JP6436778B2

JP6436778B2 - アルコール及びその誘導体のバイオテクノロジーによる生産

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Publication number: JP6436778B2
Application number: JP2014547874A
Authority: JP
Inventors: トーマス　ハース; ハーストーマス; トゥムオリヴァー; クリストフプフェファーヤン; エンゲルフィリプ; ゲーリングクリスティアン; ペターマークス
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2018-12-12
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: EP2794850A1; EP2607479A1; BR112014015155A2; CN109797127A; US20150275245A1; WO2013092426A1; EP2794850B1; BR112014015155A8; CN103998597A; US20210024967A1; US11421254B2; DK2794850T3; JP2015502163A

Description

本発明は、低減された脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物、本発明の細胞を含む水溶液とアルキルとを接触させることを含む、アルキルの酸化方法に関する。

バイオマスなどの再生可能資源に基づくバルク及びファインケミカルの工業生産は様々な欠点を有する。そのうちの１つは、大容量の水性媒体から当該生成物を抽出する必要性であり、更なる下流処理のために生成物を濃縮するだけでなく、典型的には生細胞を含む水性媒体におけるその濃度を制限することも必要とされる手順である。かかる細胞は、非常に強力であるが、過酷な条件、例えば、高温、極端なｐＨ値、有害な溶媒、生成物等の存在に曝すことができない敏感な触媒であり、あるいはそれらが溶解して、それらの触媒活性が失われ、細胞破片、代謝物質及び高分子が放出されて、これが求められている生成物を汚染するか、更には劣化させる作用をし得る可能性がある。

当該生成物の抽出のために、水性媒体を、典型的には、比較的少量の水非混和性有機溶媒と接触させる。その結果、十分に高い程度の疎水性を有する生成物が水性培養液から放出されて、水非混和性溶媒中に蓄積する。生成物は、その後、水非混和性溶媒と適合する更なる合成工程に供されるか、又は例えば、蒸留又は結晶化によって精製され得る。

化合物が水非混和性有機溶媒を用いて水相から抽出され得るかどうかは、その物理化学特性に依存する。無置換の炭素鎖に富む又は全て該炭素鎖からなる化合物は溶媒中に入りやすいが、ヘテロ原子又は更には電荷を含む官能基を有する化合物は水相中に広がることが予想されるべきである。

平衡状態に到達した液体二相系における化合物の相対的な分布は、ネルンスト分配法則を用いて記述され得る：
α＝ｃ_{ｐｈａｓｅ１}／ｃ_{ｐｈａｓｅ２}
（式中、ｃ１及びｃ２は、それぞれ、第１及び第２の相における化合物のモル平衡濃度であり、定数ｋは温度依存性の分配係数である）。二相系が水相とオクタノールを含む相を含む場合、化合物の分布特性はＫ_ｏｗ又はＰ値を用いて記載されてもよい：
Ｋ_ｏｗ＝Ｐ＝ｃ_{Ｏｃｔａｎｏｌ}／ｃ_{Ｗａｔｅｒ}

これらの式は、所定の液体二相系中の化合物の分布を記載しているが、これらは分配平衡に達した場合にのみ適用される。純水及び純粋な水非混和性有機溶媒、例えば、水及びヘキサンが混合される場合、２つの異なる相がほぼ瞬時に現れる。しかしながら、生細胞と水非混和性溶媒を含む水性培地を接触させる場合、この状況は非常に異なる。多数の可能な分子間相互作用のために、水非混和性溶剤の分離は、数日間でなければ数時間行われ、その間に、細胞は潜在的に有毒な溶媒との接触に曝される。従って、到達すべき二相状態に要する時間は、化学物質の生物工学的生産の効率的なプロセスを考案すべき場合に最適化されるべきパラメータである。

置換アルカン、例えば、アルコール、アルデヒド、ケトン、カルボン酸及びアミンは、化石炭素源から作られた化合物の転換によって従来から製造されている工業クラスの需要のある典型的な化合物である。再生不可能な化石燃料がますます制限供給される時代に、再生可能な資源、即ち、地質学的時間スケールの点で容易で、速やかに補給可能な材料を用いて出発する、アルカン及びその誘導体を製造するための生物工学的方法にかなりの関心が寄せられている。

アルカンを対応する置換アルカン、特に酸化されたアルカンに転換するための多数の方法が従来技術において報告されている。メタンモノオキシゲナーゼは、第１段階で、メチロサイナストリコスポリウム及びメチロコッカスカプスラタスなどのメタン資化細菌（Methanotroph）によるメタンの分解において、メタンのＣＨ結合への１つの酸素原子のＮＡＤＨ依存性の挿入を触媒してメタノールを形成する。可溶性メタンモノオキシゲナーゼは、典型的には、飽和及び不飽和の直鎖状、分枝鎖状、及び環状の約Ｃ８までの環状炭化水素、並びに芳香族、複素環式、及び塩素化化合物（Merkx M、Kopp DA、Sazinsky MH、Blazyk JL、Mueller J、Lippard SJ (2001)、Angew Chem Int Ed Engl 40:2782-2807; Higgins IJ、Best DJ、Hammond RC. 1980年。メタン資化細菌に関する新たな知見は、生物圏におけるその重要性とその商業的可能性を強調している。Nature 286：561-564）を含む広い基質スペクトルを有する。ヘム含有オキシゲナーゼ、バチルスメガテリウム由来のチトクロームＰ４５０ＢＭ−３を含むチトクロームＰ４５０システムのクラスからの最も顕著なものも、様々な炭素鎖長のアルカンをヒドロキシル化するために分子状酸素を使用し、タンパク質進化に近づいてきた（Koch DJ, Chen, MM, van Beilen, J.B.及びArnold F.H. （2009, Appl. And Environm. Microbiol. 75(2), 337-344）。シュードモナスプチダＧＰｏ１からのアルカンモノオキシゲナーゼなどのルブレドキシン依存性アルカンモノオキシゲナーゼが、中鎖長のアルカンの酸化を触媒すると、アルコールとカルボン酸との混合物が得られる（Grant C、Woodley, J. M、及びBaganz, F (2011年) Enzyme and Microbial Technology 48、480〜486頁）。キシレンモノオキシゲナーゼは、バイオテクノロジー又は合成の手法を用いて、その後に様々な他の置換アルカン、例えば、アミン、カルボン酸、アミド、アルキルハライド、エステル、アルケンに転換され得るアルカンをヒドロキシル化する（Bruce, P. Y. (1998), Organic Chemistry, Sec. Ed., Prentic Hall Inc.）。

アルカンは、単結合によって結合された水素原子及び炭素原子のみからなり、それ自体はヘテロ原子を含む官能基がない。その結果、長い非置換の炭素鎖はもちろん、極性官能基で置換された短いアルカンでも、水非混和性有機溶媒に可溶である。最後に、それらアルカン、例えば、メタノール及びエタノールの多くは、反応性であり且つ生物工学的に関連する微生物の増殖、生存率及び代謝に悪影響を及ぼすことが知られている。従って、このような化合物の製造のための多くの生物工学的方法は、水非混和性溶媒を用いる抽出工程を含む。

