CN104789661B - 大豆胞囊线虫抗性相关Map-5041SNP标记的芯片检测方法及应用 - Google Patents

大豆胞囊线虫抗性相关Map-5041SNP标记的芯片检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了大豆胞囊线虫抗性相关Map‑5041SNP标记的芯片检测方法及应用。本发明提供了检测大豆基因组中Map‑5041SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性中的应用。还提供了检测大豆基因组中Map‑5041SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性产品中的应用。本发明的实验证明,本发明筛选出Map‑5041SNP位点,通过检测其的基因型可以在品种早期对育种材料进行大豆胞囊线虫3号生理小种抗性,极大提高了育种过程中抗病品种的选择效率、缩短育种时间,对于抗大豆胞囊线虫品种的培育效果显著。

Description

大豆胞囊线虫抗性相关Map-5041SNP标记的芯片检测方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及大豆胞囊线虫抗性相关Map-5041SNP标记的芯片检测方法及应用。
背景技术
大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode,SCN)具有分布广,危害重,传播途径多,寄主范围广,存活时间久等特点,是一种极难防治的土传病害,其发生可对大豆生产造成毁灭性打击,目前,该病害具有蔓延及日趋加重的趋势,已经严重制约了大豆生产。实践证明,培育和种植抗病品种是防治病害的最有效途径。由于SCN抗性基因在遗传上的复杂性和大豆胞囊线虫生理小种的多样性,利用传统抗病表型鉴定和育种方法培育抗大豆胞囊线虫病的品种不但需要花费很长的时间,而且难于成功,已经不能够满足当前抗线育种的发展。随着分子标记的开发和使用,分子标记辅助选择(Molecular marker-assisted selection,MAS)成为可以节约人力、物力和加速育种进程的有效方法(Cregan et al.1999)。MAS的最大优点是在不需要评估表型特征的情况下,通过确认是否带有目标基因而鉴定出抗性植株。
经典遗传分析表明,大豆胞囊线虫的抗性是受多个位点控制的数量性状,其中Rhg4是主效的抗病基因,已被克隆(Liu et al.Nature,2012)。从该抗病区间内发掘抗病分子标记可为MAS提供有效的标记资源,满足育种需要。关联分析,又称关联作图(Association Mapping),是一种以LD(Linkage Disequlibrium)分析为基础,直接对基因型变异和表型变异进行分析,从而把那些与性状有关联的基因鉴定出来(Khush etal.2001),关联分析方法已成为发掘与表型相关分子标记的强有力工具。新型分子标记—SNP因为具有在基因组中数量多、分布广泛、可高通量检测等优点而在近年广泛用于鉴定多基因控制的复杂性状。随着SNP标记数量的不断增多,高通量的SNP分型平台不断推出,包括BeadArray(Illumina),GenomeLab SNP stream(Beckman)和MegAllele(Affymetrix)等,其中Illumina公司的BeadArray芯片鉴定技术具有高效、高通量、成本低、准确性好等优点,适合位点数从几十到几千的中等通量基因分型研究,实验成功率>99%,是理想的中等通量基因分型检测的解决方案,目前已被广泛用于人类、拟南芥、水稻等物种的SNP分型。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质的用途。
本发明提供的检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性中的应用。
所述检测Map-5041SNP位点的多态性(即等位基因)或基因型具体可为检测Map-5041SNP位点的核苷酸种类。
本发明另一个目的是提供检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质的另一个用途。
本发明提供了检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性产品中的应用。
本发明第三个目的是提供检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质的第三个用途。
本发明提供的检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定抗病大豆中的应用;所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病;
或检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗病大豆产品中的应用;所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病。
本发明第四个目的是提供检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质的第四个用途。
本发明提供了检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的单核苷酸多态性中的应用;
