊线虫3号和6号生理小种的野生大豆种质ZYD03685中发现的，对于培育新型抗病品种具有重要价值。
野生大豆种质ZYD03685高抗胞囊线虫3号和6号生理小种，其根系胞囊数分别为1.3和0.7，换算成胞囊指数分别为1.4和0.7。
本发明的技术方案是这样实现的：大豆SHMT新等位基因，其特征在于：根据SHMT参照序列（Genbank登录号JQ714083.1），设计PCR引物，在高抗胞囊线虫3号和6号生理小种的野生大豆种质ZYD03685中克隆到SHMT并测序，通过与参照序列比较，在SHMT（Genbank登录号JQ714083.1）3504 SNP位点发现了新等位基因型C，编码氨基酸His，野生大豆种质ZYD03685 SHMT核苷酸序列具有如下特征：DNA水平1344位置和cDNA水平1072位置的碱基为C，编码的氨基酸为His（CAT）；
核苷酸序列（DNA水平）
以不侵染处理为对照，研究了大豆胞囊线虫3号生理小种侵染野生大豆种质ZYD03685后不同时期SHMT的表达量变化，结果表明野生大豆种质ZYD03685 SHMT参与了野生大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性。
本发明公布了检测大豆SHMT（Genbank登录号为JQ714083.1）3504 SNP位点新基因型C的分子标记，该标记为显性标记，能够检测出含有C基因型的纯化体和杂合体，适于检测栽培大豆和野生大豆具有C基因型的样品，可用于基因资源检测和分子标记辅助选择，其具体检测方法如下：针对SNP位点的新等位基因，设计上游引物序列为5'- GTGTGATTGTTTTGCAGAGC-
3'，该引物3'第1个碱基能够与新等位基因型特异结合，为了提高PCR特异性，在该引物3’端第3个碱基人为引入错配碱基。PCR扩增的下游引物序列为5'-
GATGAGATCTTGTTTCCAATTGAGT - 3'，预期PCR产物大小为196 bp。PCR产物通过1.5%的琼脂糖胶电泳检测，如果在196 bp处出现电泳谱带，表明基因组中含有C等位基因。
本发明的积极效果是SHMT （Genbank登录号为JQ714083.1）3504 SNP位点为三等位性位点（T/A/C），野生大豆种质ZYD03685为新SNP等位基因型C；开发了C基因型的分子标记和检测方法，该标记为显性标记，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳即可检测出C基因型的纯合体或杂合体。
附图说明
图
1
为接种后不同时期
SHMT
的相对表达量。
图
2
为本发明
PCR
引物在
SHMT
的位置示意图。
图 3 为 PCR 产物的电泳检测图，1-4泳道为ZYD03685的4个单株P1的PCR产物，5泳道为100bp DNA Ladder（TIANGEN BIOTECH CO.,LTD）（最上面2条谱带分别为1500 bp和1000 bp），6-9为ZYD03685的4个单株P2的PCR产物。
图 4 为 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测图；1-2泳道为ZYD03685的2个样品，3泳道为100bp DNA Ladder（TIANGEN BIOTECH CO.,LTD）（最上面2条谱带分别为1500 bp和1000 bp）。
图 5 不同基因型样品的琼脂糖凝胶电泳分型检测图；1：TT；2：CC；3：AA；4-5：CC；6：AC；7：CC；8-11：TT M：100bp DNA Ladder（TIANGEN BIOTECH CO.,LTD）（11条谱带分别为1500、1000、900、800、700、600、500、400、300、200和100 bp）。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1
（一）
DNA
基因组水平
SHMT
克隆
1
、
DNA
提取
取野生大豆ZYD03685单株12天龄的子叶，加裂解液100ul，用电动组织研磨器（OSE-Y10）研碎后利用DNA提取试剂盒（DNA secure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒 离心柱型 TIANGEN）进行DNA提取。共提取4个ZYD03685单株的样品。
2
、
DNA
浓度及其质量检测
用NanoDrop 2000进行DNA浓度及质量的检测。
3
、引物设计及
PCR
扩增
根据SHMT序列（登录号：JQ714083.1）设计2对特异引物P1和P2（图2），覆盖了基因的整个编码区和内含子区，预期PCR产物大小分别为1470 bp和1361 bp。
PCR反应在BIO-RAD MyCycler®热循环仪上进行，程序为：94℃预变性5min后，以“94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s”循环32次，然后72℃延伸10min，最后4℃保存。
取3µl PCR产物，通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测（图3），PCR产物约为1400 bp。
4
、序列测定及序列拼接、比对
将剩余PCR产物溶液送华大基因（北京）纯化后采用PCR扩增的引物测序。序列拼接、比对采用DNAStar软件的SeqMan工具进行。
（二）
RNA
基因组水平
SHMT
的克隆及表达分析
1
、
RNA
提取
ZYD03685种子经1%的次氯酸钠溶液消毒5分钟后种植于盛有150℃高温灭菌珍珠岩的塑料钵中。以不接种处理为对照，待种植后8天的幼苗接种胞囊线虫虫卵（每株23384个虫卵）后覆层高温灭菌的砂土。接种后9天第一次取样（不接种和接种处理分别取3个植株的根系），并小心地将剩余植株根系上附着的虫卵清洗掉后重新移栽。接种后15天进行第二次（不接种和接种处理分别取3个植株的根系）。2次取得的样品分别剪碎混合后利用RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒（TIANGEN BIOTECH CO.,LTD）提RNA。