従って、本発明の根底にある課題は、水不混和性溶媒の水性媒体からの分離が速やかである、水性媒体と水非混和性溶媒を含む二相系において、アルカンを置換アルカンに変換するための生物工学的方法を提供することである。更に詳細には、本発明の根底にある課題は、２相に分離するのに要する時間に関してその中に溶解した置換アルカンと水非混和性溶媒との分離、所定の時間内の溶媒の分離度、その中に溶解した又はその後の更なるプロセスで得られた生成物の収率及び純度並びに水非混和性溶媒と接触した細胞の生存率及び／又は循環使用可能性を改善することである。

本発明の根底にある別の課題は、かかるプロセスに使用され得る細胞を提供することであり、好ましくは、例えば、一般に酸素消費、生産量当たりの酸素の消費量、成長率、代謝活性及び生存率に関して、水非混和性有機溶媒の存在によって引き起こされるストレスに対してより耐性のある細胞を提供することである。

本発明の根底にある別の課題は、ベースとなるアルカン及びその誘導体及び持続可能な資源の酸化生成物の製造方法を提供することである。

本発明の根底にある別の課題は、酸素の消費が低減される、アルカンを酸化するための生物工学的方法を提供することである。

本発明の根底にある課題は、添付の請求項の主題によって解決される。

本発明の根底にある課題は、第１の態様において、低減された脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物によって解決される。

第１の態様の第１の実施態様では、アルカンオキシダーゼは、ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ、チトクロームＰ４５０アルカンオキシダーゼ、キシレンモノオキシゲナーゼ、メタンモノオキシゲナーゼ及びその変異体を含む群から選択される。

同様に本発明の第１の態様の第１の実施態様である、第２の実施態様では、脂肪酸の分解能は、脂肪酸インポータ、脂肪酸ＣｏＡリガーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼを含む群からの酵素をコードする遺伝子の欠失によって低下する。

同様に本発明の第１の態様の第１及び第２の実施態様である、第３の実施態様では、微生物は、原核細胞又は下等真核細胞、好ましくは細菌細胞、最も好ましくは大腸菌（E. coli）である。

同様に本発明の第１の態様の第１〜第３の実施態様の実施態様である、第４の実施態様では、微生物は更に組み換えアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。

同様に本発明の第１の態様の第１〜第４の実施態様の実施態様である、第５の実施態様では、微生物は更に組換えトランスアミナーゼを発現する。

同様に本発明の第１の態様の第１〜第５の実施態様の実施態様である、第６の実施態様では、微生物は、組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはアラニンデヒドロゲナーゼを発現する。

本発明の根底にある課題は、第２の態様において、ａ）本発明の第１の態様及びそれらの実施態様のいずれかによる細胞を含む水溶液とアルキルとを接触させることを含む、アルキルの酸化方法によって解決される。

本発明の第２の態様の第１の実施態様では、この課題は、ｂ）工程ａ）からの水溶液と水非混和性有機溶媒とを接触させることを更に含む方法によって解決される。

同様に第１の実施態様の実施態様である本発明の第２の態様の第２の実施態様では、アルキル酸化、及び好ましくは水溶液からの本発明の細胞の除去が完了した後に抽出が行われる。

本発明の根底にある課題は、第３の態様において、第１の態様及びアルキルを酸化するためのその実施態様のいずれかによる微生物の使用によって解決される。

第２又は第３の態様の更なる実施態様又はそれらの実施態様のいずれかにおいて、アルキルは式Ｈ−（ＣＨ_２）_ｘ−Ｒ（式中、ｘは１〜３０であり、且つＲは任意の化学基、好ましくは−ＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ^１、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−ＯＰＯ_３Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ及び−Ｈを含む群から選択されるものであり、好ましくはＨであり、ここでＲ^１は非置換の直鎖状アルキル、好ましくはメチル及びエチルである）によって表される化合物である。

第２又は第３の態様の更なる実施態様又はそれらの実施態様のいずれかにおいて、アルキルは直鎖状アルカン、好ましくは室温で気体であるものである。

本発明の第２又は第３の態様の更なる実施態様及びそれらの実施態様のいずれかにおいて、水非混和性有機溶媒は水非混和性脂肪酸又は脂肪酸エステルである。

本発明の発明者らは、驚くことに、アルカン又はアルキル酸化を触媒することが可能な微生物を含む水性培地からの水非混和性有機溶媒の分離が、対応する野生型の微生物ではなく、低下した脂肪酸分解能を有する微生物を使用する場合に、より迅速で且つ完全であることを発見した。

更に、本発明者らは、低下した脂肪酸分解能を有する微生物は、それぞれの野生型微生物よりも少ない酸素を消費するが、生成物の収率は同等か又はより改善されることを発見した。

いかなる理論にも縛られるわけではないが、本発明者らは、細胞の脂肪酸分解能の低下が、洗浄剤として作用し且つ水非混和性有機溶媒の分離を妨げる、当該細胞の細胞内に又はその表面のいずれかに配置された、まだ同定されていない少なくとも１種の代謝物の濃度の低下につながることを理論づけた。

本発明はアルキルの酸化方法を検討する。アルキルは、アルコール、アルデヒド、ケトン、及びカルボン酸を含む群から選択される１種以上の化合物に酸化され得る。かかる化合物は、本発明の方法の主要な生成物であり得るが、これは更に処理されてもよい。例えば、本方法は、アルキルのカルボン酸への酸化だけでなく、かかるカルボン酸のアミドへの転換も含み得る。

