CN104937104B - 从羧酸或二羧酸或其单酯生产胺和二胺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及全细胞催化剂，其表达重组α‑双加氧酶或由重组脂肪酸还原酶和将所述脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合，且其除了表达α‑双加氧酶和/或由脂肪酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合以外还表达转氨酶，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地是重组体；还涉及用于将羧酸或二羧酸或其单酯转化成胺或二胺的方法，所述方法包括下述步骤：使所述羧酸或二羧酸或其单酯与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α‑双加氧酶接触，和使产物与转氨酶接触。

Description

从羧酸或二羧酸或其单酯生产胺和二胺
本发明涉及全细胞催化剂，其表达重组α-双加氧酶和/或由重组脂肪酸还原酶和将所述脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合，且其另外表达转氨酶，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地为重组体；还涉及用于将羧酸或二羧酸或其单酯转化成胺或二胺的方法，所述方法包括下述步骤：使所述羧酸或二羧酸或其单酯与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶接触，和使产物与转氨酶接触。
聚酰胺是一类以重复的酰胺基为特征的聚合物。不同于化学上有关的蛋白，术语“聚酰胺”通常涉及合成的、商购可得的热塑性聚合物。聚酰胺衍生自伯胺或仲胺，所述伯胺或仲胺常规地在烃裂化中得到。但是，衍生物（更精确地讲，氨基羧酸、内酰胺和二胺）也可以用于聚合物生产。作为反应物（Edukt）也感兴趣的是短链气态烷烃，其可以通过生物技术方法从可再生原料开始得到。
这样的胺和二胺的常规化学技术生产依赖于化石原料的供给，且是低效的，并且在该过程中形成大量不希望的副产物，在一些合成步骤中最多达80%。这样的过程的一个例子是月桂内酰胺的生产。常规地，这通过多级过程来实现，所述多级过程不仅产生低产率，而且同时需要复杂的基础设施。
由于所述缺点，已经开发了使用生物催化剂从可再生原料得到胺和二胺的方法。合适的可再生原料尤其是脂肪酸源，其可以以下述形式得到：油菜籽油、球花蓟油、棕榈仁油、椰子油、葵花子油和得自许多生物学来源（尤其是植物）的类似天然产物。
PCT/EP 2008/067447描述了使用细胞来生产化学上相似的产物（更精确讲，ω-氨基羧酸）的生物技术体系，所述细胞具有许多合适的酶活性，且能够将羧酸转化成相应的ω-氨基羧酸。所述方法包括酶促催化反应的级联，尤其是将末端碳原子处的脂肪酸氧化为醛，随后使用转氨酶和作为胺供体的氨基酸进行胺化，所述胺供体可以通过氨基酸脱氢酶再生。
但是，在其中使用的得自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1的AlkBGT氧化酶体系的已知缺点在于，它不能执行脂族烷烃至伯醇的选择性氧化。相反，产生大量氧化产物，尤其是，更高度氧化的产物（诸如相应的醛、酮或相应的羧酸）的比例随着反应时间的增加而增加(C. Grant, J. M. Woodley和F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486)，这会相应地降低期望的胺的产率。
由于形成的氧化产物在结构上非常类似，加重了相对非选择性氧化的问题。这造成非常难以有效地和没有显著产率损失地将它们与期望的氧化产物分离。
该方法的另一个缺点在于，过度氧化的副产物（例如用作反应物的脂肪酸的二羧酸）、疏水溶剂和疏水液体阳离子交换剂（根据PCT/EP2011/071491，其可以用于从水性反应混合物中分离产物）的回收是以资源利用效率为代价。
在这方面，应当强调的是，如PCT/EP2008/067447所述的具有反应级联（其中每一种反应由一种特定的酶催化）的生物技术体系的复杂性使得难以优化反应条件。例如，在基本上以反应性的ω-氨基脂肪酸作为产物的情况下，存在从细胞内部的某一临界浓度起它们将与生物体的必需组分反应并因而具有毒性效应的可能性。如果是这种情况，那么生物体的生长和合成能力会受损，直至导致细胞的死亡，而开发者不能直接识别毒性或甚至将它归因于特定反应物、中间产物或产物。也难以预测何种生物体耐受化学反应性物质的何种浓度。
关于要提高的产物产率和要减少的副产物形成，本领域技术人员也不能常规地鉴别体系（诸如在PCT/EP2008/067447中描述的体系）中的限制性因素和决定性因素。如果产物产率过低，那么这可能是因为酶之一以过低的浓度存在，而不知道这是可能的酶中的哪一种，即由于合成能力不足，在预定的时间范围内或在被竞争酶降解之前，反应物未被转化。或者，可能是由于，尽管可检测到一种酶在细胞中以多肽的形式存在，但是恰好在该细胞中不具有为活性所必需的折叠，或者缺乏迄今未知的、但是为活性所必需的辅因子。同样地，如已提及的，代谢产物可能是对细胞有毒的，或者被降解。最后，必须考虑与内源酶（即在用作全细胞催化剂的细胞中天然存在的酶）的干扰性相互作用。
因此存在对由脂肪酸生产烷基单胺和-二胺的方法的需求，在该方法中酶促催化的反应更选择性地进行，并且使不希望的副产物的形成最小化。
在该背景下，本发明的目的是，提供在产率、碳-和/或氮平衡和/或纯度方面尽可能有效的由脂肪酸生产烷基单胺和-二胺的生物技术方法。
本发明的另一个目的是，提供在产率、碳-和/或氮平衡、所使用的试剂的可重复使用性和/或产物的纯度方面尽可能有效的由脂肪酸生产烷基单胺和-二胺的生物技术方法。在这方面，有效的碳-和/或氮平衡优选地被理解为是指，在期望的终产物中以尽可能高的比例重新找到为转化羧酸或羧酸酯以合适的底物的形式喂养给细胞的碳和/或氮，而不是例如转化成不期望的产物。
本发明的另一个目的是，改善得自由脂肪酸生产烷基单胺和-二胺的多相反应混合物的可处理性，尤其是在用于处理使用过的疏水溶剂和液体阳离子交换剂的可重复使用性方面，以及在两相体系中的相形成和相分离方面，所述两相体系包含水相（在其中进行羧酸或羧酸酯的转化）和有机相（其含有有机溶剂和/或液体阳离子交换剂）。
本申请的主题和尤其是附带的独立权利要求的主题的主题实现了这些和其它目的，其中由从属权利要求获悉实施方案。
在第一方面中通过全细胞催化剂解决了作为本发明的基础的问题，所述全细胞催化剂表达重组α-双加氧酶或由重组脂肪酸还原酶和由将所述脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合，且其另外表达转氨酶，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地为重组体。
在第一方面的第一个实施方案中通过全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达氨基酸脱氢酶，所述氨基酸脱氢酶优选地为重组体。
在第二个实施方案中，其也是第一个实施方案的一个实施方案，通过全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达烷烃羟化酶，所述烷烃羟化酶优选地为重组体。
在第三个实施方案中，其也是第一至第二个实施方案的一个实施方案，通过全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达AlkL家族的多肽，所述多肽优选地是重组体。
在第四个实施方案中，其也是第二个实施方案的一个实施方案，通过全细胞催化剂解决了所述问题，所述全细胞催化剂另外表达醇脱氢酶，所述醇脱氢酶优选地为重组体。
在第五个实施方案中，其也是第一至第四个实施方案的一个实施方案，通过全细胞催化剂解决了所述问题，其中与所述全细胞催化剂的野生型相比，至少一种参与β-氧化的酶的活性降低。
在第六个实施方案中，其也是第一至第五个实施方案的一个实施方案，通过全细胞催化剂解决了所述问题，其中与所述全细胞催化剂的野生型相比，BioH或其变体的活性降低或增加。
在第七个实施方案中，其也是第一至第六个实施方案的一个实施方案，通过全细胞催化剂解决了所述问题，其中与所述全细胞催化剂的野生型相比，FadL或其变体的活性增加。
在第二方面，通过一种用于将羧酸或二羧酸或其单酯转化成胺或二胺的方法解决了作为本发明的基础的问题，所述方法包括下述步骤：
a)提供羧酸或二羧酸或在二羧酸的情况下其单酯，优选地通过使羧酸与烷烃羟化酶和/或醇脱氢酶接触，
b)使所述羧酸或二羧酸或其单酯与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶接触，形成醛产物，和
c)使得自步骤a)的产物与转氨酶接触。
在第二方面中，一种方法解决了作为本发明的基础的问题，其中在步骤c)中，存在氨基酸脱氢酶。
在第二方面的第一个实施方案中，通过一种方法解决了所述问题，其中将选自包含磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶、α-双加氧酶、转氨酶、氨基酸脱氢酶和烷烃羟化酶的组的至少一种酶，优选所使用的选自该组的所有酶，以全细胞催化剂的形式提供给根据本发明的第一方面。
在第二个实施方案中，其也是第一个实施方案的一个实施方案，通过一种方法解决了所述问题，其中所述羧酸或二羧酸或其单酯是式(I)的化合物
R1 - A - COOR2 (I)，
其中R1选自-H和COOR3，
其中R2和R3各自并彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，
前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，
其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基。
在第三个实施方案中，其也是第一至第二个实施方案的一个实施方案，一种方法解决了所述问题，其中A具有式- (CH2)n -，其中n是至少4，优选至少10。
在第三方面，通过使用根据第一方面的全细胞催化剂或根据第二方面的方法用于将脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯胺化，解决了作为本发明的基础的问题。
在第四方面，一种反应混合物解决了作为本发明的基础的问题，所述反应混合物包含在水溶液中的根据第一方面的全细胞催化剂和式(I)的脂肪酸、ω-羟基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其单酯
R1 - A - COOR2 (I)，
其中R1选自-H、-CHO、-OH和COOR3，
其中R2和R3各自并彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，
前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，
其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基，优选式- (CH2)n -，其中n是至少4，特别优选至少10。
本发明是基于发明人的以下认识：用于由脂肪酸生产胺和二胺且具有适当酶配备（Ausstattung）的全细胞催化剂中的功能重组的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶令人惊讶地提高胺和二胺的产率。
