CN116396948A

CN116396948A - Sal1突变蛋白及其在植物育种中的应用

Info

Publication number: CN116396948A
Application number: CN202111628321.2A
Authority: CN
Inventors: 黄朝锋; 谢文香
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-07-07

Abstract

本发明提供了SAL1突变蛋白及其在植物育种中的应用，具体地，本发明提供了一种分离的SAL1突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为突变的SAL1多肽，并且所述突变的SAL1多肽在野生型SAL1多肽的对应于SEQ ID NO.:1的第285位氨基酸发生突变：第285位的丙氨酸(A)。本发明对野生型SAL1多肽中的关键位点进行改造后，可以显著(i)提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量；和/或(ii)提高植物对钙和铝的敏感性；和/或(iii)改良植物农艺性状，比如，降低植物高度、提高分蘖数、降低小穗长度、延迟开花时间。

Description

SAL1突变蛋白及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明涉及植物学领域，更具体地涉及SAL1突变蛋白及其在植物育种中的应用。

背景技术

矿质营养元素如铁、锌等是植物和动物的必需营养元素，是生物体内许多蛋白的辅助因子，参与细胞代谢、氧化还原、转录调控等多种生物学过程。据统计，全世界超过20亿人口存在铁、锌等矿质营养元素缺乏问题，如何提高主要作物如水稻中的铁、锌等含量对保障人们身体健康具有重要意义。而研究水稻矿质营养元素积累的内在分子遗传机制是培育矿质营养元素高积累品种的前提和基础。

植物需要14种必需矿质营养元素来维持正常的生长发育，其中的铁、锌等必需微量元素对人类的健康维持也至关重要。据统计，全世界超过20亿人口存在铁、锌等矿质营养元素缺乏问题。目前改善矿质营养元素缺乏主要通过调整饮食结构或人工添加的食品干预法，但由于改变饮食习惯存在较大阻力，并且需要一定经济基础，该干预方法覆盖面有限，难以为继。

许多矿质营养元素首先通过较为专一的转运蛋白吸收进入植物根系，然后通过其它转运蛋白运输至地上部和种子中。国内外已报道了大量的各种矿质营养元素的转运蛋白，也有很多研究利用转基因手段改变这些转运蛋白的表达来提高作物的矿质营养元素含量，但是这种改变往往局限于个别元素。

因此，本领域迫切需要开发一种培育高矿质营养元素含量植物，比如水稻新品系的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种培育高矿质营养元素含量植物，比如水稻新品系的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的SAL1突变蛋白，所述的突变蛋白为突变的SAL1多肽，

并且所述突变的SAL1多肽在野生型SAL1多肽的对应于SEQ ID NO.:1的第 285位氨基酸发生突变：

第285位的丙氨酸(A)。

在另一优选例中，所述第285位的丙氨酸(A)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：缬氨酸(V)、亮氨酸(L)。

在另一优选例中，所述第285位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)。

在另一优选例中，所述的突变选自下组：A285V、A285(L)、或其组合。

在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的突变蛋白为具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。

在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如285位)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示的序列相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白具有提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性。

在另一优选例中，所述突变蛋白与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性至少为 80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％或99％。

在另一优选例中，所述SAL1多肽来源于单子叶植物或双子叶植物。

在另一优选例中，所述SAL1多肽来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、十字花科植物。

在另一优选例中，所述SAL1多肽来源于选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、烟草、高粱、小麦、大豆、拟南芥、马铃薯、番茄、油菜、藜麦。

在另一优选例中，所述的SAL1多肽来源于水稻(Oryza sativa)。

在另一优选例中，所述的突变蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如2个、3个、4个或 5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的衍生的多肽与SEQ ID NO.:2所示序列的同源性至少为60％，较佳地至少为70％，更佳地至少为80％，最佳地至少为90％，如95％、 97％、99％。

在另一优选例中，所述突变蛋白为SEQ ID NO.:1所示的野生型的SAL1多肽经突变形成的。

本发明第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的SAL1突变蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:3所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:3所示序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥98％)，且编码SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA 序列、或其组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。

在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述突变蛋白的ORF序列操作性连接的启动子。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。

在另一优选例中，所述真核细胞包括植物细胞。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述草本植物选自下组：茄科、禾本科植物、豆科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述木本植物选自下组：猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：禾本科植物、十字花科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：水稻、拟南芥、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、马铃薯、番茄、油菜、藜麦、高粱或其组合。

本发明第五发明提供了一种SAL1突变蛋白的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达所述的突变蛋白；和

(b)分离所述的SAL1突变蛋白。

本发明第六方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包括本发明第一方面所述的SAL1突变蛋白。

在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。

本发明第七方面提供了一种改良植物的方法，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物细胞，利用基因工程改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达本发明第一方面所述的SAL1突变蛋白；和

(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。

在另一优选例中，所述的步骤(a)包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明第一方面所述的SAL1突变蛋白的DNA编码序列；

(2)将植物细胞与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变蛋白的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和

(3)选择已转入所述突变蛋白的DNA编码序列的植物细胞。

在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达本发明第一方面所述的SAL1突变蛋白。

在另一优选例中，在步骤(a)中，利用基因编辑技术改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞中的SAL1多肽在对应于SEQ ID NO.:1的第285位的丙氨酸发生突变。

在另一优选例中，所述的基因编辑技术选自下组：CRISPR基因编辑体系、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN。

在另一优选例中，所述基因编辑技术包括碱基编辑器。

在另一优选例中，所述的基因编辑技术包括可以产生所述突变的任何技术方法。

在另一优选例中，所述方法改良植物的性能，所述性能包括：(i)提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量；和/或(ii)提高植物对钙和铝的敏感性；和/或(iii)改良植物农艺性状。

在另一优选例中，所述改良植物农艺性状包括：降低植物高度、提高分蘖数、降低小穗长度、延迟开花时间。

在另一优选例中，所述有益元素包括钾、磷、镁、钙、铁、钼、铜、锌、硒。

在另一优选例中，所述有毒重金属包括砷。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：对所述植物细胞，测试其提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的性能。

本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的SAL1突变蛋白或其编码基因的用途，用于培育积累有益元素的植物株系、或用于制备培育积累有益元素的植物株系的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述植物株系还具有选自下组的一种或多种特征：

(a)降低植物中有毒重金属的含量；

(b)提高植物对钙和铝的敏感性；

(c)降低植物高度、提高分蘖数、降低小穗长度、和/或延迟开花时间。

本发明第九方面提供了一种有益元素积累的敏感位点，所述位点包括：

对应于(i)来源于水稻的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(ii)来源于拟南芥的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(iii)来源于高粱的野生型 SAL1多肽的第284位氨基酸；或(iv)来源于小麦的野生型SAL1多肽的第285 位氨基酸；或(v)来源于玉米的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(vi)来源于油菜的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(vii)来源于大豆的野生型 SAL1多肽的第285位；或(viii)来源于马铃薯的野生型SAL1多肽的第285 位；或(ix)来源于番茄的野生型SAL1多肽的第285位；或(x)来源于大麦的野生型SAL1多肽的第285位；或(xi)来源于藜麦的野生型SAL1多肽的第285 位，或(xii)来源于烟草的野生型SAL1多肽的第285位。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了sal1突变体比野生型对钙和铝毒更敏感，在根尖积累更多的钙和铝。

其中，(A)野生型和sal1突变体在含0和0.5mM CaCl₂溶液中生长5天的表型图，(B)野生型和sal1突变体在含不同浓度CaCl₂溶液中生长5天的根伸长量， (C)野生型和sal1突变体在0.5mM钙溶液里处理3h和6h后测定根尖的钙含量， (D)野生型和sal1突变体在含0和20μM AlCl₃溶液中生长5天的表型图，(E)野生型和sal1突变体在含不同浓度铝溶液中24h的根伸长量，(F)野生型和sal1突变体在0.5mM CaCl₂溶液里处理0.5h、3h和6h后测定根尖的钙含量。图1A和1D的标尺为2cm,图1B、1C、1E和1F中数据用平均数±方差表示，图1B和1E采用10 个生物学重复，上述图中均采用Student’s测试野生型和sal1突变体的显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001.

