KR20050028087A

KR20050028087A - 수도로부터 분리한 칼모듈린에 결합하는 전사조절인자오에스씨지-1의 유전자 서열 및 기능

Info

Publication number: KR20050028087A
Application number: KR1020030064364A
Authority: KR
Inventors: 이상열; 최만수; 임채오; 조무제
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2003-09-17
Publication date: 2005-03-22
Also published as: KR100593809B1

Abstract

본 발명은 수도의 종자 수율에 영향을 미치는 신규한 OsCG-1 전사조절 유전자와 단백질에 관한 것으로 보다 상세하게는 유전자 발현에 있어서, 전사조절 활성을 저해하는 것으로 알려진 SCaM-1 단백질을 직접 조절하는 전사조절인자인 OsCG-1 유전자와 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 수도로부터 분리한 칼모듈린(CaM)과 결합하는 전사조절인자인 OsCG-1 단백질의 cDNA와 아미노산 서열을 제공하여, 이를 식물체에 형질전환을 시켜 종자 수율을 조절할 수 있는 효과가 있다.

Description

수도로부터 분리한 칼모듈린에 결합하는 전사조절인자 오에스씨지-1의 유전자 서열 및 기능{Sequence and function of OsCG-1, a Calmoduline binding transcription factor which effects to the yeild of a rice}

본 발명은 수도의 종자 수율에 영향을 미치는 신규한 OsCG-1 전사조절 유전자와 단백질에 관한 것으로 보다 상세하게는 유전자 발현에 있어서, 전사조절 활성을 억제하는 것으로 알려진 SCaM-1 단백질을 직접 조절하는 전사조절인자인 OsCG-1 유전자와 이의 단백질에 관한 것이다.

식물세포 내에서 칼슘은 호르몬, 병원균과 같은 생물학적 신호와 빛, 추위, 열, 가뭄와 같은 비생물학적 신호 등의 다양한 외부 자극에 반응하는 가장 대표적인 이차 신호전달자이다. 이렇게 다양한 외부 자극에 의해서 식물세포들은 원형질막이나 세포내의 소기관으로부터 다양한 형태의 칼슘 농도 (Ca²⁺ concentration)의 증가가 일어난다. 식물세포는 이러한 세포질내의 칼슘농도 조절에 의해서 다양한 외부신호를 세포내의 신호로 변환하게 된다. 세포질내의 다양한 칼슘농도는 생화학적인 변화들로 전환되는 다양한 내부의 칼슘결합 단백질에 의해서 해독되고, 다양한 세포 반응을 유도하게된다. 이런 기작을 통해서 식물체는 변화하는 환경에 적응하게 한다.

식물체에서 알려진 칼슘결합 단백질로는 칼모듈린(Calmodulin, CaM), 칼슘-의존성 인산화 효소(Ca²⁺/CaM-dependent protein kinase :CDPK), 칼시뉴린 B (Calcineurin B) 그리고, 비시닌(Visinin) 등이 보고되고 있다. 이들 중, 가장 잘 연구되어진 칼슘결합 단백질은 칼모듈린(CaM)이다. 칼모듈린의 특성은 전체적으로 산성을 나타내며, 칼슘과 결합할 수 있는 기능적인 부분인 EF-결합기 (EF-hand)를 4개를 가지고 있으며, 모든 진핵생물에 존재하여 신호전달 과정에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 이 단백질은 그 자체로는 효소 촉매 활성을 가지지 않으나, 칼슘과 결합하여, 세포의 여러 과정등의 대사작용(Metabolism), 이온 균형(Ionic balance), 단백질 변형(protein modification), 사이토스켈레톤(Cytoskeleton), 그리고 유전자의 발현에 관여하는 많은 목적 단백질을 활성화시킨다.

지금까지의 연구보고에 의하면, 핵에서 일어나는 현상들도 Ca²⁺/CaM 결합체에 의해서 유전자 발현이 조절되고 있는 것으로 알려져 있다. 칼슘/칼모듈린-의존성 인산화 효소(Ca²⁺/CaM-dependent protein kinase)에 의한 인산화 반응에 의해서 전사조절인자가 DNA에 결합하거나 핵으로의 이동이 조절된다는 보고가 있다. 이와 같이 전사조절인자의 활성조절에 있어서 Ca²⁺/CaM의 간접적인 역할은 비교적 많이 연구된 반면, CaM에 의해 직접적으로 조절되는 전사조절인자들에 관한 연구는 미미한 실정이다.

따라서 Ca²⁺/CaM 결합체에 의해서 조절되는 전사조절인자에 대한 연구를 통해 유전자의 발현에 있어서 칼모듈린(CaM)의 기능 유추 연구는 매우 절실히 요구되고 있다.

이에따라, 본 발명의 목적은 칼모듈린에 직접적으로 결합하여 유전자의 발현을 조절하는 새로운 식물 전사조절인자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 전사조절인자를 암호화하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 진핵세포 발현벡터를 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 목적은 상기 전사조절인자 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 종자수율을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 전사 조절 인자를 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 전사 조절 인자를 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

그리고, 본 발명은 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 대장균 XL-1 Blue/MRF(Tc^r) KCTC10494BP를 제공한다.

나아가 본 발명은 발현벡터로 식물체를 형질전환하여 제 1항의 전자 조절 인자를 발현시킴으로써 식물체의 종자 수율을 조절하는 방법을 제공한다.

더 나아가 본 발명은 방법에 의해 종자 수율이 조절된 형질전환 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 칼모듈린(CaM)을 직접적으로 조절하는 새로운 전사조절인자를 찾기 위해 플락 하이브리디제이션(plaque hybridization)의 방법(Lee SH et al, 1999))을 수행한다.

그리고, 칼모듈린(CaM)을 탐침자(probe)로 사용하여, 수도의 cDNA 발현 라이브러리 (cDNA expression library)로부터 다양한 종류의 칼모듈린 결합 단백질을 분리하고, 그 중에 전사조절인자라고 추측되는 클론을 클로닝하여 유전자의 염기서열과 유전적 구조를 분석한다.

그중, 본 발명은 신규하고 칼모듈린과 결합하는 하나의 유전자를 선정하였으며, 이 유전자를 OsCG-1이라고 명명하였는데, 이 OsCG-1 단백질은 N-말단에 DNA 결합 부위 (DNA-binding domain), 3개의 앤크린 반복 부위(Ankyrin repeat domain)가 존재하며, 칼모듈린(CaM) 결합 분석(CaM binding assay)을 통하여 C-말단에 두 개의 다른 형태(IQ motif 와 1-5-8-14 motif)의 칼모듈린 결합 부위(CaM-binding domains)를 가지고 있으며, N-말단과 C-말단에 각각 다른 형태의 핵 이동 신호 서열(bipartite type and SV40 type NLS)을 가지고 있는 새로운 (novel) 형태의 전사조절인자이다.