此外，本发明是基于发明人的以下认识：用于由脂肪酸生产胺和二胺且具有适当酶配备的全细胞催化剂中的功能重组的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶令人惊讶地降低产生的产物中的干扰性副产物（尤其是二羧酸及其酯形式的过度氧化的脂肪酸）的浓度。
此外，本发明是基于发明人的以下认识：用于由脂肪酸生产胺和二胺且具有适当酶配备的全细胞催化剂中的功能重组的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶改善液体阳离子交换剂（诸如油酸）的纯度和可重复使用性，所述液体阳离子交换剂用于从含有全细胞催化剂的发酵溶液中除去胺和二胺。
本发明涉及改进的将羧酸或二羧酸或其单酯转化成胺或二胺的方法，所述方法的特征在于，除催化脂肪酸经由它的多个氧化阶段转化为胺的反应的酶外，也存在脂肪酸还原酶或α-双加氧酶，优选地，当使用全细胞催化剂进行所述方法时。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“脂肪酸还原酶”被理解为是指这样的酶：其在消耗ATP和NAD(P)H的情况下催化ω-羧基酸（也被称为二羧酸或ω-羧基脂肪酸）向相应的ω-氧代脂肪酸的转化。在现有技术中，例如在WO/2010/135624中，描述了用于生产ω-羟基脂肪酸的脂肪酸还原酶，但是并未作为生产ω-氨基脂肪酸的体系的一部分。在一个还更优选的实施方案中，所述脂肪酸还原酶选自含有以下氨基酸序列及其变体的脂肪酸还原酶：
YP_887275.1、ZP_11001941.1、ZP_06852401.1、NP_959974.1、YP_001070587.1、ZP_05217435.1、YP_882653.1、YP_639435.1、ZP_10800193.1、YP_006452763.1、YP_006730440.1、ZP_11196216.1、YP_005349252.1、ZP_05224908.1、YP_005338837.1、YP_006307000.1、YP_005343991.1、ZP_11001942.1、ZP_09979565.1、YP_005003162.1、YP_953393.1、YP_001850422.1、ZP_11011489.1、ZP_12689264.1、YP_905678.1、ZP_09976919.1、YP_004746059.1、NP_217106.1、YP_004525443.1、NP_337166.1、ZP_09685823.1、YP_978699.1、ZP_06437984.1、ZP_06514086.1、NP_856267.1、CAA19077.1、NP_301424.1、ZP_06522140.1、ZP_06518098.1、ZP_11008938.1、ZP_07432374.2、AAR91681.1、YP_006808747.1、YP_001851230.1、ZP_15327751.1、ZP_15455857.1、ZP_12874284.1、ZP_15332534.1、ZP_15512956.1、ZP_14244106.1、ZP_15470899.1、ZP_11439367.1、YP_001703694.1、ZP_15446742.1、YP_006808978.1、ZP_07964926.1、YP_006521379.1、ZP_10796908.1、ZP_15512957.1、ZP_12874283.1、YP_005350955.1、ZP_14243341.1、YP_001705436.1、ZP_15329649.1、YP_006522325.1、YP_006732197.1、YP_003658971.1、ZP_05227804.1、YP_001703695.1、YP_006308707.1、ZP_15342047.1、YP_006521380.1、ZP_15327752.1、YP_005340557.1、ZP_11439578.1、ZP_15392943.1、ZP_15514789.1、ZP_12996178.1、ZP_09412214.1、ZP_06849686.1、YP_889972.1、YP_006570321.1、ZP_15375693.1、YP_006308219.1、YP_006521600.1、YP_005340029.1、YP_005350457.1、ZP_11439836.1、ZP_12994664.1、ZP_14240588.1、ZP_14236860.1、ZP_09410830.1、YP_006731697.1、YP_005264225.1、YP_001704097.1、ZP_15328186.1、ZP_09402885.1、ZP_12690463.1、AFO59871.1、ZP_07966879.1、YP_118225.1、YP_001828302.1、YP_006566873.1、YP_003660169.1、ZP_15337407.1、ZP_08240521.1、ZP_10456477.1、YP_001537947.1、YP_004016539.1、ZP_07664024.1、ZP_14244107.1、ZP_09794557.1、ZP_09274211.1、ZP_05224899.1、ZP_15484175.1、AAA17105.1、ZP_11437924.1、ZP_15446621.1、YP_003646340.1、ZP_15382134.1、ZP_14237669.1、ZP_09165547.1、YP_004019203.1、ZP_14240225.1、YP_001220863.1、CBA74242.1、ZP_12994240.1、EIE27140.1、ZP_15354547.1、ZP_15432557.1、ZP_15500132.1、ZP_15478632.1、ZP_06846978.1、AAA17108.1、ZP_15333767.1、ZP_05217205.1、AAD44234.1、YP_005348984.1、YP_006306749.1、ZP_05224611.1、YP_005343772.1、YP_006730188.1、YP_882425.1、ZP_10799956.1、ZP_05045132.1、NP_960176.1、ZP_12398880.1、ZP_11192735.1、ZP_11440091.1、ZP_05217203.1、ZP_06846979.1、ZP_10800936.1、ZP_06523596.1、YP_882421.1、YP_006306748.1、YP_006522017.1、ZP_15432556.1、ZP_15354095.1、ZP_05227781.1、ZP_09684639.1、YP_006730187.1、YP_005343770.1、YP_005338616.1、YP_005348983.1、ZP_15472813.1、ZP_15457007.1、ZP_15421152.1、ZP_15488933.1、ZP_14240030.1、YP_001704825.1、ZP_15328982.1、YP_005911512.1、ZP_09411638.1、ZP_12876400.1、ZP_12995435.1、ZP_07667680.1、YP_001281387.1、EIE21044.1、ZP_15375054.1、NP_334518.1、4DQV_A、ZP_06435375.1、YP_003030020.1、YP_976237.1、ZP_04926822.1、YP_004998149.1、YP_004743589.1、YP_005907921.1、NP_214615.1、YP_001286047.1、ZP_06515541.1、ZP_05139482.1、YP_888016.1、ZP_06452908.1、ZP_06519578.1、YP_004721827.1、CAJ77696.1、ZP_09680854.1、ZP_09686453.1、YP_884815.1、YP_884815.1，
CAB55600.1、ZP_09081423.1、YP_006521568.1、ZP_11440626.1、ZP_15513309.1、ZP_09410778.1、ZP_15374248.1、ZP_15405954.1、YP_001704047.1、ZP_14236911.1、ZP_12873916.1、ZP_14242094.1、ZP_12994610.1、ZP_07664023.1、ZP_15446620.1、ZP_15484174.1、ZP_14240245.1、YP_005358845.1和XP_002669159.1，
尤其是YP_006731697.1、ZP_09839660.1、YP_001704097.1、YP_889972.1、ZP_05045132.1、ZP_09794557.1、ZP_08240521.1、NP_959974.1、ZP_10456477.1、YP_118225.1、NP_217106、YP_905678.1、YP_887275.1、ZP_11001941.1、YP_953393.1和YP_005349252.1。
脂肪酸还原酶是一组这样的酶：它们的活性需要磷酸泛酰巯基乙胺化，即磷酸泛酰巯基乙胺基辅因子在所述酶上的共价固定。因此，根据本发明使用的脂肪酸还原酶是磷酸泛酰巯基乙胺基化的，且表达所述脂肪酸还原酶的全细胞催化剂会表达将所述脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，作为它的内源表达的酶配备的一部分或者呈重组形式。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶”被理解为是指这样的酶：其将磷酸泛酰巯基乙胺基残基从磷酸泛酰巯基乙胺基辅酶A转移至酶，优选地转移至脂肪酸还原酶上。