CN116003563A

CN116003563A - 钙调素结合蛋白CaMBP13在调控植物耐冷性中的应用

Info

Publication number: CN116003563A
Application number: CN202111225754.3A
Authority: CN
Inventors: 种康; 张艳东; 张景昱; 刘栋峰
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2041-10-21

Abstract

本发明公开了钙调素结合蛋白CaMBP13在调控植物耐冷性中的应用。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质CaMBP13及其编码基因、相关生物材料在调控水稻耐冷性、培育耐冷性水稻中的应用。本发明通过对粳稻日本晴中CaMBP13基因进行敲除，得到了耐冷性大幅提高的转基因水稻，表现为转基因水稻的存活率显著高于野生型。说明CaMBP13基因负调控水稻对低温信号的响应，通过抑制CaMBP13蛋白及其编码基因的表达可以增强植物对低温胁迫的耐受性，提高植物的耐冷性。本发明对于培育耐冷水稻新品种、保证水稻的高产稳产具有重要意义。

Description

钙调素结合蛋白CaMBP13在调控植物耐冷性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及钙调素结合蛋白CaMBP13在调控植物耐冷性中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)属于禾本科三大谷类植物之一，为人类提供了主要食物来源。在水稻的生长发育过程中会受到各种各样的非生物胁迫，如低温、高温、干旱及盐胁迫等，导致作物减产，严重影响了粮食安全。水稻最早起源于淡水沼泽环境，是一种对低温胁迫高度敏感的作物，低温冷害严重限制了水稻生产力，是影响水稻产量的主要不利因素之一。研究低温胁迫对植物生长发育的影响，探索植物抗寒性的生理机制，挖掘植物耐冷相关基因，对于植物的低温驯化、抗寒品种的培育，防止寒害和冻害，保证水稻的高产稳产，有着重要的经济意义和社会意义。

钙调素结合蛋白(CaM binding protein，CaMBP)是一类能够和钙调素(钙调蛋白，Calmodulin，CaM)作用调节细胞生理功能的蛋白。钙调蛋白参与细胞内多种信号转导途径，并在Ca²⁺依赖性信号转导途径中起到关键作用，是动态Ca²⁺传感器，能够响应广泛的Ca²⁺浓度，并向下游传递信号。自1979年Charbonneau和Cormier首次纯化出植物细胞中CaM以来，CaMBP被逐渐发现并鉴定。随着技术进步，已有多种方法可以用来筛选CaMBP，主要包括：酵母双杂交、CaM探针(如35S-CaM和HRP-CaM)、免疫共沉淀和微矩阵等。植物体内的CaMBP种类繁多，涉及到离子通道和膜蛋白类、激酶及磷酸酶类、转录因子等。这些功能不同的CaMBP参与到多种生物体代谢进程，如离子运输、代谢途径、细胞增殖、细胞运动等，在植物生长发育、开花受精以及逆境胁迫等方面发挥重要作用。到目前为止，在植物中已鉴定到多种多样的CaMBP。据估计，植物中至少有50种功能明确的CaMBP，其中拟南芥全基因组CaMBP的数目达500余个，绝大多数未知CaMBP的特性和生理功能尚不清楚，仍有待深入研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的耐冷性，和/或，如何培育耐冷性植物。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

A1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物耐冷性中的应用；

A2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物耐冷性的产品中的应用；

A3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育耐冷性植物中的应用；

A4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育耐冷性植物的产品中的应用；

A5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质为钙调素结合蛋白(CaM binding protein，CaMBP)，名称为CaMBP13，可为下述任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有10％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

B3)在B1)或B2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

为了使B1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质CaMBP13的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质CaMBP13的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质CaMBP13且具有蛋白质CaMBP13功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述10％以上的同一性可为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、以上的同一性。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

上述应用中，所述蛋白质CaMBP13可来源于水稻(Oryza sativa)，B2)所述的蛋白质为CaMBP13/-1bp，所述CaMBP13/-1bp的氨基酸序列是SEQ ID No.4。

进一步地，所述蛋白质CaMBP13可来源于粳稻日本晴(Oryza sativa sppjaponica cv Nipponbare，NIP)。

本发明还提供了与所述蛋白质CaMBP13相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)与所述蛋白质CaMBP13相关的生物材料在调控植物耐冷性中的应用；

D2)与所述蛋白质CaMBP13相关的生物材料在制备调控植物耐冷性的产品中的应用；

D3)与所述蛋白质CaMBP13相关的生物材料在培育耐冷性植物中的应用；

D4)与所述蛋白质CaMBP13相关的生物材料在制备培育耐冷性植物的产品中的应用；

D5)与所述蛋白质CaMBP13相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述E1)至E8)中的任一种：

E1)编码所述蛋白质CaMBP13的核酸分子；

E2)抑制或降低所述蛋白质CaMBP13的编码基因表达的核酸分子；

E3)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的表达盒；

E4)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组载体、或含有E3)所述表达盒的重组载体；

E5)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的重组微生物、或含有E3)所述表达盒的重组微生物、或含有E4)所述重组载体的重组微生物；

E6)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有E3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

E7)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E3)所述表达盒的转基因植物组织；

E8)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E3)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，E1)所述核酸分子可为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子；

F3)编码序列是SEQ ID No.5的cDNA分子；

F4)核苷酸序列是SEQ ID No.6的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的cDNA分子(耐冷相关基因CaMBP13的编码DNA分子)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质CaMBP13。

SEQ ID No.5所示的cDNA分子(CaMBP13/-1bp基因的编码DNA分子)编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质CaMBP13/-1bp。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体，具体可为BGK03载体。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。具体可为大肠杆菌Trans5α。

所述重组载体具体可为pTYCRISPR-CaMBP13。所述重组载体pTYCRISPR-CaMBP13含有两个编辑靶点(SEQ ID No.2的第236-258位和第511-533位)和Cas9蛋白的编码基因，导入受体水稻后，转录的两个向导RNA通过碱基互补配对可以靶向受体水稻基因组PAM附近的目标序列，即靶向CaMBP13基因，Cas9蛋白使CaMBP13基因上下游的DNA双链断裂，通过生物体自身的DNA损伤修复应答机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现对CaMBP13基因的敲除。

本发明还提供了一种培育耐冷性植物的方法，所述方法包括降低目的植物中所述蛋白质CaMBP13的含量和/或活性，得到耐冷性高于所述目的植物的耐冷性植物。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质CaMBP13的含量和/或活性通过降低目的植物中所述蛋白质CaMBP13的编码基因的表达量和/或活性实现。

上述方法中，所述降低目的植物中所述蛋白质CaMBP13的编码基因的表达量和/或活性可为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质CaMBP13的编码基因活性下降或失活。

上述方法中，所述利用基因编辑技术使植物基因组中所述蛋白质CaMBP13的编码基因活性下降或失活可以是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2的第236-258位和第511-533位。

所述培育耐冷性植物的方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育耐冷性植物的方法包括如下步骤：

(1)构建靶向编辑SEQ ID No.2的第236-258位和第511-533位的CRISPR/Cas9重组载体pTYCRISPR-CaMBP13；

(2)将步骤(1)构建的重组载体pTYCRISPR-CaMBP13导入目的植物(如粳稻日本晴)中；

(3)经筛选和鉴定获得耐冷性高于所述目的植物的耐冷性植物。

本发明还提供了一种制备耐冷性提高的水稻的方法，所述方法包括如下步骤:将水稻基因组中的序列表中的SEQ ID No.3所示的CaMBP13基因突变为CaMBP13/-1bp基因，得到耐冷性提高的水稻；所述CaMBP13/-1bp基因的编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子。

所述CaMBP13/-1bp基因的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.6。

本文中，所述植物可为G1)或G2)或G3)：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)禾本科植物；

G3)水稻。

本发明还提供了所述培育耐冷性植物的方法在创制耐冷性植物和/或植物育种中的应用。

所述植物育种可为作物(如水稻)耐冷性转基因育种。

本文所述调控植物耐冷性(植物忍耐冷害的能力)可为提高植物耐冷性或降低植物耐冷性。

所述CaMBP13蛋白或其编码基因在目的植物中的表达量和/或活性降低，植物的耐冷性提高。

本文中，所述耐冷性植物理解为不仅包含将所述CaMBP13基因敲除得到的第一代转基因植物，也包括其子代。所述耐冷性植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明要求保护的培育耐冷性提高的转基因植物(耐冷性植物)的方法，可包括如下步骤：对受体植物(目的植物)中能够表达CaMBP13蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比耐冷性提高。