图2野生型和sal1突变体中矿质元素元素含量的比较。

其中，(A)野生型和sal1突变体水培2周的生长表型图,(B)野生型和sal1突变体根和地上部中大量元素含量的比较，(C)野生型和sal1突变体根和地上部中微量元素含量的比较，(D)野生型和sal1突变体籽粒中大量元素含量的比较，(E) 野生型和sal1突变体籽粒中微量元素含量的比较，(F)野生型和sal1突变体籽粒中有毒重金属元素含量的比较。图2中数据用平均数±方差表示，图2A的标尺为2cm,图2B和2C中数据用平均数±方差表示，12个生物学重复，图2D-2E中设置6个生物学重复，采用Student’s测试野生型和sal1突变体的显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图3野生型和sal1突变体的农艺性状。

野生型和sal1突变体在大田中生长100天的表型图(A)和小穗表型图(B)，(C) 野生型sal1突变体在稻田中生长120天后成熟种子的表型图，在生长发育期间统计野生型和sal1突变体的分蘖个数(D)、植物高度(E)、小穗长度(F)、开花时间 (G)、千粒重(H)和结实率(I)。图3中数据用平均数±方差表示，图3A-3C的标尺为2cm,数据用平均数±方差表示，图3D-3G为65个生物学重复，图3H为16个生物学重复，图3H为38个生物学重复采用Student’s测试野生型和sal1突变体的显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

图4SAL1基因编码一个PP2C.D蛋白磷酸酶。

(A)SAL1基因的结构和sal1突变位点，(B)pNPP法分析SAL1-His和sal1-His 蛋白的蛋白磷酸酶活性，右上角是Western blotting检测纯化后的蛋白图，红色箭头指示预测SAL1蛋白的大小，(C)野生型、sal1突变体和2个回补转基因株系 (pSAL1:SAL1-3HA/sal1)com#2以及com#9在0.5mM CaCl₂溶液处理48h的根伸长量,(D和E)野生型、sal1突变体和2个回补转基因株系(pSAL1:SAL1-3HA)在1/2 Kimura B营养液中生长2周，ICP-MS测定根和地上部中大量元素和微量元素的含量，(F)qRT-PCR分析野生型、sal1突变体和2个回补转基因株系 (pSAL1:SAL1-3HA/sal1)中SAL1基因的转录本水平，(G)Western blotting检测2个回补转基因株系(pSAL1:SAL1-3HA/sal1)中SAL1蛋白水平。图4中数据用平均数±方差表示，图4B和4F中设3个生物学重复，图4C设10个生物学重复，图4D和 4E设4个生物学重复，采用基于Tukey test的ANOVA分析方法进行平均数的多重比较(p<0.05).

图5SAL1的基因表达模式。

(A)qRT-PCR分析SAL1基因的组织表达模式，(B-H)GUS染色分析SAL1在种子根(B)和侧根(C)的根尖(D)，根尖的横切图(E)显示SAL1广泛分布在根尖的所有细胞。图5G和5H的标尺为2mm,图5B-5D的标尺为1mm,图5E和5F的标尺分别为50μm和200μm。

图6SAL1的亚细胞定位。

构建成功的35S:SAL1-eGFP、35S:sal1-eGFP和35S:SAL1^{C12G,C151G,C152G}- eGFP载体通过PEG-Ca的方法转化到水稻原生质体中进行瞬时表达，采用激光共聚焦显微镜观察eGFP的荧光信号。图6中标尺为2μm。

图7SAL1与OSA7相互作用，负调控PM H⁺-ATPase活性。

(A)Split-LUC荧光酶互补试验SAL1与OSA7的相互作用，(B) DUALmembrane Y2H酵母双杂交试验测试SAL1或sal1与OSA7的相互作用，(C) Co-IP免疫共沉淀试验测试SAL1或sal1与OSA7的相互作用，(D)酵母回补试验验证SAL1负调控多个水稻细胞质膜质子泵成员OSAs的活性，(E)SAL1负调控水稻质膜上PM H⁺-ATPase的pThr⁹⁴⁷磷酸化以及其活性。图7E中数据用平均数±方差表示，设置6个生物学重复，采用Student’s测试野生型和sal1突变体的显著性差异，**表示p<0.01。

图8SAL1负调控PM H⁺-ATPase活性影响根对高钙的敏感性和元素积累。

(A)外施PM H⁺-ATPase的抑制剂Na₃VO₄对根长的影响，(B)外施PM H⁺- ATPase的激动剂FC对根长的影响，(C)在sal1突变体中将OSA7基因RNAi恢复 sal1突变体根对高钙的敏感性，在野生型中过量表达OSA7基因增加根对高钙的敏感性,5个OSA7 RNAi/sal1转基因株系和8个OSA7过量表达株系在0.5mM钙处理1周的表型图，(D)qRT-PCR分析5个OSA7 RNAi/sal1转基因株系和8个 OSA7过量表达株系中OSA7基因的转录本表达水平，(E和F)野生型、sal1突变以及3个OSA7 RNAi/sal1转基因株系在1/2Kimura B营养液中培养2周，ICP-MS 分析中大量元素(E)和微量元素(F)含量，(G和H)野生型和3个OSA7过量表达转基因株系在1/2Kimura B营养液中培养2周，ICP-MS分析幼苗地上部和根中大量元素(G)和微量元素(H)的含量。图8中数据用平均数±方差表示，图8A和8B 设置10个生物学重复，图8D设置3个生物学重复，采用Student’s测试野生型和 sal1突变体的显著性差异，**表示p<0.01。图8E-8H设置4个生物学重复，采用基于Turkey’s的ANOVA进行多重比较。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地筛到了具有提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性的关键氨基酸位点。本发明发现，对野生型SAL1多肽中的关键位点进行改造后，可以显著(i)提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量；和/或(ii)提高植物对钙和铝的敏感性；和/或(iii)改良植物农艺性状，比如，降低植物高度、提高分蘖数、降低小穗长度、延迟开花时间。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“L87I”表示第87位的氨基酸L突变为I，以此类推。

如本文所用，术语“SAL1”是指Sensitive to aluminum 1，SAL1是铝敏感基因SAL1编码的蛋白，是PP2C.D磷酸酶家族的成员，本发明首次发现，SAL1 基因突变后使得sal1突变体的根对铝毒超敏感，增加籽粒中有益元素的积累以及降低重金属砷的积累，改良植物，比如水稻农艺性状。

如本文所用，术语“SAL1突变蛋白”、“突变的SAL1多肽”、“突变蛋白”、“本发明多肽”等可互换使用，都指本发明第一方面所述的多肽。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的SAL1突变蛋白”是指该突变蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该突变蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，所述“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。除甘氨酸外均为L－α－氨基酸(其中脯氨酸是一种L－α－亚氨基酸)，其结构通式为

(R基为可变基团)。

本发明突变蛋白及其编码核酸

如本文所用，术语SAL1突变蛋白”、“突变的SAL1多肽”、“突变蛋白”、“本发明多肽”可互换使用，均指非天然存在的为突变的SAL1多肽，且所述突变蛋白为基于SEQ ID NO.:1所示蛋白进行人工改造的蛋白，其中，所述的突变蛋白含有与具有提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸是经过人工改造的。

术语“核心氨基酸”指的是基于SEQ ID NO.:1，且与SEQ ID NO.:1同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％或99％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID NO.:1所示的序列，核心氨基酸为：

第285位的丙氨酸(A)。

且对上述核心氨基酸进行突变所得到的突变蛋白具有提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性。

优选地，在本发明中，对本发明的所述核心氨基酸进行如下突变：

第285位的丙氨酸(A)突变为缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。

应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQ ID NO.:1作出，当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO.:1的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似的提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。

本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(i ii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。

表I

本发明的活性突变蛋白具有提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性。

优选地，所述的突变蛋白如SEQ ID NO.:2所示。

MIVTLMNLLRACWRPSSNQHARAGSDVAGRQDGLLWYKDTGQHVNGEFSMAVVQANNLLEDQCQIES

GPLSFLDSGPYGTFVGVYDGHGGPETACYINDHLFHHLKRFASEQNSMSADVLKKAYEATEDGFFSV

VTKQWPVKPQIAAVGSCCLVGVICGGILYVANVGDSRVVLGRHVKATGEVLAVQLSAEHNVSIESVR

KELQSMHPEDRHIVVLKHNVWRVKGLIQVCRSIGDAYLKRSEFNREPLYAKFRLREPFHKPILSSEP

SISVQPLQPHDQFLIFVSDGLWEHLTNQEAVDIVHSSPRNGSARRLIKAALQEAAKKREMRYSDLKKIDRGVRRHFHDDITVIVVFLDSSLVSRASTYRGPSVSLRGGGVNLRSNTLAPYASQM(SEQ ID NO.2)

应理解，本发明突变蛋白与SEQ ID NO.:2所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与SEQ ID NO.:2所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％或 99％。

