CN101768593B - 副球菌虾青素合成操纵子及其表达载体与应用 - Google Patents

Abstract

一种副球菌虾青素合成操纵子，全长6352bp。通过培养、提取总DNA和PCR扩增后得到操纵子的序列为SEQ ID No：1。由于该操纵子源自于副球菌属微生物，具有安全、非致病性核对环境污染很小等特点，该序列及其表达载体可以应用于虾青素的生产。

Description

副球菌虾青素合成操纵子及其表达载体与应用

技术领域

本发明涉及一种色素合成微生物操纵子，尤其涉及一种色素合成副球菌属微生物操纵子，更具体的是涉及一种虾青素合成操纵子及其在合成虾青素中的应用。

背景技术

类胡萝卜素是一种天然色素，是由8个类异戊二烯单位组成的一类碳氢化合物及其氧化衍生物的总称(J.Biotech.，1998，59，169)。

类胡萝卜素可分为四个亚族，包括胡萝卜素，如：α-、β-、γ-胡萝卜素，番茄红素；胡萝卜醇，如：叶黄素，玉米黄素，虾青素；胡萝卜醇的酯类，如：β-阿朴-8’-胡萝卜酸酯；胡萝卜酸，如：藏红素，胭脂树橙。类胡萝卜素的基本结构是番茄红素，其它类胡萝卜素是由其氧化、氢化、脱氢、环化以及碳架重排、降解而衍生。一般类胡萝卜素是C40分子，但也存在高分子类胡萝卜素(如：C45和C500)和降解的类胡萝卜素(如：C30)(Plant Cell，1995，7，1015)。类胡萝卜素在自然界中广泛存在，总数达600多种，而其中有50余种能形成维生素A。β-胡萝卜素、番茄红素和虾青素都是类胡萝卜素家族中对人类健康十分重要的三个主要成员(Nutr.Cancer.，1991，16，93)。

美国商业情报机构(Global Industry Analysts(GIA))公司发表了一份研究报告——《虾青素：全球战略经营报告》，据该报告预测，随着含天然营养成分的保健品在消费市场呈现出良好发展势头，到2010年，全球类胡萝卜素市场的规模预计将达到10.6亿美元。据调查，对类胡萝卜素这种抗氧化剂的需求之所以不断增长，主要原因是消费者对自身健康的日益关切以及老龄化人口的不断增加。GIA公司的研究报告对类胡萝卜素市场进行了全面分解，以弄清楚哪些类别的类胡萝卜素将可能在今后几年里获得最大的发展。

在类胡萝卜素的国际市场上，β-胡萝卜素是规模最大的一类产品。2006年，欧洲在β-胡萝卜素上占据的市场份额高达43.3％。研究报告预测，美国β-胡萝卜素市场的增长速度将超过欧洲。2007-2010年，美国市场的增速将略高于欧洲市场，其市场价值预计将增加859万美元。到2010年，β-胡萝卜素的市场将达到2.2亿美元。此外，预计到2010年，全球类胡萝卜素市场的规模将达到2.19亿美元；预计到2010年，全球虾青素市场的规模将达到4.5亿美元。此外，从2007年-2010年，叶黄素和角黄素的总销售额将增加2880万美元，叶黄素在欧洲市场的增长最为强劲。

所有类胡萝卜素都是通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成的。它是一类从乙酰CoA开始生物合成的次生代谢产物，合成过程为：3个乙酰CoA分子通过失去1个分子的羧基而缩合成3，5-二羟-3-甲基戊酸(MVA)，在酶的作用下磷酸化形成焦磷酸酯并经脱羧后形成异戊二烯焦磷酸(IPP)，IPP在IPP异构酶作用下异构为二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)，DMAPP依次与3分子的IPP在GGPS(GGPP合成酶)的作用下，缩合生成二甲基辛烯焦磷(GPP)、法尼基二磷酸(FPP)、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(GGPP)。2个GGPP在八氢番茄红素合成酶(PSY)作用下头对头进行二聚作用形成第1个无色的类胡萝卜素——八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成α-胡萝卜素、β-胡萝卜素，α、β-胡萝卜素经引入、转化、环化、氧化等反应形成结构更复杂的类胡萝卜素、叶黄素、新黄质等(Curr.Opin.Plant Biol.，2001，4，210)。

到目前为止，分别从多种细菌、植物、藻类和真菌中克隆了近150个与类胡萝卜素合成有关的基因。1995年Misawa从欧氏杆菌杆菌中克隆获得GGPP合成酶基因(crtE)、玉米黄素转糖激酶(crtX)、番茄红素环化酶基因(crtY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(crtB)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)，将这些基因分别转化到植物中能够使转基因植物合成不同类型的类胡萝卜素或前体物质(US5,429,939)。1996年Ausich等人从欧氏杆菌(Erwinia herbicola)克隆获得了牻牛儿基脚焦磷酸化酶基因、八氢番茄红素合成酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因以及番茄红素环化酶基因并分别将它们与叶绿素转运肽编码序列融合转化到植物中提高了植物类胡萝卜素总量(US5,530,188)。植物中也相继发现了类胡萝卜素合成相关基因。1994年Bird将番茄中克隆到参与类胡萝卜素合成的基因pTOM5(该基因与crtB同源)转化到植物中，并发现该基因能够调控植物中番茄红素的含量(US5,304,478)。1998年Cunningham从拟南芥中克隆到ε-番茄红素环化酶基因、IPP异构酶基因和β-胡萝卜素羟化酶基因，这些基因的功能在大肠杆菌中表达后获得了验证(US5,744,341)。此外Vainstein 1999发现其它与类胡萝卜素相关的蛋白，如黄瓜中的CHRC和CHRD蛋白(US6,551,793)。2002年Busch从烟草中克隆到ζ-胡萝卜素去饱和酶和番茄红素合成酶(EP1,156,117)。Wang等2006年从枸杞中克隆到与八氢番茄红素合成酶基因(CN1884547)和β-番茄红素环化酶同源基因(CN1884546)。

副球菌属(Paracoccus)为革兰阴性非发酵型细菌，存在于海洋等外环境，共有15种，绝大多数的种与人的疾病无关。在副球菌属微生物内富含大量的维生素，但还没有关于副球菌生产虾青素的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种副球菌虾青素合成操纵子，该操纵子源自于副球菌属。

本发明的另一个目的在于提供一种含有副球菌虾青素合成操纵子的表达载体。

本发明的又一个目的在于提供一种副球菌虾青素合成操纵子及其表达载体，该操纵子与表达载体在生物合成虾青素的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

虾青素合成操纵子源自于副球菌属，其核苷酸序列为SEQ ID No：1所示，在其序列中416-1144核苷酸为β胡萝卜素酮酶基因；1141-1629核苷酸为β胡萝卜素羟化酶基因；1626-2786核苷酸为番茄红素β环化酶基因；2783-4288核苷酸为八氢番茄红素去饱和酶基因；4285-5199核苷酸为八氢番茄红素合成酶基因以及5196-6071核苷酸为牻牛儿基焦磷酸合成酶基因。

SEQ ID No：1所示的虾青素合成操纵子的获取方法为：先将野生菌在LB固体培养基中培养12小时，选择呈红色、黄色或橙黄色的菌落；再将选择出来的菌落置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，再以总DNA为模板，采用长基因PCR扩增和克隆方法(ApplEnviron Microbiol，1997，63，4504)克隆并得到虾青素合成相关的操纵子。

一种SEQ ID No：1所示的虾青素合成操纵子的具体获取方法为：

菌种分离

从上海近海深水区取污泥，稀释10-100倍后涂布在LB固体培养基上(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)，28℃培养24小时，挑取菌落。

总DNA提取

将分离获得的不同颜色的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物(Invitrogen)，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以重力加速度6,000g离心5min，得到菌体沉淀。将这些沉淀在-20℃下冷冻1hr，之后使用TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)清洗一次，加入浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌溶液悬浮，在37℃下摇床培养1hr。向培养液中加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和5M的NaCl溶液，轻轻振荡混匀，再加入20mg/mL蛋白激K，37℃下培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA；水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取，震荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇，震荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA于4℃保存。

PCR扩增

以CAT1：5’GAATTCTGCAGGCGCTGGCGGCGCCGTTCCACGAC3’和CAT2：5’CATAGGCTAAGCCGCGCCGCCCCGCGGGACTATTCTGGCCGATCA3’为扩增引物对虾青素合成相关的操纵子进行PCR扩增。使用Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃600秒，扩增30个循环。加入rtaq酶，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为6352bp的SEQ ID No 1序列。