本発明は、好ましくはアルコールなどの酸化アルキルへのアルキルの転換のために、低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物を中心としている。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「アルカンオキシダーゼ」との用語は、アルカン及び／又はアルキルを酸化することが可能な酵素を意味する。様々なアルカンオキシダーゼが、文献、例えば、basidiomycete heme-thiolate peroxidases (Gutierrez, A., Babot, E. D., Ullrich, R., Hofrichter, M., Martinez, A. T., del Rio, J. C. (2011年)、ArcH. Biochem. Biophys. 514 (1-2), 33-43頁)、the alkane hydroxylase system of Gardonia sp. strain SoCg (Lo Piccolo, L, De Pasquale, C, Fodale, R., Puglia, A. M., Quatrini, P. (2011年)、Appl. Environm. Microbiol. 77 (4), 1204-12013; Alkane oxidases from Alcanivorax (Grant, C, Woodley, J. M., Baganz, F. (2011年) Enzyme and Microbial Technology, 480-486頁)及びCytochrom P450 systems (Koch, D. J., Chen, M. M., van Beilen, J. B., 及びArnold F. H. (2009年) Appl. and Env. Microbiology, 337-344頁)に記載されている。特に好ましい実施態様では、アルカンオキシダーゼはａｌｋＢ型のアルカンオキシダーゼである。ＡｌｋＢは、２つの補助ポリペプチド、ＡｌｋＧ及びＡｌｋＴに依存する、シュードモナスプチダＡｌｋＢＧＴ系からの酸化還元酵素である。ＡｌｋＴは、ＮＡＤＨからＡｌｋＧに電子を移動させるＦＡＤ依存性ルブレドキシン還元酵素である。ＡｌｋＧは、ＡｌｋＢへの直接的な電子供与体として機能する鉄含有酸化還元タンパク質である、ルブレドキシンである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「ａｌｋＢ型アルカンオキシダーゼ」との用語は、シュードモナスプチダＧｐｏ１からのＡｌｋＢ（アクセスコード：ＣＡＢ５４０５０．１、アプリケーションで使用される任意のアクセスコードは、ＮＣＢＩによって管理されるＧｅｎｂａｎｋデータベースからの各配列を意味し、その際、言及されたリリースは、２０１１年１２月１５日に１つのオンラインにある）又はその変異体を意味する。好ましい実施態様において、「アルキル」との用語は、Ｒが任意の化学基であり、ｘが１、２、３、好ましくは８以上、更に好ましくは１１以上である、式Ｈ−（ＣＨ_２）_ｘ−Ｒによって表される置換基、又はかかる置換基を有する化合物を意味する。

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ」との用語は、ルブレドキシンを介して電子を受けるアルカンをその基質として認識するオキシドレダクターゼを意味し、更に好ましい実施態様では、これは、電子をアルカンオキシダーゼに移動させる２つのαらせんと２〜３つのβ鎖で折りたたまれたα＋βクラスを有する鉄−硫黄タンパク質であり、最も好ましい実施態様では、シュードモナスプチダ又はそれらの変異体からのＡｌｋＧである。例としてはシュードモナスプチダからのＡｌｋＧが挙げられる。

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「シトクロムＰ４５０酵素」との用語は、そのＣＯ結合形で４５０ｎｍで吸収帯を有し且つ好ましくはアルカンを酸化することが可能なＰ４５０型シトクロムを有する酸化還元酵素を意味する。例としては、Bacillus megaterium (Koch, D. J., Chen, M. M., van Beilen, J. B., 及びArnold, F. H. (2009年) Appl. And Environm. Microbiol. 75(2), 337〜344頁)からのシトクロムＰ４５０ＢＭ−３が挙げられる。

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「キシレンモノオキシゲナーゼ」との用語はヒスチジンに富む活性部分を有し且つ好ましくはアルカンを酸化することが可能な、膜スパニング、非ヘム二鉄酵素酸化還元酵素を意味する。例としては、シュードモナスプチダからのＸｙｌＭが挙げられる（Austin, R. N., Buzzi, K., Kim, E., Zylstra, G. J., 及びGroves, J. T. (2003年) J. Biol. Inorg. Chem. 8, 733〜740頁）。

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「メタンモノオキシゲナーゼ」との用語は、酸素原子によって架橋した二鉄中心（Ｆｅ−Ｏ−Ｆｅ）を含み且つ３つのタンパク質成分、ヒドロキシラーゼ、βユニット、及びメタン資化性細菌からのレダクターゼを含む可溶性メタンモノオキシゲナーゼであるか又は粒状のメタンモノオキシゲナーゼのいずれかである酸化還元酵素、銅含有活性部分を有する、メタン細菌における膜タンパク質を意味する。可溶性及び粒子状のメタンモノオキシゲナーゼの例としては、それぞれ、メチロサイナストリコスポリウムＯＢ３ｂからの溶解性メタンモノオキシゲナーゼ（A C Rosenzweig, Frederick, C. A., Lippard, S. J., Nordlung, P. (1993年) Nature, 366, 537〜543頁）及びメチロコッカスカプスラツスからの粒子状メタンモノオキシゲナーゼ（Bath）（Nguyen, H. H. T., Elliot, S. J., Yip, J. H. K, 及びChan, S. I. (1998年)、J. Biol. Chem. 273, 7957〜7966頁）が挙げられる。

本発明の教示は、本出願において、例えば、名称又は受託番号によって明確に、又は暗示的に示される正確なアミノ酸又は核酸配列を有する生物学的高分子を用いて実施されるだけでなく、かかる配列の変異体を用いて実施されてもよい。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「変異体」との用語は、アミノ酸又は核酸配列を含み、これらはそれぞれ、参照のアミノ酸又は核酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７、９８％、又は９９％同一であり、その際、好ましくは、機能、例えば、タンパク質の触媒作用にとって不可欠なもの以外のアミノ酸、又は分子の折りたたみ又は構造が挿入によって欠失され、置換され又は置き換えられるか、又は必須のアミノ酸は保守的な方法で置き換えられる。最新技術は、２つの所与の核酸又はアミノ酸配列を整列させ且つ同一性の程度を計算するために使用され得るアルゴリズムを含む。Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第3版、Thompsonら、Nucleic Acids Research 22, 4637〜4680頁、1994年、及びKatohら、Genome Information, 16(1), 22-33, 2005年を参照されたい。「変異体」との用語は、「相同体」との用語に同義的に且つ交換可能に使用される。かかる変異体は、かかる巨大分子又はそれらの変異体を含むアミノ酸又は核酸配列並びに融合において欠失、挿入又は置換を導入することによって調製され得る。好ましい実施態様では、アミノ酸配列に関する、「変異体」との用語は、好ましくは、上記の配列の同一性に加えて、それぞれの基準に対して１つ以上の保存的なアミノ酸の変更を含むアミノ酸配列又は野生型配列を含むか又は１つ以上の保存的なアミノ酸の変更を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好ましい実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列の「変異体」との用語は、好ましくは上記の配列の同一性に加えて、それぞれ、アミノ酸配列又は核酸配列の任意の活性部分及び／又はフラグメント、又はアミノ酸配列の活性部分及び／又はフラグメントをコードする任意の核酸配列を含む。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「活性部分」との用語は、アミノ酸配列又は核酸配列を意味し、これらは、それぞれ、完全長のアミノ酸配列よりも短いか又は完全長のアミノ酸配列よりも短くコードし、その際、アミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、それぞれ、それらの必須の生物学的活性の少なくとも一部を保持する。例えば、プロテアーゼの活性部分及び／又はフラグメントは、ポリペプチドにおけるペプチド結合を加水分解することが可能である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「それらの必須の生物学的活性の少なくとも一部を保持する」との用語は、当該アミノ酸配列が、背景の活性を超える及びそれとは異なる生物学的活性及び前記活性を特徴とする速度パラメータ、更に詳細にはｋ_ｃａｔ及びＫ_Ｍを有し、特定の基質に関する基準分子によって示される値の、好ましくは３桁以内の、更に好ましくは２桁以内、最も好ましくは１桁以内であることを意味する。好ましい実施態様では、核酸の「変異体」との用語は、その相補鎖が好ましくは基準又は野生型の核酸に対して、厳格な条件下でハイブリダイズする核酸を含む。ハイブリダイゼーション反応の厳格さは、当業者によって容易に決定され、これは一般にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖に再アニールするする変性ＤＮＡの能力に依存し、これはその融点よりも低い環境に存在する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高い程、使用され得る相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は反応条件をより厳しくし、より低い温度はそれほど厳しくしない傾向があるということになる。ハイブリダイゼーション反応の厳格さの更なる詳細及び説明については、F. M. Ausubel (1995年), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。更には、当業者は、ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ配列をどのように同定するかについて、マニュアル「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization」、Boehringer Mannheim GmbH、マンハイム、ドイツ、1993年及びLieblら(International Journal of Systematic Bacteriology 41 : 255〜260頁(1991年)に示された指示に従ってよい。好ましい実施態様では、厳格な条件は、任意のハイブリダイゼーションに適用される、即ち、ハイブリダイゼーションは、プローブが標的配列に７０％以上同一である場合のみ起こる。標的配列よりも低い程度の同一性を有するプローブは、ハイブリダイズされ得るが、かかるハイブリッドは不安定であり、且つ選好性を高めるために、温度が約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃であると同時に、塩の濃度を２×ＳＳＣまで低下させるか、又は任意にその後０．５×ＳＳＣまで低下させる、厳格な条件下にて洗浄工程で除去される。特に好ましい実施態様では、温度は約６４℃〜６８℃又は約６６℃〜６８℃である。塩の濃度を０．２×ＳＳＣ又は更に０．１×ＳＳＣに調整することが可能である。参照又は野生型配列の少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％に対してある程度の同一性を有するポリヌクレオチド断片が単離され得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、核酸配列の「相同体」との用語は、遺伝子コードの縮重に従って、参照核酸配列と同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を意味する。