또한, 알비에스에스 (Random Binding Site Selection : RBSS) 분석(Schindler et al, 1992)을 수행한 결과, 본 발명의 OsCG-1 전사조절인자는 TWCGCGTKKKKTKCG (W는 A나 C, 그리고 K는 G나 T)인 뉴클레오타이드 서열과 결합한다.

한편, 상기 뉴클레오타이드를 애기장대의 원형질에서 트랜지언트 분석 방법(transient assay; Abel, S. et al, 1994)으로 유전자의 전사조절활성을 실험한 결과, 본 발명의 OsCG-1 전사조절인자는 전사를 활성화하고, 칼모듈린(CaM)은 OsCG-1의 전사조절 활성을 억제한다.

그리고, 본 발명은 OsCG-1 유전자 내의 N-말단과 C-말단의 핵 이동 신호(NLS) 영역에 GFP(Green fluorescent protein) 유전자를 각각 융합하여 애기장대의 원형질(protoplast)에서 발현시켜 OsCG-1의 발현 부위를 확인한 결과, 대조구인 GFP 벡터만 발현시켰을 때, 핵과 세포질에 골고루 분포한다. 하지만, N-말단의 핵 이동 신호에 의한 GFP는 대부분 핵에서 발현되고 동시에 세포질에서도 일부 발현되나 C-말단의 핵 이동 신호 영역은 OsCG-1 전사 조절 인자에 융합된 GFP는 핵에서만 발현된다. 따라서, OsCG-1 유전자 양 말단에 있는 두 개의 핵 이동 신호는 OsCG-1 단백질을 핵으로 이동시키는 신호로서 기능을 수행하고 있다. 그리고 각각의 재조합 단백질의 발현 정도와 발현 부위에 있어서, 상기 두 핵 이동 신호를 비교하면, C-말단의 핵 이동 신호(NLS)가 N-말단의 핵 이동 신호(NLS)보다 핵으로 이동하는데 더 효과적이다.

또한, OsCG-1의 C-말단의 핵 이동 신호는 NLSⅡ와 겹쳐있으므로 칼모듈린(CaM)이 OsCG-1이 핵으로 이동하는데 어떤 역할을 수행하는지 알아보기 위해서 칼모듈린(CaM)과 함께 발현 (co-expression)시켜 GFP의 발현양상을 관찰한 결과, C-말단 핵 이동 신호에 의해 GFP가 핵에서만 발현되던 것이 칼모듈린과 함께 발현시키면 핵뿐만 아니라, 세포질에서도 GFP가 발현되는데, 이는 칼모듈린(CaM)이 OsCG-1에 결합하여 핵으로 이동하는 것을 억제하는 것으로 판단된다.

그리고, OsCG-1 유전자를 식물체 전이용 벡터인 pCAMBIA1300에 클로닝하여 범바드멘트(bombardment)를 이용하여 OsCG-1이 다량으로 발현되는 형질전환 수도 식물체를 제조하고 이의 형질전환체에서 생리적 기능과 형태적 변화등을 관찰하면, OsCG-1이 과발현된 형질전환 식물체는 종자를 맺지 못하고 불임(sterile)현상이 일어난다.

상기 결과는 OsCG-1 유전자를 결실 (knock-out)시킬 경우, 종자형성방해능의 상실을 유발하게 됨으로써, 불임과는 정반대 현상인 식물체 종자형성수율을 획기적으로 증가시킬수 있음을 제시하고 있다.

한편, 본 발명의 OsCG-1 유전자를 보존하기 위하여, 재조합 발현 벡터(pBluescript SK Ⅱ, stratagene, USA)와 이를 도입한 대장균 XL-1 Blue/MRF(Tc^r)를 개발하였으며, 이를 2003년 7월 3일자로 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하였다( KCTC10494BP).

이하 실시예를 들어 본 발명을 자세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1-1. 수도의 칼모듈린(CaM)과 결합하는 단백질 분리

수도의 현탁 배양세포에 병원균(Magnaporthe grisea)을 처리하여, mRNA를 분리한 뒤 이를 이용하여 두가닥 cDNA(double stranded cDNA)를 합성하였다. 평활말단화(blunting)된 cDNA 양 말단에 EcoR I 과 Xho I 어탭터를 결찰(ligation)하였다. 이를 람다 잽 투 액스알 벡터( ZAP II XR vector)의 EcoR I 과 Xho I 자리에 클로닝하였다. 그리고, 파아지 라이브러리를 구축하기 위하여 cDNA를 포함하고 있는 파아지 벡터 라이브러리를 Gigapack II Gold packaging extract(Stratagene)안으로 패키징(package)하였다. 그런다음, 파아지 라이브러리를 대장균에 도입하여 1X10⁶개의 파아지(phage)를 형성하도록 하였다. 이 파아지들을 10mM IPTG에 미리 적신 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 옮긴다. 이 막에 탐참자인 칼모듈린 탐침자(CaM:HRP)를 이용하여, 1차로 칼모듈린에 결합하는 단백질을 스크리닝하고, 1차 스크린에서 얻은 플락(plaque)을 다시 2차, 3차의 스크리닝(screening)을 통해 한 개의 플락(single plaque)으로 분리한다. 이 플락으로부터 DNA를 회수하여, 선별하였다.

상기 방법으로 얻어낸 클론(Clones)들을 생거 디데옥시 DNA 염기서열 결정방법에 따라 자동화 염기서열 결정기(Automatic DNA Sequencer, Applied iosystems model 377A, Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 염기 서열을 분석하였다. 그 결과 다양한 종류의 칼모듈린 결합 단백질(CaM-binding proteins)들을 분리하였다. 분리한 칼모듈린 결합 단백질 중에 파슬리로부터 분리한 유전자인 PcCG-1( P etroselinum crispum CG-1)과 염기서열이 매우 유사성이 매우 높게 나타났다. 그래서 이의 유전자의 RNA 레벨을 조사하였다. 그 결과 UV을 처리했을 때, 이 유전자의 RNA 발현이 증가되었다. 그리고 이 단백질은 CGCG의 특정 염기서열에 결합하는 특성을 가지고 있다는 보고가 있었다(Oswaldo da Costa e Silva (1994)). 이러한 근거를 바탕으로 수도로부터 분리한 본 발명의 유전자를 OsCG-1(Oryza s ativa CG-1)이라 명명을 하였다.