在一个特别优选的实施方案中，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶选自含有以下氨基酸序列及其变体的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶：ABI83656.1、YP_006811024.1、YP_120266.1、YP_005265173.1、YP_004006671.1、ZP_08152482.1、ZP_11104141.1、ZP_14482198.1、YP_706581.1、ZP_10002626.1、ZP_09308410.1、YP_002783881.1、ZP_18276502.1、ZP_09271851.1、ZP_08204640.1、YP_002766085.1、ZP_09788717.1、ZP_09799863.1、ZP_10961877.1、YP_003273299.1、GAB86168.1、YP_006668875.1、ZP_08766535.1、ZP_09793386.1、ZP_09212827.1、ZP_09276344.1、ZP_09213870.1、ZP_09081490.1、ZP_10947586.1、YP_003658841.1、ZP_06852853.1、YP_953148.1、ZP_11011170.1、YP_639258.1、YP_886985.1、ZP_11194383.1、ZP_09681094.1、ZP_06455719.1、NP_337369.1、YP_004077819.1、NP_217310.1、YP_006452521.1、YP_005339056.1、ZP_05226335.1、ZP_07965127.1、ZP_07419314.2、NP_302077.1、YP_005003342.1、YP_005349465.1、ZP_10800435.1、ZP_06564430.1、YP_882860.1、YP_001135287.1、YP_001850220.1、ZP_05217634.1、YP_003646683.1、YP_004746246.1、ZP_15327906.1、ZP_09979035.1、YP_001703848.1、YP_906028.1、ZP_15395499.1、ZP_11438833.1、ZP_11005955.1、ZP_09410582.1、NP_961833.1、YP_001106197.1、ZP_14237113.1、YP_004085491.1、YP_003835595.1、ZP_12994399.1、YP_004523804.1、ZP_12690887.1、YP_003339468.1、ZP_06589331.1、YP_004801334.1、ZP_09974565.1、ZP_04608379.1、ZP_13037142.1、YP_712537.1、ZP_11236665.1、NP_630748.1、ZP_06527138.1、YP_003835167.1、CCH33620.1、ZP_10309401.1、ZP_08881396.1、YP_003102953.1、YP_003487252.1、ZP_08881565.1、YP_006263961.1、NP_822924.1、YP_004914569.1、ZP_09400366.1、AFV71333.1、ZP_07309518.1、ZP_09172171.1、ZP_06710898.1、CAN89630.1、ZP_06921116.1、ZP_08804003.1、ZP_19189663.1、ZP_10545589.1、YP_006248725.1、ZP_10455557.1、YP_004015869.1、ZP_08801530.1、ZP_10550999.1、YP_004492879.1、ZP_09958730.1、ZP_08286666.1、ZP_11212856.1、AAL15597.1、AAZ94407.1、ZP_19188802.1、AFF18625.1、ZP_06575404.1、AAK06801.1、ADC79635.1、YP_004080528.1、YP_004921314.1、ACY01405.1、YP_004584022.1、YP_003114157.1、YP_003203177.1、AFB69911.1、YP_006876460.1、ZP_08024798.1、YP_006269867.1、YP_006881814.1、CCK26150.1、ZP_07307765.1、ZP_07315112.1、YP_005466392.1、NP_824081.1、YP_003493882.1、ZP_06412387.1、ZP_10068239.1、ZP_08234258.1、YP_001822177.1、ZP_03979107.1、ZP_07979043.1、BAA22407.1、ZP_09402950.1、YP_003112617.1、NP_738483.1、YP_480609.1、EKX90208.1、BAE93744.1、BAB69186.1、ZP_04713061.1、YP_006881735.1、ZP_07274901.1、ZP_11379052.1、ZP_06581115.1、YP_006437406.1、ZP_12871839.1、NP_601186.1、ZP_08451808.1、YP_005057339.1、YP_005303909.1、ZP_07090824.1、YP_003783676.1、YP_004630011.1、ZP_06588772.1、AAX98203.1、AFK80329.1、ZP_08124665.1、ZP_03710365.1、AAB17877.1、ZP_07403633.1、ZP_11268660.1、ZP_07288841.1、ABV83217.1、ZP_16178576.1、AAG43513.1、ZP_09155938.1、YP_004605750.1、ZP_03918977.1、AAF71762.1、ZP_05007864.1、ZP_06836265.1、ZP_03934882.1、YP_001508477.1、ZP_06043756.1、ZP_05366306.1、YP_002835056.1、ZP_03933464.1、ZP_07469321.1、ZP_07713507.1、YP_005160553.1、NP_939820.1、AAU93794.1、ZP_14659796.1、ZP_14383679.1、YP_005058606.1、YP_001221073.1、ZP_08231568.1、YP_250920.1、ZP_11383249.1、YP_003916320.1、ZP_08681170.1、YP_001800249.1、YP_001157632.1、YP_166099.1、ZP_10088015.1、YP_004760065.1、ZP_07947675.1、YP_001603066.1、YP_003812683.1、YP_004403402.1、ZP_08292153.1、ZP_09471260.1、YP_004018108.1、ZP_05115352.1、AAD13565.1、ZP_09295321.1、YP_001535629.1、ZP_04607273.1、YP_006561753.1、ZP_00960958.1、YP_006571985.1、ZP_08862188.1、YP_002906426.1、CCK30433.1、ZP_13042493.1、ZP_09090153.1、YP_614397.1、ZP_11163860.1、YP_003983492.1、YP_004080668.1、ZP_09420475.1、ZP_05914565.1、ZP_01101149.1、ZP_14743088.1、YP_001239694.1、ZP_09127532.1、YP_003833873.1、ZP_08516197.1、ZP_10160483.1、ZP_01987188.1、ZP_01755304.1、ZP_08825027.1、ZP_05077116.1、YP_001444606.1、ZP_03392800.1、ZP_01057781.1、AFB69889.1、ZP_08815097.1和AAO17175.1。在一个特别优选的实施方案中，其是具有数据库代码ABI83656.1的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或其变体。
可替换地或除了由脂肪酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合以外，所述全细胞催化剂还可以含有α-双加氧酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“α-双加氧酶”被理解为是指这样的酶，其在消耗1分子氧的情况下并在裂解掉1个二氧化碳分子的情况下将羧酸和/或二羧酸或其单酯催化转化为与用作反应物的羧酸和/或二羧酸或其单酯相比，其在末端ω-碳原子处缩短了1个碳原子的，在末端ω碳原子上携带醛基的羧酸和/或二羧酸或其单酯。在一个特别优选的实施方案中，所述α-双加氧酶选自含有以下氨基酸序列及其变体的α-双加氧酶：NP_001066718.1、EAY82977.1、BAH79993.1、ABG22011.1、BAJ90503.1、AFD04418.1、AFD04417.1、BAJ87736.1、AFW75180.1、ABG22012.1、XP_002311389.1、CAH05011.1、XP_002279884.1、CBI34957.3、AAG59584.1、NP_001234414.1、NP_001234410.1、XP_003553942.1、XP_002275161.1、XP_003553937.1、CBI34960.3、CAA07589.1、XP_003543402.1、XP_002517402.1、XP_002882184.1、NP_186791.1、AAK85133.1、CAN77070.1、XP_002529555.1、CAH64542.1、NP_001234061.1、XP_002281357.1、ADM21465.1、XP_002318527.1、NP_177509.1、CAN74266.1、XP_002888940.1、NP_001185393.1、XP_003631072.1、BAJ33800.1、XP_002517377.1、XP_003530944.1、BAJ34623.1、ABG22013.1、ABP02610.1、XP_001773135.1、XP_002960339.1、ABK95279.1、ABD73303.1、ABD73304.1、YP_001805721.1、ZP_08971815.1、ZP_08430366.1、YP_823013.1、ZP_05026427.1、ZP_11003953.1、YP_007064484.1、YP_007113008.1、YP_633369.1、ZP_18906570.1、ZP_09251410.1、ZP_10050808.1、ZP_01306662.1、YP_001516886.1、ZP_05042862.1、AAC49625.1、ZP_09648375.1、ZP_09792714.1、ZP_09788527.1、XP_001728273.1、AAC83355.1、YP_890542.1、ZP_11000891.1、XP_002605323.1、EGO58341.1、YP_006249145.1、YP_001507004.1、YP_001704637.1、ZP_12876141.1、ZP_11150830.1、ZP_14236257.1、ZP_09411385.1、ZP_14243118.1、EKD16664.1、ZP_15416799.1、ZP_15338016.1、ZP_10080295.1、ZP_11438929.1、ZP_12995210.1、ZP_10946648.1、YP_003409541.1、XP_001637870.1、YP_005451221.1、XP_001212758.1、ZP_07290489.1、ZP_05781329.1、ZP_19187748.1、ZP_06574534.1、XP_002605322.1、NP_822950.1、YP_006366425.1、EJP63377.1、EKD21217.1、XP_001795927.1、XP_003042615.1、ZP_06566152.1、EGU88116.1、EFY94417.1、XP_388327.1、EKJ68934.1、ZP_07290463.1、CCC10458.1、YP_001107201.1、XP_003348248.1、T49753、CAD31840.1、XP_001229975.1、CBN77040.1、YP_004813753.1、XP_002513273.1、XP_001627136.1、AFG52858.1、AFG52857.1、AEW08450.1、NP_841291.1、YP_004512343.1、ACG75701.1和ZP_03500906.1。在一个特别优选的实施方案中，其是具有数据库代码NP_001066718.1的α-双加氧酶或其变体。