本発明の教示は、広範囲の微生物を用いて行われ得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「微生物」との用語は、細菌、古細菌、真菌、藻類等を含む任意の恒久的単細胞微生物を指す。好ましい実施態様では、微生物は、細菌微生物、更に好ましくはシュードモナス、コリネバクテリウム及び大腸菌（Escherichia coli）を含む群からのもの、最も好ましくは大腸菌である。別の好ましい実施態様では、微生物は、下等真核生物、更に好ましくはサッカロミセス、カンジダ、ピキア、シゾサッカロミセス及びヤロウイアを含む群からの真菌、最も好ましくはサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerivisiae）である。本出願を通して、「微生物」との用語は、「細胞」との用語の同意語として及び同義的使用されている。微生物は、単離された微生物、換言すれば、微生物の単一菌株の純粋な培養物であってよいか、又は少なくとも２種の菌株の混合物を含み得る。バイオテクノロジー関連の微生物は、例えば、アメリカ培養コレクション(ＡＴＣＣ)又はドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）から市販されている。微生物を維持し且つ修正するための粒子は、先行技術、例えば、Sambroke/Fridge/Maniadis (1989年): Molecular cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, 第２版, Fuchs/Schlegel (2007年), Allgemeine Mikrobiologie, 2008年, Georg Thieme Verlagから入手可能である。

本発明の微生物は、低減された脂肪酸分解能を有している。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「低下した脂肪酸分解能を有する」との用語は、それぞれの微生物が、通常の脂肪酸分解能を有する同等の微生物よりも遅い速度で、脂肪酸、好ましくは環境から取り込まれるものを分解することを意味する。好ましい実施態様では、かかる微生物の脂肪酸分解は、β−酸化経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失、阻害又は不活性化のために低くなる。本発明の好ましい実施態様では、β−酸化経路に関与する少なくとも１種の酵素は、選好性の増大のために、それぞれの野生型微生物における同等の条件下で同じ酵素の活性に対して、５％、１０％、２０％、４０、５０％、７５％、９０％又は９９％の活性が失われる。当業者は、Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989年)に記載されるように、例えば、放射能に細胞を曝した後に得られた突然変異体の蓄積又はスクリーニング、点突然変異の部位特異的導入又は活性酵素のためにコードする染色体中組込み遺伝子のノックアウトによって、酵素をコードする遺伝子を削除するか又は微生物中のかかる酵素の活性を低下させるために使用され得る様々な技術に精通している。また、転写抑制因子ＦａｄＲは、β−酸化経路に関与する酵素の発現が抑制されるまで過剰に発現され得る(Y Fujita、H Matsuoka、及びK Hirooka (2007年) Mol. Microbiology 66(4), 829〜839頁)。好ましい実施態様において、本願明細書で使用される「遺伝子の削除」との用語は、前記遺伝子をコードする核酸配列が、前記遺伝子によってコードされた活性ポリペプチドの発現が低減されるように修飾されることを意味する。例えば、遺伝子は、ポリペプチドの触媒活性中心をコードする配列を含む配列の一部をインフレーム除去することにより削除され得る。あるいは、リボソーム結合部位は、リボソームがもはや対応するＲＮＡを翻訳しないように変更され得る。更に、当業者は、酵素学の教科書、例えば、A Cornish-Bowden (1995年), Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limited, 1995に記載されるような標準的な試験を用いて生存細胞によって発現される酵素の活性を日常的に測定することが可能である。技術水準は、β−酸化経路に関与する酵素の活性を測定するために特別に設計された様々な試験、例えば、K Kameda & W D Nunn (1981年) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707頁、H Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y Soら(2003年) Biochem. J. 370, 1055-1062頁、S Lobo, G Florova、及びK A Reynolds (2001年) Biochemistry 40 (39), 11955-64頁、X Yu, T Liu, F Zhu, 及びC Khosla (2011年) PNAS、オンラインに発表)を開示している。