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

在一优选实施方式中，本发明的编码突变蛋白的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.:3所示。 ATGATAGTGACATTGATGAACTTGTTACGGGCATGCTGGAGACCATCATCCAACCAGCATGCCCGGGCAGGCTCAGATGTTGCCGGCAGGCAGGATGGACTTCTATGGTACAAGGACACTGGTCAGCATGTAAATGGGGAAT TCTCTATGGCTGTGGTCCAGGCCAACAACTTACTTGAGGATCAGTGCCAGATTGAATCGGGTCCATTGAGC TTTCTTGACTCTGGTCCATACGGAACTTTCGTCGGGGTTTATGATGGACATGGTGGCCCAGAGACGGCTTG CTATATCAACGATCACCTATTCCACCATCTGAAAAGGTTTGCATCTGAACAGAATTCGATGTCTGCTGATG TGCTGAAGAAAGCATATGAAGCTACAGAAGATGGGTTCTTCTCTGTTGTCACTAAGCAATGGCCTGTGAAG CCTCAAATAGCTGCTGTTGGCTCGTGCTGCCTGGTTGGTGTAATCTGTGGTGGCATTCTTTATGTTGCTAA TGTTGGGGATTCCCGTGTTGTTTTAGGCAGACATGTCAAAGCCACGGGAGAAGTTCTGGCTGTCCAACTCT CAGCAGAGCATAACGTAAGCATTGAGTCAGTGAGAAAAGAATTGCAGTCAATGCACCCGGAAGATAGGCAT ATTGTTGTTCTCAAGCACAACGTTTGGCGTGTAAAAGGTCTAATTCAGGTCTGCAGATCAATTGGTGATGC CTATCTCAAAAGATCAGAGTTCAACCGGGAACCTTTGTATGCAAAATTCCGCCTCCGGGAACCTTTTCACA AGCCCATACTAAGTTCAGAACCATCGATTAGTGTGCAACCCCTACAACCACATGATCAATTTCTCATATTT GTATCTGATGGTCTATGGGAGCACTTAACCAATCAAGAGGCCGTTGACATTGTTCACAGTAGCCCTCGCAA TGGAAGTGCTAGGAGGCTCATAAAGGCAGCTTTGCAAGAAGCAGCCAAGAAAAGAGAAATGAGGTACTCAG ATCTCAAGAAGATTGACCGTGGTGTTCGCCGCCACTTCCATGATGACATAACCGTCATAGTAGTCTTCCTC GACTCCAGCCTTGTCAGCAGGGCGAGCACCTACAGGGGCCCTTCTGTTTCTTTAAGAGGCGGCGGCGTGAA TCTGCGCAGCAACACACTTGCACCTTATGCATCTCAAATGTGA(SEQ ID NO.3)

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件) 下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指： (1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子 (或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

应注意，本发明的来源水稻的SAL1氨基酸序列中的285位点在拟南芥(序列登录号NP_195564.2，对应位点285)、在高粱(序列登录号 XP_002439035.1，对应位点284)、在小麦(序列号XP_044425325.1，对应位点 285)、在大麦(序列号XP_044956403.1，对应位点285)、在玉米(序列号 PWZ24762.1，对应位点285)、在油菜(序列号CAF2151304.1，对应位点285)、在大豆(序列号XP_040869151.1，对应位点285)、在马铃薯(序列号 KAH0685333.1，对应位点285)、在番茄(序列号XP_004234522.1，对应位点 285)中均为保守位点。因此，上述位点在作物中对提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量的活性具有至关重要的作用。

在一优选实施方式中，本发明的编码突变蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3 所示。

ATGATAGTGACATTGATGAACTTGTTACGGGCATGCTGGAGACCATCATCCAACCAGCATGCCCGG GCAGGCTCAGATGTTGCCGGCAGGCAGGATGGACTTCTATGGTACAAGGACACTGGTCAGCATGTAAATGG GGAATTCTCTATGGCTGTGGTCCAGGCCAACAACTTACTTGAGGATCAGTGCCAGATTGAATCGGGTCCAT TGAGCTTTCTTGACTCTGGTCCATACGGAACTTTCGTCGGGGTTTATGATGGACATGGTGGCCCAGAGACG GCTTGCTATATCAACGATCACCTATTCCACCATCTGAAAAGGTTTGCATCTGAACAGAATTCGATGTCTGC TGATGTGCTGAAGAAAGCATATGAAGCTACAGAAGATGGGTTCTTCTCTGTTGTCACTAAGCAATGGCCTG TGAAGCCTCAAATAGCTGCTGTTGGCTCGTGCTGCCTGGTTGGTGTAATCTGTGGTGGCATTCTTTATGTT GCTAATGTTGGGGATTCCCGTGTTGTTTTAGGCAGACATGTCAAAGCCACGGGAGAAGTTCTGGCTGTCCA ACTCTCAGCAGAGCATAACGTAAGCATTGAGTCAGTGAGAAAAGAATTGCAGTCAATGCACCCGGAAGATA GGCATATTGTTGTTCTCAAGCACAACGTTTGGCGTGTAAAAGGTCTAATTCAGGTCTGCAGATCAATTGGT GATGCCTATCTCAAAAGATCAGAGTTCAACCGGGAACCTTTGTATGCAAAATTCCGCCTCCGGGAACCTTT TCACAAGCCCATACTAAGTTCAGAACCATCGATTAGTGTGCAACCCCTACAACCACATGATCAATTTCTCA TATTTGTATCTGATGGTCTATGGGAGCACTTAACCAATCAAGAGGCCGTTGACATTGTTCACAGTAGCCCT CGCAATGGAAGTGCTAGGAGGCTCATAAAGGCAGCTTTGCAAGAAGCAGCCAAGAAAAGAGAAATGAGGTA CTCAGATCTCAAGAAGATTGACCGTGGTGTTCGCCGCCACTTCCATGATGACATAACCGTCATAGTAGTCT TCCTCGACTCCAGCCTTGTCAGCAGGGCGAGCACCTACAGGGGCCCTTCTGTTTCTTTAAGAGGCGGCGGC GTGAATCTGCGCAGCAACACACTTGCACCTTATGCATCTCAAATGTGA(SEQ ID NO.3)

野生型SAL1多肽

如本文所用，“野生型SAL1多肽”是指天然存在的、未经过人工改造的 SAL1多肽，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型SAL1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

MIVTLMNLLRACWRPSSNQHARAGSDVAGRQDGLLWYKDTGQHVNGEFSMAVVQANNLLEDQCQIE SGPLSFLDSGPYGTFVGVYDGHGGPETACYINDHLFHHLKRFASEQNSMSADVLKKAYEATEDGFFSVVTK QWPVKPQIAAVGSCCLVGVICGGILYVANVGDSRVVLGRHVKATGEVLAVQLSAEHNVSIESVRKELQSMH PEDRHIVVLKHNVWRVKGLIQVCRSIGDAYLKRSEFNREPLYAKFRLREPFHKPILSSEPSISVQPLQPHD QFLIFASDGLWEHLTNQEAVDIVHSSPRNGSARRLIKAALQEAAKKREMRYSDLKKIDRGVRRHFHDDITV IVVFLDSSLVSRASTYRGPSVSLRGGGVNLRSNTLAPYASQM(SEQ ID NO.1)

重组技术和植物改良

本发明的编码SAL1突变蛋白的多核苷酸的全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或除草剂抗性多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的除草剂抗性多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码SAL1突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含SAL1突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞、动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得除草剂耐受性改变的植物。

也可以利用基因编辑技术直接对目标植物基因组中的SAL1进行编辑，从而使植物细胞表达本发明的突变蛋白。代表性的基因编辑技术包括CRISPR基因编辑体系、易错PCR、基因重组、TALEN和ZFN。

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统为细菌与古生菌中抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。该系统的核酸酶在crRNA的指导下识别并降解外源DNA。其中，II型CRISPR/Cas系统组成简单，仅包括一个核酸酶Cas9与 tracrRNA:crRNA二聚体便可完成识别和切割功能。CRISPR/Cas9系统以其设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势迅速成为新一代的基因组编辑技术，已被广泛应用于人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物、真菌与细菌等不同物种。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的SAL1突变蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对SAL1突变蛋白功能的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组SAL1突变蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能刺激SAL1突变蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对SAL1突变蛋白或是其编码基因具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的SAL1突变蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。本发明的各类抗体可以利用SAL1突变蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与SAL1突变蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。SAL1突变蛋白的抗体可用于检测样品中的SAL1突变蛋白。

一种检测样品中是否存在SAL1突变蛋白的方法是利用SAL1突变蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与SAL1突变蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SAL1突变蛋白。

本发明多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或 DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用 SAL1突变蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链式反应(RT-PCR)体外扩增也可检测 SAL1突变蛋白的转录产物。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次发现，水稻SAL1的第285位氨基酸由A突变为V后，可显著改良植物的性能，包括(i)提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属的含量；和/或(ii)提高植物对钙和铝的敏感性；和/或(iii)改良植物农艺性状。

(b)本发明首次发现，SAL1通过调控质膜H⁺-ATPase活性从而调控矿质营养元素积累，并利用sal1突变体提高稻米矿质营养元素含量，改良稻米营养品质。

(c)本发明首次发现，本发明筛选获得的sal1突变体表现为多种矿质营养元素含量升高而不影响农艺性状，因而该sal1突变位点具有育种利用价值，可以通过遗传杂交导入至主栽水稻品种中，培育高矿质营养元素含量水稻新品系。此外，本发明的研究也为通过基因编辑手段定点突变SAL1基因改良水稻种子矿质营养含量提供基因资源和关键理论支撑。

(d)本发明首次克隆了调控水稻矿质营养积累新基因SAL1，它编码一个 PP2C.D磷酸酶家族成员。

(e)本发明首次揭示SAL1通过负调控H⁺-ATPase活性从而调控矿质元素含量的分子机制。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。