除α-双加氧酶或由脂肪酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合外，根据本发明的全细胞催化剂必然地含有将末端醛基胺化的转氨酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“转氨酶”被理解为是指这样的酶：其催化α氨基从供体分子（优选氨基酸）转移至受体分子（优选α-酮基羧酸）。在一个特别优选的实施方案中，所述转氨酶选自含有以下氨基酸序列及其变体的转氨酶：3HMU_A、AAD41041.1、AAK15486.1、ABE03917.1、ADR60699.1、ADR61066.1、ADR62525.1、AEL07495.1、CAZ86955.1、EFW82310.1、EFW87681.1、EGC99983.1、EGD03176.1、EGE58369.1、EGH06681.1、EGH08331.1、EGH24301.1、EGH32343.1、EGH46412.1、EGH55033.1、EGH62152.1、EGH67339.1、EGH70821.1、EGH71404.1、EGH78772.1、EGH85312.1、EGH97105.1、EGP57596.1、NP_102850.1、NP_106560.1、NP_248912.1、NP_248990.1、NP_354026.2、NP_421926.1、NP_637699.1、NP_642792.1、NP_744329.1、NP_744732.1、NP_747283.1、NP_795039.1、NP_901695.1、XP_002943905.1、YP_001021095.1、YP_001059677.1、YP_001061726.1、YP_001066961.1、YP_001074671.1、YP_001120907.1、YP_001140117.1、YP_001170616.1、YP_001185848.1、YP_001188121.1、YP_001233688.1、YP_001268866.1、YP_001270391.1、YP_001345703.1、YP_001412573.1、YP_001417624.1、YP_001526058.1、YP_001579295.1、YP_001581170.1、YP_001668026.1、YP_001669478.1、YP_001671460.1、YP_001685569.1、YP_001747156.1、YP_001749732.1、YP_001765463.1、YP_001766294.1、YP_001790770.1、YP_001808775.1、YP_001809596.1、YP_001859758.1、YP_001888405.1、YP_001903233.1、YP_001977571.1、YP_002229759.1、YP_002231363.1、YP_002280472.1、YP_002297678.1、YP_002543874.1、YP_002549011.1、YP_002796201.1、YP_002801960.1、YP_002875335.1、YP_002897523.1、YP_002912290.1、YP_002974935.1、YP_003060891.1、YP_003264235.1、YP_003552364.1、YP_003578319.1、YP_003591946.1、YP_003607814.1、YP_003641922.1、YP_003674025.1、YP_003692877.1、YP_003755112.1、YP_003896973.1、YP_003907026.1、YP_003912421.1、YP_004086766.1、YP_004142571.1、YP_004147141.1、YP_004228105.1、YP_004278247.1、YP_004305252.1、YP_004356916.1、YP_004361407.1、YP_004378186.1、YP_004379856.1、YP_004390782.1、YP_004472442.1、YP_004590892.1、YP_004612414.1、YP_004676537.1、YP_004693233.1、YP_004701580.1、YP_004701637.1、YP_004704442.1、YP_108931.1、YP_110490.1、YP_168667.1、YP_237931.1、YP_260624.1、YP_262985.1、YP_271307.1、YP_276987.1、YP_334171.1、YP_337172.1、YP_350660.1、YP_351134.1、YP_364386.1、YP_366340.1、YP_369710.1、YP_370582.1、YP_426342.1、YP_440141.1、YP_442361.1、YP_468848.1、YP_521636.1、YP_554363.1、YP_608454.1、YP_610700.1、YP_614980.1、YP_622254.1、YP_625753.1、YP_680590.1、YP_751687.1、YP_767071.1、YP_774090.1、YP_774932.1、YP_788372.1、YP_858562.1、YP_928515.1、YP_983084.1、YP_995622.1、ZP_00948889.1、ZP_00954344.1、ZP_00959736.1、ZP_00998881.1、ZP_01011725.1、ZP_01037109.1、ZP_01058030.1、ZP_01076707.1、ZP_01103959.1、ZP_01167926.1、ZP_01224713.1、ZP_01442907.1、ZP_01446892.1、ZP_01550953.1、ZP_01625518.1、ZP_01745731.1、ZP_01750280.1、ZP_01754305.1、ZP_01763880.1、ZP_01769626.1、ZP_01865961.1、ZP_01881393.1、ZP_01901558.1、ZP_02145337.1、ZP_02151268.1、ZP_02152332.1、ZP_02167267.1、ZP_02190082.1、ZP_02242934.1、ZP_02360937.1、ZP_02367056.1、ZP_02385477.1、ZP_02456487.1、ZP_02883670.1、ZP_03263915.1、ZP_03263990.1、ZP_03400081.1、ZP_03452573.1、ZP_03456092.1、ZP_03517291.1、ZP_03529055.1、ZP_03571515.1、ZP_03572809.1、ZP_03587785.1、ZP_03588560.1、ZP_03697266.1、ZP_03697962.1、ZP_04521092.1、ZP_04590693.1、ZP_04890914.1、ZP_04891982.1、ZP_04893793.1、ZP_04902131.1、ZP_04905327.1、ZP_04941068.1、ZP_04944536.1、ZP_04945255.1、ZP_04959332.1、ZP_04964181.1、ZP_05053721.1、ZP_05063588.1、ZP_05073059.1、ZP_05077806.1、ZP_05082750.1、ZP_05091128.1、ZP_05095488.1、ZP_05101701.1、ZP_05116783.1、ZP_05121836.1、ZP_05127756.1、ZP_05637806.1、ZP_05742087.1、ZP_05783548.1、ZP_05786246.1、ZP_05843149.1、ZP_05945960.1、ZP_06459045.1、ZP_06487195.1、ZP_06492453.1、ZP_06493162.1、ZP_06703644.1、ZP_06731146.1、ZP_06839371.1、ZP_07007312.1、ZP_07266194.1、ZP_07374050.1、ZP_07662787.1、ZP_07778196.1、ZP_07797983.1、ZP_08099459.1、ZP_08138203.1、ZP_08141719.1、ZP_08142973.1、ZP_08177102.1、ZP_08185821.1、ZP_08186468.1、ZP_08208888.1、ZP_08266590.1、ZP_08402041.1、ZP_08406891.1、ZP_08522175.1、ZP_08527488.1、ZP_08631252.1、ZP_08636687。
根据本发明使用的脂肪酸还原酶、以及优选地根据本发明使用的其它酶是重组酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“重组体”被理解为是指，编码对应酶的核酸分子不存在于天然细胞中，和/或它利用基因工程方法来生产。在一个优选的实施方案中，当相应的多肽由重组核酸编码时，称为重组蛋白。在一个优选的实施方案中，本文中使用的重组细胞被理解为，至少含有一种重组核酸或一种重组多肽的细胞。适合用于生产重组分子或细胞的方法是本领域技术人员已知的，例如在下述文献中描述的那些：Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, 第2版。优选过表达重组酶，例如利用本领域技术人员已知的pET或pGEX载体体系。
关于生物体的选择，根据本发明可使用的全细胞催化剂没有限制，只要它是可培养的、稳定的，并任选可以实现可通过基因工程引入的修饰，例如用于减弱酶活性的方法，例如敲除。例如，所述细胞同样可以为原核细胞或真核细胞。在真核细胞的情况中，单细胞的真核生物是特别优选的，特别是酵母诸如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、白色假丝酵母（Candida albicans）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。