CN112877342B - 一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法及其相应生物感应器和应用 - Google Patents

一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法及其相应生物感应器和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法及其相应生物感应器和应用。所述生物感应器包括含番茄红素操纵子的重组质粒、甲羟戊酸途径上游表达载体和甲羟戊酸途径下游表达载体；所述重组质粒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的或与SEQ ID NO.1所示的具有90%以上同源性的，且能够合成番茄红素的核苷酸序列的番茄红素操纵子以及如SEQ ID NO.2所示的启动子。本发明的生物传感器能够感应不同浓度的爆炸物分子，而合成不同产量的番茄红素，将爆炸物分子浓度与番茄红素产量进行偶联，实现了爆炸物分子的可视化检测，检测操作简单、方便、安全性高。

Description

一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法及其相 应生物感应器和应用
技术领域
本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法及其相应生物感应器和应用。
背景技术
生物感应技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件是负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等等；而报告元件可在感应元件的作用下而产生感应信号，一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)和荧光素酶，分别产生绿色荧光、黄色荧光、红色荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这些较为常见的报告元件的特点是技术成熟、容易操作，但是荧光和自发光的检测需要借助于分析仪器，例如酶标仪、紫外分析仪、荧光检测仪、自发光检测仪等，还需要对荧光信号和自发光信号进行定量和定性分析。荧光和自发光均不能实现肉眼观察，尤其实在明场情况下。
战区残留爆炸物(例如地雷)对于生命安全、生态系统都造成了不可修复的损伤，因此针对地雷进行安全有效的检测具有重要的战略意义。通过生物感应检测技术对残留地雷进行检测是一种有效的手段。爆炸物(例如地雷)的有效成份为TNT，TNT可分解为多种化合物，如1，3-二硝基苯(1，3-DNB)和2，4-二硝基甲苯(2，4-DNT)。以色列科学家ShimshonBelkin于2014年报道了对爆炸物分子2，4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP基因作为报告元件，构建了检测2，4-DNT的生物感应系统。此生物感应系统以GFP作为报告元件，在野外进行爆炸物探测时，需使用仪器进行特定波长的紫外激发，以及绿色荧光信号的收集。另外，野外情况较为复杂，多种非GFP物质都能在紫外激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。另外，产生的绿色荧光需要在一定的距离范围内进行收集，否则荧光发生散射，距离越远，信号越弱，而对于爆炸物分子，远距离检测是基本的要求，较近距离的检测会增加检测人员的危险性。
在微生物体内，利用番茄红素操纵子中的三个基因，crtE、crtB、crtI，可以合成番茄红素。其中crtE编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(CrtE)，crtB编码八氢番茄红素合成酶(CrtB)，crtI编码八氢番茄红素去饱和酶(CrtI)。以微生物体内产生的前体异戊二烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)为底物，在crtE、crtB和crtI三个酶的作用下，可以合成番茄红素。而目前，并没有利用番茄红素来进行爆炸物分子可视化检测的相关报道。
发明内容
为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法及其相应生物感应器，和其在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)扩增番茄红素操纵子lyc基因片段，纯化回收后，与pET28a质粒同时利用EcoRI和Hind III双酶切，然后将质粒酶切片段与lyc基因片段以2∶1的质量比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含卡那霉素的LB固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒pET-lyc；
(2)分别扩增重组质粒pET-lyc和启动子yqjF基因片段，纯化回收后，将重组质粒pET-lyc和启动子yqjF基因片段以1∶2的浓度比进行无缝连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含卡那霉素的LB固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒pET-yqjF-lyc；
(3)将重组质粒pET-yqjF-lyc、甲羟戊酸途径上游表达载体和甲羟戊酸途径下游表达载体共转化大肠杆菌感受态细胞，于含氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体平板上筛选到的阳性克隆，得到工程菌株XLYC1；
(4)将工程菌株XLYC1于含氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，过夜培养活化，再转接至M9培养基中培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG诱导后，最终获得生物传感器。