1-2. OsCG-1 유전자로부터 추론되어지는 아미노산 서열과 구조 특이성

실시예 1-1의 자동염기서열 분석기로 분석한 결과, 도 1과 같이 OsCG-1의 유전자는 927개의 아미노산을 코딩하는 2,841bp의 단백질 합성 명령신호(Open Reading Frame)를 가지는 3,134bp의 cDNA라는 것을 확인하였다.

OsCG-1 단백질의 N-말단은 DNA 결합 부위(DNA-binding domain)에 있어서, 파스리 (parsley) PcCG-1의 DNA 결합 부위와 49%의 상동성을 가짐으로써 유사성이 높음을 확인하였는데, 이 부위는 NFAT나 Rel/NF- B등 많은 전사조절인자(L. Aravind and Eugene V.Koonin, 1999)에서도 발견되는 것으로 알려져 있는 부위이다. 그리고, 비특이적으로 DNA와 접촉하는 것으로 보고된 TIG 부위(transcription factor immunglobulin)가 존재하는 것을 확인하였다.

또한, 단백질-단백질 결합에 관여하는 부위라고 알려진 33개의 아미노산으로 구성된 앤크린 반복 부위(Ankyrin Repeat Domains)가 3개 있음을 확인하였으며, C-말단에는 아미노산 염기서열로부터 5개의 칼모듈린(CaM) 결합 부위(CaM-Binding Domains) 존재하며, 이들 칼모듈린 결합 부위(CaM-Binding Domains)는 4개의 칼슘에 독립적으로 칼모듈린에 결합(Ca²⁺-independent CaM binding motif)하는 아이큐 모티브(IQ motif)와 1개의 칼슘에 의존적으로 칼모듈린에 결합(Ca²⁺-dependent CaM binding motif)하는 1-5-8-14 모티브(1-5-8-14 motif)가 존재하고 있음을 확인하였다.

그리고, OsCG-1 단백질에서는 공통적으로 가지는 전사활성부위 (Transcription Activation Domain)가 N-말단에 존재하는데, 이 전사활성부위는 주로 산성을 띄는 아미노산 잔기 즉 글루타메이트(Glutamate : E), 아스파테이트 (Aspartate : D), 프로린(Proline : P), 글루타민(Glutamine : Ｑ)가 위치하는 부위를 가지고 있음을 확인하였다.

한편, OsCG-1의 N-말단에 바이파타이드 형태의 핵 이동 신호(bipartide type NLS : RKVVRNFRKDGHNWKKKK)와 C-말단에 에스브이 40 형태의 핵 이동 신호(SV 40 type NLS : RKKR)가 각각 존재하고 있으며, 그 중 C-말단의 에스브이 40 형태의 핵 이동 신호 염기서열(SV40 type NLS)은 칼슘에 의존적으로 칼모듈린(Ca²⁺-dependent CaM binding motif)에 결합하는 1-5-8-14 모티브(1-5-8-14 motif)와 겹쳐져 있는 것이 확인되었다.

따라서, 상기 C-말단의 에스브이 40 형태의 핵 이동 신호 염기서열 부위는 핵으로의 이동 신호 기능과 칼모듈린의 결합을 경쟁적으로 조절 하는 기능을 하는것으로 판단된다.

이와같이, OsCG-1 단백질은 구조적 특징과 분자 수준에 의해 전사조절인자라는 것을 확인할 수 있었다.

1-3. 수도 게놈(Genome)상의 존재하는 OsCG-1 유전자

수도의 게놈(Genome)상에 OsCG-1이 어떻게 존재하는지 알아보기 위하여 ³²P-[ATP]로 표시된 프로브를 사용하여 서든 블랏 분석(Southern blot assay)을 수행하였다. 수도의 게놈을 EcoR I, Hind III, Pst I, 그리고 Xho I의 제한효소들(Restriction enzymes)로 완전히 자른 후 0.8 % 아가로즈 겔(Agarose gel)에서 전기영동하여 블랏을 만든 다음 각각 완전한 길이의 OsCG-1 cDNA(Total probe)와 C-말단의 특이적인 부위(Specific probe)를 탐침자(probe)로 사용하여 서든 블랏 분석(Southern blot assay)을 수행하였다 (도 2 참조). 그 결과, 도 2의 TP에서와 같이, 완전한 길이의 OsCG-1 cDNA(Total probe)를 탐침자로 혼성화한 결과는, 각 레인(lane)에서 두 개에서 네 개의 밴드가 혼성을 확인할 수 있었으며 우측 그림에서 나타난 결과는 C-말단의 특이적인 부위를 탐침자(probe)로 혼성화하였을 때, 각 레인에서 한 개나 두개의 밴드가 혼성됨을 확인할 수 있었다.

이런 결과들로부터 OsCG-1은 수도의 게놈(Genome)상에 하나의 유전자로 구성되어 있음을 확인하였다.

[실시예 2] OsCG-1 단백질과 칼모듈린(CaM)과의 결합 부위 결정

OsCG-1의 아미노산 서열에서 유추한 칼모듈린 결합 부위(CaM Binding Domains)가 실제로 칼모듈린(CaM)과 결합하는지를 알아보기 위하여 제한효소 (Restriction Enzyme)의 인식 위치를 이용하여 C-말단을 제거한 변이 OsCG-1 (C-terminal deletion mutants) 시리즈를 GST 벡터(Green fluorescent protein, University of Wisconsin, USA)의 C-말단에 각각 융합하여 박테리아에서 발현시켜 칼모듈린(CaM)과의 결합 분석(CaM binding Assay)을 수행하였다. 그 결과 아미노산 서열에서 유추한 칼모듈린(CaM) 결합 부위(CaM Binding Domain)를 포함하는 부위에서만 칼슘에 독립적으로 칼모듈린(CaM)과 결합함을 확인하였다.

한편, OsCG-1의 아미노산 서열을 유추하면, OsCG-1과 칼모듈린과의 결합 부위는 칼슘에 비의존적인 네 개의 칼모듈린 결합 모티브(Ca²⁺- independent CaM binding motif : IQ motif)와 한 개의 칼슘 의존적인 칼모듈린 결합 모티브(Ca²⁺-dependent CaM binding motif : 1-5-8-14 motif)가 있음을 알 수 있었다.

그런다음, OsCG-1 전자조절인자 내에 있는 다섯 개의 칼모듈린(CaM) 결합 부위(CaM Binding Domains)들이 모두 칼모듈린(CaM)과 결합하는지를 알아보기 위해서, 각각의 칼모듈린(CaM) 결합 부위(CaM Binding Domain)를 피씨알(PCR)로 증폭한 후 GST에 각각 융합하여 재조합 단백질을 만들었으며 이들 단백질과 칼모듈린(CaM)과의 결합 분석실험을 (CaM Binding Domain Assay)을 실시하였다.