1.植物材料和生长条件

本发明所涉及水稻的遗传背景都为Kasalath生态型(Oryza sativa L.subsp.Indica,Kasalath，获自中国科学院分子植物科学卓越创新中心),发明人前期构建了一个Kasalath的EMS诱变库(Liu et al.,2016)，从此诱变库中通过筛选水稻铝毒敏感突变体过程中获得了sal1(sensitive to aluminum 1)突变体。为了调查野生型和sal1突变体的农艺性状，于2019年6月初将野生型和sal1突变体的种子播种并单株种植在上海松江区庆丰农场，每5个单株为1行，野生型和sal1突变体各 15行。在水稻的生长发育过程中，对植物表型进行拍照并统计农艺性状，包括开花时间、株高、分蘖数、小穗长度和成熟种子的千粒重。

2.钙和铝毒敏感性的评价

比较野生型和sal1突变体对铝毒的敏感性时，试验方法如之前文献报道所述(Liu et al.,2020)，水稻种子加去离子水于37℃避光浸泡2天，播在漂浮于盛有 pH 4.5的0.5mM CaCl₂溶液的水稻网上生长3天，然后转移到含有不同浓度AlCl₃和0.5mM CaCl₂的溶液，溶液的pH用2M HCl调至4.5，用尺子测量每隔24h的根长。为了比较野生型和sal1突变体对长时间铝毒的敏感性时，将露白的野生型和sal1突变体种子直接播种在含或者不含20μMAlCl₃的0.5mM CaCl₂溶液(pH 4.5),生长5天后用直尺测量根的长度并且拍照。

比较野生型和sal1突变体对钙的敏感性时，将浸泡2天露白的水稻种子直接播在含不同浓度的CaCl₂溶液里生长5天，用直尺测量根的长度并拍照。

3.元素含量的测定

根尖钙和铝积累量的测定方法参考本课题组已发表的一篇论文(Liu et al.,2016)，将生长5天的水稻幼苗转移到20μM AlCl₃或0.5mM CaCl₂溶液中处理0.5 h、3h和6h,根在pH为8.0的10mM EDTA中洗2次，每次2分钟，最后在18MΩ去离子水中洗2分钟，吸水纸去除表面的水。用刀片切0-1cm的根尖，每20根作为一个样本并加200μL HNO₃，在室温放置3天以上溶解根尖的钙和铝离子，最后将溶解液定容至10mL。

水稻根、地上部和籽粒中矿质元素的测定在参考本课题组发表的论文(Yang etal.,2021)上做了微调，为了检测水稻根、地上部矿质元素的含量，采用水培的方法将野生型和sal1突变体在1/2强度的Kimura B营养液中培养2周(Chen et al., 2006)，根在pH为8.0的10mM EDTA中洗2次，每次5分钟，最后在18MΩ去离子水中洗5分钟，收集好的根和地上部放到60℃烘干4天。取适量的根、地上部和已经脱壳的水稻籽粒，加2mL HNO₃后放置过夜使组织软化,135℃消化4h后将样品定容至10mL。采用电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS(NePerkinElmer, NexION300D)测定以上样品中铝、钙以及其他矿质元素的含量。

4.SAL1基因的克隆

为了克隆SAL1，技术流程参考本课题组发表的论文(Liu et al.,2020)。将 sal1突变体和野生型杂交构建用于做遗传分析和基因定位的F2群体，该群体F2 中481单株进行高钙处理，分析高钙敏感和不敏感单株的数量比，并以此作为判断SAL1基因的遗传方式的依据。将上述高钙敏感群体和野生型的叶片组织混合样品委托予上海瀚宇生物科技有限公司建立混合池进行全基因组测序(Abe et al., 2012)，以野生型的全基因组测序结果为参考，根据测序公司的分析结果发展酶切扩增多态性序列(dCAPS)进行连锁分析，所用的引物见表格表1。

为了构建遗传回补转基因水稻，以野生型基因组DNA(gDNA)为模板、5’- TTGGGGCCCAACGTTCTCGAGCCATTAGCAGCCAATATGCCCT-3’及5’- CATGGTCTTTGTAGTCAAGCTTCATTTGAGATGCATAAGGTGCAA-3’为引物，用KOD-Plus-NEO高保真酶(Toyobo,Japan)扩增包括ATG前3523bp和不带终止密码子TGA的编码区基因组序列，按照ClonExpress II One StepCloning Kit 试剂盒说明书(C112,Vazyme，China)将DNA片段通过同源重组的方法构建到3HA-pCAMBIA1305质粒，确认序列正确后将质粒转到农杆菌EHA105菌株 (Agrobacteriumtumefaciens)，通过农杆菌Agrobacterium介导的转化方法转化到 sal1突变体的愈伤组织，水稻转基因部分的工作委托予浙江省农业科学院王华老师。鉴定到的2个T2纯合转基因株系com#2和com#9用于遗传回补试验和SAL1- HA的检测。

表1 dCAPS所用引物列表

5.RNA提取和qRT-PCR

为了分析SAL1基因转录本的表达情况，野生型、sal1突变体以及转基因株系包括sal1突变体的回补株系com#2和com#9、5个OSA7 RNIi/WT转基因植株和 5个pUBi:OSA7/WT转基因植株，露白的水稻子直接播种在1/2强度的Kimura B营养液中培养2周，收集根组织样品，用Trizol试剂(R0016,Beyotime,China)提取总RNA。取1μg RNA按照HiScript II QSelect RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R233,Vazyme,China)试剂盒说明反转录为cDNA，以此作为模板，按照 2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix(RK21203，ABclonal,China)试剂盒说明书,以水稻UBQ5为内参基因，采用2^{^(-ΔΔt)}方法分析SAL1基因转录本的相对表达。用于qRT-PCR分析SAL1基因的引物序列为5’- CCACCATCTGAAAAGGTTTGC-3’和5’-GCCACCACAGATTACACCAAC-3’, 水稻UBQ5内参基因的引物序列为5’-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3’和5’- ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3’。在采用qRT-PCR方法分析SAL1基因在水稻各个组织的表达模式时，模板是来自野生型水稻各个组织的cDNA(Liu etal., 2020)。

6.GUS染色

为了构建用于组织定位的pSAL1:SAL1-GUS/WT转基因株系，用引物5’- TTGGGGCCCAACGTTCTCGAGCCATTAGCAGCCAATATGCCCT-3’和5’- GGCCGCAAAGTCGACGAATTCCATTTGAGATGCATAAGGTGCAA-3’扩增包括ATG前3523bp和不带终止密码子TGA的编码区基因组序列，采用同源重组的方法将DNA片段插入到pORE-R2质粒，确认序列正确后将质粒转到农杆菌EHA105菌株，通过农杆菌Agrobacterium介导的转化方法转化到野生型种子的愈伤组织，鉴定到的T2纯合转基因株系用于GUS染色。将pSAL1:SAL1-GUS/WT 转基因株系的种子在1/2强度的Kimura B营养液中培养1周，根系用去离子水中清洗1次，并加适量非扩散型GUS染液(S101,北京奥博来科技有限公司)淹没植物的各个组织，放于37℃培养箱避光染色过夜，叶片需在倾倒掉染液后依次在 25％、50％、75％和100％乙醇梯度脱色后加适量去离子水，其他组织在倾倒染色液后加适量去离子水。为了更清楚地观察根尖和茎部GUS的染色情况，将GUS染色后的根尖和茎轻柔地包埋于将要凝固的5％Agar溶液里，室温冷却后切成50μm厚度的横切切片(LeicaVT1200S,Leica,Germany)。最后将组织样品和横切切片放于实体显微镜(Olymps SZX7,Toyobo,Japan)下拍照。

7.蛋白磷酸酶活性的测定

首先构建原核表达载体，分别以野生型和sal1突变体的cDNA为模板，用引物5’-TCCATGGCTGATATCGGATCCATGATAGTGACATTGATGAAC-3’和

5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCATTTGAGATGCATAAGGTGCAA- 3’扩增SAL1和sal1片段，采用同源重组的方法将DNA片段插入到带有His标签的 pET29a原核表达载体，构建成功的载体转化到大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)pLys 菌株(Cat#EC1003,Shanghai WeidiBiotechnology,China)。将转化子在37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，添加终浓度为0.5mM的IPTG,于16℃震荡过夜诱导SAL1- His和sal1-His的表达，按照Ni-TED琼脂糖纯化树脂(C610030,Songon,China)说明书对SAL1-His和sal1-His蛋白进行纯化，使用Quick Start^TMBradford (5000205，Bio-Rad，USA)测定已纯化蛋白的浓度并用洗脱液调到统一浓度。取10μg纯化后的蛋白先进行12％SDS-PAGE分离蛋白和Western blotting确认蛋白大小。