其中，所述对受体植物中能够表达CaMBP13蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述受体植株中的表达。

在本发明的一个实施方案中，对受体植物中能够表达CaMBP13蛋白的核酸分子进行抑制表达具体是通过CRISPER/Cas9技术实现的：以SEQ ID No.3所示DNA片段存在的基因组中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，所述靶序列具体为：

靶点一：

3’-CCTCTCATTTTGCTGCTGCATCA-5’或

5’-TGATGCAGCAGCAAAATGAGAGG-3’；

靶点二：

3’-CCTTTTTGAGGTCGTCCAGGTAC-5’或

5’-GTACCTGGACGACCTCAAAAAGG-3’。

在上述方法中，将重组表达载体或基因编辑载体导入所述受体植物，包括但不限于：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明通过对粳稻日本晴(Oryza sativa spp japonica cv Nipponbare，NIP)中的钙调素结合蛋白(CaM binding protein，CaMBP)CaMBP13基因(CaMBP13基因)进行基因敲除，得到了14株CaMBP13基因相应靶点位置碱基发生突变的水稻(转基因水稻)。实验证明，与没有进行CaMBP13基因敲除的野生型水稻(NIP)相比，CaMBP13基因敲除水稻(oscambp13-1)显示出了优良了耐冷性。低温胁迫前，野生型水稻(NIP)与目的植物中CaMBP13基因的表达受到抑制的植株(CaMBP13基因敲除水稻oscambp13-1)生长状况及存活率基本无差异，低温胁迫后，与野生型水稻(NIP)相比，目的植物中CaMBP13的表达受到抑制植株(CaMBP13基因敲除水稻oscambp13-1)耐冷性大幅提高，表现为存活率显著高于野生型(显著性差异分析通过Student’s t-test完成，**表示p<0.001)。结果表明，CaMBP13蛋白及其编码基因可以调控植物的耐冷性，CaMBP13基因负调控水稻对低温信号的响应，通过抑制CaMBP13蛋白及其编码基因的表达可以增强植物对低温胁迫的耐受性，显著提高植物的耐冷性。

本发明首次发现了钙调素结合蛋白CaMBP13及其编码基因在调控植物耐冷性中的应用，对于培育耐冷植物新品种、保证植物的高产稳产具有重要意义和广泛的应用前景。

附图说明

图1为克隆的CaMBP13基因的cDNA条带。

图2为CRISPR/Cas9突变体中CaMBP13基因突变靶点位置及突变形式示意图和对应测序峰图。图2中A为CRISPR/Cas9突变体中CaMBP13基因突变靶点位置及突变形式示意图。突变体株系突变位点位于第三外显子上，突变形式为缺少1个碱基。浅色核苷酸代表靶点序列，(-)代表缺失碱基；图2中B为对应测序峰图。

图3为CaMBP13基因CRISPR/Cas9突变体材料低温耐受表型分析。三叶期野生型(WT)和oscambp13-1幼苗在4℃低温处理96h，恢复生长35d表型，bars＝5cm；以及恢复生长35d后的CaMBP13-1突变体与WT幼苗存活率统计，存活率为3次生物学重复的平均值，bars代表SD。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CaMBP13蛋白及其编码基因在调控水稻耐冷性中的应用

本实施例涉及一种来源于粳稻日本晴(Oryza sativa spp japonica cvNipponbare，NIP)的耐冷相关蛋白，其名称为CaMBP13，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。CAMBP13基因的cDNA序列(CDS)如SEQ ID No.2所示，基因组序列如SEQ ID No.3所示。SEQID No.3中，第1-98位、699-788位、1339-1468位、2057-2103位、3083-3197位、3527-3562位、3888-4048位、4181-4376位、4481-4645位、4727-4879位、4969-5057位、5194-5232位、5269-5490位、7312-7974位为外显子；第99-698位、789-1338位、1469-2056位、2104-3082位、3198-3526位、3563-3887位、4049-4180位、4377-4480位、4646-4726位、4880-4968位、5058-5193位、5233-5268位、5491-7311位为内含子。

一、编码基因CaMBP13的克隆

为获得编码基因CaMBP13的CDS序列，设置5′引物(ATGTCTGTAGCCCTGCCTCAGGATC)，3′引物(CTAGAAACTCCCCGCAAAGAAGGGAGGAG)。提取粳稻日本晴全株RNA，反转录成为cDNA，运用合成好的引物PCR扩增出CDS序列。具体步骤如下：

1、植物RNA提取

植物RNA提取过程使用的试剂盒为Magen公司的HiPure Plant RNA Mini Kit。使用的试剂、研钵、试管和枪头等均为RNase-free以防止RNase污染。收集生长到三叶期的粳稻Nipponbare样品，迅速放置液氮中，用低温打样机迅速将样品研磨至细小的粉末，转移至1.5mL离心管中；加入500μL裂解液Buffer RL，涡旋震荡充分打散样品，室温静置3分钟；室温14000×g离心5分钟；将离心后的上清转移到gDNA Filter Column过滤柱中，过滤柱放入2mL收集管中，14000×g离心2分钟；在过滤后的溶液中加入250μL的无水乙醇，吹吸混匀；取上一步中700μL滤液转移至HiPure RNA Mini Column过滤柱中，过滤柱放入2mL收集管，14000×g离心1分钟，弃废液；加入500μL Buffer RW1，12000×g离心1分钟，弃废液；加入500μL Buffer RW2(已加入适量无水乙醇)，12000×g离心1分钟，弃废液；12000×g离心2分钟，去除残留的乙醇；将HiPure RNA Mini Column过滤柱转移至一个干净的1.5mL RNase-free离心管中，滴加30～50μL的RNase-free ddH₂O至膜中央，室温静置2分钟后12000×g离心2分钟，收集RNA；将提取成功的RNA保存于-80℃备用。

2、反转录为cDNA

使用赛默飞公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits进行反转录第一链cDNA的合成。所有操作均在冰上进行。取步骤1中备用待反转录的RNA 2μg，加RNase-free H₂O至10μL；使用试剂盒内的试剂配制2×RT master mix，于冰上温和混匀，成分如下：10×RT Buffer 2.0μL；25×dNTP Mix 0.8μL；10×RT Random Primers 2.0μL；MultiScribe^TM Reverse Transcriptase 1.0μL；RNase抑制剂1.0μL；Nuclease-free H₂O3.2μL。

将2×RT master mix和RNA混合，按照25℃10min→37℃120min→85℃5min，4℃的条件进行反转录；将反转录得到的cDNA保存于-20℃备用。

3、PCR扩增

取步骤2中的cDNA模板，按照以下体系进行PCR扩增：10μL 2×Taq聚合酶(北京康为世纪生物科技有限公司)、7μL ddH₂O、2μL cDNA、0.5μL 5′引物、0.3μL3′引物(引物序列如前所述)。设定PCR扩增程序：95℃2min(预变性)，进入循环95℃30S(变性)→55℃30S(复性)→72℃90s(延伸)循环次数为35次，后进入72℃(终延伸)10min。

将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分离。得到如图1所示的大概为2418bp左右的条带。使用OMEGA DNA胶回收试剂盒(北京鸿跃创新科技有限公司)进行凝胶回收，得到的产物进一步测序分析，所得序列结果与编码CaMBP13蛋白的核酸分子序列(SEQ ID No.2)一致，为基因CaMBP13的CDS序列。

二、重组载体的构建

构建CRISPR/Cas9重组载体对CaMBP13基因进行基因敲除。以SEQ ID No.3所示DNA片段存在的基因组中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。设计的靶序列为：

靶点一：

3’-CCTCTCATTTTGCTGCTGCATCA-5’或

5’-TGATGCAGCAGCAAAATGAGAGG-3’；

靶点二：

3’-CCTTTTTGAGGTCGTCCAGGTAC-5’或

5’-GTACCTGGACGACCTCAAAAAGG-3’。

根据上述设计的靶点构建CRISPR/Cas9重组载体。步骤如下：

oligo引物：

5’端引物：5’-GCAGGTCTCATGTGTGATGCAGCAGCAAAATGAGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT-3’；

3’端引物：5’-GCAGGTCTCTAAAACCCTTTTTGAGGTCGTCCAGGTACTGCCACGGATCATCTGCA-3’。

划线部分为在基因上下游的两个靶点。用oligo引物对U3质粒进行扩增，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，对目的条带进行切胶回收(OMEGA DNA胶回收试剂盒)。