一种SEQ ID No：1所示的虾青素合成操纵子的基因合成方法(NucleicAcids Research，2004，32，e98)，利用PCR进行虾青素操纵子全长扩增，在Taq DNA聚合酶存在的反应体系中，使用多个扩增引物和2个外侧引物完成。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃延长10min，共25个循环。PCR结束后，0.8％(w/v)琼脂糖胶回收。

SEQ ID No：1序列与表达载体相连接后转入微生物细胞中，能表达β胡萝卜素酮酶(EC：1.13.-.-)、β胡萝卜素羟化酶(EC：1.14.13)、番茄红素β环化酶(EC：1.14.-.-)、八氢番茄红素去饱和酶(EC：1.14.99)、八氢番茄红素合成酶(EC：2.5.1.32)以及牻牛儿基焦磷酸合成酶(EC：2.5.1.29)，从而合成虾青素。

SEQ ID No：1序列与表达载体相连接后转入原核生物细胞中，能表达β胡萝卜素酮酶、β胡萝卜素羟化酶、番茄红素β环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、八氢番茄红素合成酶以及牻牛儿基焦磷酸合成酶，从而合成虾青素。

表达载体应当包含编码与类胡萝卜素合成或代谢有关的一种或多种酶以及至少一个能通过现有技术(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1994)构建的启动子(promoter)。此外，表达载体还可以含有一些调节子(regulatory element)如：抑制子(repressor)、抗生素标记(如：氨苄青霉素、卡那霉素或新霉素等)或荧光标记(如：绿色荧光蛋白GFP)等。

一种表达载体，包括虾青素合成操纵子SEQ ID No：1序列。

一种SEQ ID No：1序列转入原核生物细胞的方式，将SEQ ID No：1序列直接与T/A克隆载体相连，4℃连接过夜。然后将该载体转化感受态大肠杆菌DH5α。

含有虾青素合成操纵子(SEQ ID No：1)的表达载体转入原核生物细胞后，该细胞能表达β胡萝卜素酮酶、β胡萝卜素羟化酶、番茄红素β环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、八氢番茄红素合成酶以及牻牛儿基焦磷酸合成酶，从而能够合成虾青素。将菌液涂布于LB固体培养基，经过培养能获得橘黄色菌落。

一种原核生物合成虾青素的方法为，将SEQ ID No：1序列直接与T/A克隆载体相连，4℃连接过夜。然后将该载体转化感受态大肠杆菌DH5α，将菌液涂布于LB固体培养基上，该细胞能表达β胡萝卜素酮酶、β胡萝卜素羟化酶、番茄红素β环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、八氢番茄红素合成酶以及牻牛儿基焦磷酸合成酶，经过培养能获得橘黄色菌落。

然后挑取呈橘黄色的大肠杆菌菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时。采用甲醇抽提细菌细胞中的虾青素，使用分光光度计在470nm下的吸光值。根据标准曲线计算样品中虾青素含量。

本发明技术方案实现的有益效果

副球菌是一类安全、非致病性且对环境污染很小的微生物。通过培养、提取总DNA和PCR扩增后得到的SEQ ID No 1的序列可以应用于虾青素的生产。

附图说明

图1为PCR扩增所得序列为SEQ ID No：1的虾青素操纵子电泳图，其中泳道1为DNA分子量标记(Marker)；泳道2为从大肠杆菌扩增的对照组；泳道3为从副球菌扩增虾青素的操纵子。；

图2为含有序列为SEQ ID No 1大肠杆菌和不含SEQ ID No：1序列大肠杆菌在LB培养基上培养结果图，其中图的左半边为含有序列为SEQ IDNo：1大肠杆菌菌落，呈橘黄色；图的右半边为不含SEQ ID No：1序列大肠杆菌菌落，呈乳白色；

图3为虾青素在470nm附近的吸收光谱。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。

实施例1菌种分离

从上海近海深水区取污泥，稀释10-100倍后涂布在LB固体培养基上(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)，28℃培养24小时。挑取红色菌株，该菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，无色，不产生荧光色素，革兰氏染色反应为阴性的菌株；进一步通过显微镜筛选无鞭毛，无芽孢的杆状菌株。将获得的菌株稀释10⁴后反复在LB固体平板培养基上纯合。

实施例2总DNA的提取

将实施例1中分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物(Invitrogen)，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时，菌体培养液以6,000g速度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀在-20℃下冷冻1hr。之后使用TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0)溶液清洗一次。加入含有20μl浓度为10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1hr。加入50μL 0.5MEDTA，50μl 10％(w/v)SDS和50μl浓度为5M的NaCl轻轻振荡混匀。再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA储存于4℃下备用。

实施例3副球菌菌株同源性分析

以实施例2抽提的总DNA为模板，利用16s rRNA两端引物进行扩增。扩增的引物为16SR1：5’CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’和16SF：5’TACGGCTACCTTGTTACGACTTC3’。以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，72℃延伸300秒，扩增片段长1408bp(如下)。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与Paracoccus属中的许多种菌的16s rRNA有98％的同源性(NCBI)。菌株系统发育地位上属于副球菌属(Paracoccus)。

1    cagagtttga tctggcttca ggcttaacac atgcaagtcg agcgagacct tcgggtctag

61   cggcggacgg gtgagtaacg cgtgggaacg tgcccttctc tacggaatag ccccgggaaa

121  ctgggagtaa taccgtatac gccctttggg ggaaagattt atcggagaag gatcggcccg

181  cgttggatta ggtagttggt ggggtaatgg cccaccaagc cgacgatcca tagctggttt

241  gagaggatga tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca

301  gtggggaatc ttagacaatg ggggcaaccc tgatctagcc atgccgcgtg agtgatgaag

361  gccttagggt tgtaaagctc tttcagctgg gaagataatg acggtaccag cagaagaagc

421  cccggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gggctagcgt tgttcggaat

481  tactgggcgt aaagcgcacg tgggcggact ggaaagtcag aggtgaaatc ccagggctca

541  accttggaac tgcctttgaa actatcagtc tggagttcga gagaggtgag tggaattccg

601  agtgtagagg tgaaattcgt agatattcgg aggaacacca gtggcgaagg cggctcactg

661  gctcgatact gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt

721  agtccacgcc gtaaacgatg aatgccagac gtcggcaagc atgcttgtcg gtgtcacacc

781  taacggatta agcattccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg

841  acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt

901  accaaccctt gacatggcag gaccgctgga gagattcagc tttctcgtaa gagacctgca

961  cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttcggtta agtccggcaa

1021 cgagcgcaac ccacgtccct agttgccagc attcagttgg gcactctatg gaaactgccg

1081 atgataagtc ggaggaaggt gtggatgacg tcaagttctc atggccctta cgggttgggc

1141 tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg ggttaatccc caaaagccat ctcagttcgg

1201 attgtcctct gcaactcgag ggcatgaagt tggaatcgct agtaatcgcg gaacagcatg

1261 ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt

1321 ctacccgacg acgctgcgct aaccttcggg gggcaggcgg ccacggtagg atcagcgact

1381 ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgta

实施例4虾青素合成操纵子的扩增

以CAT1：5’GAATTCTGCAGGCGCTGGCGGCGCCGTTCCACGAC3’和CAT2：5’CATAGGCTAAGCCGCGCCGCCCCGCGGGACTATTCTGGCCGATCA3’为扩增引物，以实施例2中制得的总DNA为模版，对虾青素合成相关的操纵子进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃600秒，30个循环。然后加入2单位rtaq(宝生物工程(大连)有限公司)，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为6352bp的SEQ ID No：1核苷酸(见图1)。

取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。37℃培养后，获得橘黄色菌落(见图2)。图2左半边为含有SEQ ID No 1序列的大肠杆菌菌落，呈橘黄色)；右半边为不含SEQ ID No 1序列大肠杆菌菌落，呈乳白色)。

实施例5虾青素合成操纵子基因的合成

以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)将虾青素操纵子(SEQ ID No：1)克隆。设计的引物如下：