采用pNPP法蛋白磷酸酶活性的测定(Spartz et al.,2014)，取1μg已纯化的 His、SAL1-His和sal1-His蛋白在100μL反应液体系中室温反应20min,反应液组分为：75mMTris,pH 7.6,10mM MnCl2,100mM NaCl,0.5mM EDTA,5mM pNPP。以pET29a载体表达的蛋白为空白对照，4-nitrophenol为标线，用酶标仪 (Varioskan Flush,Thermo,USA)测定405nm的吸光度值。

8.跨膜区和棕榈酰化位点的预测

为了预测SAL1蛋白是否有跨膜区域，将SAL1的氨基酸序列直接提交到在线网站TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。为了预测SAL1蛋白的棕榈酰化位点，将SAL1的氨基酸序列分别提交到在线预测网站WAP-Palm(http:// bioinfo.ncu.edu.cn/WAP-Palm.aspx)和CSS-Palm Online Service(http:// csspalm.biocuckoo.org/online.php)，根据返回结果的预测可能性选择概率较高的3个棕榈酰化位点C12、C151和C152。

9.原生质体提取和亚细胞定位

将野生型种子在1/2Kimura B营养液中避光生长2周，用2周的黄化苗来制备原生质体，原生质体提取和转化方法参照文献所述(Zhang et al.,2011)。为了构建35S:SAL1-eGFP和35S:sal1-eGFP载体，分别以野生型和sal1突变体的cDNA为模板、5’-TCGAGCTCAAGCTTCGAATTCATGATAGTGACATTGATGAAC-3’和5’-GTACCGTCGACTGCAGAATTCCATTTGAGATGCATAAGGTGCAA-3’采为引物扩增SAL1和sal1片段，通过同源重组的方法将其插入pEZS- NL(35S:eGFP)瞬时转化载体。

为了构建35S:SAL1^{C12G,C151G,C152G}-eGFP载体，首先以35S:SAL1-eGFP为模板、5’-GTTACGGGCATGCTGGAGACCATCATCCAAC-3’和5’- ATGGTCTCCAGCA TGCCCGTAACAAGTTCAT-3’为引物反向扩增，PCR产物经DpnI处理后进行纯化后直接转化到大肠杆菌感受态并提取质粒35S:SAL1^C12G- eGFP；再以质粒35S:SAL1^C12G-eGFP为模板，5’-GCTGTTGGCTCGTGCTGCCTGGTTGGT GTAATCTGT-3’和5’- TACACCAACCAGGCAGCACGAGCCAACAGCAGCTAT-3’为引物反向扩增， PCR产物经DpnI处理后进行纯化后直接转化到大肠杆菌感受态并提取质粒 35S:SAL1^{C12G，C151G,C152G}-eGFP。构建成功的质粒转化到水稻原生质体并在激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM880)下观察GFP的荧光信号,使用的激发光波长为 488nm,eGFP信号在500-530nm波长区段叶绿素自发荧光收集650-750nm。

10.Split-LUC试验

Split-LUC试验操作参考已发表的文献(Sparkes et al.,2006)，为了构建 SAL1-cLUC和OSA7-nLUC,以野生型的cDNA为模板，分别用引物5’- GAGAACACGGGGGACGAGCTCATGATAGTGACATTGATGAAC-3’和 5’-TACATAACCGGACATGAGCTCCATTTGAGATGCATAAGGTG-3’以及

5’-CGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGGTGGGCTCGAGGAGAT-3’和

5’-CGCGTACGAGATCTGGTCGACCACTGTGTAGTTCTGCTGGA-3’扩增 SAL1和OSA7片段，通过同源重组的方法插入到pCAMBIA1300-cLUC和 pCAMBIA1300-nLUC，将上述载体转化到农杆菌GV3101菌株(CAT#:AC1001, Shanghai Weidi Biotechnology,China),不同组合的农杆菌一起注射到生长2周的烟草叶片，暗适应1天后放到光照培养箱培养2天，向农杆菌注射过的叶片区域喷洒0.3mg/mL的D-荧光素钠盐(L6882,Sigma-Aldrich,USA)，暗室放置10分钟后在CCD相机(Tanon 5200,Tanon,China)下拍照。

11.Y2H酵母双杂交试验

采用DUALmembrane膜系统测试SAL1和OSA7的相互作用，试验方法见DUALmembrane kit 3(P01001,Dualsystems Biotech AG,Switzerland)说明书。以野生型或sal1突变体的cDNA为模板，用引物5’-ATTAACAAGGCCATTACGGCCATGATAGTGACATTGATGAACTTG-3和5’-AACTGATTGGCCGA GGCGGCCCCCATTTGAGATGCATAAGGTGC-3’以及5’-AGAGTGGCCATTA CGGGCCCGGGAAATGGGTGGGCTCGAGGAGAT-3’和5’- TATCGATAAGCTTG ATATCG AATTCTCTCACACTGTGTAGTTCTGCT-3’扩增SAL1或sal1和OSA7基因片段，分别将SAL1和sal1片段重组到pBT3-SUC、 OSA7重组到pPR3-N,将不同组合的质粒共转到酵母NMY51菌株，SD-Trp-Leu二缺培养基筛选阳性转化子，以共转TSU-APP-pBT3和NubG-Fe56-pPR3为阳性对照、pBT3-SUC和pPR3-N空载体为阴性对照。过夜培养的阳性转化子用灭菌的去离子水清洗3次，对酵母细胞进行梯度稀释使OD₆₀₀＝0.1、0.01，分别取6μL 细胞稀释液点在SD-Trp-Leu二缺培养基和含2mM 3-AT的SD-Trp-Leu-His-Ade 四缺培养基上，待吹干表面液体后放于30℃度培养箱培养2-3天。

12.Co-IP试验

以野生型或sal1突变体的cDNA为模板，用引物5’- CTTGCTCCGTGGATCCTCTAGAATGATAGTGACATTGATGAACTTG-3和5’- GAACATCGTATGGGTATCTAGACATTTGAGATGCATAAGGTGC-3’以及5’- CTTGCTCCGTGGATCCTCTAGAATGGGTGGGCTCGAGGAGAT-3’和5’- TGTAGTCAGAAGGCCTGGT ACCTCTCACACTGTGTAGTTCTGCT-3’分别扩增SAL1、sal1和OSA7片段，同源重组的方法插入到35S:3HA和35S:2Flag瞬时表达载体(Zhang et al.,2019)。等摩尔质量的35:SAL1-3HA或35S:sal1-3HA和 35S:OSA7-2Falg共转到水稻原生质体，短暂离心收集原生质体(Zhang etal., 2011)

每个转化添加500μL膜蛋白裂解液缓慢摇动0.5h溶解膜蛋白(Lee et al.,2016),13000g低温离心10分钟后转移上清到新的管子，吸取20μL上清液用于 Input上样量的检测，其余部分添加20μL Anti-HA免疫磁珠(B26201,Bimake, USA)特异性沉淀带有HA标签蛋白及其复合体，并以此分析SAL1-3HA或sal1- 3HA和OSA7-2Flag的相互作用。

13.酵母回补试验

酵母回补试验所使用酵母菌株和载体来自于中国农业大学郭岩课题组，试验方法参照已发表论文(Fuglsang et al.,2007；Spartz et al.,2014)。以水稻野生型 cDNA为模板，用表2中引物扩增带有NotI酶切位点的SAL1或sal1和OSA1-OSA10 基因的DNA片段，将以上纯化后的DNA片段与pMP1645和pMP1612载体在T4 DNA lignase作用下4℃酶连过夜,连接产物直接转化到大肠杆菌E.Coli DH5α，经Sanger测序确认插入序列。将等摩尔质量不同组合的载体共转到酵母RS-72菌株，在含2％半乳糖的SD-His-Ade固体培养基上筛选出阳性转化子，挑取单克隆在含2％半乳糖的SD-His-Ade的液体培养基过夜培养，用灭菌的去离子水清洗3 次酵母细胞，调节细胞密度到OD₆₀₀＝1，逐步梯度稀释到0.1和0.01，吸取6μL酵母细胞到分别含2％半乳糖和2％葡萄糖的SD-His-Ade固体培养基上，待吹干表面液体后放于28℃度培养箱培养3-5天。

表2酵母回补试验所用引物列表

14.细胞膜提取和PM H⁺-ATPase活性测定

采用两相分离的方法提取根的细胞膜蛋白(Qiu et al.,2002)，野生型和sal1 突变体在1/2Kimura B营养液中生长2周，根系用去离子水中清洗5分钟，擦干表面水分后准备提取根的细胞膜：

(1)每1g根系组织添加2-4mL提前4℃预冷的组织研磨液：0.33M sucrose, 10％(wt/vol)glycerol,0.2％(wt/vol)BSA,5mM EDTA,5mM DTT,5mM ascorbate,0.2％(wt/vol)casein,0.6％polyvinylpyrrolidone,1mM PMSF,3μg/ml leupeptin,1μg/mlpepstatin A,50mM Hepes-KOH，溶液pH 7.5)，在冰上研磨成匀浆；