扩增产物序列如SEQ ID No.7所示。

取2μL BGK03载体(记载在如下文献中：Yuming Lu et al.,Genome-wideTargeted Mutagenesis in Rice Using the CRISPR/Cas9 System.Molecular Plant,2017Sep 12；10(9):1242-1245.，公众可从中国科学院植物研究所即申请人处获得，以重复本发明的实验用)，用BasI酶进行酶切，酶切体系如下：

37℃酶切2小时，酶切产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，切下15,000bp线性化的BGK03大片段进行回收，最终产物用30μL的ddH₂O溶解，得到线性化的BGK03载体。

取PCR扩增产物(SEQ ID No.7)3μL，线性化的BGK03载体1μL，T4连接酶1μL，T4连接酶缓冲液1μL，补水至总体积10μL。室温连接1h后转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞(北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品)。经卡那霉素的抗性平板进行筛选，第二天挑取生长的阳性克隆，提取质粒后经测序验证，将其命名为pTYCRISPR-CaMBP13。

所述质粒pTYCRISPR-CaMBP13(重组载体pTYCRISPR-CaMBP13)含有两个编辑靶点(SEQ ID No.2的第236-258位和第511到533位)和Cas9蛋白的编码基因，导入受体水稻后，转录的两个向导RNA通过碱基互补配对可以靶向受体水稻基因组PAM附近的目标序列，即靶向CaMBP13基因，Cas9蛋白使CaMBP13基因上下游的DNA双链断裂，通过生物体自身的DNA损伤修复应答机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现对CaMBP13基因的敲除。

三、转基因水稻的构建及鉴定

1、转基因水稻的构建

将实施例1构建的重组载体pTYCRISPR-CaMBP13通过根癌农杆菌EHA105的介导导入粳稻日本晴(Oryza sativa spp japonica cv Nipponbare，NIP)的愈伤组织中，再用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤4-5遍，无菌滤纸吸干后转至N₆D₂S₁培养基上，筛选一代；两周后，转移至N₆D₂S₂培养基上筛选二代(2周/代)；取出经过3代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织，转移至分化培养基(1)上，在分化培养箱(光周期设定为12小时光照，12小时黑暗，白天28℃，夜晚25℃)中培养7天；然后转移至分化培养基(2)上，在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的植株在生根壮苗培养基上生根壮苗；待小苗长至10厘米左右时，打开容器封口膜，炼苗2-3天，然后将小苗移入人工气候室栽培，获得共20棵T0代转基因水稻，命名为EHA105/pTYCRISPR-CaMBP13。

上述方法中，所用培养基如表1。

表1培养基

2、转基因水稻的鉴定

为鉴定重组质粒pTYCRISPR-CaMBP13是否成功转入水稻中并且引起水稻基因CaMBP13相应靶点位置碱基发生突变，根据数据库分析结果，在包含两个靶点的DNA序列内设置引物，5′引物(TGATGCAGCAGCAAAATGAGAGG)，3′引物(CCTTTTTGAGGTCGTCCAGGTAC)。进行PCR扩增，设定PCR扩增程序：95℃2min(预变性)，进入循环95℃30S(变性)→59℃30S(复性)→72℃1min(延伸)循环次数为35次，后进入72℃(终延伸)10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现明显条带后送公司测序，结果共鉴定出14株CaMBP13基因相应靶点位置碱基发生突变的水稻，将这14棵幼苗移至温室栽培，按照不同株系收种，得到CaMBP13基因相应靶点位置碱基发生突变的水稻的T1代种子。在此基础上经过海南繁种得到的纯合CaMBP13基因相应靶点位置碱基发生突变的水稻T2代植株。所选取进一步进行表型观察的纯合突变形式(即选取CRISPR/Cas9突变体中的1个CaMBP13基因敲除突变株系，命名为oscambp13-1)如图2所示。

CaMBP13基因敲除突变株系oscambp13-1与日本晴(野生型水稻)相比，对于CaMBP13基因，两条同源染色体中CaMBP13基因均突变为CaMBP13/-1bp基因，CaMBP13/-1bp基因是将序列表中SEQ ID No.2的第251位的核苷酸缺失、保持SEQ ID No.2的其他核苷酸不变得到的DNA分子，导致移码突变，从而将CaMBP13基因敲除；CaMBP13/-1bp基因的编码序列是序列表中SEQ ID No.5，编码由88个氨基酸组成的蛋白质CaMBP13/-1bp(SEQ IDNo.4)。

四、水稻的低温耐受性(耐冷性)检测

对野生型水稻以及CaMBP13基因敲除转基因水稻进行低温胁迫处理，观察处理前后水稻幼苗的表型，进而分析转基因水稻幼苗对于低温胁迫的耐受性。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：

将步骤三的纯合T2代CRISPR/Cas9突变体(oscambp13-1)植株所结的种子(T3代)，野生型对照粳稻日本晴(NIP)的种子分别在水中37℃萌发后，置于木村B培养液里，在光照培养箱中(光强为10000μmol/m²/s，光照时间为16h/d，温度为30℃)培养至三叶期；再将三叶期幼苗的根(每个株系32株)置于4℃低温循环冷水浴(水温4℃±1℃)中，突变体材料(oscambp13-1)及其野生型对照(NIP)处理4天，然后转移至木村B培养液中，于光照培养箱(光强为10000μmol/m²/s，光照时间为16h/d，30℃恢复生长35d，拍照、统计存活率。

如图3所示，低温处理前，与野生型NIP相比，纯合T2代CRISPR/Cas9突变体oscambp13-1的生长状况无显著差异；经低温处理和恢复生长后，野生型NIP的平均存活率为17.2％，纯合T2代CRISPR/Cas9突变体oscambp13-1平均存活率为85.2％，由此可以看出，纯合T2代CRISPR/Cas9变体对低温耐受，说明CaMBP13基因负调控水稻对低温信号的响应。

因此可以看出，在野生型NIP中敲除CaMBP13基因使NIP耐冷性明显提高，表明CaMBP13基因的缺失提高了植物对低温胁迫的耐受性，CaMBP13蛋白及其编码基因CaMBP13可以调控水稻的耐冷性。

上述实例中的木村B培养液，具体配方如下(参见表2)：1L木村B培养液由1ml大量元素母液、1ml微量元素母液、1ml铁盐母液、1ml硅酸钠母液与蒸馏水组成，用6mol/L HCl调木村B培养液pH值为5.8；木村B母液购于北京酷来搏科技有限公司。

表2木村B培养液成分表

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 钙调素结合蛋白CaMBP13在调控植物耐冷性中的应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 805

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

Met Ser Val Ala Leu Pro Gln Asp His Glu Glu Asn Asp Asp Glu Gly

1 5 10 15

Ser Gln Arg Ser Pro Pro Ala Lys Arg Leu Arg Asn Ser Cys Asp Phe

20 25 30

Asp Arg Ser Thr Phe Arg Leu Arg Ser Asn Ile Leu Phe Pro Asn Phe

35 40 45

Tyr Ser Leu Val Phe Tyr Ala His Ala Ser Arg Thr Ala Lys Cys Asp

50 55 60

Lys Gln Thr Glu Met Leu Gln Glu Ile Leu Arg Met Asn Arg Met Met

65 70 75 80

Gln Gln Gln Asn Glu Arg Ile Lys Leu Val Leu Arg Glu Asn Gln Glu

85 90 95

Leu Arg Glu Lys Val Ser Ser Leu Thr Ala Ala Ile Ser Glu Val Val

100 105 110

Gly Tyr His Lys Arg Ile Pro Ala Pro Arg Met Leu Pro Asp Gln Asn

115 120 125

Cys Ser Glu Pro Leu Arg Leu Gln Phe Val Asn Ser Cys Ser Asn Asp

130 135 140

Lys Tyr Ser Thr His Lys Ile Glu Ala Asp Asp Glu Ser Pro Leu Gln

145 150 155 160

Trp Thr Glu Glu Tyr Phe Arg Ser Lys Ile Val Pro Gly Arg Pro Gln

165 170 175

Lys Gly His Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Phe Arg Leu Gln Asn Gly

180 185 190

Val Gly Tyr Leu Asn Ala Lys Phe Gln Asp Asn Ser Ser Phe Val Pro

195 200 205

Ser Lys Lys Phe Lys Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Glu Arg Ile Ser