도 3의 결과와 같이, 염기서열에서 유추한 칼모듈린 부위 중, 두 번째 칼슘에 의존적인 칼모듈린 결합 모티브(IQ motif)가 칼슘에 없는 상태(-Ca²⁺)에서 칼모듈린(CaM)과 결합하였다. 또한 칼슘에 의존적인 칼모듈린 결합 모티브(Ca²⁺-dependent CaM binding motif : 1-5-8-14 motif)는 칼슘이 있는 상태(+Ca²⁺)에서 다른 부위에 칼모듈린(CaM)이 결합하였다. 이로써 OsCG-1은 칼슘 비의존적인 칼모듈린 결합 모티브(Ca²⁺-independent CaM binding motif) 와 칼슘에 의존적인 칼모듈린 결합 모티브(Ca²⁺-dependent CaM binding motif)의 각각 다른 형태 칼모듈린 결합 부위를 가짐으로써 칼슘 존재에 상관없이 항상 칼모듈린과 결합할 수 있음을 알 수 있었다.

그리고, 칼모듈린 결합 분석에서 칼모듈린과 결합하는 결합력은 도 3의 B에서와 같이, OsCG-1의 칼슘 비의존적인 칼모듈린 결합부위(Ca²⁺-independent CaM binding motif)보다 칼슘 의존적인 칼모듈린 결합부위(Ca²⁺-dependent CaM binding motif)가 칼모듈린과 더 강하게 결합함을 확인하였다.

[실시예 3] OsCG-1 전사조절인자가 결합하는 뉴클레오타이드의 염기서열 결정

3-1. OsCG-1 전사조절인자가 결합하는 뉴클레오타이드의 염기서열을 결정하기 위한 (Random Binding Site Selection : RBSS) 실험방법의 전략

먼저, 파슬리 (parsley) PcCG-1이 결합하는 뉴클레오타이드의 염기서열과 CGCG 염기서열을 가지는 수도의 PAL 유전자의 프로모터(promoter)를 각각 ³²P-[ATP]로 표지한 탐침자를 이용하여 OsCG-1 단백질과 이들 탐침자가 결합하는지를 DNA-단백질 결합 분석법(Electrophoretic mobility shift assay)을 이용하여 분석하였다.

그 결과, OsCG-1은 파슬리 (parsley) PcCG-1이 결합하는 뉴클레오타이드의 염기서열에는 결합하지 않는 반면에, PAL 유전자의 프로모터에는 결합함을 알 수 있었다. 이로써, OsCG-1은 PcCG-1과는 다른 염기서열에 결합하는 결합특이성을 가지고 있음을 확인하였다.

따라서, OsCG-1이 결합하는 DNA 염기서열을 규명하기 위하여 하기와 같은 알비에스에스 (Random Binding Site Selection)실험 전략을 수행하였다.

먼저, 알비에스에스(Random Binding Site Selection)의 실험을 위해서, 임의의 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide)의 66개 중에서 중앙에 OsCG-1이 결합할 뉴클레오타이드 결정하기 위한 15개 무작위 염기서열과, 상기 염기서열을 클로닝하기 위해 양쪽에 BamHI과 HindIII 제한효소 인지 염기 서열(Restriction Enzyme Site)과, 증폭을 위해 프라이머(primer)가 결합될 수 있는 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotide)의 풀(pool)을 합성하였다.

상기 올리고뉴클레오타이드들의 풀에서 프라이머(Primer)를 결합시킨 후 클레나우 (Klenow) 효소를 사용하여 틈 메움(Fill-in) 방식으로 방사성 동위원소로 ³²P-[ATP]로 표지된 두 가닥의 탐침자를 만들었다.

상기 탐침자들은 OsCG-1 단백질과 결합시킨 후, 아크릴아마이드 겔 (Acrylamide gel)에서 전기영동하여 단백질과 올리고뉴클레오타이드의 결합체를 분리하도록 하였다.

상기 분리된 결합체는 겔에서 올리고뉴클레오타이드만 추출하여 피씨알(PCR)방법으로 증폭시켰다.

이때, OsCG-1 단백질과 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드만 남게 하고 비특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드는 제거시키기 위해서, 상기 증폭된 올리고뉴클레오타이드를 상술한 방법으로 다시 OsCG-1 단백질과 결합시킨 후, 반복하여 수행하였다.

이런 반복된 과정을 통해 최종적으로 선택된 뉴클레오타이드들은 BamHI과 HindIII 제한효소를 이용하여 클로닝 벡터인 블루스크립트(pBluescript SK II; stratagene, USA)에 클로닝한 후, 이를 염기서열분석기를 통해서 OsCG-1이 결합하는 염기서열을 결정하는 실험방법의 전략을 선택하였다. 이런 전략을 도 4의 모식도에 간략히 나타내었다.

3-2. OsCG-1과 결합하는 특이적인 올리고 뉴클레오타이드(Oligonucleotide) 염기서열 결정

실시예 3-1의 실험방법을 수행한 결과, OsCG-1 단백질과 특이하게 결합하는 염기서열은 도 5와 같이 크게 두 개의 그룹 (group)로 분류될 수 있었다. 첫 번째 그룹 (group)는 CGCGT 염기서열을 가지는 그룹 (group)이고, 두 번째 그룹 (group)은 CGTGT 염기서열을 가지는 그룹 (group)로 분류되었다. 더 상세히 살펴보면, 그룹 (group) Ia는 CGCGT, 그리고 14번째와 15번째 위치에 CG를 가지는 그룹 (group)으로서 가장 많은 빈도 수를 보이는 염기서열로, 그룹 (group) Ib는 CGCGT 염기서열은 가지지만, 14번째와 15번째 위치에 CG의 염기서열을 가지지 않는 그룹 (group)으로, 그룹 (group) Ic는 CGCG와 14번째와 15번째 위치의 CG 염기서열은 가지지만 CGCG 다음의 7번째 위치에 T가 다른 염기로 치환된 그룹 (group), Id는 CGCG의 염기서열이 GCGC로 된 그룹 (group)으로 분류하였다. 그리고 그룹 (group) IIa는 그룹 (group) Ia와 유사하지만, CGCGT의 염기서열이 CGTGT로 변환된 염기서열을 가지는 그룹 (group)이며, 마지막으로 그룹 (group) IIb는 CGTGT 염기서열을 가지지만 다른 염기들이 보존되어 있지 않는 그룹 (group)으로 분류하였다.

한편, 도 5를 통해 OsCG-1이 결합하는 염기서열을 종합하여, 하기 표 1에서 나타내었다.