1.EMPII-1：

GAA，TTG，ACT，GCA，GGA，ACT，GGC，AGC，GCC，GAT，CCA，CGA，CTG，GAG，CAT，CCC，CAC，GAC，CGC，GTC

2.EMPII-2：

ACC，CGG，TCC，CGC，CCC，ATC，ATC，GGC，GCT，GTG，GCG，CGC，AGC，GAC，GCG，GTC，GTG，GGG，ATG，CTC

3.EMPII-3：

GAT，GAT，GGG，GCG，GGA，CCG，GGT，TCT，GAC，CGG，GTC，GGG，CGG，GCT，GCG，TCA，CGG，GAA，GGA，CAC

4.EMPII-4：

TGC，CCC，ACG，AGG，TCC，GCG，CCA，TCG，CGG，ATG，GAT，TTC，GCG，GTG，TCC，TTC，CCG，TGA，CGC，AGC

5.EMPII-5：

TGG，CGC，GGA，CCT，CGT，GGG，GCA，AGC，GGC，GCG，CGC，TTT，GCC，CGC，CGC，GGG，CCA，CAG，CGC，CTT

6.EMPII-6：

AGC，TGC，CTC，ACG，ACG，TGG，GAC，AGG，TGA，TCG，AAC，AGG，GCC，AAG，GCG，CTG，TGG，CCC，GCG，GCG

7.EMPII-7：

GTC，CCA，CGT，CGT，GAG，GCA，GCT，GCG，CAT，GGC，CAT，GTA，CTG，CAC，CGG，ATC，CGC，CGA，CCT，TGC

8.EMPII-8：

CCA，GGC，CGT，GGC，ACC，AGC，ACC，GGC，GCG，CTG，CGC，AGC，GCC，GCA，AGG，TCG，GCG，GAT，CCG，GTG

9.EMPII-9：

GGT，GCT，GGT，GCC，ACG，GCC，TGG，TGG，CCA，ATG，GTC，GCA，AAG，AAC，GGG，GAT，GGA，CCC，CGG，CGC

10.EMPII-10：

TCC，CCC，GGA，GTC，GCG，ATC，GGC，GCA，GAG，TAC，AGT，CCC，GCG，GCG，CCG，GGG，TCC，ATC，CCC，GTT

11.EMPII-11：

GCC，GAT，CGC，GAC，TCC，GGG，GGA，CAA，GAT，GAG，CGC，ACA，TGC，CCT，GCC，CAA，GGC，AGT，TCT，GAC

12.EMPII-12：

GCG，GCG，TTG，ATG，CCG，TTC，GAG，ACG，ATC，AGG，CTT，GTG，GCG，GTC，AGA，ACT，GCC，TTG，GGC，AGG

13.EMPII-13：

CTC，GAA，CGG，CAT，CAA，CGC，CGC，ATG，GCT，TGC，AAT，GCA，TGT，GCA，TGC，GCT，GTG，GTT，TCT，GGA

14.EMPII-14：

AGG，TGA，CCC，GCG，ACC，GGC，AGG，ATG，CCA，TGG，GCC，GCC，GCG，TCC，AGA，AAC，CAC，AGC，GCA，TGC

15.EMPII-15：

CCT，GCC，GGT，CGC，GGG，TCA，CCT，GGC，CCT，GGC，CTG，GCT，GTT，GGT，CGG，ATT，GTT，CAT，CAT，CGC

16.EMPII-16：

GCA，CGC，GCC，GGC，ACG，TCC，GAC，CCG，TGC，ATC，GCG，CCA，TGC，GCG，ATG，ATG，AAC，AAT，CCG，ACC

17.EMPII-17：

GTC，GGA，CGT，GCC，GGC，GCG，TGC，GCG，CGG，CAA，TGC，GCC，GAT，GCC，CCA，GCA，TGT，CCT，GAT，ACT

18.EMPII-18：

TGC，TTG，ACG，ATC，ATC，TTG，CGC，CAC，GAA，AAT，CCG，GCA，AAG，AGT，ATC，AGG，ACA，TGC，TGG，GGC

19.EMPII-19：

GCG，CAA，GAT，GAT，CGT，CAA，GCA，CAT，GGC，CGA，TCA，CCG，CCA，TGC，TGG，AAC，AAA，CGA，CGA，GCC

20.EMPII-20：

CGC，GCG，TAC，CAG，CGG，ACC，GCG，GCG，CCA，TGG，TCG，AAA，TCT，GGC，TCG，TCG，TTT，GTT，CCA，GCA

21.EMPII-21：

CGC，GGT，CCG，CTG，GTA，CGC，GCG，CTT，CAT，CGG，CAC，CTG，TTT，CGG，CTG，GCG，CGA，CCG，GGT，GCT

22.EMPII-22：

CCC，AGC，ATC，AGC，GCA，TAC，AAC，GTC，ACG，TTG，ACG，GGC，AGC，AGC，ACC，CGG，TCG，CGC，CAG，CCG

23.EMPII-23：

GTT，GTA，TGC，GCT，GAT，GCT，GGG，AAA，TCG，CTG，CAT，GTA，CGT，GGT，CAA，CTG，GCC，GAT，GCC，GTC

24.EMPII-24：

CAA，GTG，GGG，AAC，ACG，CAC，AGC，CGG，ATC，GAC，GGG，AGG，ATC，GAC，GGC，ATC，GGC，CAG，TTG，ACC

25.EMPII-25：

GCT，GTG，CGT，GTT，CCC，CAC，TTG，GCT，GCG，GCA，CCG，GGC，CGG，CCA，CGA，CGC，TAT，CCC，GGA，CCG

26.EMPII-26：

GAC，ACA，GGG，TCG，CTG，ATC，CGC，GAC，GAG，CGC，GCA，TTA，TGG，CGG，TCC，GGG，ATA，GCG，TCG，TGG

27.EMPII-27：

GCG，GAT，CAG，CGA，CCC，TGT，GTC，GCT，GCT，GAG，CTG，CTA，TCA，AAT，TGG，CCG，TTA，TCA，TCA，CGT

28.EMPII-28：

CGC，AGG，CGC，AAC，CAC，GGC，ACC，GTC，GGG，TGC，CGG，TGG，TGA，ACG，TGA，TGA，TAA，CGG，CCA，ATT

29.EMPII-29：

GGT，GCC，GTG，GTT，GCG，CCT，GCG，CAG，CAC，CCG，CAC，CAA，GGT，GGC，CAC，CGC，ATG，ACG，AAT，TTG

30.EMPII-30：

CGT，CAA，CTC，CAT，CAC，CAG，CAC，GGT，GGC，GAC，GAC，GAT，CAG，CAA，ATT，CGT，CAT，GCG，GTG，GCC

31.EMPII-31：

GTG，CTG，GTG，ATG，GAG，TTG，ACG，AAG，TAT，TCC，GTC，CAA，CGC，TGG，ATA，CAG，CAC，GGA，AGG，CTG

32.EMPII-32：

GTC，GTG，TTC，CTC，GTG，GTG，GGA，CGG，GTG，CCA，GCC，CAA，GCG，CAG，CCT，TCC，GTG，CTG，TAT，CCA

33.EMPII-33：

TCC，CAC，CAC，GAG，GAA，CAC，GAC，CAC，GGG，CTG，GAA，GAG，AAC，GAG，GTG，TAC，GGC，CTG，GTA，CCC

34.EMPII-34：

GAT，CCA，GCG，GAC，CGT，GCA，CAG，CAG，CGT，GGC，GAT，CAC，CGC，GGG，TAC，CAG，GCC，GTA，CAC，CTC

35.EMPII-35：

CTG，TGC，ACG，GTC，CGC，TGG，ATC，TAA，ACG，CCG，GTC，CTG，TGG，TGG，ATC，GGG，TTG，GGC，ATG，ACC

36.EMPII-36：

CAC，AAA，ATC，ATG，CAG，GAC，GCC，ATA，GAT，CAG，CCA，ATA，GAC，GGT，CAT，GCC，CAA，CCC，GAT，CCA

37.EMPII-37：

GGC，GTC，CTG，CAT，GAT，TTT，GTG，GTT，CAT，CAG，CGC，TGG，CCA，ATC，CGC，TAC，ATC，CCG，CGC，GGC

38.EMPII-38：

CTG，CAG，GCG，GTC，TTC，CTG，ATA，CAG，GCG，TCT，GCG，ATA，GCC，GCC，GCG，CGG，GAT，GTA，GCG，GAT

39.EMPII-39：

TAT，CAG，GAA，GAC，CGC，CTG，CAG，CAT，GCG，GTC，GAG，CCG，CGC，CCG，CAT，TGC，GTC，AGC，TTC，GGC

40.EMPII-40：

GTC，CTG，CTG，CAG，CTT，GTC，GAC，GAG，GCC，CGC，ATA，GAA，GAA，GCC，GAA，GCT，GAC，GCA，ATG，CGG

41.EMPII-41：

GTC，GAC，AAG，CTG，CAG，CAG，GAC，GTG，AAG，ACG，TCA，AGC，GTA，CTG，CGG，GCC，GAC，CCG，GAG，GAG

42.EMPII-42：

GGC，TCG，AGG，CTG，CCA，GCA，GCA，CGT，CAT，CCG，TCA，CGT，GGG，CTC，CTC，CGG，GTC，GGC，CCG，CAG

43.EMPII-43：

TGC，TGC，TGG，CAG，CCT，CGA，GCC，TTG，CGA，ACG，CCC，TGA，TCG，CCC，TCG，CGC，TGC，GAC，CGG，CGC