210 215 220

Glu Arg Ile Gln Glu Gly Ile Thr Glu Ser Phe Ala Val Lys Asp Val

225 230 235 240

Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Lys Asn Pro Asn Pro Ser Pro Arg Asp Ala

245 250 255

Val Tyr Lys Leu Ser Lys Ile Ala Lys Asn Gly Asp Arg His Lys Leu

260 265 270

Leu Glu Gln Asn Gly Ile Lys Thr Val Glu Asp Phe Leu Ser Phe Tyr

275 280 285

Asn Lys Ser Pro Asp Asp Leu Arg Lys Ile Leu Gly Lys Ile Ser Asp

290 295 300

Gln Asp Trp Asp Leu Ile Ile Ser His Ala Leu Lys Cys Asn Pro Arg

305 310 315 320

Pro Gly Ile Tyr Ser Ser Cys Leu Gln Glu Ser Asn Val Ser His Glu

325 330 335

His Glu Ala Phe Phe Arg Ser Asn Gly Ser Tyr Tyr Leu Gln Gly Ser

340 345 350

Cys Ser Met Gln Pro Ser His Thr Ser Gln Gly Leu Leu Ile Leu Gln

355 360 365

Lys Leu Thr Glu Gln Leu Asp Val Gln Gly Thr Arg Gln Gln Ile Ser

370 375 380

Ser Thr Cys Asn Gly Leu Ser Ser Gly Gly Leu Ser Val Ile Val Pro

385 390 395 400

Asn Arg Ser Lys Phe Gln Pro Asp Thr Ser Asp Gln Asn Leu Met His

405 410 415

His Gly Gln Leu Glu Arg Ile Gln Val Val Asp Arg Gln Val Ser Ser

420 425 430

Val Gly Asn Glu Val Met Ser Val Ser Ser Met Asp Asn Asn Met Leu

435 440 445

Glu Val Ser Ser Ser Gln Gln Gln His Ser Leu Gly His Ile Asn Thr

450 455 460

Ala Glu Ile Asp Gly Asn Gly Leu Ser His Ala Asn Pro Ser Asp Trp

465 470 475 480

Asn Ser Ser Leu Asp Trp Ile His Gly His Ala Asp Val Gln Leu Glu

485 490 495

Ser Met Arg Ser Lys Thr Gly Val Ile His Leu Ser Val Lys Gln Ala

500 505 510

Val Gly Ala Thr Gly Asp Phe Leu Leu His Gly Pro Gln Ala Val Gly

515 520 525

Asp Thr Gly Asp Ile His Phe His Leu Pro Gly Glu Leu Ala Val Glu

530 535 540

Asp Thr Glu Lys His Ala Val Ala Ala Thr Val Asn Lys Ser Leu Glu

545 550 555 560

Lys Pro Val Ala Ala Thr Ala Tyr Gly Leu Pro His Cys Arg Leu Ser

565 570 575

Cys Phe Gln Thr Ile Ser Ala Ile Gln Val Gly Trp Pro Pro Arg Arg

580 585 590

Leu Pro His Gly Arg His Gly Arg Arg Asn Pro Ser Arg Arg Arg Arg

595 600 605

Pro Thr Pro Pro Leu Thr Pro Ala Ser Pro Pro Leu Glu Arg Val Ala

610 615 620

Ser Lys Ala Gly Gly Ser Arg Gly Trp Leu Arg Arg Pro Pro Pro Glu

625 630 635 640

Gln Ala Arg Ala Ser Thr Val Glu Ala Gly Arg Ser Asn Ala Asp Val

645 650 655

Glu Ala Cys Ala Arg Glu Glu Ala Glu Ala Gly Lys Glu Glu Ala Gly

660 665 670

Glu Leu Gly Gln Pro Gly Leu Ala Pro Leu Asp Gln Ala Ala Gly Ala

675 680 685

Gly Gln Arg Arg Gly Arg Arg Gly Ala Gly Ala Arg Pro Ala Ala Arg

690 695 700

Gly Arg Cys Arg Arg Gly Arg Arg Gly Arg Ala Ala Gly Gly Ala Thr

705 710 715 720

Val Ser Ala Glu Ala Arg Ala Pro Arg Asp Gly Gly Ala Ala Thr Arg

725 730 735

Arg Pro Glu Gln Gln Arg Arg Ile Gly Arg Arg Gly Gly Trp Ile Val

740 745 750

Gly Gly Gly Val Arg Arg Ser Arg Ser Gly Ser Val Ser Ser Val Gly

755 760 765

Ala Gly Pro Asp Gly Ser Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Pro

770 775 780

Ser Ser Leu Pro Val Val Thr Ile Ala Leu Leu Gly Ala Pro Pro Phe

785 790 795 800

Phe Ala Gly Ser Phe

805

<210> 2

<211> 2418

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

atgtctgtag ccctgcctca ggatcatgag gagaatgacg acgaaggatc acaaagatca 60

ccgcctgcga agcgactgcg gaactcctgt gatttcgata gatccacctt taggctgcgg 120

tcgaacatcc tctttcccaa cttctactct ctcgttttct atgcgcacgc ttcccgaact 180

gctaaatgtg acaagcagac tgaaatgctc caggagattc tacggatgaa tcgaatgatg 240

cagcagcaaa atgagaggat caaattagtg cttagggaga atcaggagct gcgagaaaaa 300

gtttccagcc taacagcggc aataagtgaa gttgttggtt accataagcg aatccctgcg 360

cctaggatgt tacctgatca gaactgcagc gaaccacttc gattacaatt tgtgaattca 420

tgcagtaacg ataagtactc aacacacaaa atagaagcag atgacgagag cccccttcag 480

tggactgaag agtacttccg tagtaaaata gtacctggac gacctcaaaa aggacatttg 540

ctgtctggga agctgtattt taggctgcaa aatggtgtgg gttatctcaa tgccaagttc 600

caagacaatt ctagttttgt tccaagcaaa aagttcaagt tgggtgttat ggcagctgat 660

gaaagaatct cagaaagaat tcaagaagga ataactgaat cttttgctgt gaaggatgtt 720

cggggatact taacaaagaa gaatcccaat ccatccccac gtgatgctgt atataaactg 780

agcaaaattg caaagaacgg tgacaggcac aagttactag agcagaatgg tatcaagaca 840

gtggaggact tcttatcttt ctacaacaag agtccagatg atctgcgtaa aattttggga 900

aagatttctg atcaagattg ggatttgatc attagtcatg ctctgaaatg taatccaaga 960

ccaggaattt actctagttg ccttcaagag agtaatgtgt ctcatgaaca tgaggcattt 1020

tttagaagca atggcagcta ttaccttcag ggatcatgct caatgcaacc aagtcataca 1080

tcacaaggtt tattgattct tcaaaaactc acagaacaac ttgatgttca aggaactcgc 1140

cagcaaattt cttcaacgtg taatggacta tcatccggtg gattatcagt gattgtgcca 1200

aataggtcca agttccaacc agacacttca gaccaaaact tgatgcatca tggacaactt 1260

gagcgtatcc aagttgtcga ccggcaagtt tcatcggtag gaaatgaggt tatgtcggtt 1320

tcatccatgg ataacaatat gttagaagtg tcgagctcac agcaacaaca ttctttgggg 1380

cacatcaata cggctgaaat tgatgggaat ggattatcac atgctaatcc atctgattgg 1440

aattcgtcgt tggactggat tcatggccac gcagatgtgc agttggaatc tatgcggagc 1500

aaaactgggg tcattcacct gtcagtgaag caggcagttg gagccacagg ggacttcctc 1560

cttcacgggc cgcaggcagt aggagacaca ggagacattc attttcacct gccaggggag 1620

ctggcagtag aagacacaga gaagcacgca gtagcagcta cggtgaacaa gtctttggag 1680

aagccagtag cagcgactgc ttatggttta ccccactgcc gcctgtcttg ttttcagaca 1740

atatcagcaa tacaagttgg ttggcccccg cgtcgcctcc cgcatgggcg acatgggcgg 1800

cggaacccta gccgccgccg tcgccccacc ccacctctca cccctgcctc gccgccgctt 1860

gaacgagtag ccagcaaagc tggaggctca cgaggatggc tgcggcgacc accaccagag 1920

caggcgcggg catccacggt ggaggctggc cggagcaacg ccgacgtcga agcctgcgct 1980

cgggaggagg cggaggcggg gaaggaggag gccggcgagc tcgggcagcc gggtctggcg 2040

ccgctagatc aggcggccgg cgcgggacag cgccgcgggc ggcgaggagc gggggcacgg 2100

ccggcggccc gaggtcggtg taggaggggc cggcgtggac gtgcggctgg aggcgcgact 2160

gtcagcgcgg aggcccgcgc tcctcgggat ggtggcgcgg cgacgcgtag gccggagcag 2220

cagaggcgca taggccggcg tggaggctgg atcgtggggg ggggggtgcg ccggagcagg 2280