或检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的单核苷酸多态性产品中的应用。
本发明第五个目的是提供检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质的第五个用途。
本发明提供了检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在筛选或辅助筛选抗病大豆中的应用;所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病;
或检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在制备筛选或辅助筛选抗病大豆产品中的应用;所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病。
上述应用中,所述大豆基因组中Map-5041SNP位点基因型为TT或GG;
所述Map-5041SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的Glyma.08g104600基因的第932位;所述Glyma.08g104600基因的核苷酸序列为序列1。
所述检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质包括Map-5041SNP固定用于检测Map-5041SNP位点的探针组的SNP基因型芯片;
所述探针组由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明的第六个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性的方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:检测待测大豆基因组Map-5041SNP位点基因型,若所述待测大豆基因组Map-5041SNP位点基因型为TT,则所述待测大豆为或候选为抗病品种;若所述待测大豆基因组Map-5041SNP位点基因型为GG,则所述待测大豆不为或候选不为抗病品种;所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病;
所述检测待测大豆基因组Map-5041SNP位点基因型采用下述固定用于检测Map-5041SNP位点的探针组的SNP基因型芯片检测。
本发明第六个目的是提供检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质。
本发明提供的检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质,为a)-d)中的任一种产品:
a)鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性的产品;
b)鉴定或辅助鉴定抗病大豆的产品;所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病;
c)鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的单核苷酸多态性产品;
d)筛选或辅助筛选抗病大豆产品;所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病;
所述Map-5041SNP位点的所在基因为大豆基因组第8条染色体的Glyma.08g104600基因;所述Glyma.08g104600基因的核苷酸序列为序列1;
所述Map-5041SNP位点为序列表中序列1第932位。
上述产品中,所述检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质包括Map-5041SNP固定用于检测Map-5041SNP位点的探针组的SNP基因型芯片;
所述探针组由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明的实验证明,本发明筛选出Map-5041SNP位点,通过检测其的基因型可以在品种早期对育种材料进行大豆胞囊线虫3号生理小种抗性,极大提高了育种过程中抗病品种的选择效率、缩短育种时间,对于抗大豆胞囊线虫品种的培育效果显著。
具体实施方式
下面实施例中表3的高代品系是以中国农业科学院作物科学研究所繁育的中品03-5373(张姗姗等,作物学报,2013,39(10):1746-1753)为母本、中黄13(ZDD23876)为父本杂交构建F2群体、株行混收法繁殖F2-4、单粒传法繁殖F5~F10而衍生的F5:10代 高代品系。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、Map-5041SNP位点是与大豆胞囊线虫3号生理小种抗病相关的单核苷酸多态性
Map-5041单核苷酸多态性位点位于Glyma.08g104600基因核苷酸序列(序列1)第932位,其基本信息见表1。
表1、Map-5041SNP单核苷酸多态性位点基本信息
二、Map-5041SNP基因型与大豆胞囊线虫3号生理小种抗病的关联分析
1、大豆品种对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗病检测