44.EMPII-44：

CCG，CCG，CAT，GGT，CCA，GCA，GCA，GCA，CGG，GCA，GGT，CGC，CCC，GCG，CCG，GTC，GCA，GCG，CGA，GGG

45.EMPII-45：

TGC，TGC，TGG，ACC，ATG，CGG，CGG，GAC，CGT，CAG，AAG，GGG，ATA，CCT，GGT，CAT，GCC，ACG，AGG，GCG

46.EMPII-46：

GCC，GGG，GCT，TCA，GGC，GCG，GGA，GGG，AGT，GCG，GCG，ACA，GAT，CGC，CCT，CGT，GGC，ATG，ACC，AGG

47.EMPII-47：

TCC，CGC，GCC，TGA，AGC，CCC，GGC，GCC，GCG，CCA，ACT，GGC，GGG，ACC，AGG，AGG，TGC，GCT，TTC，GGG

48.EMPII-48：

CCA，GCG，AGC，CGT，AAC，CGG，TTG，CCA，GCC，GCC，TTG，CAT，GGC，CCC，GAA，AGC，GCA，CCT，CCT，GGT

49.EMPII-49：

CAA，CCG，GTT，ACG，GCT，CGC，TGG，ACG，AGG，CGG，GGC，TGG，CGG，ATG，CGG，TGG，TCA，GGT，CGG，GCG

50.EMPII-50：

CAT，CCA，GCA，AGG，CGA，TGT，CGC，TGT，GGG，AGC，GGA，TCT，CCC，CGC，CCG，ACC，TGA，CCA，CCG，CAT

51.EMPII-51：

GCG，ACA，TCG，CCT，TGC，TGG，ATG，CGC，CGG，GCC，GGA，CAC，TGT，CCT，GGG，GCA，CCC，CCA，TCG，AGG

52.EMPII-52：

GGG，ACT，TGT，GCG，GGC，GGG，GCC，CGT，CCA，GGA，GGG，AGC，CGG，CCT，CGA，TGG，GGG，TGC，CCC，AGG

53.EMPII-53：

GGC，CCC，GCC，CGC，ACA，AGT，CCC，GGC，AAC，TGA，CCT，TCC，GTT，TCC，ACT，CCA，TCC，TGG，GTG，TCG

54.EMPII-54：

CCG，GCC，CCG，GCA，CGG，CGT，GGT，TGC，CGT，CGG，TCT，CGA，TCT，CGA，CAC，CCA，GGA，TGG，AGT，GGA

55.EMPII-55：

ACC，ACG，CCG，TGC，CGG，GGC，CGG，TGA，TCA，TGG，ACG，GGA，CAG，TCA，CCC，AGC，CCG，ACG，GGT，ACG

56.EMPII-56：

GGA，TGC，GCG，TCC，GAA，AGA，ACC，GCA，GCA，GAT，AAT，GAA，AGC，CGT，ACC，CGT，CGG，GCT，GGG，TGA

57.EMPII-57：

GGT，TCT，TTC，GGA，CGC，GCA，TCC，TGA，TCG，AGG，GCA，CGC，GCT，ATT，CCG，ATT，GCG，GCG，ATC，TCG

58.EMPII-58：

CCG，CAT，AGT，CTT，GGG，ACG，CCG，GGG，CCA，GCG，CGT，CGT，CGT，CGA，GAT，CGC，CGC，AAT，CGG，AAT

59.EMPII-59：

CGG，CGT，CCC，AAG，ACT，ATG，CGG，GCC，AGC，AGG，GTT，GAA，CCC，CGG，CCG，AGG，TCC，GGC，GCG，AAC

60.EMPII-60：

TCG，CTT，CGT，CAT，GGG，CCA，ACG，CAA，TAG，GCT，GGA，TGC，CCC，GTT，CGC，GCC，GGA，CCT，CGG，CCG

61.EMPII-61：

CGT，TGG，CCC，ATG，ACG，AAG，CGA，CCT，TCT，GGC，CCG，ATC，ACG，CGG，AGG，CCC，CTG，TTC，GGG，TGG

62.EMPII-62：

AAT，AGC，CCG，TGA，CCG，TTT，GAA，AGA，ACC，GGG，CGC，GCA，TTT，CCA，CCC，GAA，CAG，GGG，CCT，CCG

63.EMPII-63：

TTC，AAA，CGG，TCA，CGG，GCT，ATT，CGC，TGC，GGT，ATG，CGG，GGC，AGG，TGG，CGG，ACG，CGG，TGG，CGG

64.EMPII-64：

CGG，GGC，GCA，GCG，CGT，CGG，TGC，CGC，CCG，GCC，CGG，ACA，GCG，CCG，CCA，CCG，CGT，CCG，CCA，CCT

65.EMPII-65：

GCA，CCG，ACG，CGC，TGC，GCC，CCG，CCA，TCC，GCG，ATC，ACG，CGA，TCG，ACC，CAG，CAC，GCC，GCG，ACC

66.EMPII-66：

AGC，GGC，GGA，ACA，CCA，TCC，GGT，TCA，GCA，GGC，GCA，GGA，AGC，GGT，CGC，GGC，GTG，CTG，GGT，CGA

67.EMPII-67：

ACC，GGA，TGG，TGT，TCC，GCC，GCT，GCG，CGA，ACG，ACC，CCC，GCT，ATA，CCC，TGC，TGC，AGC，GGG，TAT

68.EMPII-68：

CGG，CAT，AGA，CCC，GTT，CGA，TCA，GTC，CAT，GCG，GCA，TGC，GGT，ATA，CCC，GCT，GCA，GCA，GGG，TAT

69.EMPII-69：

TGA，TCG，AAC，GGG，TCT，ATG，CCG，GCC，CGC，TGA，AGG，TGG，CGC，AAC，AGC，TGC，GCA，TCG，TGA，CAG

70.EMPII-70：

GGC，AGC，GTA，TGC，GGG，TGC，CAA，CGC，GAA，TGC，CTG，GCT，TGC，CTG，TCA，CGA，TGC，GCA，GCT，GTT

71.EMPII-71：

TTG，GCA，CCC，GCA，TAC，GCT，GCC，TGG，CGG，AAC，GAC，CGG，TGC，ATG，AAG，AAA，ACG，CAT，GAA，CGC

72.EMPII-72：

GCG，CCG，ATC，ACG，ATG，GCG，GTT，TTG，GCC，GCG，GGC，GAA，TGG，GCG，TTC，ATG，CGT，TTT，CTT，CAT

73.EMPII-73：

AAC，CGC，CAT，CGT，GAT，CGG，CGC，TGG，CTT，TGG，CGC，GCA，GGG，CCT，GGC，CAT，CCG，CCT，GCA，GTC

74.EMPII-74：

TTG，TCG，CGG，GCC，TCG，ACA，AGG，GTG，GTG，GCG，ATG，TGC，GCG，GAC，TGC，AGG，CGG，ATG，GCC，AGG

75.EMPII-75：

CCT，TGT，CGA，GGC，CCG，CGA，CAA，GCC，CGG，CCA，GCG，CGC，CTA，TGT，CAG，CCA，CGA，TCA，GGA，CCA

76.EMPII-76：

CCG，GTT，TCG，GTG，ATG，ACA，GTC，GGG，GGC，GCG，TCG，GGG，ACA，TGG，TCC，TGA，TCG，TGG，CTG，ACA

77.EMPII-77：

GAC，TGT，CAT，CAC，CGA，AAC，CGG，TGC，GGT，CAA，GGA，GCT，GTG，AGC，GCT，GAA，CGG，GCA，GGA，CAT

78.EMPII-78：

TAG，AAG，CCC，GAC，AGC，GGC，ATC，AGC，GTC，ACC，TCG，CGC，GAA，ATG，TCC，TGC，CCG，TTC，AGC，GCT

79.EMPII-79：

GAT，GCC，GCT，GTC，GGG，CTT，CTA，TCG，GCT，GTT，GTG，GCC，GGG，CCC，CAA，GTT，CTA，CGA，TTA，CGT

80.EMPII-80：

AAC，TTT，TCG，AAA，TGG，CGT，TCC，TGC，TGA，TCG，GGC，TCG，TTC，ACG，TAA，TCG，TAG，AAC，TTG，GGG

81.EMPII-81：

GGA，ACG，CCA，TTT，CGA，AAA，GTT，CAA，CCC，GGA，CAA，CCT，GGA，AGG，AGA，CCG，TCG，CAT，CCG，TGA

82.EMPII-82：

AGC，TTG，ACG，TAG，GGG，TCC，TGG，TAC，ACG，GGC，TCA，GCG，TGA，TCA，CGG，ATG，CGA，CGG，TCT，CCT

83.EMPII-83：

CCA，GGA，CCC，CTA，CGT，CAA，GCT，GGG，CAC，CGT，GGC，CTT，CCT，CAA，GCT，GGG，CCA，AAT，GCT，CAA

84.EMPII-84：

GAA，TTG，TAT，GCC，TCA，AGC，TTC，ATC，AGC，GCG，CCC，GCG，GCC，TTG，AGC，ATT，TGG，CCC，AGC，TTG

85.EMPII-85：

GAA，GCT，TGA，GGC，ATA，CAA，TTC，CGT，CCA，TGC，CAA，GGT，CGC，GAC，CTT，CAT，CAA，GGA，CCC，CTA

86.EMPII-86：

CCC，ACC，AGC，AGC，GTC，TGA，TAC，GAA，GCG，GCT，TGC，CGC，AGA，TAG，GGG，TCC，TTG，ATG，AAG，GTC