2
、
RNA
浓度及其质量检测
用NanoDrop 2000进行RNA浓度及其质量检测。
3
、
cDNA
的合成
利用TransScript one-Step gDNA
Removal and cDNA Synthesis Super Mix 试剂盒合成cDNA，具体步骤按试剂盒附带的说明书进行。
4
、引物设计及
PCR
扩增
根据SHMT mRNA参照序列（JQ714080）设计1对引物，正向序列为5’-ATGGATCCAGTAAGCGTGTGGG-3’，反向引物为5’- CTAATCCTTGTACTTCATTTCAGAT-3’。以第一次接种和不接种处理的样品为试材进行SHMT的克隆。利用2×TransTaq-T PCR SuperMix 试剂盒进行SHMT基因扩增。PCR反应体系为50µl，其中包括1×TransTaq-T PCR SuperMix，0.32µM正向引物，0.32µM反向引物，1ul cDNA。PCR反应在BIO-RAD MyCycler®热循环仪上进行，程序为：94℃预变性5min后，以“94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s”循环32次，然后72℃延伸10min，最后4℃保存。
取3µl PCR产物，通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测（图4），PCR产物约为1400 bp。
5
、序列测定及序列拼接、比对
将剩余PCR产物溶液送华大基因（北京）纯化后采用PCR扩增的引物测序，并根据测得序列设计2个测序引物（PF：5’- ATTCATTGCCGCCGTAG-3’，PR：5’- GCCATGACTTCTAGGGGTT-3’），将PCR产物测通。序列拼接、比对采用DNAStar软件的SeqMan工具进行。
6
、
SHMT
的表达分析
以接种后9天（不接种和接种2个处理）和15天（不接种和接种2个处理）共4个RNA样品为试验材料，进行SHMT定量表达研究。
根据野生大豆ZYD03685 SHMT 的cDNA序列设计引物，正向引物为5’- GGGTATAAGGTGGAGAAACTCTGT -3’，反向引物为5’- AGATCTTCAATAGCCTTGTTGTTG
-3’，扩增片段长度269bp。采用SYBR premix Ex TaqTM (TaKaRa，Japan)试剂盒，在ABI PRISM 7900HT上实时荧光定量PCR，程序为：95℃ 30s，以“95℃ 5s，60℃ 30s”循环40次，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 5s。相对表达量采用2-CT△△法进行计算。内参基因为GmActin。
比较不同时期接种处理与对照（不接种）SHMT的表达量差异发现，接种处理的野生大豆SHMT表达量明显较高（图1），表明SHMT参与了野生大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性。
（三）
SHMT
3504 SNP
位点新等位基因
C
的分型
1
、标记开发及
PCR
扩增
参照ZYD03685 SHMT序列，针对C位点设计1个分子标记，其特异引物（上游引物）序列为5'- GTGTGATTGTTTTGCAGAGC-
3'，下游引物序列为5'-
GATGAGATCTTGTTTCCAATTGAGT - 3'，预期PCR产物大小为196 bp。利用2×TransTaq-T PCR SuperMix 试剂盒进行DNA水平的PCR扩增。PCR反应体系为15µl，其中包括1×TransTaq-T PCR SuperMix，0.32µM正向引物，0.32µM反向引物，30 ng DNA。PCR反应在BIO-RAD MyCycler®热循环仪上进行，程序为：94℃预变性5min后，以“94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s” 循环30次，然后72℃延伸10min，最后4℃保存。
2
、琼脂糖凝胶电泳检测
上述PCR产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果在196 bp处出现电泳谱带，表明基因组中含有C等位基因。因此，开发的分子标记为显性标记，可将含有C等位基因的纯化体和杂合体检测出来。利用开发的分子标记对10个DNA样品的基因型进行了重复鉴定，结果表明，C基因型检测与测序获得的基因型完全吻合，准确率为100%（图5）。
Claims (2)
1.大豆SHMT新等位基因，其特征在于：根据SHMT参照序列（Genbank登录号JQ714083.1），设计PCR引物，在高抗胞囊线虫3号和6号生理小种的野生大豆种质ZYD03685中克隆到SHMT并测序，通过与参照序列比较，在SHMT（Genbank登录号JQ714083.1）3504 SNP位点发现了新等位基因型C，编码氨基酸His，野生大豆种质ZYD03685 SHMT核苷酸序列具有如下特征：DNA水平1344位置和cDNA水平1072位置的碱基为C，编码的氨基酸为His（CAT）；
核苷酸序列（DNA水平）
表明野生大豆种质ZYD03685 SHMT参与了野生大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性。
2.大豆SHMT新等位基因，其特征在于所述的检测大豆SHMT（Genbank登录号为JQ714083.1）3504 SNP位点新基因型C的分子标记，该标记为显性标记，能够检测出含有C基因型的纯化体和杂合体，适于检测栽培大豆和野生大豆具有C基因型的样品，可用于基因资源检测和分子标记辅助选择，其具体检测方法如下：针对SNP位点的新等位基因，设计上游引物序列为5'- GTGTGATTGTTTTGCAGAGC- 3'，该引物3'第1个碱基能够与新等位基因型特异结合，为了提高PCR特异性，在该引物3’端第3个碱基人为引入错配碱基，PCR扩增的下游引物序列为5'-
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