微生物中の脂肪酸の分解は、酵素的に触媒される一連の反応により達成される。まず第一に、脂肪酸が取り込まれ、大腸菌の場合、それぞれＦａｄＬ及びＦａｄＤと呼ばれる、脂肪酸ＣｏＡリガーゼ活性を有する少なくとも１つの外膜タンパク質及び１つの内膜関連タンパク質を含むトランスポート／アシル活性化機構を介して細胞膜にわたり転位する。細胞の内部では、分解されるべき脂肪酸は、β−酸化経路の他の反応を触媒する酵素に供される。最初の細胞内の工程は、アシル−ＣｏＡのエノイル−ＣｏＡへのアシル−ＣｏＡ脱水素酵素を介した変換を含み、これは大腸菌の場合、ＦａｄＥと呼ばれる。得られたエノイル−ＣｏＡは、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡを介して、水素化及び酸化を通して、３−ケトアシル−ＣｏＡに転換され、触媒されてエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼになり、これは大腸菌においてＦａｄＢと呼ばれる。最後に、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ、大腸菌におけるＦａｄＡが、３−ケトアシル−ＣｏＡの切断を触媒すると、アセチル−ＣｏＡ及び２つの炭素原子によって短縮された導入アシル−ＣｏＡが得られる。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「低下した脂肪酸分解能を有する微生物」との用語は、脂肪酸を取り込む及び／又は分解する能力が低下した微生物、好ましくは少なくとも８個の炭素鎖を有するものを意味する。微生物の脂肪酸分解能は、様々な方法で低下され得る。好ましい実施態様では、微生物は、その野生型と比較して、低下したβ−酸化経路に関与する酵素の活性を有する。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「β−酸化経路に関与する酵素」との用語は、β−酸化経路を介して、前記脂肪酸の分解の一部として形成された脂肪酸又はその誘導体と直接相互作用する酵素を意味し、一連の反応は、好ましくは脂肪酸又はその誘導体を基質と見なすことによって、脂肪酸のアセチル−ＣｏＡ及び短縮された脂肪酸のＣｏＡエステルへの変換を行い、そしてこれをβ−酸化経路の一部として形成された代謝物に変換する。特に好ましい実施態様では、「β−酸化経路に関与する酵素」との用語は、脂肪酸インポーター、更に具体的には脂肪酸導入機構の要素、例えば、ＦａｄＬ又はその変型及び膜結合脂肪酸ＣｏＡ−リガーゼの成分を含む。例えば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、脂肪酸−ＣｏＡと相互作用し且つ脂肪酸−ＣｏＡエステルをエノイル−ＣｏＡに変換し、これはβ−酸化の一部として形成される代謝物質であるため、β−酸化経路に関与する酵素である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「脂肪導入酸化経路に関与する酵素」との用語は、導入された脂肪酸及びその成分、脂肪酸ＣｏＡ−リガーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及び３−ケト−アシル−ＣｏＡチオラーゼを含む群からの任意のポリペプチドを含む。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「脂肪酸トランスポーター」との用語は、膜の外側から又は外側、即ち、媒体に露出した膜、微生物の膜の外側から脂肪酸を、場合により複数の活性ポリペプチドを含む機構の一部として、細胞の内部に転位することが可能なポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドＦａｄＬ（アクセスコード：ＢＡＡ１６２０５．１）は脂肪酸トランスポーターである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ」との用語は、脂肪酸のＣｏＡエステルへの脂肪酸の変換を触媒することが可能なポリペプチド、即ち、好ましくは前記脂肪酸をβ−酸化経路に導入するために、カルボキシ基の官能基−ＯＨが−Ｓ−ＣｏＡに置き換えられた分子を意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドＦａｄＤ（アクセスコード：ＢＡＡ１５６０９．１）はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」との用語は、好ましくはβ−酸化経路の一部として、アシル−ＣｏＡのエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒することが可能なポリペプチドである。例えば、大腸菌中のポリペプチドＦａｄＥ（アクセスコード：ＢＡＡ７７８９１．２）はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ」との用語は、好ましくはβ−酸化経路の一部として、２，４−ジエノイルＣｏＡの、不飽和脂肪酸からエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒することが可能なポリペプチドである。例えば、大腸菌中のポリペプチドＦａｄＨは２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ」との用語は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをも意味し、水素化及び酸素化を通して、好ましくはβ−酸化経路の一部として、エノイル−ＣｏＡの３−ケトアシル−ＣｏＡへの転換を触媒することが可能なポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドＦａｄＢ（アクセスコード：ＢＡＥ７７４５７．１）はエノイル−ＣｏＡヒドラターゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ」との用語は、好ましくはβ−酸化経路の最終段階として、２つの炭素原子及びアセチル−ＣｏＡによって短縮されたアシルＣｏＡが得られる、切断３−ケトアシル−ＣｏＡの変換を触媒することが可能なポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドＦａｄＡ（アクセスコード：ＡＰ００９０４８．１）はケトアシル−ＣｏＡチオラーゼである。

多くの化合物は、それらがアルキル置換基、例えば、これらに限定されないが、アルカン、アルケン、アルキン、アリール、ヘテロアリール、アルコール、アミン、アルカン酸、アルケン酸、脂質、アミノ酸、飽和又は不飽和及び／又は直鎖状又は分岐鎖状脂肪酸を含む限り、本発明の微生物を用いてアルコールに変換され得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「アルキル」との用語は、式Ｈ−（ＣＨ_２）_ｘ−Ｒ（式中、ｘは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８であるか、又は優先度の順に、少なくとも６、８、１０又は１２であり、且つＲは任意の化学基、好ましくは−ＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ^１（式中、Ｒ^１は非置換の直鎖状アルキル、好ましくはメチル及びエチル、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−ＯＰＯ_３Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ及び−Ｈであり、好ましくはＨである）によって表される化合物である。好ましい実施態様では、アルキルは脂肪酸又はそのエステルである。他の好ましい実施態様では、アルキルは、式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋２によって表されるアルカン、例えば、分枝鎖状アルカン、シクロアルカン及び１つ以上の直鎖状アルキル置換基を有するシクロアルカンであり、且つｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、好ましくは１〜１２、更に好ましくは１〜４である。別の好ましい実施態様では、アルキルは、分枝鎖状アルキルを含む、２５℃で且つ大気圧下でガス状のアルキルである。好ましい実施態様では、アルカンはイソブタンである。

組換えアルカンオキシダーゼに加えて、更なる酵素、好ましくは組換え酵素を有する微生物を使用することが有利であり得る。好ましい実施態様では、微生物は、アルカンオキシダーゼに加えて、野生型又は、好ましくは組み換え、アルコールデヒドロゲナーゼを有する。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「アルコールデヒドロゲナーゼ」との用語は、アルデヒド又はケトンに対応するアルコールの変換を触媒することが可能な酵素を意味する。例としては、バチルスステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（アクセスコードＰ４２３２８）、ロドコッカスルベル（Rhodococcus ruber）（アクセスコードＡＪ４９１３０７．１）、ラルストニアユートロファ（Ralstonia eutropha）（アクセスコードＡＣＢ７８１９１．１）、ラクトバチルスブレビス（Lactobacillus brevis）（アクセスコードＹＰ＿７９５１８３．１）、ラクトバチルスケフィリ（Lactobacillus kefiri）（アクセスコードＡＣＦ９５８３２．１）、パラコッカスパントトロフス（Paracoccus pantotrophus）（アクセスコードＡＣＢ７８１８２．１）及びスフィンゴビウムヤノイクヤエ（Sphingobium yanoikuyae）（アクセスコードＥＵ４２７５２３．１）並びにそれらの変異体からのアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の微生物は、アルカンオキシダーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼの他に、トランスアミナーゼ、好ましくは組換えトランスアミナーゼを有してよく、これはアルキルをアミンに変換することが目的である場合に有利である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「トランスアミナーゼ」との用語は、別のアミノ酸を得るために、α−アミノ基、好ましくはアミノ酸を、供与体から受容体分子、好ましくはα−ケト酸に転移することが可能な酵素を意味する。特に好ましい実施態様では、トランスアミナーゼはω−トランスアミナーゼである。トランスアミナーゼの例としては、クロモバクテリウムビオラセウム（Chromobacterium violaceum）ＡＴＣＣ１２４７２（アクセスコードＮＰ＿９０１６９５）からのトランスアミナーゼが挙げられるが、これに限定されない。