进一步的，所述番茄红素操纵子lyc基因来源于草生欧文氏菌Pantoeaagglomerans。
进一步的，所述番茄红素操纵子lyc基因具有下列核苷酸序列之一：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的，且能够合成番茄红素的核苷酸序列。
进一步的，所述启动子yqjF基因来源于大肠杆菌Escherichia coli。
进一步的，所述启动子yqjF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述甲羟戊酸途径上游表达载体能够外源表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS。
进一步的，所述甲羟戊酸途径下游表达载体能够外源表达甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII。
本发明还提供了所述的利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法中获得的生物感应器。
本发明还提供了所述的生物感应器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。
进一步的，所述生物感应器的使用方法为：将生物感应器培养活化后，加入待测样品后进行共培养，肉眼观察培养液颜色，红色越明显则待测样品中爆炸物分子的浓度越高。
进一步的，所述可视化检测包括锥形瓶检测和厌氧管检测。
进一步的，所述爆炸物分子为DNT。
进一步的，所述生物感应器能够感应不同浓度的爆炸物分子，从而合成不同产量的番茄红素，根据番茄红素的产量肉眼观察颜色的变化达到可视化检测爆炸物分子的目的。
进一步的，所述生物感应器能够将爆炸物分子浓度与番茄红素产量进行偶联。
本发明还提供了所述的产番茄红素的生物感应器在用于制备提高爆炸物分子检测可视度的生物制剂中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
1、本发明将含有番茄红素操纵子的报告质粒作为基础质粒，通过连接不同的启动子，得到的重组质粒后，再与甲羟戊酸途径的上下游表达载体共转染得到一种能够感应爆炸物分子的生物感应器，该生物感应器能够感应不同浓度的爆炸物分子，从而生成不同浓度的番茄红素，进而只需通过肉眼观察红色的强烈程度即可达到检测爆炸物分子的目的，使用方便、简单。
2、合成番茄红素的过程中，底物DMAPP和IPP可由甲羟戊酸(MVA)代谢途径和4-磷酸甲基赤藓糖醇(MEP)代谢途径合成。在大肠杆菌中，利用其本身存在的MEP代谢途径，同时外源导入MVA途径，可以提高底物DMAPP和IPP的合成效率，从而提高番茄红素在大肠杆菌细胞中的合成效率，更有利于番茄红素达到肉眼观察的程度。
3、本发明将合成番茄红素的操纵子作为报告元件，与感应特定化合物的感应元件进行连接，构建的可感应爆炸物分子的产番茄红素的生物传感器，获得可视化生物感应系统，可以实现对爆炸物的可视化检测，且该检测方法可直接通过肉眼观察结果，方便快捷、在爆炸物检测中安全性高，因此本发明的产番茄红素的生物感应器具有很大的应用前景。
附图说明
图1为构建的载体pET-lyc的质粒图谱。
图2为琼脂糖凝胶电泳检测pET-lyc片段(A)、yqjF片段(B)和菌落PCR验证(C)。
图3为构建的载体pET-yqjF-lyc的质粒图谱。
图4为XLYC1重组菌株在锥形瓶诱导结果，左侧为IPTG诱导结果；右侧为DNT处理结果。
图5为XLYC1重组菌株在厌氧管诱导结果，从左至右分别为0、10、25、50mg/L DNT处理结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
实施例1：基因的获得和载体的构建
1、基因的获得
来自于草生欧文氏菌(Pantoea agglomerans)的番茄红素操纵子(AddgeneNO.53270)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由金唯智公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-lyc载体。
来自于大肠杆菌(Escherichia coli)的启动子yqjF(GenBank登陆号为AAC76136.1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由金唯智公司化学合成至pUC-57载体上，获得pUC-yqjF载体。
2、pET-lyc表达载体的构建
以pUC-lyc为模版，引物crtI-pET-F和引物crtE-pET-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增lyc片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure BDA0002949511050000051
PCR程序为：95℃ 3min；30循环×(95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 3min)；72℃ 5min；16℃ ∞。
引物序列如下所示：
crtI-pET-F：
5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCCTAAACGGGACGCTGCCAAAGACC-3’(SEQ ID NO.3)；
crtE-pET-R：
5’-TGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGTGAGTGGCAGTAAAGCGGG-3’(SEQ ID NO.4)。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(Vazyme，货号DC301-01)进行胶回收纯化。
利用限制性内切酶1 EcoR I(TaKaRa，货号1611)和限制性内切酶2 Hind III(TaKaRa，货号1615)同时双酶切pET28a质粒(Novagen，货号69864-3)和PCR产物，其酶切体系为：