(2)将组织匀浆透过3层的尼龙膜过滤以去除未溶解的组织，将滤液在 13,000g离心力的条件下在4℃低温离心10min,上清转移到新的管子中再于 80000g离心力下4℃离心50min，去除上清，添加适量的溶解液重悬管底的微粒体，溶解液配方为：0.33M sucrose,3mM KCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,1 mM PMSF,1μg/ml leupeptin,1μg/ml pepstatin A,5mMpotassium phosphate，溶液pH 7.8；

(3)将(2)得到的微粒体溶液添加到两相分离系统，两相分离系统组成为： 6.2％(wt/wt)Dextran T-500，6.2％(wt/wt)PEG3350，5mM K₃PO₄，0.33M sucrose，3mM KCl，溶液pH 7.8,将含有微粒体的两相分离系统在1500g离心力下4℃低温离心5min；

(4)向(3)中得到的上相溶液添加5倍体积的重悬液：0.33M sucrose，10％ (wt/vol)glycerol，0.1％(wt/vol)BSA，0.1mM EDTA，2mM DTT，1μg/ml leupeptin，1μg/mlpepstatin A，20mM Hepes-KOH，溶液pH 7.5,重悬液于100000g离心力下4℃低温离心50min，弃上清；

(5)添加适量含有1mM EDTA的重悬液重悬(4)中得到的细胞膜沉淀,使用 QuickStart^TM Bradford(5000205，Bio-Rad，USA)试剂，采用Bradford法测定膜蛋白的蛋白浓度并用膜蛋白溶解液将各个样品的蛋白浓度调成一样。

植物PM H⁺-ATPas活性测定的具体操作方法参照已发表文献中所述，采用基于磷钼蓝比色法的总磷测定来比较钒酸敏感的PM H⁺-ATPase活性(Regenberg, 1995)，以野生型细胞膜蛋白的活性为对照，记为100％。取50μg细胞膜蛋白配成300μL反应液：20mM MES,50mM KNO,5mM NaN₃,3.5mM Na₂MoO₄， 10mM MgCI₂,30mM ATP,pH 7.0；反应液放于30℃孵育20min后,添加300μL 冰上预冷的终止液，终止液配方为：10mL的102mM ascorbic acid0.3N HCI, 0.065％SDS,1mL的57mM(NH4)2MoO4。在冰上放置10min，最后添加450 μL显色液：154mM NaAsO₂,68mM sodium citrate,350mM acetic acid；室温放置60min让磷钼蓝复合物稳定，同时以NaH₂PO₄为标线，用分光光度计测定 860nm下的吸光度。

15.Western blotting

SAL1-HA蛋白、PM H⁺-ATPase和pThr947蛋白的检测方法参照已发表的论文(Hayashi et al.,2010)。为了检测SAL1-HA蛋白，将露白的sal1以及2个回补转基因植株com#2和com#9直接播种在pH 4.5的0.5mM CaCl2溶液中生长5天，收集0-1cm根尖放液氮速动后放于组织研磨器(Tissuelyser-48,上海净信)，在频率 45Hz下研磨2分钟或更久直至全部成粉末，向根组织中加1×SDS Loading buffer: 0.25M Tris-HCl(pH 6.8),2％SDS,0.1M DTT,0.05％溴酚蓝。100℃煮沸5分钟后，13000rppm室温离心10min,吸取上清的蛋白样品，跑12％SDS-PAGE凝胶电泳并转印至PVDF膜。

为了检测PM H⁺-ATPase和pThr947蛋白，将露白的野生型和sal1突变体种子播种在1/2Kimura B营养液中生长2周，收集根部组织提取细胞膜蛋白。如无特殊说明，一般取10μg蛋白样品和1/5体积的5×Loading buffer混合，100℃煮沸5 分钟，10％或12％SDS-PAGE凝胶电泳至蛋白Marker各个条带清晰，经转膜将凝胶上的蛋白印迹到PVDF膜，将膜浸泡在5％脱脂奶粉(用1×TBST溶解)，放于摇床慢速封闭1h,再加入含一抗的5％脱脂奶粉浸泡膜，4℃慢摇过夜孵育或室温2h,倾倒一抗后用1×TBST清洗膜3次，每次5分钟，再加入与二含抗的5％脱脂奶粉浸泡膜，室温孵育2h后倾倒二抗，用1×TBST清洗膜3次，每次5分钟，添加适量Pro-light HRP化学发光检测试剂(PA112,Tiangen,China)覆盖整张膜，放于ChemiDoc^TM成像系统(ChemiDoc^TM Touch Imagine system,BioRad,USA) 下显影。本研究Wester blotting所涉及到的一抗有：6×His小鼠单抗(GNI4110- HS,GNI,Japan)、小鼠HRP偶联HA抗体(HA-HRP,Roche Applied Science)、拟南芥PM H⁺-ATPase兔多抗(AHA-cat)和pThr⁹⁴⁷ of PM H⁺-ATPase(pThr947 of AHA2 pT No1)兔多抗，使用的二抗有：HRP标记的山羊抗兔IgG(D110058, Songon,China)和HRP偶联的抗小鼠lgG(D110503，Songon,China)。

16.RNAi转基因株系的构建

为了构建OSA7过表达株系pUbi1:OSA7-3Flag/WT，分别以玉米和水稻的基因组DNA(gDNA)为模板，用引物5’- GGTACCCGGGGATCCTCTAGACTGCAGTGCAGCGTGAC-3’和5’- GATCTCCTCGAGCCCACCCATCTGCAGAAGTAACACCAAACAAC-3’以及 5’-GTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAGATGGGTGGGCTCGAGGAGATC-3’和5’- CATGGTCTTTGTAGTCAAGCTTCACTGTGTAGTTCTGCTGGATC-3’分别扩增玉米Ubi1启动子和水稻OSA7，使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit 多片段重组试剂盒(C113,Vazyme,China)插入到3Flag-pCAMBIA1305植物表达载体构建pUbi1:OSA7-3Flag。为了创建OSA7 RNAi/sal1转基因株系，参照 Gateway技术说明书(250522,Invitrogen,USA)构建OSA7-pANDA植物表达载体，设计了引物引物对OSA7-pANDA-F：5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGAGTCTGCTGGTGGACC-3’和OSA7-pANDA-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACCG- ACGATGTGCTTCTTC-3’扩增OSA7基因的504bp大小的片段以对OSA7基因进行RNAi，使用Gateway^TM BP Clonase^TM Enzyme Mix(11789013，Invitrogen，USA)在BP反应下将该片段插入中间载体pDONR/Zeo,测序正确的质粒在 Gateway^TM LRClonase^TM Enzyme Mix(11791019，Invitrogen，USA)通过LR反应下将此DNA片段克隆到pANDA植物表达载体完成构建OSA7-pANDA。通过化学转化将构建成功的植物表达载体转入农杆菌EHA105，并通过农杆菌介导的方法分别将含pUbi1:OSA7-3Flag和OSA7-pANDA的阳性转化子转化到野生型水稻和sal1突变体的愈伤组织，在潮霉素抗性的培养基上筛选阳性转基因植株，水稻转基因操作委托予浙江省农业科学院王华老师。T2代纯合转基因植株用于表达、表型和蛋白的分析。

实施例1鉴定到一个对钙和铝毒敏感的突变体sal1

发明人在筛选水稻铝毒敏感突变体过程中，获得一个对钙和铝毒敏感的突变体sal1(图1A和1D)，对野生型和sal1突变体幼苗实施一系列梯度的钙和铝溶液处理，通过比较根长的伸长量来反映对钙和铝毒的敏感性，说明该突变体对钙和铝毒的敏感性是浓度依赖的(图1B和1E)。为了探究钙和铝毒抑制sal1突变体根伸长的原因，采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定根尖钙和铝的元素含量，发现sal1突变体中积累更多的钙和铝，猜测sal1突变体比野生型对钙和铝毒更敏感可能是因为根尖积累更多的钙和铝(1C和1F)。

实施例2突变体sal1中积累更多的有益元素

水培技术能够有效控制植物生长过程中元素的供应量，将野生型和sal1突变体同时含有在1/2强度的Kimura B营养液中条件下培养2周，野生型和sal1突变体的生长情况没有明显差异(图2A)，采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定野生型与sal1突变体根和地上部中的各种元素含量。结果显示在sal1突变体的根和地上部中，元素钾、磷、镁、钙、铁、钼和铜有不同程度的升高(图2B和 2C)。进一步对稻田种植的种子进行离子含量的测定，结果显示大量元素钾、钙、镁在突变体中的含量比野生型更高(图2D)，微量有益元素铁、锌、硒的含量在突变体中也显著提高(图2E)；而且sal1突变体种子中有害重金属元素砷含量下降，但镉和铅含量不变(图2F)。考虑到sal1突变体在未来育种上的应用，进一步观察并统计了sal1突变体在稻田中种植过程中的一些农艺性状，与野生型的农艺性状相比，sal1突变体在植物高度和分蘖数目上占有优势，而小穗长度降低，开花时间延迟。以上结果提示SAL1基因可作为生物营养强化的靶标基因之一，在不明显影响植物产量的基础上提高植物的有益元素含量，同时降低有毒重金属砷的含量。