本発明の微生物は、アルカンオキシダーゼの他に、アルコールデヒドロゲナーゼ及びトランスアミナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼを有してよい。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「アラニンデヒドロゲナーゼ」との用語は、アミノ酸、水及びＮＡＤ^＋のケト酸、アンモニア及びＮＡＤＨへの転換を触媒することが可能な酵素を意味する。アミノ酸デヒドロゲナーゼは、アラニンデヒドロゲナーゼ、即ち、Ｌ−アラニン、水及びＮＡＤ^＋のピルビン酸、アンモニア及びＮＡＤＨへの転換を触媒することが可能な酵素であってよい。好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼの例は、枯草菌（アクセスコード：Ｌ２０９１６）、リゾビウムレグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）（アクセスコード：ＣＰ００１６２２）、ビブリオプロテオリチカス（Vibrio proteolytikus）（アクセスコード：ＡＦ０７０７１６）、結核菌（アクセスコード：Ｘ６３０６９）及びエンテロバクターアエロゲネス（アクセスコード：ＡＢ０１３８２１）からのアラニンデヒドロゲナーゼを含む。

本発明の方法は、本発明の細胞を含む水溶液とアルキルとを接触させることを含む。この工程は、アルキルと溶液とを一時的に接触させることを含むだけでなく、実際に、酸化反応及び可能性のある更なる下流の反応を起こすほど十分に長く、例えば、少なくとも１時間、２時間、４時間、５時間、１０時間又は２０時間にわたり、本発明の細胞の存在下でアルキルをインキュベートすることを含んでよい。選択された温度は、本発明の細胞が触媒的に有能及び／又は代謝的に活性な、例えば、本発明の細胞が大腸菌細胞である場合、１０〜４２℃、好ましくは３０〜４０℃、最も好ましくは３２〜３８℃のままでなければならない。

実施態様では、本発明の方法は、工程ａ）の後に又は工程ａ）と同時に、「水非混和性有機溶媒」を用いて工程ａ）からの生成物を接触させることを考慮する。当業者であれば、本発明によって使用され得る多くの水非混和性有機溶媒を知っている。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「水非混和性有機溶媒」との用語は、少なくとも２個の炭素原子を含み且つ水性液相の存在下で、好ましくは２５℃で、明らかに水相から分離された、別の液相を形成しやすい化合物を意味する。分離相は、連続液相又はエマルションであってよい。別の好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「水非混和性」との用語は、水に溶解しない液体化合物の傾向を意味する。最後に、別の好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「水非混和性」との用語は、そのように指定された化合物が、その常用対数が０を超える、好ましくは０．５を超える、更に好ましくは１を超える、最も好ましくは２を超えるｐＨ値（J Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997年）を有する。好ましい水非混和性有機溶媒は、室温で液体の置換された及び直鎖状のアルカン、シクロアルカン、シクロアルケン、アリール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アルコール、ヘテロシクロアルカン、ヘテロシクロアルケン及びヘテロアリールを含む群からの水非混和性溶媒を含むが、これらに限定されない。水非混和性有機溶媒は、２種以上の有機溶媒を含み得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「水非混和性有機溶媒」を用いて生成物を「抽出する」との用語は、水非混和性有機溶媒を含む相に生成物を入り込ませる程度に十分に長く、本発明の細胞を含む水溶液と水非混和性有機溶媒とを接触させることを意味する。その後、水非混和性有機溶媒を含む相は、例えば、蒸留により又はデカンテーションにより、水溶液から分離され得る。化合物が液体又は気体又はどちらでもないかは、好ましくは大気圧下にて２５℃で決定される。

好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒は、脂肪酸又はそのエステルであり、更に好ましい実施態様では、式ＣＨ_３−（ＣＨ_２）_ｘ−ＣＯＯＲ^ｓ（式中、ｘは８、９、１０、２８であり、更に好ましくは１２又は１２を上回り、Ｒ^ｓはＨ又はアルキル、好ましくはメチル又はエチルである）によって表される脂肪酸である。別の好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒は、不飽和脂肪酸、好ましくは炭素鎖の９位に炭素−炭素二重結合を有するもの、更に好ましくは１２個以上の炭素原子を有するものである。最も好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒はオレイン酸である。別の好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒はヘキサン酸である。好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒はラウリン酸メチルエステルである。水非混和性有機溶媒は、これを水溶液から分離することが容易な体積である。好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒の体積は、水溶液と水非混和性有機溶媒の合わせた総体積の２〜９８パーセント、更に好ましくは５〜９５パーセント、更に好ましくは１０〜４０パーセント、最も好ましくは２０〜３０パーセントである。

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「接触させる」との用語は、細胞がアルキルを取り込み且つ代謝することができるように、アルキルと本発明の細胞とを直接接触させることを意味する。例えば、細胞とアルキルは、無機膜などの膜によって分離された異なる区画にあってはならない。アルキルが固体又は可溶性である場合、これは単純に水溶液中で本発明の細胞に添加されてよい。アルキルが気体状である場合、細胞を含む水溶液は前記ガス状アルキルを含むガスによって散布されてよい。

「水溶液」との用語は、代謝活性な及び／又は生存可能な状態で、少なくとも一時的に、本発明の細胞を維持するために使用され得る任意の溶液を含み、必要であれば、任意の追加の基質を含む。当業者であれば、本発明の細胞、例えば、大腸菌の場合、ＬＢ培地を維持するために使用され得る、通常、媒体と呼ばれる、多くの水溶液に精通している。好ましい実施態様では、水溶液は、好気性条件下で維持される。水溶液として最小培地、即ち、複合媒体とは対照的に、代謝的に活性な及び／又は生存可能な状態で細胞を維持するために、必須の最小限のセットの塩及び栄養のみを含む適切な単純組成の媒体を使用することが有利である。例えば、Ｍ９培地は最小培地として使用され得る。酸化されるべきアルキルが限定された水への溶解性を有する場合、Ｔｗｅｅｎ又はＴｒｉｔｏｎなどの洗浄剤が、水溶液に添加されるか又は疎水性の溶媒が酸化されるべきアルキルを溶解するために使用され得る。当業者であれば、種々の水溶液及び有機溶液の調製に精通している。