87.EMPII-87：

GTA，TCA，GAC，GCT，GCT，GGT，GGG，CGG，GAA，TTA，TTT，CTC，GCA，CAG，CTC，GAT，CTA，TGC，GCT，GAT

88.EMPII-88：

TTG，GCG，AAC，CAG，ACG，GCG，GCG，CGC，CGC，GCC，AGC，GCG，TGG，ATC，AGC，GCA，TAG，ATC，GAG，CTG

89.EMPII-89：

CGC，CGC，CGT，CTG，GTT，CGC，CAA，CCC，CAA，CAC，CAA，CCA，GCT，GGT，CGC，CCG，CAT，GGT，CGC，GCT

90.EMPII-90：

TTG，GCG，TTC，AGC，ATC，ATC，TGG，CCG，CCT，GGG，CGT，TCG，AAC，AGC，GCG，ACC，ATG，CGG，GCG，ACC

91.EMPII-91：

CCA，GAT，GAT，GCT，GAA，CGC，CAA，GGT，CGC，CCG，CAT，CGA，GAC，CGA，GCC，CGC，GCG，CAC，TAC，CCG

92.EMPII-92：

ATG，TCG，CCG，GTC，ATT，GAC，CGC，CCG，TCC，GCC，AGG，GTG，ACG，CGG，GTA，GTG，CGC，GCG，GGC，TCG

93.EMPII-93：

GCG，GTC，AAT，GAC，CGG，CGA，CAT，GGA，CGC，CAG，CAA，CTG，CGA，CGT，CAT，GCA，CAA，CTA，TCG，CGA

94.EMPII-94：

CCC，GCG，TCG，CTC，TGC，GCG，CGG，GCC，GTG，TGG，CGC，AAC，AGG，TCG，CGA，TAG，TTG，TGC，ATG，ACG

95.EMPII-95：

CCG，CGC，GCA，GAG，CGA，CGC，GGG，ATC，GCT，CCA，CCG，CAA，GCG，CTG，GTC，GAT，GTC，GTT，GTT，CGT

96.EMPII-96：

GCG，ATG，TCC，TTC，GCC，GCC，TCG，CCC，AGA，CCG，AAT，TGC，AGC，ACG，AAC，AAC，GAC，ATC，GAC，CAG

97.EMPII-97：

CGA，GGC，GGC，GAA，GGA，CAT，CGC，GCA，TCA，CAC，CAT，CCT，GTT，CGG，CCC，CGG，CTA，CAA，GGA，GCC

98.EMPII-98：

TCC，TCG，GCC，AGC，TCC，GGG，CGT，TTG，AAT，ATC，TCG，TTG，ACC，GGC，TCC，TTG，TAG，CCG，GGG，CCG

99.EMPII-99：

ACG，CCC，GGA，GCT，GGC，CGA，GGA，TTT，CTC，GCG，GTA，TCG，GCA，TTC，GCC，CTG，CAC，CAC，CGA，TCC

100.EMPII-100：

AGC，ACG，TAA，GGC，GTG，GAC，ATG，CCC，GGA，GCC，GCC，ATG，TCC，GGA，TCG，GTG，GTG，CAG，GGC，GAA

101.EMPII-101：

CAT，GTC，CAC，GCC，TTA，CGT，GCT，GGG，CGC，GGT，GCC，GCA，TCT，GAG，CCG，CGC，CGA，GAT，CGA，TTG

102.EMPII-102：

GCC，AGG，ATG，CGG，TCG，GCA，TAG，CGC，GGG，CCC，TCG，ACC，GCC，CAA，TCG，ATC，TCG，GCG，CGG，CTC

103.EMPII-103：

CTA，TGC，CGA，CCG，CAT，CCT，GGC，ATT，CCT，CCA，GGA，GCG，GCT，GAT，CCC，GAA，CTT，GGG，CGC，CAA

104.EMPII-104：

GCG，AAT，TCG，GCG，CCC，GTG，AAA，ATG，CGC，GTC，CTG，CTC，AGG，TTG，GCG，CCC，AAG，TTC，GGG，ATC

105.EMPII-105：

TTT，CAC，GGG，CGC，CGA，ATT，CGC，CAG，TGA，ACT，GAA，CCG，GCA，TCA，CGG，CAG，CGC，TTT，CCC，GGT

106.EMPII-106：

TGC，GGC，CGG，AAC，CAC，GCG，GAT，TGC，GTC，AGG，ATC，GGC，TCG，ACC，GGG，AAA，GCG，CTG，CCG，TGA

107.EMPII-107：

ATC，CGC，GTG，GTT，CCG，GCC，GCA，CAA，CCG，CCA，CAA，GAC，GAT，CCG，CAA，CCC，CTA，TCT，GGT，CGG

108.EMPII-108：

ACG，ACG，CCG，GGA，ATT，TCC，GCC，GGC，GGA，TGG，GTG，GGC，GCG，CCG，ACC，AGA，TAG，GGG，TTG，CGG

109.EMPII-109：

GGC，GGA，AAT，TCC，CGG，CGT，CGT，GGG，CTC，GGC，CAA，AGC，CAC，GGC，CCA，GGT，GAT，GCT，GTC，CGA

110.EMPII-110：

CCT，CGA，GGT，CAG，GAG，CAG，ATC，GCT，CAT，GCC，CTC，GCC，AAG，TCG，GAC，AGC，ATC，ACC，TGG，GCC

111.EMPII-111：

GAT，CTG，CTC，CTG，ACC，TCG，AGG，GAA，GCG，ATC，ACC，CAA，GGG，TCG，CGA，AGC，TTT，GGC，ACG，GCG

112.EMPII-112：

CAC，CGT，GTC，GTC，GCC，GAT，ACC，CGG，CGG，CAT，CAG，CTT，CCG，CGC，CGT，GCC，AAA，GCT，TCG，CGA

113.EMPII-113：

GGT，ATC，GGC，GAC，GAC，ACG，GTG，ATG，CTC，TAT，GCC，TGG，TGC，CGG，GAC，GCG，GAT，GAC，GTG，ATC

114.EMPII-114：

GTT，CAC，CGC，CTC，CGG，CCT，TCT，GCC，CAC，CGC，CTG，ACC，GTC，GAT，CAC，GTC，ATC，CGC，GTC，CCG

115.EMPII-115：

AGA，AGG，CCG，GAG，GCG，GTG，AAC，GAG，GAA，CAG，GCG，CGG，CTG，GAC，GGC，CTG，CGT，GCC，GAC，ACG

116.EMPII-116：

GGG，CCG，CGT，CAC，CGG，ACC，GTC，GCC，CTG，CAC，CGC，CGC，CAG，CGT，GTC，GGC，ACG，CAG，GCC，GTC

117.EMPII-117：

GAC，GGT，CCG，GTG，ACG，CGG，CCC，TTT，GCG，GCC，CTG，CGC，GCG，GTG，GCG，CGC，AGG，CAT，GAT，TTC

118.EMPII-118：

CGC，AAA，GCC，TTC，GAT，CAG，GTC，CAT，GGG，CCA，GGG，CTG，CCC，GAA，ATC，ATG，CCT，GCG，CGC，CAC

119.EMPII-119：

GAC，CTG，ATC，GAA，GGC，TTT，GCG，ATT，GAT，GAA，GAG，GCG，CGC，GAC，TAT，CGC，AGG，CTG，GAT，GAC

120.EMPII-120：

GGC，GAG，GAT，ATG，CGC，GAC，GTG，ATA，GGA，ATT，TTC，CAG，CAC，GTC，ATC，CAG，CCT，GCG，ATA，GTC

121.EMPII-121：

CAC，GTC，GCG，CAT，ATC，CTC，GCC，GTG，ATG，ATG，GCC，CGC，GTG，ATG，GGC，GTG，CGC，GAC，CAT，CTT

122.EMPII-122：

CTG，GAA，CGC，CAG，GGG，CAG，GTC，GCA，GGG，CCG，GTC，CAG，GAC，AAG，ATG，GTC，GCG，CAC，GCC，CAT

123.EMPII-123：

GAC，CTG，CCC，CTG，GCG，TTC，CAG，CTG，ACC，CAC，ATC，GCG，CGC，GAC，GTG，ATC，GAC，TAT，GCC，CGC

124.EMPII-124：

GTG，GTC，CAG，CCA，GTC，CCC，CGG，CAG，ATA，GCA，CGG，CGG，GAT，GCG，GGC，ATA，GTC，GAT，CAC，GTC

125.EMPII-125：

CCG，GGG，GAC，TGG，CTG，GAC，CAC，GCG，GGC，GCG，CGG，GTC，CAC，GGG，CCG，GTG，GCC，TCA，CCC，GAA

126.EMPII-126：

TTC，CGC，GGC，ATC，CAG，CAG，CCG，CAG，GAT，CAC，GGT，GTA，CAG，TTC，GGG，TGA，GGC，CAC，CGG，CCC

127.EMPII-127：

CGG，CTG，CTG，GAT，GCC，GCG，GAA，GGC，TAT，TAC，CCG，TCC，GCG，CCC，GTC，CGT，CTG，GCG，GAT，CTG

128.EMPII-128：

CCG，AAA，CGC，GGC，CCG，GAT，GTT，CCA，GGC，GCA，GCG，AGG，CGG，CAG，ATC，CGC，CAG，ACG，GAC，GGG