위치	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
G	10	19	-	79	-	79	3	21	24	24	32	-	35	-	76
A	14	28	-	-	-	-	-	9	7	10	7	-	11	-	1
T	45	6	-	-	26	-	75	45	40	36	32	75	29	3	2
C	9	26	79	-	53	-	1	4	8	9	8	4	4	76	-
일치	-	-	C	G	C/T	G	T	-	-	-	-	T	_	C	G

이런 결과로부터 OsCG-1이 결합하는 DNA 염기서열은 TWCG(C/T)GTKKKKTKCG(W는 A나 C, 그리고 K는 G나 T)임을 알 수 있었다. 이런 결과를 바탕으로 OsCG-1이 결합하는 DNA 염기서열은 PcCG-1이 결합하는 DNA 염기서열과 유사하지만, 다른 DNA 결합 특이성을 가짐을 확인하였다. 그리고 지금까지 보고된 바 없는 전사조절인자가 결합하는 특이적인 DNA 염기서열임을 확인 할 수 있었다.

3-3. OsCG-1의 DNA 결합 특이성 규명

OsCG-1 단백질과 알비에스에스에서 얻은 DNA 클론 염기서열과의 결합 특이성을 규명하기 위하여 도 5의 각 그룹 (group)에서 대표되는 클론을 골라 비특이적인 결합을 막기 위해 50 mM과 150 mM KCl 존재하에서 각각 DNA-단백질 결합 분석법(Electrophoretic mobility shift assay)을 수행하였다. 그 결과, 도 6의 결과에서와 같이, DNA 염기서열이 조금씩 변함에 따라 결합의 정도 차이를 보였으며 그 중에 염기서열 19의 OsCG-1과의 결합력을 가장 강하게 나타내었다.

[실시예 4] 생체내에서 전사 조절 인자인 OsCG-1의 기능과 CaM의 역할

OsCG-1이 실제 생체내에서 어떤 기능을 수행하는지 알아보기 위하여 애기장대의 원형질(Arabidopsis protoplast)을 이용하여 트랜지언터 발현 분석(Transient Expression Assay)을 수행하였다.

영향인자(Effector)로 완전한 OsCG-1 cDNA와 SCaM과 결합하는 DNA 부위만을 가지는 OsCG-1 조각 부위를 각각 식물체 발현 벡터에 클로닝을 하였으며, 리포터 (Reporter) 유전자로는 OsCG-1 전사조절인자와 결합력이 가장 강한 염기서열 19를 4번 반복하고 GUS(β-glucuronidase)가 발현될 수 있게 최소한의 벡터 프로모터 TATA 앞쪽에 클로닝 하였다. 이러한 플라스미드(plasmid)를 애기장대의 원형질에 형질 전환하여 GUS 활성을 조사해 보았다. 그 결과, OsCG-1 유전자가 클로닝이 안된 플라스미드만을 형질 전환하였을 때는 GUS 활성이 전혀 보이지 않는다(도 7의 첫번째와 두번째 그래프). 그리고 리포터 프라스미드(Reporter Plasmid)만을 형질 전환하였을 때(도 7의 세번째)보다 완전한 OsCG-1 cDNA를 함께 형질 전환하였을때, GUS 활성을 11배가 증가함을 알 수 있었다(도 7의 네번째). 이런 결과로 부터 리포터 프라스미드(Reporter Plasmid)만을 형질 전환하였을 때 GUS 활성이 아주 일부 증가하는 것은 애기장대의 OsCG-1과 유사한 유전자 때문이라고 추측할 수 있었고, OsCG-1 유전자의 full sequence를 도입하였을때, GUS 발현이 11배나 증가한 사실로부터 알비에스에스(RBSS)로 부터 얻은 OsCG-1 결합 DNA 염기서열이 생체내에서도 효과적으로 그 기능을 수행하고 있음을 확인할 수 있었으며, 또한 OsCG-1이 생체내 (in vivo)에서 전사활성인자로서 기능을 수행하고 있음을 증명하였다.

또, OsCG-1이 생체내에서 전사활성인자로서 기능을 수행하는데 있어서, 칼모듈린(CaM)은 어떤 기능을 수행하는지를 알아보기 위하여 칼모듈린(CaM)과 함께 형질 전환시켜 GUS 활성을 조사하여 보았다. 그 결과 OsCG-1에 의해 증가된 GUS 활성을 2배이상 저해하는 결과(도 7의 여섯번째)를 얻을 수 있었으며 이로써 칼모듈린(CaM)은 OsCG-1의 전사조절활성 기능을 억제하는 부정적인 역할 (negative function)을 수행 하는것으로 확인하였다.

[실시예 5] 전사활성인자인 OsCG-1에 대한 칼모듈린(CaM)의 활성조절 영향

도 7의 결과에서 칼모듈린(CaM)은 OsCG-1의 전사활성인자로서의 역할에 부정적인 기능을 수행함을 확인하였는데 칼모듈린(CaM)이 부정적인 기능을 수행하기 위해서는 크게 두 가지 방법으로 그 기능을 수행할 수 있을 것으로 예상할 수 있는데, 그 첫 번째로는 칼모듈린(CaM)이 결합함으로써 OsCG-1이 핵으로 이동하지 못하게 하는 것이고, 두 번째는 칼모듈린(CaM)이 결합함으로써 OsCG-1의 DNA 결합을 억제시키는 것으로 예상할 수 있는 것이다.

이를 확인하고자 먼저 OsCG-1 아미노산 염기서열로부터 C-말단의 핵 이동 신호와 칼모듈린(CaM) 결합 부위가 겹쳐있으므로 이들 바탕으로 애기장대의 원형질을 이용하여 트랜지언트 발현 분석(Transient Expression Assay)을 수행하였다.

먼저, N-말단과 C-말단의 핵 이동 신호를 GFP 발현 벡터(Green Fluorescent Protein, 위스콘신 대학교, 미국)에 클로닝하여, 애기장대의 원형질에 형질 전환 시킨 후, UV 현미경 상에서 GFP 발현양상을 관찰하였다. 그 결과 도 8에서 나타난 바와 같이, N-말단의 핵 이동 신호에 의해 GFP는 대부분 핵에서 발현되며, 일부는 세포질에서도 발현되고 있음을 관찰할 수 있었다. 하지만 C-말단의 핵 이동 신호에 의해 GFP는 핵에서만 관찰되었다. 이로써, N-말단과 C-말단의 핵 이동 신호는 OsCG-1 전사조절인자를 핵으로 이동시키는 신호로 기능을 하고 있으며, 발현 양상에 비추어 C-말단의 핵 이동 신호가 N-말단의 핵 이동 신호보다 더 효과적으로 기능을 하고 있음을 예상할 수 있었다.