Figure BDA0002949511050000061
酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。
利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：
Figure BDA0002949511050000062
连接体系置于22℃孵育90min。连接产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pET-lyc(图1)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
3、pET-yqjF-lyc表达载体的构建
以pET-lyc为模版，引物pET-lyc-F和引物pET-lyc-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增载体片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure BDA0002949511050000063
PCR程序为：30循环×(98℃ 10s，60℃ 15s，68℃ 1min30s)；16℃ ∞。
引物序列如下所示：
pET-lyc-F：5’-GATCGAGATCTCGATCCTCTACG-3’(SEQ ID NO.5)；
pET-lyc-R：5’-CGGATAACAATTCCCCTCTAGAAAT-3’(SEQ ID NO.6)。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(Vazyme，货号DC301-01)进行胶回收纯化(图2A)。
以pUC-yqjF为模版，引物yqjF-1-F和引物yqjF-1-R，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增pTrc-lyc片段，其PCR扩增体系如下所示：
Figure BDA0002949511050000071
PCR程序为：95℃ 3min；30循环×(95℃ 15s，58℃ 15s，72℃ 20s)；72℃5min；16℃∞。
引物序列如下所示：
yqjF-2-F：
5’-AGAGGATCGAGATCTCGATCCGGTTTTGGCGTATGGAGCG-3’(SEQ ID NO.7)；
yqjF-2-R：
5’-TAGAGGGGAATTGTTATCCGGCCACTCAGGCTGCTGATTG-3’(SEQ ID NO.8)。
PCR产物利用胶回收纯化试剂盒(Vazyme，货号DC301-01)进行胶回收纯化(图2B)。
利用2×Clon Exprrss Mix(Vazyme，货号C115)通过无缝克隆的方法将两个PCR产物进行连接，其体系如下所示：
Figure BDA0002949511050000072
Figure BDA0002949511050000081
体系置于50℃孵育30min。产物转化E.coli DH5α感受态，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆(图2C)，从阳性克隆中提取重组质粒pET-yqjF-lyc(图3)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
实施例2：XLYC1重组菌株的构建
将pET-yqjF-lyc质粒、pACYC-MvaE-MvaS-GPPS质粒(引用自Yang J，Nie Q，Ren M，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis ofalpha-pinene.Biotechnology For Biofuels.2013，6：60.)和pTrc-low质粒(引用自YangJ，Xian M，Su S，et a1.Enhancing production of bio-isoprene using hybrid MVApathway and isoprene synthase in E.coli.PLoS One.2012；7：e33509.)共同转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布到含34mg/L氯霉素、100mg/L氨苄青霉素和30mg/L卡那霉素的LB固体平板上，获得阳性克隆，由此获得含有载体pET-yqjF-lyc、pACYC-MvaE-MvaS-GPPS质粒和ptrc-low质粒的工程菌株XLYC1。
实施例3：可视化检测爆炸物分子的应用
锥形瓶检测：挑取实施例2获得的工程大肠杆菌XLYC1单菌落于10mL含有34mg/L氯霉素、100mg/L氨苄青霉素和30mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床过夜培养活化；再转接至100mL M9培养基中进行扩大培养，培养至OD600为0.6-0.8，加入0.5mMisopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)诱导，阳性对照加50mg/L的DNT，30℃摇床培养，拍照。
厌氧管检测：挑取实施例2获得的工程大肠杆菌XLYC1单菌落于10mL含有34mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素和30mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床过夜培养活化，再转接至2mL M9培养基，培养至OD600为0.6-0.8，各加1μL IPTG，分别加0μL(0mg/L)、2μL(10mg/L)、5μL(25mg/L)、10μL(50mg/L)DNT，30℃摇床中培养，拍照。