实施例3SAL1基因编码一个PP2C.D蛋白磷酸酶

为了克隆SAL1基因，将sal1突变体与野生型杂交构建F2分离群体进行遗传分析，对该群体F2中481单株进行高钙处理，挑选到181株高钙敏感植物和363株不敏感植株，1:3分离比的卡平方测验(χ2＝0.033,P>0.95)表明控制sal1突变体对钙敏感表型的是单基因隐性遗传。对其中的92株高钙敏感植物建立混合池进行全基因组测序，以野生型WT的基因组序列为参考，测序原数据已提交至NCBI网站：sal1突变体的是SRR11714511,野生型的是SRR11714512。采用 MutMap技术分析sal1突变体中单核酸多态(SNP)的分布和基因突变的候选区根据候选区域突变体位点发展了5个多态标记进行连锁分析，最终将候选基因锁定在OsPP2C60(LOC_Os06g50380)。在sal1突变体中，OsPP2C60 (LOC_Os06g50380)编码区854bp的G突变为A，导致第285位氨基酸的丙氨酸 Ala变成缬氨酸Val(图4A)。

为了确认sal1突变体的突变信息，分别以野生型(Oryza sativa L.subsp.Indica,Kasalath)和sal1突变体根部cDNA为模板,设计引物F:5’-ATGATAGTGACATTGATGAAC-3’和R:5’-CATTTGAGATGCATAAGGTGC- 3’扩增SAL1基因的CDS序列。同时用引物F和R测序，发现sal1突变体编码突变蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:3

ATGATAGTGACATTGATGAACTTGTTACGGGCATGCTGGAGACCATCATC CAACCAGCATGCCCGGGCAGGCTCAGATGTTGCCGGCAGGCAGGATGGA CTTCTATGGTACAAGGACACTGGTCAGCATGTAAATGGGGAATTCTCTAT GGCTGTGGTCCAGGCCAACAACTTACTTGAGGATCAGTGCCAGATTGAAT CGGGTCCATTGAGCTTTCTTGACTCTGGTCCATACGGAACTTTCGTCGGGG TTTATGATGGACATGGTGGCCCAGAGACGGCTTGCTATATCAACGATCAC CTATTCCACCATCTGAAAAGGTTTGCATCTGAACAGAATTCGATGTCTGC TGATGTGCTGAAGAAAGCATATGAAGCTACAGAAGATGGGTTCTTCTCTG TTGTCACTAAGCAATGGCCTGTGAAGCCTCAAATAGCTGCTGTTGGCTCG TGCTGCCTGGTTGGTGTAATCTGTGGTGGCATTCTTTATGTTGCTAATGTT GGGGATTCCCGTGTTGTTTTAGGCAGACATGTCAAAGCCACGGGAGAAGT TCTGGCTGTCCAACTCTCAGCAGAGCATAACGTAAGCATTGAGTCAGTGA GAAAAGAATTGCAGTCAATGCACCCGGAAGATAGGCATATTGTTGTTCTC AAGCACAACGTTTGGCGTGTAAAAGGTCTAATTCAGGTCTGCAGATCAAT TGGTGATGCCTATCTCAAAAGATCAGAGTTCAACCGGGAACCTTTGTATG CAAAATTCCGCCTCCGGGAACCTTTTCACAAGCCCATACTAAGTTCAGAA CCATCGATTAGTGTGCAACCCCTACAACCACATGATCAATTTCTCATATTT GTATCTGATGGTCTATGGGAGCACTTAACCAATCAAGAGGCCGTTGACAT TGTTCACAGTAGCCCTCGCAATGGAAGTGCTAGGAGGCTCATAAAGGCAG CTTTGCAAGAAGCAGCCAAGAAAAGAGAAATGAGGTACTCAGATCTCAA GAAGATTGACCGTGGTGTTCGCCGCCACTTCCATGATGACATAACCGTCA TAGTAGTCTTCCTCGACTCCAGCCTTGTCAGCAGGGCGAGCACCTACAGG GGCCCTTCTGTTTCTTTAAGAGGCGGCGGCGTGAATCTGCGCAGCAACAC ACTTGCACCTTATGCATCTCAAATGTGA(SEQ IDNO.3)

将野生型和sal1突变体的多聚核苷酸序列输入到在线网站SequenceTranslation(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/)转换成氨基酸序列，发现野生型 SAL1多肽的对应于SEQ ID NO.:1 MIVTLMNLLRACWRPSSNQHARAGSDVAGRQDGLLWYKDTGQHVNGEFS MAVVQANNLLEDQCQIESGPLSFLDSGPYGTFVGVYDGHGGPETACYINDH LFHHLKRFASEQNSMSADVLKKAYEATEDGFFSVVTKQWPVKPQIAAVGSC CLVGVICGGILYVANVGDSRVVLGRHVKATGEVLAVQLSAEHNVSIESVRKE LQSMHPEDRHIVVLKHNVWRVKGLIQVCRSIGDAYLKRSEFNREPLYAKFRL REPFHKPILSSEPSISVQPLQPHDQFLIFASDGLWEHLTNQEAVDIVHSSPRNG SARRLIKAALQEAAKKREMRYSDLKKIDRGVRRHFHDDITVIVVFLDSSLVS RASTYRGPSVSLRGGGVNLRSNTLAPYASQM*(SEQ ID NO.:1)。

突变体版本sal1多肽如SEQ ID NO.:2所示： MIVTLMNLLRACWRPSSNQHARAGSDVAGRQDGLLWYKDTGQHVNGEFS MAVVQANNLLEDQCQIESGPLSFLDSGPYGTFVGVYDGHGGPETACYINDH LFHHLKRFASEQNSMSADVLKKAYEATEDGFFSVVTKQWPVKPQIAAVGSC CLVGVICGGILYVANVGDSRVVLGRHVKATGEVLAVQLSAEHNVSIESVRKE LQSMHPEDRHIVVLKHNVWRVKGLIQVCRSIGDAYLKRSEFNREPLYAKFRLREPFHKPILSSEPSISVQPLQPHDQFLIFVSDGLWEHLTNQEAVDIVHSSPRNG SARRLIKAALQEAAKKREMRYSDLKKIDRGVRRHFHDDITVIVVFLDSSLVS RASTYRGPSVSLRGGGVNLRSNTLAPYASQM*(SEQ ID NO.:2)。

NCBI数据库里显示SAL1基因预测编码一个PP2C.D磷酸酶家族成员，为了测试SAL1蛋白的活性，分别表达融合有His标签的野生型SAL1(SAL1-His)和 sal1突变体版本(sal1-His)的蛋白于大肠杆菌E.Coli(DE3)中并采用Ni-TED纯化，纯化的SAL1-His和sal1-His蛋白大小都符合预期蛋白大小43.5k Da，蛋白磷酸酶活性测试显示SAL1是一个Mn²⁺依赖的PP2C.D蛋白磷酸酶，并且sal1-His蛋白的蛋白磷酸酶活性显著低于SAL1-His,虽然Ca²⁺不影响SAL1-His的蛋白磷酸酶活性，却显著促进sal1-His蛋白的蛋白磷酸酶活性(图4B)，暗示着sal1突变可能改变了SAL1蛋白酶活性区域对Ca²⁺的偏好。同时构建了回补转基因株系(pSAL1:SAL1-3HA/sal1),转基因互补实验确认SAL1/OsPP2C60能够恢复sal1突变体的钙敏感表型(图4C)，而且基本恢复sal1突变体幼苗根和地上部中矿质元素含量升高的表型(图4D和4E)。这两个回补转基因株系(pSal1:SAL1-3HA/sal1)中也检测到了比较高的SAL1基因的转录本(图4F)和带有HA标签的SAL1-HA蛋白 (图4G)。以上结果表明OsPP2C60(LOC_Os06g50380)基因控制sal1突变体对铝毒和钙敏感以及矿质元素高积累的表型。

实施例4 SAL1的基因表达模式

为了检测SAL1基因的组织表达模式，采用qRT-PCR分析野生型各个组织中 SAL1转录本的表达水平，发现SAL1广泛表达在水稻的根、茎、叶刃、叶鞘和小穗(图5A)。为了验证qRT-PCR的结果，构建了pSAL1:SAL1-GUS/WT转基因株系，对T2纯合的转基因株系GUS染色，结果显示GUS信号出现在根、茎、叶刃和叶鞘(图5B-5H)，SAL1在根的表达集中在种子根和侧根的根尖(图5B-5E)。总结来说，SAL1基因在水稻的各个组织中均有表达，在节点和根尖的表达更高。