agcggcagcg tttccagcgt cggcgcaggc ccagatggta gtgcaaaggg agctggcggc 2340

ggtgggtcgc cttcctcatt gccggttgtc accatcgccc ttcttggagc tcctcccttc 2400

tttgcgggga gtttctag 2418

<210> 3

<211> 7974

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

atgtctgtag ccctgcctca ggatcatgag gagaatgacg acgaaggatc acaaagatca 60

ccgcctgcga agcgactgcg gaactcctgt gatttcgagt gagctcactt ctacaatctt 120

gcttcattta tgtttcactt ttgcagtatt ttgtttgatc taatcacaac acactctcct 180

ttatgtgcca tatgatgttc gttgatgtaa attccccacc cccccccccc tcctcctcct 240

cagattaatc tgcttggtaa agggaaagcg gaccaggatt tagtttctcc agtttatctt 300

catccaaact cagcaacttg tgttggtggt tcaatatgca aaaaccactt ttagccttgt 360

gttcggaact ctggtgagtt ccaagttgtt ttctagacaa taaccatgtt tgttggtcac 420

gcctctctat tcttaataaa attgaccatg cctgtctagt gaaaaagaag taagtcagta 480

aatccctctc ctgagaacag catcgtagcc tagcggcagg gagttgccag gtgctcatgc 540

caaccttgtg ttcaagtgtg tctcaatcca tattttctca ctatcttatt ccctccctct 600

ataaataaac ccttctctac taagaaaatc ggttatttat aatctatatg tgatttatgt 660

aaatataata atttaaggga aaatggtaca tattgcagta gatccacctt taggctgcgg 720

tcgaacatcc tctttcccaa cttctactct ctcgttttct atgcgcacgc ttcccgaact 780

gctaaatggt actccctcca tcctataata taagaagttt tagagttgga cacggttatt 840

aagaaagtag gtagaagtga atggtgaagg gttgtgattg gatgagtagt ggaggtaggt 900

gggaaaaatg aatggtggag ggctgtgatt ggttgtgaag agaatgttga tggagaagtt 960

atattctgtg gcaaatctta agagctaaaa gttgttatat tttgggacag agggagtacg 1020

ttctttgcaa aaatgttcta taggaaagtt gatttaaaaa tcatattaat ccatttctca 1080

agttttttcg ctaatacata attaatcatg agttaatgag ctaccttgtt ttccctgcgg 1140

gagaaatggg ttacgaaccc acagattcaa acacagcctt agtttgcata gaagaaagta 1200

ttgcaaaaac acttcccaat aaaatgggca caatatgctg tgaaatgaaa aaaaaaacag 1260

atgatgacta cctgtgggct attaagctag cctagagagg taagaaattg agcttatttt 1320

ctttcgcttg catggcagtg acaagcagac tgaaatgctc caggagattc tacggatgaa 1380

tcgaatgatg cagcagcaaa atgagaggat caaattagtg cttagggaga atcaggagct 1440

gcgagaaaaa gtttccagcc taacagcggt aagagcttaa tttgtgcttc catcccatag 1500

agcaaaaatg tatgcttcag acttcatggt tgggatgata tgattccaga gctttccgat 1560

atgaagaagt tcatttatgg acttgaactt ccacatcaaa ccccaacttt aaaatcttga 1620

acttccttta taaaagaaaa ttatcttgaa ctttcaaaat cattcacttt tcaaccttaa 1680

gctgaactta gaatggttga aatgtccagt tttgaaatat aaagttgatt ttaagacttc 1740

catgaaagtt aaggatgata aaatgaactt cttcctttac aatattgttt ctgttagata 1800

caatatatga gatcttgaaa agtagttttt ggatagtatt atgtgtgctc agttcttaag 1860

tagcaaaatt tacatattgt ttgatctcaa aaggatagga gccaatagat taatgaacta 1920

ccttgtactt aagatatgtc atatgttaac tgatgtatat caaatttgag gtttatcaga 1980

atttatacca atattgttgc aaattaattt tgcattttac gtctagaaag tgatgctctt 2040

taaactctat tggcaggcaa taagtgaagt tgttggttac cataagcgaa tccctgcgcc 2100

taggttggta cttggtaata ttggcattaa tacattttcc tttgcttcaa gtttttcggt 2160

tgtacatgga gttacaacat acctgcttta agtttttgaa ttgtacatga attaagaaaa 2220

gttttgtgct attttaacta atgttatgat gttagttaac agatgaagaa gcacatttcg 2280

ttcagttttt cattttgtag tttcacatat gttgaatttg cacctataaa ctgacatagt 2340

gtctatctct ttttatagaa acataatgtt tatctctgtt gcaagaatat gcaattttat 2400

ttactttgct gtaaaggact aaaaaacatt gcattatctt tccagctttc tttattttgt 2460

ttttgctatg tcagttgtca attgactaga tattttatcc gatgttgaaa caaaataaga 2520

ttatataaat agtgaagtca tcttctgaag gttaatcgtt tggatttctg ttgcaaagag 2580

gtggagttag ggaggtttgg aatgtactag ccacaaatcg ggatgttgtc acacatgctg 2640

tcattattgt gggattgagc aaccatgatg atcttaattt atttatgaag tcctttcttt 2700

aaagtcttaa ttggcttgtt tgcctattgg ggagggttaa cttatcaaag ggttcagctt 2760

gcttggtggc ctaactttac ccatcgtgtt ctactagcaa ggctctcagt gaaatgacat 2820

ccaaggctct cacatgttct cgaaaaagtg ctagctaaaa ttaaaccggg cacctttttt 2880

ctcaagaaag tagcaagtta agagttgagg gaaaagagaa catctagtcc atcatatctc 2940

attctcatat agtcacgtgc atatatggga tacctgtatt gctctgtgtt atttttcttt 3000

gtttctttga gtacacataa gtaactgcca tatattaaag ttcaacactg tatgtttatg 3060

atgtacttgc actatttttt aggatgttac ctgatcagaa ctgcagcgaa ccacttcgat 3120

tacaatttgt gaattcatgc agtaacgata agtactcaac acacaaaata gaagcagatg 3180

acgagagccc ccttcaggta gccatatatg atcgtaacaa caagatcgta acaagtgaac 3240

cattttcttc aatgagagtt cagatcgatt gtagccatcg atggtgactt tgatgatgat 3300

cataaaggac agtggactga agagtacttc cgtagtaaaa tagtacctgg acgacctcaa 3360

aaaggacatt tgctgtctgg gaagctgtat tttaggctgc aaaatggtgt gggttatctc 3420

aatgccaagt tccaagacaa ttctagtttt gttccaagca aaaagttcaa gttgggtgtt 3480

atggcagctg atgaaagaat ctcagaaaga attcaagaag gaataactga atcttttgct 3540

gtgaaggatg ttcggggata ctgtgagttc acgctattct attatatttt taatacttat 3600

tattttgctc ctctgtgctg atatctctat catgtacatg aacatccatt aacctggaag 3660

gtgcaaacag aatgagtagt aagaacaatt tagggatcac gataactagt tggtaaccca 3720

tgtgaatatt tcatatttta tcaatatgta aaacctgttt ttagatactt aagaaccttt 3780

aaaacttggc caccatccat ttattttaca gaaaaaacat tttcacacat caatattttt 3840

caaaggataa gaggcaggat aactacattg aatgtctttc tctgcagtaa caaagaagaa 3900

tcccaatcca tccccacgtg atgctgtata taaactgagc aaaattgcaa agaacggtga 3960

caggcacaag ttactagagc agaatggtat caagacagtg gaggacttct tatctttcta 4020

caacaagagt ccagatgatc tgcgtaaagt atgagaatga attattaaca ctgttatttt 4080

gctatctaat ttgttctcat atacaatatc accaacagtt cctccttttg ttctcttttt 4140

aatcctcctt ttcttttctt tttaatgtca ccctatgtag attttgggaa agatttctga 4200

tcaagattgg gatttgatca ttagtcatgc tctgaaatgt aatccaagac caggaattta 4260

ctctagttgc cttcaagaga gtaatgtgtc tcatgaacat gaggcatttt ttagaagcaa 4320

tggcagctat taccttcagg gatcatgctc aatgcaacca agtcatacat cacaaggtag 4380

gtttggactg gcctctcttg agtaatttga ttgcttccat tcgccattca tggtctgctg 4440

ctggaggtag ttccttgttt ctgtggatat cccaatggag gtttattgat tcttcaaaaa 4500