또한, OsCG-1 전사조절인자가 핵으로 이동함에 있어서 칼모듈린(CaM)의 기능을 알아보기 위하여 OsCG-1 유전자를 칼모듈린(CaM)의 cDNA와 함께 형질 전환하였을 때, C-말단의 핵 이동 신호에 의해 GFP가 핵에서만 발현되던 것이 칼모듈린(CaM)의 cDNA와 함께 형질 전환하면, 핵뿐만 아니라 세포질에서도 GFP가 발현되고 있음을 관찰할 수 있었다. 이로 미루어 보아 칼모듈린(CaM)이 OsCG-1에 결합함으로써 C-말단의 핵 이동 신호가 그 기능을 수행하지 못하게 함으로써 OsCG-1의 전사조절 기능을 저해하는 것으로 추측할 수 있었다.

[실시예 6] OsCG-1 유전자가 과량 발현된 형질 전환 수도의 표현형

OsCG-1 유전자를 도입한 식물체 전이용 벡터를 제조하기 위하여 OsCG-1 cDNA 절편을 바이너리 벡터인 pCAMBIA 1300(Clunies Ross st, Black moutain, Australia)의 Xba I/Cla I 부위에 클로닝하여 콜리 플라워 모자이크 바이러서(CaM virus)의 35S 프로모토(promoter)와 NOS 종결자의 조절하에서 발현될 수 있는 재조합 식물체 전이용 벡터를 제조하였다(도 9의 A 참조).

이어서, 상기 재조합 벡터를 밤바더먼터(bombardment) 방법을 통하여 형질전환 시킨 후 선택배지에서 선발한 후 재분화 과정을 거친 후, 각 식물체로부터 RNA를 추출한 다음 ³²P-[ATP]로 표시된 프로버(probe)로 노던 블랏 (Northern Blot)을 수행하여 OsCG-1을 과량으로 발현하는 형질 전환 수도 3개 라인 (lines)를 선발하였다(도 9의 B 참조). 그리고 선발된 형질전환체를 온실에서 대조구(wild type)함께 6개월 정도 그 표현형을 관찰한 결과, 대조구는 정상적으로 꽃이 피고, 씨가 맺히지만 OsCG-1을 과량으로 발현하는 3개의 형질 전환 식물체 모두는 종자를 맺지 못하는 불임 (sterile) 현상을 보임을 확인할 수 있었다.

[실시예 7]

본 발명의 OsCG-1 유전자를 안정적으로 보존하기 위하여 미생물에 형질전환하여 보관하였다.

이를 위하여, OsCG-1 유전자는 pBluescript 벡터(Stratagene)의 EcoRI과 XhoI부위에 접합하여 재조합 발현 벡터 pBluescript/OsCG-1를 완성하였고 이를 대장균에 도입하여 형질전환된 대장균 XL-1Blue/MRF(Tc^r)를 보관하였다.

상기 대장균은 2003년 7월 3일자로 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하여, 수탁번호 KCTC10494BP를 부여받았다.

이상의 설명에서와 같이, 본 발명은 수도로부터 분리한 칼모듈린(CaM)과 결합하는 전사조절인자인 OsCG-1 단백질의 cDNA와 아미노산 서열을 제공하여, 이를 식물체에 형질전환을 시켜 종자 수율을 조절할 수 있게 되었다.

또한, 본 발명의 OsCG-1 전사조절유전자가 과발현된 형질전환 식물체가 종자를 맺지 못하는 불임을 나타내는 결과를 활용하여 산업적으로 그 용도를 도출한다면, OsCG-1의 결실 변이(Knock-out mutant)는 상기 결과의 반대 현상을 예측할 수 있기 때문에, 종자 수율이 크게 높아질 것이라 예상할 수 있으므로, 향후 곡물이나 과실류의 결실 효율을 높여 줌으로써 곡류 및 과실류의 생산 효율 증대에 크게 기여할 수 있는 새로운 품종을 개발할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 전사조절인자인 OsCG-1의 염기 서열과 이로부터 추론한 아미노산 서열과 특이적인 부분을 나타낸 것으로,

오른쪽의 숫자는 염기서열 번호, 괄호안 숫자는 아미노산 서열의 번호, 아래 실선은 DNA와 결합하는 도메인의 염기서열과 아미노산 서열, 굵은 실선은 비특이적으로 DNA와 접촉하는 부위(TIG), 이중실선은 단백질-단백질 결합에 관여하는 앤크린 반복 부위, 가는 점선은 칼슘이 없는 조건에서 칼모듈린과 결합하는 부분, 굵은 점선은 칼슘의 존재하에 칼모듈린과 결합하는 부분, 굵은 글씨(볼드체)는 전사를 활성시키는 부분, 별표는 정지 코돈 및 검정 상자안에 표시된 염기서열은 핵이동신호(NLS)를 나타낸 것이고,

도 2는 수도의 게놈에서 전사조절인자의 유전자 갯수를 알아보기 위해, 4종류의 제한 효소로 절단한 후, 게놈 서든 블랏 분석( Genomic southern blot analysis)의 결과를 나타낸 것으로, E는 EcoRⅠ, H는 HindⅢ, P는 PstⅠ, 그리고 X는 XhoⅠ의 제한효소로 처리한 레인을 말하고, TP는 완전한 유전자를 탐침자로 사용한 경우, SP는 유전자의 특이적인 부분을 탐침자로 사용한 경우를 나타내고,

도 3은 본 발명의 OsCG-1 전자조절인자가 칼모듈린에 결합하는 부분을 규명하기 위해, OsCG-1 유전자를 여러부분으로 나누고 GST과 결합하여 발현시켜서, 이를 칼모듈린과 결합시켜, 결합부위를 분석한 결과를 나타낸 것으로,

(A)는 아미노산 서열로부터 유추한 칼모듈린과 결합할 수 있는 부위들로부터 실제 결합부위를 확인하기 위해 각 주위를 재조합한 모식도이며, (B)에서 좌측은 겔을 쿠마시 블루 염색시약으로 염색한 사진이고, 중간과 우측은 칼슘이 있는 상태와 칼슘이 없는 상태에서 각각 칼모듈린과 결합여부를 분석한 결과를 나타낸 것으로,

DB는 DNA와 결합하는 부위, TIG는 비특이적으로 DNA와 결합하는 부위, Ank는 엔크린 반복 부위, CaMBD는 칼모듈린 결합부위, TA는 전사조절 활성부위, 및 DI-DV는 아미노산 서열로부터 유추한 칼모듈린 결합 부위이고,