将表2和表3中的大豆品种均在田间病圃与温室两种环境条件下接种大豆胞囊线虫3号生理小种。在田间采用完全随机区组试验设计方案,重复三次。田间种植行宽0.65米,行长1.5米,株间距0.05米。温室采用盆栽鉴定,每个品种种植3盆,每盆种植5株。出苗30天后,对田间和温室的每份材料均随机选择长势相同10株进行鉴定,数每株胞囊数,计算每个鉴定品种的平均胞囊数。为了检测胞囊指数(Female Index,FI)差异,每隔40行以中品03-5373作为抗病对照,中黄13作为感病对照。以基于胞囊指数划分的抗病等级评估每个品种的抗性。胞囊指数的计算公式为FI=(鉴定品种每株平均胞囊数/感病对照品种的平均胞囊数)X 100%,每份材料以离其最近的中黄13为感病对照品种)。抗感分级标准如下,FI=0-9为抗病(Resistant,R);FI=10-29为中抗(moderately resistant,MR);FI=30-59为中感(moderately susceptible,MS);FI=60+为感病(susceptible,S),结果如表2和表3所示。
2、基因型芯片检测SNP基因型
1)、Map-5041SNP位点基因型芯片的制备
根据自主开发的全基因组SNP数据集,筛选Rhg4区间(长度为2.8Mb)的Map-5041SNP位点设计成Map-5041SNP位点基因型鉴定芯片,具体如下:
根据SNP位点分析设计和人工合成Map-5041SNP探针组:
探针A:ACTTCGTCAGTAACGGACGTGAACCCTAACAGAAACGTGCGTAT(序列2);
探针B:GAGTCGAGGTCATATCGTGTGAACCCTAACAGAAACGTGCGTAG(序列3);
探针C:CACGAGTGTTATTACCCATTGTCCGCTGTTTGGGTCAGTACATACGTCTGCCTATAGTGAGTC(序列4);
Map-5041SNP位点基因型芯片为将上述人工合成的Map-5041SNP探针组的3条探针均固定到芯片(美国Iillumina公司)上,得到Map-5041SNP位点基因型芯片。
2)、基因型检测
利用Iillumina的SNP检测平台对表2中所示的133个大豆品种和表3中所示的244个大豆高代品系进行SNP基因型鉴定,具体如下:
(1)、提取各个品种的基因组DNA 250ng。
(2)、将待检测DNA样品加入含有预先根据SNP位点设计的探针组OPA的芯片微珠。
(3)、芯片的微珠上连接有地址序列的互补序列,通过地址序列完成杂交,并在芯片上进行单核苷酸碱基延伸,得到一段包含该SNP位点的片断。
(4)、清洗和扫描芯片。
(5)、利用BeadArray Reader软件根据荧光颜色判读并输出分型结果,确定待测品种的基因型。结果如表2所示。
表2为大豆品种Map-5041SNP位点基因型
上述表2涉及的品种均记载在如下文献中:王国勋.中国大豆品种资源目录.北京:中国农业出版社,1982;常汝镇,孙建英.中国大豆品种资源目录:续编一.北京:农业出版社,1991;常汝镇,孙建英,邱丽娟,陈一舞.中国大豆品种资源目录:续编二.北京:中国农业出版社,1996;张姗姗,李英慧,李金英,邱丽娟.优良品系中品03-5373系谱的遗传解析及抗大豆胞囊线虫病相关标记鉴定.作物学报,2013,39(10):1746-1753.
表3为中品03-5373和中黄13衍生的217个大豆高代品系Map-5041SNP位点基因型
品系名称 胞囊指数(%) 抗性 Map-5041位点基因型
R3 166.06 感病 GG
R4 178.57 感病 TT
R5 83.11 感病 GG
R6 109.69 感病 GG
R7 106.35 感病 TT
R8 95.94 感病 GG
R9 114.92 感病 TT
R11 117.47 感病 TT
R12 80.89 感病 TT
R14 148.09 感病 TT
R15 122.51 感病 TT
R19 87.24 感病 GG
R21 98.42 感病 TT
R23 102.33 感病 TT
R24 131.68 感病 GG
R25 122.47 感病 GG
R26 156.04 感病 TT
R27 6.45 抗病 TT
R28 179.79 感病 GG
R29 107.79 感病 GG
R30 159.20 感病 TT
R31 88.56 感病 GG
R32 155.61 感病 TT
R33 170.74 感病 GG
R36 144.82 感病 GG
R37 0.77 抗病 TT
R38 128.96 感病 GG
R42 73.78 感病 GG
R43 96.91 感病 TT
R46 83.75 感病 GG
R48 0.25 抗病 TT
R49 112.95 感病 TT
R50 136.05 感病 GG
R51 113.41 感病 GG
R52 154.29 感病 GG
R53 147.36 感病 GG
R55 183.16 感病 TT
R56 100.49 感病 GG
R59 115.97 感病 GG
R60 115.16 感病 TT
R61 107.10 感病 TT
R62 0.26 抗病 TT
R63 100.55 感病 GG
R64 101.05 感病 GG
R65 65.59 感病 TT
R67 128.11 感病 GG
R68 66.71 感病 TT
R69 117.17 感病 TT
R70 81.79 感病 GG
R73 177.91 感病 GG
R74 78.46 感病 GG
R75 103.08 感病 GG
R76 114.22 感病 TT
R81 69.26 感病 GG
R82 0.18 抗病 TT
R83 160.78 感病 TT
R84 135.00 感病 TT
R85 141.00 感病 GG
R86 71.30 感病 TT
R87 113.27 感病 GG
R88 104.40 感病 GG