好ましい実施態様では、工程ｂ）は、アルキル酸化の完了後であって、かつ好ましくは本発明の細胞の水溶液からの除去後に行われる。好ましい実施態様では、アルキル酸化、即ち、本発明の細胞によって触媒されるアルキルの酸化は、以下の要件の少なくとも１つが満たされる場合、完全であるとみなされ得る：ａ）本発明の細胞が代謝的に活性でなくなる、ｂ）基質ターンオーバーが検出できない、ｃ）基質がもはや水溶液中に存在しない、ｄ）生成物の正味量がもはや有意に増加しない、例えば、濃度プラトーに到達したか又は生成物の形成を示すグラフの傾きが２時間を超えてゼロ以下である。細胞は、例えば、遠心分離、濾過又はデカンテーションによって、当業者に公知の多数の方法で水溶液から除去され得る。

本発明は、本発明の更なる特徴、実施態様、態様及び利点が示される、以下の図面及び非限定的な実施例によって更に例示される。

図１は、「ΔＦａｄＥ」とも呼ばれる、ΔＦａｄＥ突然変異株Ｗ３１１０ΔＦａｄＥ［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］（左）及び野生型（ＷＴ）とも呼ばれる菌株Ｗ３１１０［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］（右）（ＦａｄＥである事実を除いて前者の菌株と同一の後者は削除されていない）がＡＬＳＭＥを生成するために使用される場合の異なる相分離挙動を示す。矢印は、変異体が使用される場合の１０分後に見られる有機相と水相との間の中間相を示す。かかる中間相は、野生型株が使用される場合、１０分後に検出されない。図２は、発酵の完了後に培地をファルコンチューブに移したという事実を除いて、図１に関して記載されたのと同じ実験の結果を示す。図３は、図１に関して記載された実験に使用された両方の菌株の酸素移動速度と二酸化炭素移動速度を示す。図４は、図１に関して記載されたのと同じ実験における経時的なＡＬＳＭＥ濃度を示す。

実施例１：ω−アミノ酸ラウリン酸メチルエステル（ＡＬＳＭＥ）の製造のための低下したアシルＣｏＡ−デヒドロゲナーゼ活性を有する細胞を用いる水性媒体からの疎水性相の分離の促進
ラウリン酸メチルエステルの、ω−ヒドロキシラウリン酸を経由するω−アミノラウリン酸（ＡＬＳ）メチルエステルへの転換を、菌株Ｗ３１１０ΔＦａｄＥ［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］及びＷ３１１０［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］を用いて、ＤＡＳＧＩＰからの８つの容器を備える並列発酵システムで行った。

Ｎ．Ｂ．では、これらの２つの菌株は、国際出願ＷＯ２００９／０７７４６１号に一致するオキシドレダクターゼＡｌｋＢ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びトランスアミナーゼを含むｐＢＲ３２２由来のプラスミドを含み、これらは前者がＦａｄＥをコードする遺伝子、β−酸化経路の大腸菌アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの欠損を有することを除いて同一である。

１リットルの反応容器を発酵のために使用した。ｐＨ電極をｐＨ４及びｐＨ７の標準液を用いて２点較正によって較正した。３００ｍｌの水道水を含有する反応容器を１２１℃で２０分間加圧滅菌した。その後、ｐＯ２−検出器を、ＤＡＳＧＩＰシステムで一晩（少なくとも６時間）偏光させた。翌朝、水をクリーンベンチ下で除去し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンで補足された高細胞密度培地３００ｍＬで置き換えた。その後、ｐＯ２検出器を１点較正（撹拌器：４００ｒｐｍ、ガス流：１０ｓＬ／ｈ空気）にかけて、供給材料、補正剤及び誘導に関係する管材料を、７０％のエタノール、その後、１ＭのＮａＯＨを用いて所定の洗浄によって洗浄し、その後、滅菌ＶＥ水で濯ぐ。

ＡＬＳ及びＡＬＳＭＥを産生する大腸菌の菌株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンで捕捉されたＬＢ培地（バッフルを備えた１００ｍｌのフラスコ中で２５ｍｌ）中で、３７℃及び２００ｒｐｍで約１８時間にわたり一晩、それぞれの凍結培養物から接種した。その後、２ｍＬの高細胞密度培地中の培養物（１５ｇ／Ｌのグルコース（３０ｍｌ／Ｌの別々に加圧滅菌された、１％のＭｇＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ及び２．２％のＮＨ_４Ｃｌを含む５００ｇ／Ｌのストック溶液）、１．７６ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１９．０８ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、１２．５ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ、６．６６ｇ／Ｌの酵母エキス、２．２４ｇ／Ｌのクエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸第三鉄アンモニウム溶液：１７ｍｌ／Ｌの別々に加圧滅菌された１％のストック溶液、微量元素溶液：５ｍｌ／Ｌの別々に加圧滅菌されたストック溶液（３６．５０ｇ／ＬのＨＣｌ（３７％）、１．９１ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２ ^＊４Ｈ_２Ｏ、１．８７ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ、０．８４ｇ／Ｌのエチレンジアミンテトラ酢酸二水化物、０．３０ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、０．２５ｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４ ^＊２Ｈ_２Ｏ、４．７０ｇ／ＬのＣａＣｌ_２ ^＊２Ｈ_２Ｏ、１７．８０ｇ／ＬのＦｅＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣｕＣｌ_２ ^＊２Ｈ_２Ｏ））（ベセルを備えた１００ｍｌのフラスコ内に菌株当たり２０ｍｌ）を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと共に３７℃／２００ｒｐｍで更に５．５時間にわたり接種し且つインキュベートした。

６００ｎｍにおける培養物の光学密度を、Ｗ３１１０ΔＦａｄＥ［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］の場合に６．９として及びＷ３１１０［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］の場合に７．４として測定した。反応容器を０．１の最終光学密度に接種するために、４．０ｍＬ又は４．４ｍＬを、それぞれ、無菌条件下で５ｍｌのシリンジ中に移して使用し、中空針及び７０％のエタノールの層で覆われたセプタムを用いて反応物を接種した。以下の標準プログラムを使用した。

実施した実験は、以下の段階に入る：ある光学密度で細胞を得ることが目的である増殖期、及び基質ラウリン酸メチルエステルをω−アミノラウリン酸メチルエステルに変換することが目的であるその後の生体内変換期。ｐＨ値はアンモニア（１２．５％）を用いて６．８に維持した。培養及び生体内変換の間、培養液中の溶存酸素を、３０％のガス流量で撹拌によって維持した。

発酵をフェドバッチとして実施し、その際、供給が開始し、５ｇ／Ｌｈのグルコース供給（１％のＭｇＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ及び２．２％のＮＨ_４Ｃｌを含む５００ｇ／Ｌのグルコース）がＤＯピークによって引き起こされた。供給が開始する時に、温度は３７℃から３０℃に低下した。トランスアミナーゼの発現を、供給開始から２時間後にＩＰＴＧ（１ｍＭ）の自動添加によって誘導し、ａｌｋ遺伝子を、供給開始から１０時間後にＤＣＰＫ（０．０２５％ｖ／ｖ）の手動添加によって誘導した。培養ブロスの光学密度を、生体内変換を開始する前に測定した。