在原核细胞的情况中，它可以是例如选自以下的细菌：Magnetococcus、Mariprofundus、醋杆菌属（Acetobacter）、醋酸杆菌属（Acetobacterium）、嗜酸菌属（Acidiphilium）、阿菲彼亚杆菌属（Afipia）、Ahrensia、不粘柄菌属（Asticcacaulis）、橙单胞菌属（Aurantimonas）、固氮根瘤菌属（Azorhizobium）、固氮螺菌属（Azospirillum）、芽孢杆菌属（Bacillus）、巴尔通体（Bartonella tribocorum）、拜叶林克氏菌属（Beijerinckia）、Bradyrhizobium、近弧状短波单胞杆菌（Brevundimonas subvibrioides）、布鲁杆菌属（Brucella）、柄杆菌属（Caulobacter）、Chelativorans、Citreicella、Citromicrobium、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、Dino玫瑰杆菌属（Dinoroseobacter）、赤杆菌属（Erythrobacter）、Fulvimarina、葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）、Granulibacter、Hirschia、Hoeflea、丝状细菌属（Hyphomicrobium）、生丝单胞菌属（Hyphomonas）、Ketogulonicigenium、Labrenzia、Loktanella、磁螺菌属（Magnetospirillum）、Maricaulis、Maritimibacter、Mesorhizobium、甲基杆菌属（Methylobacterium）、甲基孢囊菌属（Methylocystis）、甲基窦菌属（Methylosinus）、硝化杆菌属（Nitrobacter）、Novosphingobium、Oceanibulbus、Oceanicaulis、Oceanicola、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、Octadecabacter、Oligotropha、副球菌属（Paracoccus）、Parvibaculum、Parvularcula、短小盒菌属（Pelagibaca）、Phaeobacter、Phenylobacterium、Polymorphum、Pseudo弧菌属（Pseudovibrio）、红杆菌属（Rhodobacter）、红微菌属（Rhodomicrobium）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas）、红螺菌属（Rhodospirillum）、Roseibium、玫瑰杆菌属（Roseobacter）、Roseomonas、Roseovarius、Ruegeria、Sagittula、硅杆菌属（Silicibacter）、Sphingobium、假平胞菌属（Sphingomonas）、Sphingopyxis、Starkeya、Sulfitobacter、Thalassiobium、茁平胞菌属（Xanthobacter）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、土壤杆菌（Agrobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、大豆根瘤菌属（Sinorhizobium）、微粒孢子虫属（Anaplasma）、埃里希体属（Ehrlichia）、新立克次体属（Neorickettsia）、东方体属（Orientia）、立克次体属（Rickettsia）、沃尔巴克体属（Wolbachia）、博德特菌属（Bordetella）、伯霍尔德杆菌属（Burkholderia）、贪铜菌属（Cupriavidus）、Taiwanensis、Lautropia、Limnobacter、Polynucleobacter、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、色杆菌属（Chromobacterium）、Eikenella corrodens、Basfia、金氏杆菌属（Kingella）、海鸥形菌属（Laribacter）、Lutiella、奈瑟球菌属（Neisseria）、西蒙斯氏菌（Simonsiella）、无色杆菌属（Achromobacter）、食酸菌属（Acidovorax）、Alicycliphilus、Aromatoleum、固氮弧菌属（Azoarcus）、丛毛平胞菌属（Comamonas）、Dechloromonas、代尔夫特菌属（Delftia）、加立昂菌属（Gallionella）、草螺菌属（Herbaspirillum）、Herminiimonas、Hylemonella、詹森菌属（Janthinobacterium）、纤毛菌属（Leptothrix）、Methylibium、甲基芽孢杆菌属（Methylobacillus）、嗜甲基菌目（Methylophilales）、Methyloversatilis、Methylovorus、亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）、亚硝化螺菌属（Nitrosospira）、草酸杆菌属（Oxalobacter）、Parasutterella、极地单胞菌（Polaromonas）、极地单胞菌（Polaromonas）、Pusillimonas、Rhodoferax、红长命菌属（Rubrivivax）、Sideroxydans、Sutterella wadsworthensis、泰勒菌属（Taylorella）、需氧去氮菌属（Thauera）、硫杆菌属（Thiobacillus）、硫单胞菌属（Thiomonas）、贪噬菌属（Variovorax）、Verminephrobacter、Anaeromyxobacter、食菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）、嗜胆菌属（Bilophila）、脱硫盒菌属（Desulfarculus）、Desulfatibacillum、Desulfobacca、Desulfobacterium、脱硫葱球菌属（Desulfobulbus）、脱硫球菌属（Desulfococcus）、Desulfohalobium、脱硫杆菌属（Desulfitobacterium）、脱硫微菌属（Desulfomicrobium）、Desulfonatronospira、Desulfotalea、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、脱硫单胞菌属（Desulfuromonas）、地杆菌属（Geobacter）、Haliangium、Hippea、散沫花属（Lawsonia）、粘球菌属（Myxococcus）、Pelobacter、Plesiocystis、堆囊粘细菌属（Sorangium）、眼点粘球菌属（Stigmatella）、互营杆菌属（Syntrophobacter）、Syntrophus、弓形杆菌属（Arcobacter）、Caminibacter、弯曲杆菌属（Campylobacter）、螺杆菌属（Helicobacter）、Nitratifractor、Nitratiruptor、Sulfuricurvum、Sulfurimonas、Sulfurospirillum、Sulfurovum、类杆菌属（Wolinella）、Buchnera、Blochmannia、Hamiltonella、Regiella、Riesia、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、Cronobacter、Dickeya、爱德华菌属（Edwardsiella）、肠杆菌属（Enterobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、埃希氏菌属（Escherichia）、克雷伯菌属（Klebsiella）、成团泛菌属（Pantoea）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、变形杆菌（Proteus）、普罗威登斯菌属（Providencia）、拉恩菌属（Rahnella）、沙门氏菌属（Salmonella）、沙雷氏菌属（Serratia）、志贺氏菌属（Shigella）、Sodalis、蠕动杆菌属（Wigglesworthia）、Glossina、致病杆菌属（Xenorhabdus）、耶尔森菌属（Yersinia）、酸硫杆状菌属（Acidithiobacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、气单胞菌属（Aeromonas）、Alcanivorax、Alkalilimnicola、Allochromatium、交替单胞菌目（Alteromonadales）、互生平胞菌属（Alteromonas）、Baumannia、贝日阿托菌属（Beggiatoa）、Bermanella、Carsonella、Ruthia、Vesicomyosocius、心杆菌属（Cardiobacterium）、色盐杆菌属（Chromohalobacter）、Colwellia、Congregibacter、考克斯体属（Coxiella）、Dichelobacter、Endoriftia、Enhydrobacter、Ferrimonas、弗朗西丝菌属（Francisella）、Glaciecola、Hahella、嗜盐菌属（Halomonas）、盐红螺旋菌属（Halorhodospira）、盐硫杆菌属（Halothiobacillus）、Idiomarina、Kangiella、军团病杆菌属（Legionella）、海杆菌属（Marinobacter）、海单胞菌属（Marinomonas）、Methylobacter、甲基球菌属（Methylococcus）、Methylomicrobium、Methylophaga、莫拉菌属（Moraxella）、嗜冷菌属（Moritella）、Neptuniibacter、硝化球菌属（Nitrococcus）、假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、Psychromonas、Reinekea、小立克次体属（Rickettsiella）、Saccharophagus、斯瓦尼菌属（Shewanella）、Succinatimonas、Teredinibacter、Thioalkalimicrobium、Thioalkali弧菌属（Thioalkalivibrio）、Thiomicrospira、Tolumonas、弧菌目（Vibrionales）、放线杆菌属（Actinobacillus）、Aggregatibacter、Gallibacterium、嗜血杆菌属（Haemophilus）、嗜组织菌属（Histophilus）、曼氏杆菌属（Mannheimia）、巴斯德菌属（Pasteurella）、固氮菌属（Azotobacter）、纤维弧菌属（Cellvibrio）、假单胞菌属（Pseudomonas）、Aliivibrio、Grimontia、发光细菌属（Photobacterium）、发光细菌属（Photobacterium）、弧菌属（Vibrio）、假黄单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、狭长平胞属（Stenotrophomonas）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、木杆菌属（Xylella）、疏螺旋体属（Borrelia）、短螺旋体属（Brachyspira）、钩端螺旋体属（Leptospira）、螺旋体属（Spirochaeta）、密螺旋体属（Treponema）、Hodgkinia、Puniceispirillum、Liberibacter、Pelagibacter、Odyssella和Accumulibacter，尤其是枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）、谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）、大肠杆菌（E. coli）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、不动杆菌属（Acinetobacter sp.）、伯霍尔德杆菌属（Burkholderia sp.）、Burkholderia thailandensis、蓝细菌（cyanobacteria）、克雷伯菌属（Klebsiella sp.）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、沙门氏菌属（Salmonella sp.）、根瘤菌属（Rhizobium sp.）和苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞是肠细菌，最优选大肠杆菌。