结果如图4表明，与IPTG诱导组相比，DNT组的培养液红色更明显，且随着时间的增长，红色更加明显；图5显示DNT浓度高组的培养液红色较浓度低组更明显。说明本发明构建的XLYC1重组菌株作为一种感应爆炸物分子的生物传感器，能够感应DNT而产生肉眼可见的番茄红素，而且DNT浓度越高，番茄红素产量越高，红色越明显，结果表明这种产番茄红素的生物传感器检测爆炸物分子的效果非常显著。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
青岛海军食品与营养创新研究院（青岛特种食品研究院）
<120> 一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法及其相应生物感应器和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4590
<212> DNA
<213> 草生欧文氏菌(Pantoea agglomerans)
<400> 1
atggtgagtg gcagtaaagc gggcgtttcg cctcatcgcg aaatagaagt aatgagacaa 60
tccattgacg atcacctggc tggcctgtta cctgaaaccg acagccagga tatcgtcagc 120
cttgcgatgc gtgaaggcgt catggcaccc ggtaaacgga tccgtccgct gctgatgctg 180
ctggccgccc gcgacctccg ctaccagggc agtatgccta cgctgctcga tctcgcctgc 240
gccgttgaac tgacccatac cgcgtcgctg atgctcgacg acatgccctg catggacaac 300
gccgagctgc gccgcggtca gcccactacc cacaaaaaat ttggtgagag cgtggcgatc 360
cttgcctccg ttgggctgct ctctaaagcc tttggtctga tcgccgccac cggcgatctg 420
ccgggggaga ggcgtgccca ggcggtcaac gagctctcta ccgccgtggg cgtgcagggc 480
ctggtactgg ggcagtttcg cgatcttaac gatgccgccc tcgaccgtac ccctgacgct 540
atcctcagca ccaaccacct caagaccggc attctgttca gcgcgatgct gcagatcgtc 600
gccattgctt ccgcctcgtc gccgagcacg cgagagacgc tgcacgcctt cgccctcgac 660
ttcggccagg cgtttcaact gctggacgat ctgcgtgacg atcacccgga aaccggtaaa 720
gatcgcaata aggacgcggg aaaatcgacg ctggtcaacc ggctgggcgc agacgcggcc 780
cggcaaaagc tgcgcgagca tattgattcc gccgacaaac acctcacttt tgcctgtccg 840
cagggcggcg ccatccgaca gtttatgcat ctgtggtttg gccatcacct tgccgactgg 900
tcaccggtca tgaaaatcgc ctgataccgc ccttttgggt tcaagcagta cataacgatg 960
gaaccacatt acaggagtag tgatgaatga aggacgagcg ccttgttcag cgtaagaacg 1020
atcatctgga tatcgttctc gacccccgtc gcgccgtaac tcaggctagc gcaggttttg 1080
agcgctggcg ctttacccac tgcgccctgc cagagctgaa ttttagcgac atcacgctgg 1140
aaaccacctt cctgaatcgg cagctacagg ctccgctgct gatcagctcc atgaccggcg 1200
gcgttgagcg ctcgcgccat atcaaccgcc acctcgccga ggcggcgcag gtgctaaaaa 1260
ttgcgatggg ggtgggctcc cagcgcgtcg ccattgagag cgacgcgggc ttagggctgg 1320
ataaaaccct gcggcagctg gctccggacg tgccgctgct ggcgaacctc ggcgcggcgc 1380
agctgaccgg cagaaaaggt attgattacg cccgacgggc cgtggagatg atcgaggcgg 1440
atgcgctgat tgtgcaccta aacccgctgc aggaggcgct acagcccggc ggcgatcgcg 1500
actggcgcgg acggctggcg gctattgaaa ctctggtccg cgagctgccc gttccgctgg 1560
tggtgaaaga ggtgggagcc ggtatctccc gaaccgtggc cgggcagctg atcgatgccg 1620
gcgttaccgt gattgacgtc gcgggcgcgg gcggcaccag ctgggccgcc gttgaaggcg 1680
agcgggcggc caccgagcag cagcgcagcg tggccaacgt ctttgccgac tgggggatcc 1740
ccaccgctga ggcgctggtt gacattgccg aggcctggcc gcagatgccc cttattgcct 1800
cgggaatgcg ggctgggcta tttcacccta ccactggcta ttcgctgccg ctggcggtgg 1860
cccttgccga cgcgattgcc gacagcccgc ggctgggcag cgttccgctc tatcagctca 1920