实施例5 SAL1定位在细胞质膜

为了确定SAL1的亚细胞定位，将SAL1的编码区与GFP融合构建瞬时表达载体35S:SAL1-eGFP并转化到水稻的原生质体中，采用激光共聚焦显微镜观察 GFP荧光信号，发现SAL1定位于细胞质膜，突变体版本的sal1(35S:sal1-eGFP) 不影响SAL1在细胞质膜的定位。在用TMHMM在线预测SAL1蛋白的跨膜结构域时，发现SAL1并没有明显的跨膜区域，但是有一篇文献提示SAL1在拟南芥的同源PP2C.D可能通过棕榈酰化修饰锚定在细胞膜上，于是我们将SAL1的3个预测可能是棕榈酰化(S-palmitoylation)的半胱氨酸突变，预测结果见表3和表4。 3个棕榈酰化位点突变后(35S:SAL1 ^{C12G,C151G,C152G}-eGFP),GFP信号滞留在细胞质 (图6)，而不能定位到细胞质膜，该结果说明SAL1可能通过棕榈酰化修饰锚定在细胞质膜。

表3 WAP-Palm工具的棕榈酰化位点预测结果

表4 CSS-Palm Online Service工具的棕榈酰化位点预测结果

实施例6 SAL1与OSA7相互作用并负调控PM H⁺-ATPase的活性

为了探究SAL1影响对钙和铝毒的敏感性，以及调控有益元素积累的机制，通过DUALmembrane膜系统酵母双杂交方法筛选SAL1的靶标底物蛋白，一共筛选到430个阳性克隆，其中2个对应水稻基因组中的细胞质膜质子泵(PM H⁺- ATPase)OSA7。通过酵母双杂交(Y2H)、荧光酶互补(split-LUC)以及免疫共沉淀(Co-IP)试验证明了SAL1与OSA7相互作用，而且突变体版本的sal1降低SAL1 与OSA7相互作用的强度(图7A-7C)。

水稻基因组中有10个细胞质膜质子泵成员，将质子(H⁺)从细胞质泵出细胞质膜外，在此过程中完成离子的跨膜运输并为其提高ATP能量。这10个细胞质膜质子泵命名的编号从OSA1到OSA10，为了明确水稻中的PP2C.D家族蛋白磷酸酶中SAL1如何调控PM H⁺-ATPase，酵母回补试验的结果显示：除了OSA2和 OSA10没有回补酵母RS72菌株中PM H⁺-ATPase活性缺陷的表型，其余8个OSAs 成员均有不同程度的PM H⁺-ATPase活性，其中OSA7的PM H⁺-ATPase活性最高；SAL1能抑制OSAs的PM H⁺-ATPase活性，而且sal1突变体版本的sal1能降低这种抑制效应，说明SAL1负调控PM H⁺-ATPase的活性(图7D)。为了验证上述结果，在检测野生型水稻和sal1突变体植物体的细胞质膜部分中pThr⁹⁴⁷水平和 PM H⁺-ATPase的活性，发现sal1突变体显示更高的pThr⁹⁴⁷水平和PM H⁺-ATPase 活性(图7E)，结果表明SAL1与OSA7相互作用并负调控PM H+-ATPase的活性。

实施例7 SAL1通过负调控PM H⁺-ATPase活性而影响根对高钙的敏感性和元素积累

上述数据显示SAL2负调控PM H⁺-ATPase活性，为了测试SAL2是否通过负调控PM H⁺-ATPase活性来影响水稻对高钙的敏感性，首先对野生型和sal2突变体外施PM H⁺-ATPase的抑制剂Na₃VO₄(钒酸钠)和激动剂FC(Fusicoccin，壳梭孢菌素)Na₃VO₄处理能恢复sal2突变体对高钙的敏感性，FC处理加剧野生型和sal2 突变体对高钙的敏感性(图8A和8B)。为了在植物中验证以上结果，在sal2突变体中将OSA7基因RNAi(OSA7 RNAi/sal2)和在野生型中过量表达OSA7基因 (pUbi:OSA7/WT)，测试其中几个转基因株系对高钙的敏感性，结果显示在sal2 突变体中将OSA7基因RNAi恢复sal2突变体根对高钙的敏感性(图8C和8D)，在野生型中过量表达OSA7基因增加根对高钙的敏感性。体外化学试剂外施和植物转基因遗传数据证实SAL2是通过负调控PM H⁺-ATPase活性来影响水稻对高钙的敏感性。在OSA7 RNAi/sal2转基因株系中K、P、Ca、Mn、Fe和Mo元素含量降低到野生型水平或更低(图8E和8F)；与之相对应的是，在野生型中过量表达OSA7的pUbi:OSA7/WT转基因株系中，地上部和根中K、P、Ca、Mn、Fe和 Mo元素含量显著高于野生型，尤其是根中微量元素Fe和Mo(图8G和8H)。以上结果表明SAL1通过负调控PM H⁺-ATPase活性来影响植物对高钙的敏感性和元素积累。

参考文献：

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> SAL1突变蛋白及其在植物育种中的应用

<130> P2021-2858

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Ile Val Thr Leu Met Asn Leu Leu Arg Ala Cys Trp Arg Pro Ser

1 5 10 15

Ser Asn Gln His Ala Arg Ala Gly Ser Asp Val Ala Gly Arg Gln Asp

20 25 30

Gly Leu Leu Trp Tyr Lys Asp Thr Gly Gln His Val Asn Gly Glu Phe

35 40 45

Ser Met Ala Val Val Gln Ala Asn Asn Leu Leu Glu Asp Gln Cys Gln

50 55 60

Ile Glu Ser Gly Pro Leu Ser Phe Leu Asp Ser Gly Pro Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Phe Val Gly Val Tyr Asp Gly His Gly Gly Pro Glu Thr Ala Cys Tyr

85 90 95

Ile Asn Asp His Leu Phe His His Leu Lys Arg Phe Ala Ser Glu Gln

100 105 110

Asn Ser Met Ser Ala Asp Val Leu Lys Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Glu

115 120 125

Asp Gly Phe Phe Ser Val Val Thr Lys Gln Trp Pro Val Lys Pro Gln

130 135 140

Ile Ala Ala Val Gly Ser Cys Cys Leu Val Gly Val Ile Cys Gly Gly

145 150 155 160

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Lys Gly Leu Ile Gln Val Cys Arg Ser Ile Gly Asp Ala Tyr Leu Lys

225 230 235 240

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290 295 300

Ser Pro Arg Asn Gly Ser Ala Arg Arg Leu Ile Lys Ala Ala Leu Gln

305 310 315 320

Glu Ala Ala Lys Lys Arg Glu Met Arg Tyr Ser Asp Leu Lys Lys Ile

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Leu Ala Pro Tyr Ala Ser Gln Met

385 390

<210> 3

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgatagtga cattgatgaa cttgttacgg gcatgctgga gaccatcatc caaccagcat 60

gcccgggcag gctcagatgt tgccggcagg caggatggac ttctatggta caaggacact 120

ggtcagcatg taaatgggga attctctatg gctgtggtcc aggccaacaa cttacttgag 180

gatcagtgcc agattgaatc gggtccattg agctttcttg actctggtcc atacggaact 240

ttcgtcgggg tttatgatgg acatggtggc ccagagacgg cttgctatat caacgatcac 300

ctattccacc atctgaaaag gtttgcatct gaacagaatt cgatgtctgc tgatgtgctg 360

aagaaagcat atgaagctac agaagatggg ttcttctctg ttgtcactaa gcaatggcct 420

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agcagggcga gcacctacag gggcccttct gtttctttaa gaggcggcgg cgtgaatctg 1140

cgcagcaaca cacttgcacc ttatgcatct caaatgtga 1179

Claims

1.一种分离的SAL1突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白为突变的SAL1多肽，

并且所述突变的SAL1多肽在野生型SAL1多肽的对应于SEQ ID NO.:1的第285位氨基酸发生突变：

第285位的丙氨酸(A)。

2.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述第285位的丙氨酸(A)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：缬氨酸(V)、亮氨酸(L)。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的SAL1突变蛋白。

4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种SAL1突变蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达所述的突变蛋白；和

(b)分离所述的SAL1突变蛋白。

7.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包括权利要求1所述的SAL1突变蛋白。

8.一种改良植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(a)提供一植物细胞，利用基因工程改造所述植物细胞，从而使所述植物细胞表达权利要求1所述的SAL1突变蛋白；和

(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。

9.一种权利要求1所述的SAL1突变蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于培育积累有益元素的植物株系、或用于制备培育积累有益元素的植物株系的试剂或试剂盒。

10.一种有益元素积累的敏感位点，其特征在于，所述位点包括：

对应于(i)来源于水稻的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(ii)来源于拟南芥的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(iii)来源于高粱的野生型SAL1多肽的第284位氨基酸；或(iv)来源于小麦的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(v)来源于玉米的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(vi)来源于油菜的野生型SAL1多肽的第285位氨基酸；或(vii)来源于大豆的野生型SAL1多肽的第285位；或(viii)来源于马铃薯的野生型SAL1多肽的第285位；或(ix)来源于番茄的野生型SAL1多肽的第285位；或(x)来源于大麦的野生型SAL1多肽的第285位；或(xi)来源于藜麦的野生型SAL1多肽的第285位，或(xii)来源于烟草的野生型SAL1多肽的第285位。