当根据本发明的全细胞催化剂除了脂肪酸还原酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和转氨酶而外还含有丙氨酸脱氢酶，以便从无机含氮分子再生在末端醛基的胺化过程中被转氨酶消耗掉的丙氨酸时是有利的。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“丙氨酸脱氢酶”被理解为是指这样的酶：其在消耗水和NAD+的情况下催化L-丙氨酸向丙酮酸盐、氨和NADH的转化和逆反应。在一个特别优选的实施方案中，所述丙氨酸脱氢酶选自包括以下丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列及其变体的丙氨酸脱氢酶：得自枯草芽孢杆菌(数据库代码L20916)、豌豆根瘤菌(数据库代码CP001622)、溶蛋白弧菌(数据库代码AF070716)、结核分枝杆菌(数据库代码X63069)、产气肠杆菌(数据库代码AB013821)的丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列，EGR93259.1、YP_003654745.1、YP_003651439.1、YP_003637111.1、YP_003631815.1、YP_001327051.1、YP_001262560.1、YP_886996.1、YP_882850.1、YP_704410.1、YP_703508.1、ZP_08624689.1、YP_001230376.1、P17557.1、P17556.1、CCB94892.1、CCB73698.1、YP_001168635.1、YP_004668736.1、YP_004569425.1、YP_003513168.1、YP_004561169.1、ZP_08554945.1、YP_400777.1、ZP_08311476.1、ZP_08310170.1、ZP_08267322.1、ZP_08263846.1、ZP_07898723.1、YP_149301.1、YP_148605.1、YP_004340432.1、EFT09946.1、EFS80513.1、EFS51332.1、EFS42459.1、YP_003060895.1、YP_003059033.1、ZP_03305373.1、YP_847214.1、YP_004095847.1、YP_003338282.1、YP_003337256.1、YP_355846.1、YP_253131.1、ZP_08197563.1、ZP_08196283.1、ADW06447.1、YP_734091.1、NP_372233.1、NP_102173.1、ZP_08170259.1、EGD36706.1、EGD32748.1、ZP_08155540.1、YP_004142849.1、YP_002417649.1、YP_001301040.1、YP_002992892.1、YP_081348.1、YP_080482.1、YP_002476349.1、ZP_08115025.1、ZP_08114403.1、YP_003552869.1、YP_002358112.1、YP_575010.1、YP_477594.1、YP_474564.1、YP_130399.1、YP_129373.1、YP_123314.1、NP_810467.1、NP_646469.1、NP_626044.1、NP_391071.1 (由SEQ ID NO: 11编码)、ZP_08086822.1、ZP_08084776.1、ZP_08083119.1、ZP_08020768.1、ZP_08013590.1、ZP_08011832.1、YP_003783744.1、YP_002781576.1、YP_002780533.1、ZP_02195873.1、NP_797482.1、ZP_07645051.1、ZP_07643260.1、ZP_06611917.1、AAT40119.1、ZP_07864946.1、YP_004068409.1、YP_002796203.1、YP_002774420.1、YP_003600348.1、YP_003599946.1、YP_003565624.1、YP_003565223.1、YP_335198.1、YP_423850.1、YP_155059.1、ZP_07843538.1、ZP_07841226.1、ZP_06928932.1、ZP_05692073.1、ZP_05687006.1、ZP_04867480.1、YP_775531.1、CBE70214.1、ZP_07721182.1、ZP_04302850.1、ZP_04298961.1、ZP_04287684.1、ZP_04277177.1、ZP_04248389.1、ZP_04235899.1、ZP_02159718.1、ZP_02152178.1、YP_003974610.1、YP_003546595.1、YP_002317127.1、ZP_07313778.1、ZP_07302778.1、ZP_07298850.1、CBK69442.1、YP_003413835.1、YP_003595089.1、ZP_06807811.1、YP_003582455.1、YP_003464731.1、YP_003496397.1、YP_003421918.1、CBL07274.1、CBK64956.1、YP_003508515.1、AAL87460.1、AAC23579.1、AAC23578.1、AAC23577.1、ACU78652.1、YP_003471439.1、YP_003452777.1、ZP_06384971.1、ACY25368.1、ABC26869.1、AAP44334.1、EEZ80018.1、ZP_05110458.1、1PJB_A、ZP_04717201.1、ZP_04689103.1、CAO90307.1、CAM75354.1、CAA44791.1、BAA77513.1、EGR96638.1、EGL90046.1、YP_004510847.1、ZP_08450330.1、YP_003387804.1、YP_003058152.1、EFS74272.1、EFS67128.1、ZP_06844564.1、YP_826658.1、YP_001195249.1、YP_003095978.1、YP_469292.1、YP_004442054.1、YP_004461174.1、YP_004055616.1、YP_003576656.1、YP_003094537.1、YP_001295973.1、AEE71143.1、YP_004447480.1、YP_003761844.1、YP_040853.1、YP_003154888.1、YP_003142045.1、YP_002280953.1、NP_371963.1、NP_422368.1、EGC98966.1、EGC76398.1、YP_004263661.1、YP_004252039.1、YP_679036.1、YP_499973.1、ZP_08054972.1、ZP_08053009.1、ZP_04067276.1、ZP_03968868.1、ZP_03963857.1、ZP_03933079.1、ZP_03497046.1、ZP_06668924.1、ZP_06667106.1、ZP_06324464.1、ZP_06196777.1、ZP_05114159.1、ZP_05083968.1、ZP_05070370.1、ZP_05030022.1、ZP_04673064.1、ZP_03517011.1、ZP_03505783.1、XP_001310698.1、ABK27691.1和CAB59281.2。对于由丙氨酸脱氢酶催化的反应，不仅需要存在丙酮酸盐（其形成为适合作为全细胞催化剂的任何细胞的初级代谢的一部分），而且也需要存在铵。后者通常以无机氮盐的形式提供，例如铵盐、硝酸盐等。优选地，将铵盐（例如氯化铵）加入水性反应介质中。
此外，当根据本发明的全细胞催化剂表达烷烃羟化酶和任选的对于烷烃羟化酶的活性而言所必需的其它酶时是有利的，尤其是对于下述情况而言：使用仅具有一个末端羧基官能团的脂肪酸作为生产二胺的底物。然后，烷烃羟化酶和/或额外表达的醇脱氢酶氧化末端碳原子直至为醛基，所述醛基随后可以被转氨酶胺化，或氧化为羧基，所述羧基被α-双加氧酶或由脂肪酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合转化为末端醛基，所述醛基随后可以被转氨酶胺化。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“烷烃羟化酶”被理解为是指这样的酶：其催化未被取代的含有至少6个、优选12个碳原子的直链烷基残基的羟基化。
根据本发明，众多氧化体系（尤其如在PCT/EP 2008/067447中所述的）适合作为烷烃羟化酶。在一个优选的实施方案中，所述烷烃羟化酶是CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。在一个优选的实施方案中，术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”被理解为是指这样的细胞溶质氧化酶：其是另外含有铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的3-组分体系的一部分，具有烷烃结合位点和将烷烃羟基化的能力。在一个特别优选的实施方案中，它是：与得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)具有至少80%、优选90%、最优选95%或99 %序列同一性的酶，或者是含有一种多肽序列且另外具有烷烃羟化酶活性的酶，所述多肽序列与得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)具有至少80%、优选90%、最优选95%或99 %序列同一性。如贯穿本申请的，所述数据库代码在这里是指基于NCBI (国家生物技术信息中心, Bethesda, USA)的数据库，更精确讲，2012年11月21日可在线获得的版本。在一个优选的实施方案中，术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”被理解为是指非膜结合的氧化酶，其包括用于烷烃、未被取代的直链烷基残基（包括至少5个、优选12个碳原子）或单羟基化的烷烃的结合位点，且其多肽链含有基序LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN。在一个优选的实施方案中，本文中使用的“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”是得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)或其变体，其优选地具有烷烃羟化酶活性。