cccggcagtt tgccgaacgc cactggcgca ggcagggatt cttccgcctg ctgaaccgga 1980
tgcttttcct ggccgggcgc gaggagaacc gctggcgggt gatgcagcgc ttttatgggc 2040
tgccggagcc caccgtagag cgcttttacg ccggtcggct ctctctcttt gataaggccc 2100
gcattttgac gggcaagcca ccggttccgc tgggcgaagc ctggcgggcg gcgctgaacc 2160
attttcctga cagacgagat aaaggatgaa aaaaaccgtt gtgattggcg caggctttgg 2220
tggcctggcg ctggcgattc gcctgcaggc ggcagggatc ccaaccgtac tgctggagca 2280
gcgggacaag cccggcggtc gggcctacgt ctggcatgac cagggcttta cctttgacgc 2340
cgggccgacg gtgatcaccg atcctaccgc gcttgaggcg ctgttcaccc tggccggcag 2400
gcgcatggag gattacgtca ggctgctgcc ggtaaaaccc ttctaccgac tctgctggga 2460
gtccgggaag accctcgact atgctaacga cagcgccgag cttgaggcgc agattaccca 2520
gttcaacccc cgcgacgtcg agggctaccg gcgctttctg gcttactccc aggcggtatt 2580
ccaggaggga tatttgcgcc tcggcagcgt gccgttcctc tcttttcgcg acatgctgcg 2640
cgccgggccg cagctgctta agctccaggc gtggcagagc gtctaccagt cggtttcgcg 2700
ctttattgag gatgagcatc tgcggcaggc cttctcgttc cactccctgc tggtaggcgg 2760
caaccccttc accacctcgt ccatctacac cctgatccac gcccttgagc gggagtgggg 2820
ggtctggttc cctgagggcg gcaccggggc gctggtgaac ggcatggtga agctgtttac 2880
cgatctgggc ggggagatcg aactcaacgc ccgggtcgaa gagctggtgg tggccgataa 2940
ccgcgtaagc caggtccggc tggcggatgg tcggatcttt gacaccgacg ccgtagcctc 3000
gaacgctgac gtggtgaaca cctataaaaa gctgctcggc caccatccgg tggggcagaa 3060
gcgggcggca gcgctggagc gcaagagcat gagcaactcg ctgtttgtgc tctacttcgg 3120
cctgaaccag cctcattccc agctggcgca ccataccatc tgttttggtc cccgctaccg 3180
ggagctgatc gacgagatct ttaccggcag cgcgctggcg gatgacttct cgctctacct 3240
gcactcgccc tgcgtgaccg atccctcgct cgcgcctccc ggctgcgcca gcttctacgt 3300
gctggccccg gtgccgcatc ttggcaacgc gccgctggac tgggcgcagg aggggccgaa 3360
gctgcgcgac cgcatctttg actaccttga agagcgctat atgcccggcc tgcgtagcca 3420
gctggtgacc cagcggatct ttaccccggc agacttccac gacacgctgg atgcgcatct 3480
gggatcggcc ttctccatcg agccgctgct gacccaaagc gcctggttcc gcccgcacaa 3540
ccgcgacagc gacattgcca acctctacct ggtgggcgca ggtactcacc ctggggcggg 3600
cattcctggc gtagtggcct cggcgaaagc caccgccagc ctgatgattg aggatctgca 3660
atgagccaac cgccgctgct tgaccacgcc acgcagacca tggccaacgg ctcgaaaagt 3720
tttgccaccg ctgcgaagct gttcgacccg gccacccgcc gtagcgtgct gatgctctac 3780
acctggtgcc gccactgcga tgacgtcatt gacgaccaga cccacggctt cgccagcgag 3840
gccgcggcgg aggaggaggc cacccagcgc ctggcccggc tgcgcacgct gaccctggcg 3900
gcgtttgaag gggccgagat gcaggatccg gccttcgctg cctttcagga ggtggcgctg 3960
acccacggta ttacgccccg catggcgctc gatcacctcg acggctttgc gatggacgtg 4020
gctcagaccc gctatgtcac ctttgaggat acgctgcgct actgctatca cgtggcgggc 4080
gtggtgggtc tgatgatggc cagggtgatg ggcgtgcggg atgagcgggt gctggatcgc 4140
gcctgcgatc tggggctggc cttccagctg acgaatatcg cccgggatat tattgacgat 4200