生体内変換段階は、ラウリン酸メチルエステル、オレイン酸（工業グレード、９０％）を含む混合物をバッチとして発酵ブロスに添加することによって供給開始から１４時間後に開始した。トランスアミナーゼにアミノ基供与体を提供するために、生体内変換の開始の３０分前に、５ｍｌの３Ｍ硫酸アンモニウム溶液を発酵ブロスに添加した。２ｍｌの発酵ブロス試料を容器から取り出し、その一部をアセトン及びＨＣｌ（ｃ（ＨＣｌ）０．１モル／Ｌ）を含む混合物中で１：２０に希釈して抽出した。試料を、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、７．５時間、１０．５時間、１９．５時間及び２１時間で取っておき、その後、全ての反応容器から生体内変換を開始する。ＤＡＳＧＩＰシステムからの排気ガスの分析を介して発酵中に酸素移動速度（ＯＴＲ）及び炭素移動速度（ＣＴＲ）を測定した。発酵は、生体内変換の開始から２１時間後に終了した。撹拌機、ガス流量、温度制御、及びｐＨ制御の電源を切り、容器を更に５〜１０分間静置する機会を設けた。

結果：
生体内変換が進行すると、酸素と炭素の移動速度は、Ｗ３１１０［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］の場合に大幅に増加する。これとは対照的に、酸素と炭素の移動速度は、欠失変異体Ｗ３１１０ΔＦａｄＥ［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］の場合には減少し、生体内変換の前に観察されるレベルに近づく（図３）。両方の菌株によって形成された生成物の量は同等であり（図４）、実際に、収率は変異体を用いた場合よりもわずかに良好である。

生体内変換の完了から１０分後に、はっきりとした相分離を、菌株Ｗ３１１０ΔＦａｄＥ［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］を含む反応容器内で視覚的に検出することができ、その際、上相は体積の約４０％を占め、下相は約６０％を占めた。薄い中間相は、これらの相の間で観察され得る。試料を上相及び下相から取り、１５ｍｌのファルコンチューブに移し、そして５５００×ｇで１０分間遠沈させた。下相からの試料を含むチューブは、約９５％の水相とバイオマスからなっていた。上相からの試料を含むチューブは、約６０％の有機溶液からなっていた（図２）。菌株Ｗ３１１０［ａｌｋＢ−ａｌａＤ−ＴＡ］を含む反応容器は、１０分後に均質なエマルションを含有し、相分離は更に２０分間全く観察できなかった（図１）。

要約すると、ＦａｄＥをコードする遺伝子、β−酸化経路の大腸菌アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼの欠失は、変異体が水溶液中にあり且つ水非混和性有機溶媒と接触する場合に改善された相分離をもたらし、さらには低下した酸素の消費をもたらす。

Claims

野生型と比較して低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物であって、ここで、前記微生物が大腸菌であり、前記脂肪酸分解能は、脂肪酸インポーター、脂肪酸ＣｏＡリガーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択されるβ−酸化経路に関与する酵素をコードする遺伝子の欠失によって、それぞれの野生型における同等の条件下で同一の酵素の活性に対して少なくとも４０％活性が低下されており、前記組み換えアルカンオキシダーゼが、ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ、チトクロームＰ４５０酵素、キシレンモノオキシゲナーゼ及びメタンモノオキシゲナーゼからなる群から選択される、ことを特徴とする、前記微生物。
組み換えアルカンオキシダーゼが、シュードモナスプチダからのＡｌｋＧである、請求項１に記載の微生物。
微生物が、更に組換えアルコールデヒドロゲナーゼを発現する、請求項１または２に記載の微生物。
微生物が、更に組換えトランスアミナーゼを発現する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の微生物。
微生物が、更に組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼを発現する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の微生物。
組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼが、アラニンデヒドロゲナーゼである、請求項５に記載の微生物。
ａ）アルキルと、野生型と比較して低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物を含む水溶液とを接触させ、ここで、前記微生物が大腸菌であり、前記脂肪酸分解能は、β−酸化経路に関与する酵素をコードする遺伝子の欠失、阻害または不活性化によって低下されており、前記微生物中で発現したアルカンオキシダーゼが、ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ、チトクロームＰ４５０酵素、キシレンモノオキシゲナーゼ及びメタンモノオキシゲナーゼからなる群から選択され；かつ、
ｂ）工程ａ）からの水溶液と水非混和性有機溶媒とを接触させることを含む、アルキルの酸化方法であって、ここで、アルキルが、式Ｈ−（ＣＨ_２）_ｘ−Ｒ（式中、ｘは少なくとも６であり、且つＲは−ＯＨ、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ^１、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−ＯＰＯ_３Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ及び−Ｈからなる群から選択されるものであり、ここでＲ^１は非置換の直鎖状アルキルである）によって表される化合物であることを特徴とする、前記方法。
請求項７に記載の方法であって、アルキル酸化を完了させた後に、工程ｂ）を実施する、前記方法。
請求項７または８に記載の方法であって、アルキル酸化を完了させ、かつ水溶液から細胞を除去した後に、工程ｂ）を実施する、前記方法。
請求項７に記載の方法であって、工程ｂ）を工程ａ）と同時に実施する、前記方法。
アルキルが直鎖状アルカンである、請求項７から１０までのいずれか１項に記載の方法。
水非混和性有機溶媒が水非混和性脂肪酸又は脂肪酸エステルである、請求項７から１１までのいずれか１項に記載の方法。
β−酸化経路に関与する酵素が、脂肪酸インポーター、脂肪酸ＣｏＡリガーゼ、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される、請求項７から１２までのいずれか１項に記載の方法。
微生物が、更に組換えアルコールデヒドロゲナーゼを発現する、請求項７から１３までのいずれか１項に記載の方法。
微生物が、更に組換えトランスアミナーゼを発現する、請求項７から１４までのいずれか１項に記載の方法。
微生物が、更に組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼを発現する、請求項７から１５までのいずれか１項に記載の方法。
組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼが、アラニンデヒドロゲナーゼである、請求項１６に記載の方法。
野生型と比較して低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物をアルキルの酸化に用いる使用であって、ここで、前記微生物が大腸菌であり、前記脂肪酸分解能が、β−酸化経路に関与する酵素をコードする遺伝子の欠失、阻害または不活性化によって低下されており、前記微生物中で発現したアルカンオキシダーゼが、ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ、チトクロームＰ４５０酵素、キシレンモノオキシゲナーゼ及びメタンモノオキシゲナーゼからなる群から選択されていることを特徴とする、前記使用。
アルキルが直鎖状アルカンである、請求項１８に記載の使用。