도 4는 본 발명의 OsCG-1 단백질이 DNA부위에 결합하는 뉴클레오타이드 염기서열을 결정하기 위한 전략의 모식도를 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명의 OsCG-1 단백질이 DNA부위에 결합하는 뉴클레오타이드의 염기서열을 분석하여, 공통적인 서열을 가진 각각의 15개 길이의 염기 서열들을 분류하여 나타낸 것이고,

도 6은 본 발명의 OsCG-1 단백질과 결합한다고 판명된 DNA부위의 뉴클레오타이드 염기서열 (Random Binding Site Selection : RBSS의 결과)과 각 그룹에서 대표되는 클론의 뉴클레오타이드에 OsCG-1 단백질을 결합시킨 결합 특이성을 분석한 결과로서,

(A)는 도 4의 각 그룹에서 대표되는 클론의 염기서열을 나타내것이고, (B)는 각 그룹의 대표되는 클론을 비특이적인 결합을 막기위해 50 mM KCl과 150 mM KCl 상태에서 각각 젤 이동성 분석(Gel Mobility Shift Assay : EMSA) 방법으로 측정한 결합정도를 분석한 결과이고, (C)는 각 클론을 50 mM KCl과 150 mM KCl 상태에서 결합능력이 가장 큰 클론 (19번 크론)의 결합력을 100으로 하고, 각각의 결합능력을 상대적으로 막대그래프로 나타낸 것이고,

도 7은 생체 내 (in vivo)에서 본 발명의 OsCG-1의 전사조절 활성화 현상 및 칼모듈린(CaM)에 의한 OsCG-1의 활성화 저해 결과를 나타낸 것으로,

(A)는 본 실험에서 사용된 벡터를 나타낸 모식도인데, 도 5의 클론 19를 (pdel. 151-8 벡터)의 TATA 상자를 가지고 있는 최소 프로모터 앞 부분에 클로닝한 것을 나타낸 것이고, (B)는 애기장대의 원형질체(Arabidopsis protoplast)에서 OsCG-1 과 SCaM-1 을 여러 조합으로 도입하여 형질전환체를 제조한 후에 GUS활성을 막대그래프로 나타내어 비교한 것이고,

도 8은 생체내에서 칼모듈린(CaM)에 의해 본 발명의 전사조절인자 OsCG-1가 핵으로 이동되는 것이 저해되는 것을 UV 현미경을 통해 나타낸 것으로,

(A)는 OsCG-1의 구조에서 두개의 핵 이동 신호(NLS) 위치와 아미노산서열을 나타낸 모식도로서, 이들을 부위를 각각 GFP 벡터에 클로닝한 것이고, (B)는 첫 번째(NLS I)에 비해 두 번째의 핵으로 이동 신호(NLS II)가 더 효과적으로 이동 할 수 있음을 보여주는 결과이다. 또한 두 번째의 핵으로 이동 신호를 고농도의 칼슘상태에서 칼모듈린(CaM)과 함께 발현시켰을 때 핵으로의 이동이 저해됨을 나타낸 사진인데, NLSI 과 NLSII는 OsCG-1 단백질을 핵으로 이동시킬 것으로 추정되는 핵으로의 이동신호 부위이고, AnkRP는 앤크린 반복 부위, TA는 전사조절 활성 부위 (transcription activation domain)이고,

도 9는 본 발명의 OsCG-1 단백질을 다량으로 발현하는 형질전환 식물체는 불임 현상이 발생되는 것을 사진으로 나타내는 것으로,

(A)는 OsCG-1을 대량으로 발현하는 형질전환 수도를 제조하기 위하여 만든 재조합 DNA 벡터의 모식도를 나타낸 것이고, (B)는 형질전환 수도에서 OsCG-1의 발현을 확인하기 위하여 노던블랏 분석(Northern Blot)을 수행한 결과이고, (C)는 형질전환 수도와 대조구를 종자 발생 유무를 비교한 사진을 나타낸 것이다.