ctcacagaac aacttgatgt tcaaggaact cgccagcaaa tttcttcaac gtgtaatgga 4560

ctatcatccg gtggattatc agtgattgtg ccaaataggt ccaagttcca accagacact 4620

tcagaccaaa acttgatgca tcatggtaat tggccttttt ctctgtggtg tgtatatttt 4680

gtatgtcatc agttttaaag gtagatttgc tctgaatttt ctgcaggaca acttgagcgt 4740

atccaagttg tcgaccggca agtttcatcg gtaggaaatg aggttatgtc ggtttcatcc 4800

atggataaca atatgttaga agtgtcgagc tcacagcaac aacattcttt ggggcacatc 4860

aatacggctg aaattgatgg tagcaacttt atttctgtgg cactttttgt tagttaatgt 4920

tttggaataa tagtctgatg tttgcatgct gtcatatttt tccattaggg aatggattat 4980

cacatgctaa tccatctgat tggaattcgt cgttggactg gattcatggc cacgcagatg 5040

tgcagttgga atctatggta aatgcacaga ggagagaaaa tttgctgagt gaatatgtgg 5100

ggcgggggga gcatgatttc acgggaactc ctggctcagg aggttcctgc agtgcagctg 5160

agcaaaactg gggtcattcg cctgtcactg cagcggagca aaactggggt cattcacctg 5220

tcagtgaagc aggtagcatg aactacaatg gggctgtcaa tgaagcaggc agttggagcc 5280

acaggggact tcctccttca cgggccgcag gcagtaggag acacaggaga cattcatttt 5340

cacctgccag gggagctggc agtagaagac acagagaagc acgcagtagc agctacggtg 5400

aacaagtctt tggagaagcc agtagcagcg actgcttatg gtttacccca ctgccgcctg 5460

tcttgttttc agacaatatc agcaatacaa gtaaatattt cacggatgaa gaataatata 5520

cttcactctt cttaaaaata tatatatata tatatatact tcactgatga aacgggtgat 5580

gcatgccttt atgccgccgt ttattcagaa ggtactccca tcggattgct tgtattcagt 5640

tcaactttag tgcatatttg gatgttatta gtatatttac agaccatagc tttcagtaca 5700

ttttatgcat accatagtta tatttttgct ttgagaaaaa ccaaggcgtc taaatttagt 5760

acaattctat gcactatttc attggaaagc aacctgttgg tgtggctctg acctctgatc 5820

tgtgaccaac aaccctgttt gttgttcttg tttgttcctg ttatttccat ggcaatgatg 5880

acgtttttta tataatgccg tgcattcctg gtatgctctt ctctctcttc tggaaatcta 5940

catatgtcca gtttcagaaa cgaggaaggt gcctaagttg gaatcattcc ccgtgttaat 6000

tttcagagtt tcttcaagca gagacagttt ttagacttgt acagtgcctg gaagctattc 6060

tgactggatt tttcacattt tagtcttttt gaaaaactta tcctacaaat aggcctctaa 6120

aaaaacttat tctagaaatg atctttttcg cggcaccaat gtcattggcg ccgcgaaaag 6180

gaataagttt ttttaggggt ctatttgtaa aataagtttt ctaaaagaat caaaatgtga 6240

aaaatccagg ctattctgaa tcaatttcac tccttgaaaa cttgctcatc cataaaacac 6300

cagcctaacc acatccatca tcttgaacca aaacagcaac tgtttgtttg aattgaccac 6360

caggcactaa tcatctttgg cacaagaagt tgcacagcag agaagggtaa aagagatgac 6420

tcttgactcg gcaaacctaa ccagacccca tgaacgacag ccagcagcga ggaagcagcg 6480

aggaggaaaa acgagcgagt attcctcacc gcgttatatc actcctatac tgtattataa 6540

atcgaattca caagcacgcg tttagatcac ttgatcactt gcaagttcat gcacgcgtaa 6600

ttgtcatcgc catcgtacgt cttcctcctc ctctgcttgt gctacacctc gtgcatccac 6660

cgcgttttgc ttggatccca gcaaagctac ctcctcgagc tccggcaatg tcgctctccc 6720

ggcctggtcg gcgcagggag gaggagagcg atgacggccg tgttggtggt gaaggcaagc 6780

gacctcggct ctgctcctgt tgccagtgaa ttcggtcccc tgttcatcag ttgtttcttt 6840

catctgtcac catcatatgc ttcaatttat attcttttgt gaatattgga ataataaaga 6900

tccatgctga ataaacctat aaaagaattg aaagaggggg ttaaacggca gaaataaaat 6960

atttagagtt accaagcaga tagatcgagg gttttataac aagtccagca aaaaaaaaag 7020

aaagaaaact tatgcataca agatgttcag attagttaag aaagtcttta gacaattaat 7080

tcgagggaaa atccaggagt tttgatgcca cttaggcatt gttcggttcc ttgggattta 7140

atccccaagt ggaatatatc caggaaggga ttgagtgaat ccctcccatg tcactcaatc 7200

cctatggggg ttggaatccc ttgctctctc ttattccctg tcttaaaccc tatgttcgtt 7260

ttagctatca aaatctgata aattgaaaga gcagaataga cgtgaactta ggttggttgg 7320

cccccgcgtc gcctcccgca tgggcgacat gggcggcgga accctagccg ccgccgtcgc 7380

cccaccccac ctctcacccc tgcctcgccg ccgcttgaac gagtagccag caaagctgga 7440

ggctcacgag gatggctgcg gcgaccacca ccagagcagg cgcgggcatc cacggtggag 7500

gctggccgga gcaacgccga cgtcgaagcc tgcgctcggg aggaggcgga ggcggggaag 7560

gaggaggccg gcgagctcgg gcagccgggt ctggcgccgc tagatcaggc ggccggcgcg 7620

ggacagcgcc gcgggcggcg aggagcgggg gcacggccgg cggcccgagg tcggtgtagg 7680

aggggccggc gtggacgtgc ggctggaggc gcgactgtca gcgcggaggc ccgcgctcct 7740

cgggatggtg gcgcggcgac gcgtaggccg gagcagcaga ggcgcatagg ccggcgtgga 7800

ggctggatcg tggggggggg ggtgcgccgg agcaggagcg gcagcgtttc cagcgtcggc 7860

gcaggcccag atggtagtgc aaagggagct ggcggcggtg ggtcgccttc ctcattgccg 7920

gttgtcacca tcgcccttct tggagctcct cccttctttg cggggagttt ctag 7974

<210> 4

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

Met Ser Val Ala Leu Pro Gln Asp His Glu Glu Asn Asp Asp Glu Gly

1 5 10 15

Ser Gln Arg Ser Pro Pro Ala Lys Arg Leu Arg Asn Ser Cys Asp Phe

20 25 30

Asp Arg Ser Thr Phe Arg Leu Arg Ser Asn Ile Leu Phe Pro Asn Phe

35 40 45

Tyr Ser Leu Val Phe Tyr Ala His Ala Ser Arg Thr Ala Lys Cys Asp

50 55 60

Lys Gln Thr Glu Met Leu Gln Glu Ile Leu Arg Met Asn Arg Met Met

65 70 75 80

Gln Gln Gln Met Arg Gly Ser Asn

85

<210> 5

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

atgtctgtag ccctgcctca ggatcatgag gagaatgacg acgaaggatc acaaagatca 60

ccgcctgcga agcgactgcg gaactcctgt gatttcgata gatccacctt taggctgcgg 120

tcgaacatcc tctttcccaa cttctactct ctcgttttct atgcgcacgc ttcccgaact 180

gctaaatgtg acaagcagac tgaaatgctc caggagattc tacggatgaa tcgaatgatg 240

cagcagcaaa tgagaggatc aaattag 267

<210> 6

<211> 7973

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

atgtctgtag ccctgcctca ggatcatgag gagaatgacg acgaaggatc acaaagatca 60

ccgcctgcga agcgactgcg gaactcctgt gatttcgagt gagctcactt ctacaatctt 120

gcttcattta tgtttcactt ttgcagtatt ttgtttgatc taatcacaac acactctcct 180

ttatgtgcca tatgatgttc gttgatgtaa attccccacc cccccccccc tcctcctcct 240

cagattaatc tgcttggtaa agggaaagcg gaccaggatt tagtttctcc agtttatctt 300

catccaaact cagcaacttg tgttggtggt tcaatatgca aaaaccactt ttagccttgt 360

gttcggaact ctggtgagtt ccaagttgtt ttctagacaa taaccatgtt tgttggtcac 420

gcctctctat tcttaataaa attgaccatg cctgtctagt gaaaaagaag taagtcagta 480