R89 144.00 感病 TT
R90 0.14 抗病 TT
R91 80.55 感病 TT
R92 121.23 感病 TT
R93 129.52 感病 TT
R94 97.44 感病 TT
R96 122.35 感病 TT
R97 1.68 抗病 TT
R98 106.54 感病 TT
R99 2.67 抗病 GG
R100 144.56 感病 GG
R102 124.39 感病 GG
R103 219.50 感病 GG
R104 100.34 感病 GG
R107 87.01 感病 TT
R108 96.74 感病 GG
R109 2.81 抗病 TT
R110 122.73 感病 GG
R111 106.04 感病 GG
R112 123.24 感病 TT
R113 68.49 感病 TT
R114 145.84 感病 TT
R115 85.97 感病 TT
R116 105.56 感病 GG
R118 91.84 感病 GG
R121 219.53 感病 TT
R122 212.09 感病 GG
R123 132.29 感病 GG
R125 197.85 感病 TT
R126 160.32 感病 GG
R128 98.93 感病 GG
R129 110.80 感病 TT
R130 95.43 感病 TT
R131 169.61 感病 TT
R132 0.57 抗病 TT
R133 121.63 感病 GG
R134 100.31 感病 GG
R135 149.64 感病 TT
R136 0.61 抗病 TT
R137 157.02 感病 TT
R139 128.23 感病 GG
R141 150.77 感病 GG
R142 101.42 感病 TT
R143 0.30 抗病 TT
R144 153.95 感病 TT
R145 97.31 感病 GG
R146 157.03 感病 GG
R147 0.87 抗病 TT
R148 140.44 感病 GG
R149 64.58 感病 GG
R150 64.62 感病 GG
R151 105.61 感病 GG
R152 195.49 感病 TT
R153 188.43 感病 GG
R154 84.10 感病 GG
R155 101.96 感病 GG
R156 159.30 感病 GG
R157 1.28 抗病 TT
R158 65.77 感病 GG
R161 2.70 抗病 TT
R162 76.22 感病 TT
R163 120.41 感病 GG
R164 122.80 感病 GG
R165 151.45 感病 TT
R166 154.51 感病 GG
R167 87.90 感病 TT
R168 0.50 抗病 TT
R170 148.23 感病 TT
R171 134.33 感病 GG
R172 0.44 抗病 TT
R173 113.55 感病 TT
R174 102.14 感病 TT
R175 216.91 感病 TT
R176 212.57 感病 TT
R177 335.64 感病 GG
R178 171.45 感病 TT
R179 112.90 感病 TT
R180 62.46 感病 GG
R181 74.19 感病 GG
R182 2.77 抗病 GG
R183 89.09 感病 GG
R184 99.15 感病 TT
R185 145.01 感病 TT
R186 60.37 感病 GG
R187 3.50 抗病 GG
R189 98.98 感病 GG
R190 108.60 感病 GG
R191 108.43 感病 TT
R193 3.16 抗病 TT
R195 65.03 感病 TT
R196 115.44 感病 TT
R197 5.26 抗病 GG
R204 63.28 感病 GG
R205 3.24 抗病 GG
R206 70.82 感病 GG
R207 82.88 感病 GG
R208 127.55 感病 GG
R209 99.44 感病 GG
R211 118.35 感病 GG
R214 76.47 感病 GG
R216 93.24 感病 TT
R217 92.48 感病 GG
R218 141.64 感病 TT
R220 62.54 感病 GG
R221 127.59 感病 TT
R222 121.21 感病 TT
R224 195.22 感病 GG
R226 166.09 感病 TT
R228 122.40 感病 GG
R229 108.12 感病 TT
R232 122.99 感病 GG
R233 162.19 感病 GG
R234 3.26 抗病 TT
R235 89.67 感病 GG
R236 70.02 感病 GG
R237 95.46 感病 GG
R238 110.48 感病 TT
R241 9.43 抗病 TT
R242 131.68 感病 TT
R243 165.67 感病 TT
R244 0.84 抗病 TT
R245 165.64 感病 TT
R246 103.17 感病 GG
R247 104.50 感病 GG
R248 109.63 感病 GG
R249 117.76 感病 GG
R250 70.86 感病 TT
R251 0.09 抗病 TT
R253 65.76 感病 TT
R256 0.22 抗病 TT
R257 119.26 感病 GG
R258 119.48 感病 TT
R259 151.47 感病 GG
R261 174.83 感病 GG
R262 140.95 感病 TT
R263 79.02 感病 GG
R264 91.27 感病 TT
R265 85.34 感病 GG