129.EMPII-129：

AAC，ATC，CGG，GCC，GCG，TTT，CGG，ATC，TAT，CGC，GGG，ATC，CCG，CTG，CCC，ATC，GGC，AAG，GGC，CCG

130.EMPII-130：

GCC，CTT，GGA，CGT，GCT，GAT，CGG，TTG，GCG，ATA，GGC，CTC，CGG，CGG，GCC，CTT，GCC，GAT，GGG，CAG

131.EMPII-131：

CCG，ATC，AGC，ACG，TCC，AAG，GGC，GCC，AAA，ATC，GCT，CTG，CTC，CGC，AAC，GGC，CCC，TGG，GAT，GTC

132.EMPII-132：

CTG，CCG，TGA，CAC，GCC，CGA，CGG，CCG，GCA，GGC，GTG，ATC，GGC，GAC，ATC，CCA，GGG，GCC，GTT，GCG

133.EMPII-133：

CCG，TCG，GGC，GTG，TCA，CGG，CAG，GAC，TCC，TGG，ACG，GGC，CCG，CAT，CAC，GGC，TAG，GCG，CGC，GCG

134.EMPII-134：

GGA，AAT，TGA，GGC，TGT，GCT，GGA，ACC，CGC，GTT，GCC，TTA，CGG，CGC，GCG，CGC，CTA，GCC，GTG，ATG

135.EMPII-135：

TCC，AGC，ACA，GCC，TCA，ATT，TCC，GGA，GGG，TGA，AGG，CGC，TTG，CTG，GGC，ACC，ATC，CCA，TTC，AGC

136.EMPII-136：

GCA，GAA，AGT，GTG，CGG，CCA，GTA，TGA，GGC，CAG，CCG，CGG，GCA，GCT，GAA，TGG，GAT，GGT，GCC，CAG

137.EMPII-137：

TAC，TGG，CCG，CAC，ACT，TTC，TGC，AGG，TCT，GAC，ACG，GCG，AGA，ACC，CCT，CGC，CAC，GCG，CCG，GAC

138.EMPII-138：

GGC，GGC，GCT，GGG，CAA，GGA，TAC，GGG，TCG，CGA，TGC，GGC，TTG，GTC，CGG，CGC，GTG，GCG，AGG，GGT

139.EMPII-139：

GTA，TCC，TTG，CCC，AGC，GCC，GCC，TGG，TCG，CCC，AGA，ACT，TCC，AGC，AGG，TCG，TCA，TAG，GAC，TGA

140.EMPII-140：

CCA，GAT，GCT，TGA，TTT，TCG，CCG，TCA，GCT，GGG，CCG，GGT，GTT，TCA，GTC，CTA，TGA，CGA，CCT，GCT

141.EMPII-141：

CGG，CGA，AAA，TCA，AGC，ATC，TGG，ATC，TGC，TTC，TCG，GCG，TCG，ACC，TCT，TTG，ATC，ACG，GCC，AGC

142.EMPII-142：

CCT，GAG，GAC，CGG，CGT，GTT，GTT，CAT，CGA，GGG，ACT，GAA，GAT，GCT，GGC，CGT，GAT，CAA，AGA，GGT

143.EMPII-143：

AAC，AAC，ACG，CCG，GTC，CTC，AGG，TCC，TGT，TCC，TGG，TCG，ACC，CCC，GCG，CCG，TTC，TTG，TCC，GCA

144.EMPII-144：

GCC，GCA，GCG，CCT，GTG，CGC，CGG，CCA，GGA，CCT，GGA，CTT，GCA，TGC，GGA，CAA，GAA，CGG，CGC，GGG

145.EMPII-145：

CCG，GCG，CAC，AGG，CGC，TGC，GGC，CCC，AGG，GAC，CGC，GAC，TGG，ATC，CGC，ACC，AGC，TGC，GCC，CGC

146.EMPII-146：

GTG，GCT，GCT，GGC，CGG，TGC，GCG，CGG，CGC，GTC，GGG，CAC，GGT，GCG，GGC，GCA，GCT，GGT，GCG，GAT

147.EMPII-147：

CGC，GCA，CCG，GCC，AGC，AGC，CAC，ATC，GCC，TCG，GTG，ATC，AAA，GCG，ATG，CCA，AGC，AGC，ACG，GCG

148.EMPII-148：

CGG，CCA，GCT，GGC，GAC，CCA，TCT，GGC，GCA，TGT，CGA，TAG，CCT，CGC，CGT，GCT，GCT，TGG，CAT，CGC

149.EMPII-149：

AGA，TGG，GTC，GCC，AGC，TGG，CCG，CCG，CGC，AGG，GCG，GCA，TCG，TGC，ATG，CAG，CCC，AGG，TCG，TCG

150.EMPII-150：

TTG，CGC，CCT，CGA，GAT，TGT，GCA，TGC，CGC，ATC，GCT，GAT，CGT，CGA，CGA，CCT，GGG，CTG，CAT，GCA

151.EMPII-151：

TGC，ACA，ATC，TCG，AGG，GCG，CAA，GCC，GCG，TCG，ACG，ATC，GTG，TAG，CAG，ACC，GGG，CCC，GAA，GCC

152.EMPII-152：

CAA，GCG，TCC，CCG，CGG，CAT，GCT，GAT，GCT，GCT，TGC，GGG，CGA，GGC，TTC，GGG，CCC，GGT，CTG，CTA

153.EMPII-153：

AGC，ATG，CCG，CGG，GGA，CGC，TTG，CGG，GAG，GAC，AGC，GCC，GCC，AAA，GCG，GCG，CCA，AGC，GGC，TGC

154.EMPII-154：

CAG，AAT，TGA，GGA，GAT，CCG，CCA，GCC，ATT，CGG，TGC，TGC，GTT，GCA，GCC，GCT，TGG，CGC，CGC，TTT

155.EMPII-155：

TGG，CGG，ATC，TCC，TCA，ATT，CTG，GTC，TGC，GGA，AGG，GTG，GCG，TGG，ATC，GCC，TTG，ACG，TCT，CGT

156.EMPII-156：

AAC，GCC，AGG，TCA，GAA，CCC，AAG，CGC，GAA，GGC，ACT，GAT，GAG，ACG，AGA，CGT，CAA，GGC，GAT，CCA

157.EMPII-157：

CTT，GGG，TTC，TGA，CCT，GGC，GTT，ATG，GCC，TGG，CCC，GCC，GTG，GTA，TCG，GGC，AGA，CGG，TCA，TCC

158.EMPII-158：

ATC，GGC，GTG，AAC，CGT，TCT，AAC，ATC，CGG，ACT，GTT，GAC，GGT，GGA，TGA，CCG，TCT，GCC，CGA，TAC

159.EMPII-159：

GTT，AGA，ACG，GTT，CAC，GCC，GAT，TGC，CGA，CCC，AAT，TCG，ACG，ACG，ACG，CGC，CTT，CGC，GCG，GCT

160.EMPII-160：

ACC，ATC，GGC，GTG，CCG，GTC，CAC，TGA，CTT，TGT，TGG，ACA，AAT，AGC，CGC，GCG，AAG，GCG，CGT，CGT

161.EMPII-161：

GCG，CGG，GTG，AAT，CCG，GCC，AAG，GAT，GCA，TGA，CTG，CCC，GCA，ACC，ATC，GGC，GTG，CCG，GTC，CAC

利用PCR进行虾青素操纵子全长扩增，在100μl反应体系中，EMPII-2-EMPII-160共159个扩增引物的添加量为2ng，2个外侧引物EMPII-1和EMPII-161添加量为30ng。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃10min，共25个循环。扩增所使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)。

PCR结束后，用0.8％(w/v)琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。之后高效转化入大肠杆菌DH5α感受态中，获得阳性克隆。

实施例6虾青素合成操纵子在大肠杆菌中表达并合成虾青素

挑取实施例4中呈橘黄色的大肠杆菌菌落于20ml LB液体培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中，37℃振荡培养12小时。培养液在5,000g重力加速度下离心5min，无菌水清洗1次。所得的细胞沉淀用2mL浓度为1M磷酸缓冲液(113g/L K₂HPO₄，47g/LKH₂PO₄)重悬浮，然后将其转移到微量离心管中，以12,000g再次离心5min。沉淀用浓度为5ml/g的甲醇重悬浮后，以12,000g再次离心5min，去除上清液于铝箔中保存。再用甲醇抽提四次，每次的上清液分别装入试管中保存。对每个样品测定其在470nm下的吸光值。将各部分收集到一起混匀，0.22μm膜过滤灭菌，测定混合液在470nm下的吸光值(根据虾青素吸收光谱确定，见图3)。根据标准曲线计算样品中虾青素含量为每克湿重细胞含有虾青素182μg。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>副球菌虾青素合成操纵子及其表达载体与应用