aatccctctc ctgagaacag catcgtagcc tagcggcagg gagttgccag gtgctcatgc 540

caaccttgtg ttcaagtgtg tctcaatcca tattttctca ctatcttatt ccctccctct 600

ataaataaac ccttctctac taagaaaatc ggttatttat aatctatatg tgatttatgt 660

aaatataata atttaaggga aaatggtaca tattgcagta gatccacctt taggctgcgg 720

tcgaacatcc tctttcccaa cttctactct ctcgttttct atgcgcacgc ttcccgaact 780

gctaaatggt actccctcca tcctataata taagaagttt tagagttgga cacggttatt 840

aagaaagtag gtagaagtga atggtgaagg gttgtgattg gatgagtagt ggaggtaggt 900

gggaaaaatg aatggtggag ggctgtgatt ggttgtgaag agaatgttga tggagaagtt 960

atattctgtg gcaaatctta agagctaaaa gttgttatat tttgggacag agggagtacg 1020

ttctttgcaa aaatgttcta taggaaagtt gatttaaaaa tcatattaat ccatttctca 1080

agttttttcg ctaatacata attaatcatg agttaatgag ctaccttgtt ttccctgcgg 1140

gagaaatggg ttacgaaccc acagattcaa acacagcctt agtttgcata gaagaaagta 1200

ttgcaaaaac acttcccaat aaaatgggca caatatgctg tgaaatgaaa aaaaaaacag 1260

atgatgacta cctgtgggct attaagctag cctagagagg taagaaattg agcttatttt 1320

ctttcgcttg catggcagtg acaagcagac tgaaatgctc caggagattc tacggatgaa 1380

tcgaatgatg cagcagcaaa tgagaggatc aaattagtgc ttagggagaa tcaggagctg 1440

cgagaaaaag tttccagcct aacagcggta agagcttaat ttgtgcttcc atcccataga 1500

gcaaaaatgt atgcttcaga cttcatggtt gggatgatat gattccagag ctttccgata 1560

tgaagaagtt catttatgga cttgaacttc cacatcaaac cccaacttta aaatcttgaa 1620

cttcctttat aaaagaaaat tatcttgaac tttcaaaatc attcactttt caaccttaag 1680

ctgaacttag aatggttgaa atgtccagtt ttgaaatata aagttgattt taagacttcc 1740

atgaaagtta aggatgataa aatgaacttc ttcctttaca atattgtttc tgttagatac 1800

aatatatgag atcttgaaaa gtagtttttg gatagtatta tgtgtgctca gttcttaagt 1860

agcaaaattt acatattgtt tgatctcaaa aggataggag ccaatagatt aatgaactac 1920

cttgtactta agatatgtca tatgttaact gatgtatatc aaatttgagg tttatcagaa 1980

tttataccaa tattgttgca aattaatttt gcattttacg tctagaaagt gatgctcttt 2040

aaactctatt ggcaggcaat aagtgaagtt gttggttacc ataagcgaat ccctgcgcct 2100

aggttggtac ttggtaatat tggcattaat acattttcct ttgcttcaag tttttcggtt 2160

gtacatggag ttacaacata cctgctttaa gtttttgaat tgtacatgaa ttaagaaaag 2220

ttttgtgcta ttttaactaa tgttatgatg ttagttaaca gatgaagaag cacatttcgt 2280

tcagtttttc attttgtagt ttcacatatg ttgaatttgc acctataaac tgacatagtg 2340

tctatctctt tttatagaaa cataatgttt atctctgttg caagaatatg caattttatt 2400

tactttgctg taaaggacta aaaaacattg cattatcttt ccagctttct ttattttgtt 2460

tttgctatgt cagttgtcaa ttgactagat attttatccg atgttgaaac aaaataagat 2520

tatataaata gtgaagtcat cttctgaagg ttaatcgttt ggatttctgt tgcaaagagg 2580

tggagttagg gaggtttgga atgtactagc cacaaatcgg gatgttgtca cacatgctgt 2640

cattattgtg ggattgagca accatgatga tcttaattta tttatgaagt cctttcttta 2700

aagtcttaat tggcttgttt gcctattggg gagggttaac ttatcaaagg gttcagcttg 2760

cttggtggcc taactttacc catcgtgttc tactagcaag gctctcagtg aaatgacatc 2820

caaggctctc acatgttctc gaaaaagtgc tagctaaaat taaaccgggc accttttttc 2880

tcaagaaagt agcaagttaa gagttgaggg aaaagagaac atctagtcca tcatatctca 2940

ttctcatata gtcacgtgca tatatgggat acctgtattg ctctgtgtta tttttctttg 3000

tttctttgag tacacataag taactgccat atattaaagt tcaacactgt atgtttatga 3060

tgtacttgca ctatttttta ggatgttacc tgatcagaac tgcagcgaac cacttcgatt 3120

acaatttgtg aattcatgca gtaacgataa gtactcaaca cacaaaatag aagcagatga 3180

cgagagcccc cttcaggtag ccatatatga tcgtaacaac aagatcgtaa caagtgaacc 3240

attttcttca atgagagttc agatcgattg tagccatcga tggtgacttt gatgatgatc 3300

ataaaggaca gtggactgaa gagtacttcc gtagtaaaat agtacctgga cgacctcaaa 3360

aaggacattt gctgtctggg aagctgtatt ttaggctgca aaatggtgtg ggttatctca 3420

atgccaagtt ccaagacaat tctagttttg ttccaagcaa aaagttcaag ttgggtgtta 3480

tggcagctga tgaaagaatc tcagaaagaa ttcaagaagg aataactgaa tcttttgctg 3540

tgaaggatgt tcggggatac tgtgagttca cgctattcta ttatattttt aatacttatt 3600

attttgctcc tctgtgctga tatctctatc atgtacatga acatccatta acctggaagg 3660

tgcaaacaga atgagtagta agaacaattt agggatcacg ataactagtt ggtaacccat 3720

gtgaatattt catattttat caatatgtaa aacctgtttt tagatactta agaaccttta 3780

aaacttggcc accatccatt tattttacag aaaaaacatt ttcacacatc aatatttttc 3840

aaaggataag aggcaggata actacattga atgtctttct ctgcagtaac aaagaagaat 3900

cccaatccat ccccacgtga tgctgtatat aaactgagca aaattgcaaa gaacggtgac 3960

aggcacaagt tactagagca gaatggtatc aagacagtgg aggacttctt atctttctac 4020

aacaagagtc cagatgatct gcgtaaagta tgagaatgaa ttattaacac tgttattttg 4080

ctatctaatt tgttctcata tacaatatca ccaacagttc ctccttttgt tctcttttta 4140

atcctccttt tcttttcttt ttaatgtcac cctatgtaga ttttgggaaa gatttctgat 4200

caagattggg atttgatcat tagtcatgct ctgaaatgta atccaagacc aggaatttac 4260

tctagttgcc ttcaagagag taatgtgtct catgaacatg aggcattttt tagaagcaat 4320

ggcagctatt accttcaggg atcatgctca atgcaaccaa gtcatacatc acaaggtagg 4380

tttggactgg cctctcttga gtaatttgat tgcttccatt cgccattcat ggtctgctgc 4440

tggaggtagt tccttgtttc tgtggatatc ccaatggagg tttattgatt cttcaaaaac 4500

tcacagaaca acttgatgtt caaggaactc gccagcaaat ttcttcaacg tgtaatggac 4560

tatcatccgg tggattatca gtgattgtgc caaataggtc caagttccaa ccagacactt 4620

cagaccaaaa cttgatgcat catggtaatt ggcctttttc tctgtggtgt gtatattttg 4680

tatgtcatca gttttaaagg tagatttgct ctgaattttc tgcaggacaa cttgagcgta 4740

tccaagttgt cgaccggcaa gtttcatcgg taggaaatga ggttatgtcg gtttcatcca 4800

tggataacaa tatgttagaa gtgtcgagct cacagcaaca acattctttg gggcacatca 4860

atacggctga aattgatggt agcaacttta tttctgtggc actttttgtt agttaatgtt 4920

ttggaataat agtctgatgt ttgcatgctg tcatattttt ccattaggga atggattatc 4980

acatgctaat ccatctgatt ggaattcgtc gttggactgg attcatggcc acgcagatgt 5040

gcagttggaa tctatggtaa atgcacagag gagagaaaat ttgctgagtg aatatgtggg 5100

gcggggggag catgatttca cgggaactcc tggctcagga ggttcctgca gtgcagctga 5160

gcaaaactgg ggtcattcgc ctgtcactgc agcggagcaa aactggggtc attcacctgt 5220