<110> Gyeongsang national university <120> Sequence and function of OsCG-1, a Calmoduline binding transcription factor which effects to the yeild a rice <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3134 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (26)..(2809) <400> 1 cagcggcgga ggcggaggcg gcggccatgg cgggagcggg cggatgggac ccgctcgtcg 60 gctccgagat ccacggtttc ctcacttacc cagacttgaa ctatgataag ctggtggcgg 120 aggcggcggc gcggtggttc cggcctaatg agatctacgc gatattggcg aaccacgcga 180 ggttcaagat ccacgcacaa ccggtcgaca agcccgtgag tggaactgtt gttctatatg 240 atcgtaaagt agtcaggaac ttccgtaagg atggccataa ttggaaaaaa aagaaggatg 300 gcaggacggt ccaagaagct catgaaaaat taaagattgg taacgaagaa agggttcatg 360 tctattatgc tcgaggtgaa aatgatccaa atttctttcg aagatgctac tggctacttg 420 acaaagattt ggagcgcata gttcttgtgc attatcggca aacagctgag gaaaatgcaa 480 tggttcttcc gaacccagaa cctgaagttg cagatgttcc tacagtgaat ttgatccatt 540 acacctttct tctgacctct gcagattcaa cctctggtca tactgagcta tctttgccag 600 aggaaattaa ttcacatggt 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<212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Gly Ala Gly Gly Trp Asp Pro Leu Val Gly Ser Glu Ile His 1 5 10 15 Gly Phe Leu Thr Tyr Pro Asp Leu Asn Tyr Asp Lys Leu Val Ala Glu 20 25 30 Ala Ala Ala Arg Trp Phe Arg Pro Asn Glu Ile Tyr Ala Ile Leu Ala 35 40 45 Asn His Ala Arg Phe Lys Ile His Ala Gln Pro Val Asp Lys Pro Val 50 55 60 Ser Gly Thr Val Val Leu Tyr Asp Arg Lys Val Val Arg Asn Phe Arg 65 70 75 80 Lys Asp Gly His Asn Trp Lys Lys Lys Lys Asp Gly Arg Thr Val Gln 85 90 95 Glu Ala His Glu Lys Leu Lys Ile Gly Asn Glu Glu Arg Val His Val 100 105 110 Tyr Tyr Ala Arg Gly Glu Asn Asp Pro Asn Phe Phe Arg Arg Cys Tyr 115 120 125 Trp Leu Leu Asp Lys Asp Leu Glu Arg Ile Val Leu Val His Tyr Arg 130 135 140 Gln Thr Ala Glu Glu Asn Ala Met Val Leu Pro Asn Pro Glu Pro Glu 145 150 155 160 Val Ala Asp Val Pro Thr Val Asn Leu Ile His Tyr Thr Phe Leu Leu 165 170 175 Thr Ser Ala Asp Ser Thr Ser Gly His Thr Glu Leu Ser Leu Pro Glu 180 185 190 Glu Ile Asn Ser His Gly Gly Ile Ser Ala Ser Ser Glu Thr Gly Asn 195 200 205 His Asp Ser Ser Leu Glu Glu Phe Trp Ala Asn Leu Leu Glu Ser Ser 210 215 220 Ile Lys Asn Asp Pro Lys Val Val Thr Ser Ala Cys Gly Gly Ser Phe 225 230 235 240 Val Ser Ser Gln Gln Ile Asn Asn Gly Pro Lys Asn Ser Gly Asn Ile 245 250 255 Val Asn Thr Ser Met Ala Ser Asn Ala Ile Pro Ala Leu Asn Val Val 260 265 270 Ser Glu Thr Tyr Ala Thr Asn His Gly Leu Asn Gln Val Asn Ala Asn 275 280 285 His Phe Gly Ala Leu Lys His Gln Gly Asp Gln Thr Gln Ser Leu Leu 290 295 300 Ala Ser Asp Val Asp Ser Gln Ser Asp Gln Phe Ile Ser Ser Ser Val 305 310 315 320 Lys Ser Pro Met Asp Gly Asn Thr Ser Ile Pro Asn Glu Val Pro Ala 325 330 335 Arg Gln Asn Ile Leu Gly Leu Trp Asn Tyr Leu Asp Asp Asp Ser Pro 340 345 350 Gly Leu Gly Asp Asn Pro Ser Ser Val Pro Gln Ser Phe Cys Pro Val 355 360 365 Thr Asn Glu Arg Leu Leu Glu Ile Asn Glu Ile Ser Pro Glu Trp Ala 370 375 380 Tyr Ser Thr Asp Thr Thr Lys Val Val Val Ile Gly Asn Phe Tyr Glu 385 390 395 400 Gln Tyr Asn His Leu Ala Gly Ser Ala Met Phe Gly Val Phe Gly Glu 405 410 415 Gln Cys Val Ala Gly Asp Ile Val Gln Thr Gly Val Tyr Arg Phe Met 420 425 430 Val Gly Pro His Thr Pro Gly Lys Val Asp Phe Tyr Leu Thr Leu Asp 435 440 445 Gly Lys Thr Pro Ile Ser Glu Ile Cys Ser Phe Thr Tyr His Val Met 450 455 460 His Gly Ser Ser Leu Glu Ala Arg Leu Pro Pro Ser Glu Asp Asp Tyr 465 470 475 480 Lys Arg Thr Asn Leu Lys Met Gln Met Arg Leu Ala Arg Leu Leu Phe 485 490 495 Ala Thr Asn Lys Lys Lys Ile Ala Pro Lys Leu Leu Val Glu Gly Thr 500 505 510 Lys Val Ala Asn Leu Met Ser Ala Leu Pro Glu Lys Glu Trp Met Asp 515 520 525 Leu Trp Asn Ile Leu Ser Asp Pro Glu Gly Thr Tyr Val Pro Val Thr 530 535 540 Glu Ser Leu Leu Glu Leu Val Leu Arg Asn Arg Leu Gln Glu Trp Leu 545 550 555 560 Val Glu Met Val Met Glu Gly His Lys Ser Thr Gly Arg Asp Asp Leu 565 570 575 Gly Gln Gly Ala Ile His Leu Cys Ser Phe Leu Gly Tyr Thr Trp Ala 580 585 590 Ile Arg Leu Phe Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Asp Phe Arg Asp Ser 595 600 605 Ser Gly Trp Thr Ala Leu His Trp Ala Ala Tyr His Gly Arg Glu Arg 610 615 620 Met Val Ala Thr Leu Leu Ser Ala Gly Ala Asn Pro Ser Leu Val Thr 625 630 635 640 Asp Pro Thr Pro Glu Ser Pro Ala Gly Leu Thr Ala Ala Asp Leu Ala 645 650 655 Ala Arg Gln Gly Tyr Asp Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Ala Glu Lys Gly 660 665 670 Leu Thr Ala His Phe Glu Ala Met Ser Leu Ser Lys Asp Thr Glu Gln 675 680 685 Ser Pro Ser Lys Thr Arg Leu Thr Lys Leu Gln Ser Glu Lys Phe Glu 690 695 700 His Leu Ser Glu Gln Glu Leu Cys Leu Lys Glu Ser Leu Ala Ala Tyr 705 710 715 720 Arg Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ser Asn Ile Gln Ala Ala Leu Arg Glu 725 730 735 Arg Thr Leu Lys Leu Gln Thr Lys Ala Ile Gln Leu Ala Asn Pro Glu 740 745 750 Ile Glu Ala Ser Glu Ile Val Ala Ala Leu Lys Ile Gln His Ala Phe 755 760 765 Arg Asn Tyr Asn Arg Lys Lys Ala Met Arg Ala Ala Ala Arg Ile Gln 770 775 780 Ser His Phe Arg Thr Trp Lys Met Arg Arg Asn Phe Ile Asn Met Arg 785 790 795 800 Arg Gln Val Ile Arg Ile Gln Ala Ala Tyr Arg Gly His Gln Val Arg 805 810 815 Arg Gln Tyr Arg Lys Val Ile Trp Ser Val Gly Ile Val Glu Lys Ala 820 825 830 Ile Leu Arg Trp Arg Lys Lys Arg Lys Ala Leu Arg Gly Ile Ala Ser 835 840 845 Gly Met Pro Val Val Met Thr Val Asp Ala Glu Ala Glu Pro Ala Ser 850 855 860 Thr Ala Glu Glu Asp Phe Phe Gln Ala Gly Arg Gln Gln Ala Glu Asp 865 870 875 880 Arg Phe Asn Arg Ser Val Val Arg Val Gln Ala Leu Phe Arg Ser Tyr 885 890 895 Lys Ala Gln Gln Glu Tyr Arg Arg Met Lys Ile Ala His Glu Glu Ala 900 905 910 Lys Ile Glu Phe Ser Glu Gly Gln Leu Gly Ala Ala Cys Arg Ser 915 920 925

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 전사 조절 인자.
제 1항의 전사 조절 인자를 암호화하는 유전자.
제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 3항의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 6항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 pBluescript/OsCG-1 임을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
제 6항의 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 대장균 XL-1 Blue/MRF(Tc^r) KCTC10494BP.
제 6항의 발현벡터로 식물체를 형질전환하여 제 1항의 전자 조절 인자를 발현시킴으로써 식물체의 종자 수율을 조절하는 방법.
제 8항의 방법에 의해 종자 수율이 조절된 형질전환 식물체.