gcggctattg accgctgcta tctgcccgcc gagtggctgc aggatgccgg gctgaccccg 4260
gagaactatg ccgcgcggga gaatcgggcc gcgctggcgc gggtggcgga gcggcttatt 4320
gatgccgcag agccgtacta catctcctcc caggccgggc tacacgatct gccgccgcgc 4380
tgcgcctggg cgatcgccac cgcccgcagc gtctaccggg agatcggtat taaggtaaaa 4440
gcggcgggag gcagcgcctg ggatcgccgc cagcacacca gcaaaggtga aaaaattgcc 4500
atgctgatgg cggcaccggg gcaggttatt cgggcgaaga cgacgagggt gacgccgcgt 4560
ccggccggtc tttggcagcg tcccgtttag 4590
<210> 2
<211> 240
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
cggttttggc gtatggagcg cctggcatct ggttaaaacg actctcaagc agcaacagct 60
ccgcggttag cttccctctg gccggagcca ttccggcctt atccctcaaa ttttttggag 120
atctttgtca attttccttg ctaacaatca tcattcacca catttatgat tctctccatc 180
gacaacaacg acgccaatac cgcgcctttg cacaaaaaaa caatcagcag cctgagtggc 240
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgagtgcgg ccgcaagctt cctaaacggg acgctgccaa agacc 45
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgggtcgcgg atccgaattc atggtgagtg gcagtaaagc ggg 43
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatcgagatc tcgatcctct acg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggataacaa ttcccctcta gaaat 25
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agaggatcga gatctcgatc cggttttggc gtatggagcg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagaggggaa ttgttatccg gccactcagg ctgctgattg 40

Claims (5)

1.一种利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）扩增番茄红素操纵子lyc基因片段，纯化回收后，与pET28a质粒同时利用EcoR I和Hind III双酶切，然后将质粒酶切片段与lyc基因片段以2:1的质量比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒pET-lyc；
所述番茄红素操纵子lyc基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（2）分别扩增重组质粒pET-lyc和启动子yqjF基因片段，纯化回收后，将重组质粒pET-lyc和启动子yqjF基因片段以1:2的浓度比进行无缝连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒pET-yqjF-lyc；
所述启动子yqjF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（3）将重组质粒pET-yqjF-lyc、甲羟戊酸途径上游表达载体和甲羟戊酸途径下游表达载体共转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB固体平板上筛选到的阳性克隆，得到工程菌株XLYC1；
所述甲羟戊酸途径上游表达载体能够外源表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS；
所述甲羟戊酸途径下游表达载体能够外源表达甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII；
（4）将工程菌株XLYC1于含氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中培养活化，再转接至M9培养基中培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG诱导后，得到生物感应 器。
2.权利要求1所述的利用番茄红素操纵子合成生物感应器的制备方法中获得的生物感应器。
3.权利要求2所述的生物感应器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的生物感应器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用，其特征在于，所述生物感应器的使用方法为：将生物感应器培养活化后，加入待测样品后进行共培养，肉眼观察培养液颜色，红色越明显则待测样品中爆炸物分子的浓度越高。
5.权利要求2所述的生物感应器在用于制备提高爆炸物分子检测可视度的生物制剂中的应用。
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