<130>0911005

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>6352

<212>DNA

<213>副球菌虾青素合成操纵子

<400>1

gaattgactg caggaactgg cagcgccgat ccacgactgg agcatcccca cgaccgcgtc    60

gctgcgcgcc acagcgccga tgatggggcg ggaccgggtt ctgaccgggt cgggcgggct    120

gcgtcacggg aaggacaccg cgaaatccat ccgcgatggc gcggacctcg tggggcaagc    180

ggcgcgcgct ttgcccgccg cgggccacag cgccttggcc ctgttcgatc acctgtccca    240

cgtcgtgagg cagctgcgca tggccatgta ctgcaccgga tccgccgacc ttgcggcgct    300

gcgcagcgcg ccggtgctgg tgccacggcc tggtggccaa tggtcgcaaa gaacggggat    360

ggaccccggc gccgcgggac tgtactctgc gccgatcgcg actccggggg acaagatgag    420

cgcacatgcc ctgcccaagg cagttctgac cgccacaagc ctgatcgtct cgaacggcat    480

caacgccgca tggcttgcaa tgcatgtgca tgcgctgtgg tttctggacg cggcggccca    540

tggcatcctg ccggtcgcgg gtcacctggc cctggcctgg ctgttggtcg gattgttcat    600

catcgcgcat ggcgcgatgc acgggtcgga cgtgccggcg cgtgcgcgcg gcaatgcgcc    660

gatgccccag catgtcctga tactctttgc cggattttcg tggcgcaaga tgatcgtcaa    720

gcacatggcc gatcaccgcc atgctggaac aaacgacgag ccagatttcg accatggcgc    780

cgcggtccgc tggtacgcgc gcttcatcgg cacctgtttc ggctggcgcg accgggtgct    840

gctgcccgtc aacgtgacgt tgtatgcgct gatgctggga aatcgctgca tgtacgtggt    900

caactggccg atgccgtcga tcctcccgtc gatccggctg tgcgtgttcc ccacttggct    960

gcggcaccgg gccggccacg acgctatccc ggaccgccat aatgcgcgct cgtcgcggat    1020

cagcgaccct gtgtcgctgc tgagctgcta tcaaattggc cgttatcatc acgttcacca    1080

ccggcacccg acggtgccgt ggttgcgcct gcgcagcacc cgcaccaagg tggccaccgc    1140

atgacgaatt tgctgatcgt cgtcgccacc gtgctggtga tggagttgac gaagtattcc    1200

gtccaacgct ggatacagca cggaaggctg cgcttgggct ggcacccgtc ccaccacgag    1260

gaacacgacc acgggctgga agagaacgag gtgtacggcc tggtacccgc ggtgatcgcc    1320

acgctgctgt gcacggtccg ctggatctaa acgccggtcc tgtggtggat cgggttgggc    1380

atgaccgtct attggctgat ctatggcgtc ctgcatgatt ttgtggttca tcagcgctgg    1440

ccaatccgct acatcccgcg cggcggctat cgcagacgcc tgtatcagga agaccgcctg    1500

cagcatgcgg tcgagccgcg cccgcattgc gtcagcttcg gcttcttcta tgcgggcctc    1560

gtcgacaagc tgcagcagga cgtgaagacg tcaagcgtac tgcgggccga cccggaggag    1620

cccacgtgac ggatgacgtg ctgctggcag cctcgagcct tgcgaacgcc ctgatcgccc    1680

tcgcgctgcg accggcgcgg ggcgacctgc ccgtgctgct gctggaccat gcggcgggac    1740

cgtcagaagg ggatacctgg tcatgccacg agggcgatct gtcgccgcac tccctcccgc    1800

gcctgaagcc ccggcgccgc gccaactggc gggaccagga ggtgcgcttt cggggccatg    1860

caaggcggct ggcaaccggt tacggctcgc tggacgaggc ggggctggcg gatgcggtgg    1920

tcaggtcggg cggggagatc cgctcccaca gcgacatcgc cttgctggat gcgccgggcc    1980

ggacactgtc ctggggcacc cccatcgagg ccggctccct cctggacggg ccccgcccgc    2040

acaagtcccg gcaactgacc ttccgtttcc actccatcct gggtgtcgag atcgagaccg    2100

acggcaacca cgccgtgccg gggccggtga tcatggacgg gacagtcacc cagcccgacg    2160

ggtacggctt tcattatctg ctgcggttct ttcggacgcg catcctgatc gagggcacgc    2220

gctattccga ttgcggcgat ctcgacgacg acgcgctggc cccggcgtcc caagactatg    2280

cgggccagca gggttgaacc ccggccgagg tccggcgcga acggggcatc cagcctattg    2340

cgttggccca tgacgaagcg accttctggc ccgatcacgc ggaggcccct gttcgggtgg    2400

aaatgcgcgc ccggttcttt caaacggtca cgggctattc gctgcggtat gcggggcagg    2460

tggcggacgc ggtggcggcg ctgtccgggc cgggcggcac cgacgcgctg cgccccgcca    2520

tccgcgatca cgcgatcgac ccagcacgcc gcgaccgctt cctgcgcctg ctgaaccgga    2580

tggtgttccg ccgctgcgcg aacgaccccc gctataccct gctgcagcgg gtataccgca    2640

tgccgcatgg actgatcgaa cgggtctatg ccggcccgct gaaggtggcg caacagctgc    2700

gcatcgtgac aggcaagcca ggcattcgcg ttggcacccg catacgctgc ctggcggaac    2760

gaccggtgca tgaagaaaac gcatgaacgc ccattcgccc gcggccaaaa ccgccatcgt    2820

gatcggcgct ggctttggcg cgcagggcct ggccatccgc ctgcagtccg cgcacatcgc    2880

caccaccctt gtcgaggccc gcgacaagcc cggccagcgc gcctatgtca gccacgatca    2940

ggaccatgtc cccgacgcgc ccccgactgt catcaccgaa accggtgcgg tcaaggagct    3000

gtgagcgctg aacgggcagg acatttcgcg cgaggtgacg ctgatgccgc tgtcgggctt    3060

ctatcggctg ttgtggccgg gccccaagtt ctacgattac gtgaacgagc ccgatcagca    3120

ggaacgccat ttcgaaaagt tcaacccgga caacctggaa ggagaccgtc gcatccgtga    3180

tcacgctgag cccgtgtacc aggaccccta cgtcaagctg ggcaccgtgg ccttcctcaa    3240

gctgggccaa atgctcaagg ccgcgggcgc gctgatgaag cttgaggcat acaattccgt    3300

ccatgccaag gtcgcgacct tcatcaagga cccctatctg cggcaagccg cttcgtatca    3360