cagtgaagca ggtagcatga actacaatgg ggctgtcaat gaagcaggca gttggagcca 5280

caggggactt cctccttcac gggccgcagg cagtaggaga cacaggagac attcattttc 5340

acctgccagg ggagctggca gtagaagaca cagagaagca cgcagtagca gctacggtga 5400

acaagtcttt ggagaagcca gtagcagcga ctgcttatgg tttaccccac tgccgcctgt 5460

cttgttttca gacaatatca gcaatacaag taaatatttc acggatgaag aataatatac 5520

ttcactcttc ttaaaaatat atatatatat atatatactt cactgatgaa acgggtgatg 5580

catgccttta tgccgccgtt tattcagaag gtactcccat cggattgctt gtattcagtt 5640

caactttagt gcatatttgg atgttattag tatatttaca gaccatagct ttcagtacat 5700

tttatgcata ccatagttat atttttgctt tgagaaaaac caaggcgtct aaatttagta 5760

caattctatg cactatttca ttggaaagca acctgttggt gtggctctga cctctgatct 5820

gtgaccaaca accctgtttg ttgttcttgt ttgttcctgt tatttccatg gcaatgatga 5880

cgttttttat ataatgccgt gcattcctgg tatgctcttc tctctcttct ggaaatctac 5940

atatgtccag tttcagaaac gaggaaggtg cctaagttgg aatcattccc cgtgttaatt 6000

ttcagagttt cttcaagcag agacagtttt tagacttgta cagtgcctgg aagctattct 6060

gactggattt ttcacatttt agtctttttg aaaaacttat cctacaaata ggcctctaaa 6120

aaaacttatt ctagaaatga tctttttcgc ggcaccaatg tcattggcgc cgcgaaaagg 6180

aataagtttt tttaggggtc tatttgtaaa ataagttttc taaaagaatc aaaatgtgaa 6240

aaatccaggc tattctgaat caatttcact ccttgaaaac ttgctcatcc ataaaacacc 6300

agcctaacca catccatcat cttgaaccaa aacagcaact gtttgtttga attgaccacc 6360

aggcactaat catctttggc acaagaagtt gcacagcaga gaagggtaaa agagatgact 6420

cttgactcgg caaacctaac cagaccccat gaacgacagc cagcagcgag gaagcagcga 6480

ggaggaaaaa cgagcgagta ttcctcaccg cgttatatca ctcctatact gtattataaa 6540

tcgaattcac aagcacgcgt ttagatcact tgatcacttg caagttcatg cacgcgtaat 6600

tgtcatcgcc atcgtacgtc ttcctcctcc tctgcttgtg ctacacctcg tgcatccacc 6660

gcgttttgct tggatcccag caaagctacc tcctcgagct ccggcaatgt cgctctcccg 6720

gcctggtcgg cgcagggagg aggagagcga tgacggccgt gttggtggtg aaggcaagcg 6780

acctcggctc tgctcctgtt gccagtgaat tcggtcccct gttcatcagt tgtttctttc 6840

atctgtcacc atcatatgct tcaatttata ttcttttgtg aatattggaa taataaagat 6900

ccatgctgaa taaacctata aaagaattga aagagggggt taaacggcag aaataaaata 6960

tttagagtta ccaagcagat agatcgaggg ttttataaca agtccagcaa aaaaaaaaga 7020

aagaaaactt atgcatacaa gatgttcaga ttagttaaga aagtctttag acaattaatt 7080

cgagggaaaa tccaggagtt ttgatgccac ttaggcattg ttcggttcct tgggatttaa 7140

tccccaagtg gaatatatcc aggaagggat tgagtgaatc cctcccatgt cactcaatcc 7200

ctatgggggt tggaatccct tgctctctct tattccctgt cttaaaccct atgttcgttt 7260

tagctatcaa aatctgataa attgaaagag cagaatagac gtgaacttag gttggttggc 7320

ccccgcgtcg cctcccgcat gggcgacatg ggcggcggaa ccctagccgc cgccgtcgcc 7380

ccaccccacc tctcacccct gcctcgccgc cgcttgaacg agtagccagc aaagctggag 7440

gctcacgagg atggctgcgg cgaccaccac cagagcaggc gcgggcatcc acggtggagg 7500

ctggccggag caacgccgac gtcgaagcct gcgctcggga ggaggcggag gcggggaagg 7560

aggaggccgg cgagctcggg cagccgggtc tggcgccgct agatcaggcg gccggcgcgg 7620

gacagcgccg cgggcggcga ggagcggggg cacggccggc ggcccgaggt cggtgtagga 7680

ggggccggcg tggacgtgcg gctggaggcg cgactgtcag cgcggaggcc cgcgctcctc 7740

gggatggtgg cgcggcgacg cgtaggccgg agcagcagag gcgcataggc cggcgtggag 7800

gctggatcgt gggggggggg gtgcgccgga gcaggagcgg cagcgtttcc agcgtcggcg 7860

caggcccaga tggtagtgca aagggagctg gcggcggtgg gtcgccttcc tcattgccgg 7920

ttgtcaccat cgcccttctt ggagctcctc ccttctttgc ggggagtttc tag 7973

<210> 7

<211> 673

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttca 60

agagcttgga gtggatggaa ttttcctccg ttttacctgt ggaatcggca gcaaaggaag 120

gaatctttaa acatacgaac agatcactta aagttcttct gaagcaactt aaagttatca 180

ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc 240

gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga acactgggta cgttggaaac 300

cacgtgtgat gtgaaggagt aagataaact gtaggagaaa agcatttcgt agtgggccat 360

gaagcctttc aggacatgta ttgcagtatg ggccggccca ttacgcaatt ggacgacaac 420

aaagactagt attagtacca cctcggctat ccacatagat caaagctggt ttaaaagagt 480

tgtgcagatg atccgtggca ccgatcgtgt cgccggacag gttttagagc tagaaatagc 540

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 600

ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaagctag tccgtagcgc gtgcgccaat 660

tctgcagaca aat 673

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

所述蛋白质为下述任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于水稻,B2)所述的蛋白质为CaMBP13/-1bp，所述CaMBP13/-1bp的氨基酸序列是SEQ ID No.4。

3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

D1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物耐冷性中的应用；

D2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物耐冷性的产品中的应用；

D3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育耐冷性植物中的应用；

D4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育耐冷性植物的产品中的应用；

D5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料为下述E1)至E8)中的任一种：

E1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

E2)抑制或降低权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；

E3)含有E1)和/或E2)所述核酸分子的表达盒；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，E1)所述核酸分子为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子；

F2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子；

F3)编码序列是SEQ ID No.5的cDNA分子；

F4)核苷酸序列是SEQ ID No.6的DNA分子。

5.一种培育耐冷性植物的方法，其特征在于，所述方法包括降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到耐冷性高于所述目的植物的耐冷性植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述利用基因编辑技术使植物基因组中权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.2的第236-258位和第511-533位。

9.一种制备耐冷性提高的水稻的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:将水稻基因组中的序列表中的SEQ ID No.3所示的CaMBP13基因突变为CaMBP13/-1bp基因，得到耐冷性提高的水稻；所述CaMBP13/-1bp基因的编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子。

10.根据权利要求1-4中任一所述的应用，和/或，权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于，所述植物为G1)或G2)或G3)：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)禾本科植物；

G3)水稻。