为了给CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶最佳地供给来自还原剂（优选NADH）的电子，优选的是，所述细胞表达烷烃羟化酶以及在功能上与它相互作用的铁氧还蛋白还原酶和在功能上与它相互作用的铁氧还蛋白。这些可以是分离的多肽，或在使用全细胞催化剂的情况下，是共表达的多肽，或是在N-或C-端与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶融合的多肽。本领域技术人员可以如下容易地确定铁氧还蛋白还原酶或铁氧还蛋白与给定的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是否在功能上彼此相互作用：与缺少所述3种物质中的至少一种的情况相比，在有烷烃底物和所述3种多肽存在下是否会更有效地氧化还原剂。或者可以使用Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M,和Hauer, B.(2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727描述的酶试验，在功能上相互作用的多肽的情况中，该试验显示出反应速率的显著增加。在一个特别优选的实施方案中，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶源自相同生物体。在一个特别优选的实施方案中，它们是得自Alcanivorax borkumensis SK2的铁氧还蛋白还原酶(数据库代码YP_691923)或其变体、得自Alcanivorax borkumensis SK2的铁氧还蛋白(数据库代码YP_691920)或其变体、和得自Alcanivorax borkumensis SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)或其变体。
在另一个优选的实施方案中，所述烷烃羟化酶是AlkB单加氧酶。AlkB是首先从得自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkBGT体系已知的氧化还原酶，其依赖于另外2种多肽AlkG和AlkT。AlkT被表征为FAD依赖性的红素氧还蛋白还原酶，其将电子从NADH传递至AlkG。AlkG是一种红素氧还蛋白（含铁的氧化还原蛋白），其作为AlkB的直接电子供体起作用。在一个优选的实施方案中，术语“AlkB单加氧酶”是这样的多肽：其与恶臭假单胞菌Gpo1的AlkB的序列(数据库代码: CAB54050.1；象在本申请中使用的所有其它数据库代码一样，该数据库代码源自现有技术，即源自NCBI数据库，更精确讲，在2012年10月15日可在线得到的版本)具有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%的序列同源性（按照递增优选次序给出），且具有氧化烷烃的能力。在一个特别优选的实施方案中，所述AlkB单加氧酶是氧化烷烃的氧化还原酶，其在功能上与得自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkG (CAB54052.1)和AlkT (CAB54063.1)多肽相互作用。为了给AlkB烷烃羟化酶最佳地供给电子，优选的是，所述细胞表达单加氧酶以及在功能上与它相互作用的辅助蛋白，优选AlkG和/或AlkT或它们各自的变体，其中在一个特别优选的实施方案中，这些再次是得自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkG (CAB54052.1)和AlkT (CAB54063.1)多肽。
在全细胞催化剂的使用中，问题可以源自：必须使底物与位于细胞内的酶接触，从而发生期望的反应。在长链烷烃及其衍生物的情况下，优选的是，全细胞催化剂含有AlkL家族的多肽。AlkL是得自恶臭假单胞菌的膜蛋白，其可以将长链脂肪酸及其衍生物输入细菌细胞中。在一个优选的实施方案中，本文中使用的“AlkL家族的多肽”是这样的多肽：其在230个连续氨基酸的长度上与得自恶臭假单胞菌的AlkL (数据库代码CAB69081)或得自恶臭假单胞菌的AlkL的变体具有至少80%、优选90%、更优选90%的序列同一性，且优选地具有促进长链烷烃向细胞内部输入的能力。在另一个实施方案中，本文中使用的“AlkL家族的多肽”是位于革兰氏阴性细菌的外膜中的多肽，其具有序列基序DXWAPAXQ(V/A)GXR，其中X代表形成蛋白的氨基酸，且优选地另外是得自恶臭假单胞菌的AlkL (数据库代码CAB69081)或其变体。AlkL家族的成员的例子包括得自恶臭假单胞菌(数据库代码CAB69081)、水油海杆菌（Marinobacter aquaeolei）VT8 (数据库代码YP_957722)、Oceanicaulis alexandriiHTCC2633 (数据库代码ZP_00953584)、Marinobacter manganoxydans MnI7-9 (数据库代码ZP_09158756)、柄杆菌K31 (数据库代码YP_001672217)、食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）(数据库代码Q00595)的AlkL及其变体。
本发明的教导不仅可以使用具有精确氨基酸或核酸序列的大分子（在本文中引用）来实现，或者不仅可以使用相对于各自的野生型具有降低的带精确氨基酸序列的多肽活性的细胞（在本文中引用）来实现，而且可以使用这样的大分子的变体、或与各个细胞的各自的野生型相比具有降低的多肽变体活性的细胞（其可以通过一个或超过一个氨基酸或核酸的删除、添加或置换而得到）来实现。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语核酸序列或氨基酸序列的“变体”（在下面与术语“同系物”等效地且可交换地使用）是指另一种核酸或氨基酸序列，其包括或者是这样的序列：其相对于相应的原始野生型核酸-或氨基酸序列，具有70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更高百分比的同源性（在这里与同一性等效使用），其中优选地，除了形成催化活性中心的氨基酸或者为结构或折叠所必需的那些氨基酸以外的氨基酸被删除或置换，或者它们仅仅被保守地置换，例如用谷氨酸替换天冬氨酸，或用亮氨酸替换缬氨酸。现有技术描述了可以用于计算2个序列的同源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版。在本发明的另一个更优选的实施方案中，优选地除了前述序列同源性以外，氨基酸-或核酸序列的变体基本上具有与野生型分子或原始分子相同的酶活性。例如，作为蛋白酶的酶活性多肽的变体具有与该多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个特殊的实施方案中，术语“基本上相同的酶活性”是指，关于野生型多肽的底物的活性，其明显高于背景活性，或/和与野生型多肽关于相同底物表现出的KM和/或kcat值相差小于3个、更优选2个、还更优选1个数量级。在另一个优选的实施方案中，术语核酸-或氨基酸序列的“变体”包含所述核酸-或氨基酸序列的至少一个活性部分或片段。在另一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“活性部分”是指这样的氨基酸序列或核酸序列：其具有比全长氨基酸序列更小的氨基酸序列或编码比全长氨基酸序列更小的氨基酸序列，其中具有比野生型氨基酸序列更小长度的氨基酸序列或编码的氨基酸序列具有与野生型多肽或其变体（例如蛋白酶）基本上相同的酶活性。在一个具体实施方案中，术语核酸的“变体”包括这样的核酸：其互补链结合野生型核酸，优选地在严谨条件下。对于本领域技术人员而言，杂交反应的严谨性是容易确定的，且通常取决于探针的长度、洗涤温度和盐浓度。一般而言，较长的探针需要较高的杂交温度，而较短的探针与较低温度一起使用。杂交是否发生，通常取决于变性的DNA与在它们附近存在的互补链退火的能力，更确切地说在解链温度以下。杂交反应的严谨性和相应的条件更详细地描述在：F. M. Ausubel (1995), CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.。借助杂交鉴别DNA序列的说明本领域技术人员尤其可见于Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, 德国, 1993)的手册“The DIG system User’s Guide for Filter Hybridization”中和在Liebl等人(International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))中。在一个优选的实施方案中，所述杂交在严谨条件下进行，也就是说，仅形成这样的杂交体：其中探针和靶序列（即用探针处理的多核苷酸）具有至少70%同一性。已知的是，缓冲液组成、温度和盐浓度的变化会影响和/或决定包括洗涤步骤的杂交的严谨性。一般而言，与洗涤步骤相比，在相对低的严谨性下进行杂交反应(Hybaid Hybridisation Guide, HybaidLimited, Teddington, UK, 1996)。例如，在约50℃-68℃的温度下，可以使用与5x SSC缓冲液相应的缓冲液用于杂交反应。在此，探针还可以与这样的多核苷酸杂交：所述多核苷酸与所述探针的序列具有小于70%的同一性。这样的杂交体具有更低的稳定性，并且通过在严谨条件下的洗涤来除去。这可以例如如下实现：通过将盐浓度降低至2x SSC，和任选地随后降低至0.5x SSC (The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization,Boehringer Mannheim, 曼海姆, 德国, 1995)，其中按照递增优选次序，建立约50℃- 68℃、约52℃- 68℃、约54℃- 68℃、约56℃- 68℃、约58℃- 68℃、约60℃- 68℃、约62℃-68℃、约64℃- 68℃、约66℃- 68℃的温度。约64℃-68℃或约66℃-68℃的温度范围是优选的。任选地还可以将盐浓度降低至与0.2x SSC或0.1x SSC相应的浓度。通过使杂交温度以约1-2℃的步长从50℃逐步升高至68℃，可以分离这样的多核苷酸片段：例如，按照递增优选次序，其与使用的核酸分子的序列具有至少70%、或至少80%、或至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同一性。关于杂交的其它说明，可以在市场上以所谓的试剂盒(例如DIG Easy Hyb，得自公司RocheDiagnostics GmbH, 曼海姆, 德国, 目录号1603558)的形式得到。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语核酸的“变体”包括这样的任意核酸序列：其在遗传密码简并性的范围内，编码与原始核酸相同的氨基酸序列或该氨基酸序列的变体。