gacgctgctg gtgggcggga attatttctc gcacagctcg atctatgcgc tgatccacgc    3420

gctggcgcgg cgcgccgccg tctggttcgc caaccccaac accaaccagc tggtcgcccg    3480

catggtcgcg ctgttcgaac gcccaggcgg ccagatgatg ctgaacgcca aggtcgcccg    3540

catcgagacc gagcccgcgc gcactacccg cgtcaccctg gcggacgggc ggtcaatgac    3600

cggcgacatg gacgccagca actgcgacgt catgcacaac tatcgcgacc tgttgcgcca    3660

cacggcccgc gcgcagagcg acgcgggatc gctccaccgc aagcgctggt cgatgtcgtt    3720

gttcgtgctg caattcggtc tgggcgaggc ggcgaaggac atcgcgcatc acaccatcct    3780

gttcggcccc ggctacaagg agccggtcaa cgagatattc aaacgcccgg agctggccga    3840

ggatttctcg cggtatcggc attcgccctg caccaccgat ccggacatgg cggctccggg    3900

catgtccacg ccttacgtgc tgggcgcggt gccgcatctg agccgcgccg agatcgattg    3960

ggcggtcgag ggcccgcgct atgccgaccg catcctggca ttcctccagg agcggctgat    4020

cccgaacttg ggcgccaacc tgagcaggac gcgcattttc acgggcgccg aattcgccag    4080

tgaactgaac cggcatcacg gcagcgcttt cccggtcgag ccgatcctga cgcaatccgc    4140

gtggttccgg ccgcacaacc gccacaagac gatccgcaac ccctatctgg tcggcgcgcc    4200

cacccatccg ccggcggaaa ttcccggcgt cgtgggctcg gccaaagcca cggcccaggt    4260

gatgctgtcc gacttggcga gggcatgagc gatctgctcc tgacctcgag ggaagcgatc    4320

acccaagggt cgcgaagctt tggcacggcg cggaagctga tgccgccggg tatcggcgac    4380

gacacggtga tgctctatgc ctggtgccgg gacgcggatg acgtgatcga cggtcaggcg    4440

gtgggcagaa ggccggaggc ggtgaacgag gaacaggcgc ggctggacgg cctgcgtgcc    4500

gacacgctgg cggcggtgca gggcgacggt ccggtgacgc ggccctttgc ggccctgcgc    4560

gcggtggcgc gcaggcatga tttcgggcag ccctggccca tggacctgat cgaaggcttt    4620

gcgattgatg aagaggcgcg cgactatcgc aggctggatg acgtgctgga aaattcctat    4680

cacgtcgcgc atatcctcgc cgtgatgatg gcccgcgtga tgggcgtgcg cgaccatctt    4740

gtcctggacc ggccctgcga cctgcccctg gcgttccagc tgacccacat cgcgcgcgac    4800

gtgatcgact atgcccgcat cccgccgtgc tatctgccgg gggactggct ggaccacgcg    4860

ggcgcgcggg tccacgggcc ggtggcctca cccgaactgt acaccgtgat cctgcggctg    4920

ctggatgccg cggaaggcta ttacccgtcc gcgcccgtcc gtctggcgga tctgccgcct    4980

cgctgcgcct ggaacatccg ggccgcgttt cggatctatc gcgggatccc gctgcccatc    5040

ggcaagggcc cgccggaggc ctatcgccaa ccgatcagca cgtccaaggg cgccaaaatc    5100

gctctgctcc gcaacggccc ctgggatgtc gccgatcacg cctgccggcc gtcgggcgtg    5160

tcacggcagg actcctggac gggcccgcat cacggctagg cgcgcgcgcc gtaaggcaac    5220

gcgggttcca gcacagcctc aatttccgga gggtgaaggc gcttgctggg caccatccca    5280

ttcagctgcc cgcggctggc ctcatactgg ccgcacactt tctgcaggtc tgacacggcg    5340

agaacccctc gccacgcgcc ggaccaagcc gcatcgcgac ccgtatcctt gcccagcgcc    5400

gcctggtcgc ccagaacttc cagcaggtcg tcataggact gaaacacccg gcccagctga    5460

cggcgaaaat caagcatctg gatctgcttc tcggcgtcga cctctttgat cacggccagc    5520

atcttcagtc cctcgatgaa caacacgccg gtcctcaggt cctgttcctg gtcgaccccc    5580

gcgccgttct tgtccgcatg caagtccagg tcctggccgg cgcacaggcg ctgcggcccc    5640

agggaccgcg actggatccg caccagctgc gcccgcaccg tgcccgacgc gccgcgcgca    5700

ccggccagca gccacatcgc ctcggtgatc aaagcgatgc caagcagcac ggcgaggcta    5760

tcgacatgcg ccagatgggt cgccagctgg ccgccgcgca gggcggcatc gtgcatgcag    5820

cccaggtcgt cgacgatcag cgatgcggca tgcacaatct cgagggcgca agccgcgtcg    5880

acgatcgtgt agcagaccgg gcccgaagcc tcgcccgcaa gcagcatcag catgccgcgg    5940

ggacgcttgc gggaggacag cgccgccaaa gcggcgccaa gcggctgcaa cgcagcaccg    6000

aatggctggc ggatctcctc aattctggtc tgcggaaggg tggcgtggat cgccttgacg    6060

tctcgtctca tcagtgcctt cgcgcttggg ttctgacctg gcgttatggc ctggcccgcc    6120

gtggtatcgg gcagacggtc atccaccgtc aacagtccgg atgttagaac ggttcacgcc    6180

gattgccgac ccaattcgac gacgacgcgc cttcgcgcgg ctatttgtcc aacaaagtca    6240

gtggaccggc acgccgatgg ttgcgggcag tcatgcatcc ttggccggat tcacccgcgc    6300

cgcatcgtga ttggccagaa tagtcccgca aagcggcgcg gcttagccta tg            6352

Claims (9)

1.一种副球菌虾青素合成操纵子，序列为SEQ ID No:1。

2.根据权利要求1所述的副球菌虾青素合成操纵子，其特征在于，所述的SEQ ID No:1含有β胡萝卜素酮酶基因、β胡萝卜素羟化酶基因、番茄红素β环化酶基因、八氢番茄红素去饱和酶基因、八氢番茄红素合成酶基因，以及牻牛儿基焦磷酸合成酶基因。

3.权利要求1或2所述的副球菌虾青素合成操纵子在生物合成虾青素中的应用。

4.权利要求1或2所述的副球菌虾青素合成操纵子在利用原核生物合成虾青素中的应用。

5.权利要求1或2所述的副球菌虾青素合成操纵子在大肠杆菌合成虾青素中的应用。

6.一种包含权利要求1所述副球菌虾青素合成操纵子的表达载体。

7.根据权利要求6所述的含有副球菌虾青素合成操纵子的表达载体，其特征在于，所述表达载体为T/A载体与SEQ ID No:1序列直接连接形成。

8.权利要求6所述的含有副球菌虾青素合成操纵子的表达载体在生物合成虾青素中的应用。

9.权利要求7所述的含有副球菌虾青素合成操纵子的表达载体在大肠杆菌合成虾青素中的应用。

Images