R266 102.76 感病 GG
R267 98.26 感病 GG
R268 164.98 感病 TT
R269 0.65 抗病 TT
R270 73.95 感病 GG
R271 64.35 感病 TT
R272 84.91 感病 GG
R274 86.66 感病 GG
R275 65.20 感病 TT
R280 105.12 感病 TT
R281 115.59 感病 GG
R282 182.45 感病 GG
R283 140.92 感病 GG
R284 131.92 感病 GG
R285 188.05 感病 GG
R287 137.53 感病 GG
R288 194.90 感病 TT
R289 206.12 感病 GG
表2结果显示,34个大豆抗病品种中31个品种的Map-5041 SNP位点的等位基因基因型为TT;17个大豆感病病品种中15个品种的Map-5041 SNP位点的等位基因基因型为GG。
计算表2中抗病品种或品系鉴定效率(携带TT等位基因的抗病品种/所有的抗病品种),抗病品种或品系鉴定效率为91.2%。
计算表2中感病品种或品系鉴定效率(携带GG等位基因的感病品种/所有的感病品种);感病品种鉴定效率为88.2%。
表3结果显示,中品03-5373和中黄13杂交衍生的28个抗病高代品系中,23个高代品系的Map-5041 SNP位点的等位基因基因型为TT;189个大豆感病高代品系中108个品种的Map-5041 SNP位点的等位基因基因型为GG。
计算表3中抗病高代品系鉴定效率(携带TT等位基因的抗病高代品系/所有抗病高代品系),抗病高代品系鉴定效率为82.1%。
计算表3中感病高代品系鉴定效率(携带GG等位基因的感病高代品系/所有感病高代品系),感病高代品系鉴定效率为57.1%。
上述方法可以用于鉴定待测大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性。

Claims (8)

1.检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫抗性中的应用;
所述大豆基因组中Map-5041SNP位点基因型为TT或GG;
所述Map-5041SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的第8041676位。
2.检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫抗性产品中的应用;
所述大豆基因组中Map-5041SNP位点基因型为TT或GG;
所述Map-5041SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的第8041676位。
3.检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫抗性相关的单核苷酸多态性中的应用;
所述大豆基因组中Map-5041SNP位点基因型为TT或GG;
所述Map-5041SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的第8041676位。
4.检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫抗性相关的单核苷酸多态性产品中的应用;
所述大豆基因组中Map-5041SNP位点基因型为TT或GG;
所述Map-5041SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的第8041676位。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用,其特征在于:
所述大豆胞囊线虫为大豆胞囊线虫3号生理小种。
6.一种鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫抗性的方法,包括如下步骤:检测待测大豆基因组Map-5041SNP位点基因型,若所述待测大豆基因组Map-5041SNP位点基因型为TT,则所述待测大豆为或候选为抗病品种;若所述待测大豆基因组Map-5041SNP位点基因型为GG,则所述待测大豆不为或候选不为抗病品种;所述病为由大豆胞囊线虫引发的病;
所述大豆基因组中Map-5041SNP位点基因型为TT或GG;
所述Map-5041SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的第8041676位;
所述大豆胞囊线虫具体为大豆胞囊线虫3号生理小种。
7.检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的产品,为鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫抗性的产品;
所述Map-5041SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的第8041676位。
8.根据权利要求7所述的产品,其特征在于:所述检测大豆基因组中Map-5041SNP位点的多态性或基因型的物质包括固定用于检测Map-5041SNP位点的探针组的SNP基因型芯片;
所述探针组由序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成;
所述大豆胞囊线虫为大豆胞囊线虫3号生理小种。
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