在一个优选的实施方案中，根据本发明使用的细胞具有与其野生型相比至少一种酶的活性降低，所述酶催化脂肪酸的β-氧化反应之一，其中这优选地为选自以下的酶：脂肪酸辅酶A连接酶、酰基辅酶A脱氢酶、2,4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A水合酶和3-酮酰基辅酶A硫解酶、脂肪酸输入酶（Fettsäureimporter）或其变体。脂肪酸的β-氧化是普遍的代谢途径，其同样允许原核和真核生物氧化脂肪酸和使得其中所含的化学能可用于代谢。在更宽的含义上，它从将脂肪酸摄取到细胞中开始。在那里，只要条件需要它，在大肠杆菌FadE的情况下，脂肪酸首先在辅酶A脂肪酸酯的β位置处被酰基辅酶A脱氢酶氧化。或者，在大肠杆菌FadH中，通过借助2,4-二烯酰辅酶A还原酶的还原，还可以从双不饱和脂肪酸形成类似的分子。在大肠杆菌FadB中，多功能的酶，烯酰辅酶A水合酶/3-羟基酰基辅酶A脱氢酶，然后催化水合，形成仲醇，随后将它氧化为酮。在最后一步中，在大肠杆菌FadA的情况下，3-酮酰基辅酶A硫解酶催化酮酰基辅酶A的裂解，结果是，释放出乙酰辅酶A和与起始分子相比缩短了2个碳原子的脂肪酸的辅酶A酯。如果它也不是乙酰辅酶A，则可以将后者重新送入β氧化循环，并通过氧化而缩短。FadR也参与脂肪酸的β氧化的调节，Fad操纵子的调节基因，所述Fad操纵子包含脂肪酸的降解所必需的基因，但是FadR不会催化β氧化反应。在一个优选的实施方案中，术语“催化脂肪酸的β氧化反应之一的酶”被理解为是指这样的所有酶：其与脂肪酸底物或在通向乙酰辅酶A的途径上的从所述脂肪酸底物形成的分子直接相互作用，优选地将它识别为底物，并催化它转化为在该降解途径上更接近乙酰辅酶A的代谢产物，优选地包括实现将脂肪酸摄取到细胞中的脂肪酸输入酶。例如，根据上述定义，这些酶包括酰基辅酶A脱氢酶，因为它与脂肪酸辅酶A酯相互作用，并催化它向烯酰辅酶A的转化，所述烯酰辅酶A在β氧化的代谢途径上比脂肪酸辅酶A酯更接近乙酰辅酶A。在一个特别优选的实施方案中，本文中使用的术语“催化脂肪酸的β氧化反应之一的酶”被理解为是指这样的任意酶：其选自得自大肠杆菌的基因产物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE，和/或它们的变体或得自其它生物体的同系物。得自大肠杆菌的基因产物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE，以及变体和许多其它生物技术上有用的生物体的同系物，和它们的核酸-和多肽序列，被描述在现有技术中，例如在登录号AP009048.1下的FadA、在登录号BAE77457.1下的FadB、在登录号BAA15609.1下的FadD、和在登录号BAA77891.2下的FadE。现有技术公开了许多特别适合用于测量酶的活性的试验，所述酶催化脂肪酸的β氧化反应之一，例如在下述文献中：KKameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, Hi Marrakchi, W EDeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y So等人(2003) Biochem. J. 370, 1055-1062, Lobo等人(2001)和X Yu, T Liu, F Zhu,和C Khosla (2011) PNAS, 印刷前的电子出版物。
就根据本发明的全细胞催化剂的效率而言，有利的是，要转化的底物、优选羧酸或二羧酸或其单酯可以容易地接触根据本发明必需的酶，所述酶位于全细胞催化剂的内部。因此，至关重要的是，所述底物可以到达细胞的内部。为了使其变得容易，优选的是，在细菌、尤其是革兰氏阴性全细胞催化剂的情况下，所述全细胞催化剂表达脂肪酸输入酶，特别优选脂肪酸输入酶FadL (数据库代码: BAA16205.1)或变体，优选地以浓度和活性与相应的全细胞催化剂的野生型的活性相比增加。通过本领域技术人员常规地可接近的多种途径，可以实现多肽活性与细胞的野生型相比的增加，所述途径例如：掺入在功能上与启动子连接的编码多肽的核苷酸序列的额外拷贝，或将天然启动子置换为更强的启动子。
已经表明，根据本发明，在下述情况下，以更高产率和纯度生产胺和二胺：优化在全细胞催化剂中内源性地表达的酶的背景，从而降低或关闭内源酶的活性，所述内源酶在代谢途径中降解根据本发明的方法或使用根据本发明的细胞的反应物、中间产物或产物（优选ω-氨基羧酸、ω-羟基羧酸、ω-氧代羧酸和二羧酸的甲酯），或者以偏离期望产物的形成的其它方式修饰它们。在该背景下，可能有利的是，根据本发明的全细胞催化剂是这样的细胞，其具有与它的野生型相比降低的酯酶BioH [数据库代码YP_492020.1]或其变体的活性。这样的具有降低的BioH活性的细胞、它们的生产和活性确定试验描述于欧洲专利申请EP12007663.3中。
对于化合物的混合物作为使用羧酸、二羧酸或其单酯的情况，在所述化合物中，末端羧基以高程度存在，优选地至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%以酯的形式存在，例如因为这些底物的更好可用性或游离羧酸或二羧酸的毒性，所述单酯可以通过完全酯化的二羧酸的部分或完全水解来提供，且所述游离羧酸通过完全酯化的羧酸的部分或完全水解来提供。对于该情况有利的是，通过合适的酯酶的过表达来增加细胞对酯水解的能力。为此，在一个优选的实施方案中，酯水解酶BioH或其变体的活性与使用的全细胞催化剂的野生型相比增加，特别优选地通过过表达。然后通过酯水解原位提供相应的单酯和/或未酯化的羧酸或二羧酸。还可以通过化学催化的水解，例如在低pH值下，实现完全酯化的二羧酸的部分或完全水解。
根据本发明的全细胞催化剂可以优选地用在将羧酸或二羧酸或其单酯转化成对应胺或二胺的方法中，其中所述羧酸或二羧酸或其单酯是式(I)的化合物
R1 - A - COOR2 (I)，
其中R1选自-H和COOR3，其中R2和R3各自并彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳原子的烃基。在一个优选的实施方案中，A是式-(CH2)n-的结构，其中n优选地是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一个优选的实施方案中，所述羧酸或二羧酸是月桂酸或ω-羧基月桂酸。在另一个最优选的实施方案中，所述羧酸是式CH3-(CH2)n-COOH的羧酸，其中n优选地是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，优选是己酸或癸酸。在另一个最优选的实施方案中，所述羧酸或二羧酸是式HOOC-(CH2)n-COOH的二羧酸，其中n优选地是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，优选是ω-羧基己酸或ω-羧基癸酸。在另一个最优选的实施方案中，所述羧酸或二羧酸是ω-羧基十四烷酸。因此，根据本发明生产的胺或二胺优选地是式CH3-(CH2)n-NH2或NH2-(CH2)n-NH2的化合物，其中n在每种情况下优选地是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
关于羧酸或二羧酸或其单酯和关于在本申请中描述的任意化学化合物，所述的各个式包括各种化合物的所有盐（质子化的或去质子化的）。例如，月桂酸不仅包括质子化形式，而且包括具有所有阳离子的月桂酸盐，例如月桂酸钠。
根据本发明的方法要求，在水溶液中使根据本发明的方法使用的酶（任选地，以根据本发明的全细胞催化剂的形式提供）与羧酸或二羧酸或其单酯接触。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“接触”被理解为是指，各自的酶与它的底物直接接触，尤其是在二者之间没有插入物理屏障诸如不透性膜等。在最简单的情况下，通过将底物加入酶或全细胞催化剂所在的水溶液中来进行所述接触。
适合用于实现根据本发明的教导的是这样的反应混合物，其包含水溶液中的根据本发明的全细胞催化剂8和式(I)的羧酸或二羧酸或其单酯，其中R1选自-H COOR3，其中R2和R3各自并彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳的烃基，优选式- (CH2)n -，其中n是至少4，特别优选至少10。这里的水溶液例如就组成、pH和温度而言，必须构造成使得所述溶液促进全细胞催化剂的生存力或至少催化能力至少一定时间。本领域技术人员已知许多适合作为水溶液的水性培养基，它们适合用于维持或培养细胞，尤其是在生物技术上重要的细胞。这些同样包括完全培养基诸如LB培养基、基本培养基诸如M9培养基和选择性培养基，例如含有高盐浓度且因此仅允许嗜盐的或至少耐盐的生物体的生长的那些。在一个优选的实施方案中，本文中使用的术语“水性培养基”被理解为是指基于水的反应介质，其就所有有关的因素（尤其是pH、盐含量和温度）而言，被构造成使得它会维持或促进其中所含的细胞（优选微生物）的生存力，并且水性培养基以及疏水有机相都以液体形式存在。从微生物学和分子生物学教科书（例如Fuchs/Schlegel, 2008），可以知悉不同的在生物技术上重要的细胞的温度需求。在一个优选的实施方案中，在接触时，水性培养基的pH值在4-9之间，更优选在4.5至8.5之间，最优选在6.5至7.5之间。在另一个优选的实施方案中，所述温度是在0-45℃之间，更优选15-40℃之间，最优选在20-37℃之间。所述反应混合物通常含于发酵罐中。可以被灭菌（优选高压灭菌）并允许培养全细胞催化剂、通气和控制反应条件（例如氧含量和温度）的任何反应容器可以充当发酵罐。
在一个优选的实施方案中，所述反应混合物除了包括水溶液以外还包括疏水有机相。这可以包含有机溶剂和/或疏水液体阳离子交换剂，所述阳离子交换剂用于从水溶液中除去ω-氨基脂肪酸。合适的溶剂和阳离子交换剂描述于EP11191520.3中。
此外，通过下述附图和非限制性实施例更具体地描述了本发明，从其中可以推知本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
图1：21.75 h处理时间以后，菌株大肠杆菌W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc]/pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)的发酵液中的单胺和二胺的检测。
实施例1
生产用于表达得自耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）的基因MSMEG_2956和得自诺卡氏菌属（Nocardia sp.）的基因npt的表达载体
为了生产用于共表达得自耻垢分枝杆菌的编码脂肪酸还原酶(YP_887275.1)的MSMEG_2956 (carA, SEQ ID No. 1)和得自诺卡氏菌属的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(ABI83656.1)（其将脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺化）的npt (SEQ ID No. 2)的载体，借助于PCR扩增两个基因，插入用于重组克隆的同源区域。在这方面，供体生物体的用于扩增基因MSMEG_2956的基因组DNA和用于扩增基因npt的合成DNA片段充当模板。所述基因是在lacuv5启动子(SEQ ID No. 3)的控制下，其同样借助于PCR从现有的载体起始进行扩增，插入用于重组克隆的同源区域。
在这方面，使用以下寡核苷酸：
Plac_H1_fw: 5‘-TTATGCGACTCCTGCTGGCTATGGTGGGATTTCC-3‘(SEQ ID Nr. 4)
Plac_H2_rv: 5‘-GATCGTCATATGCCACTCTCCTTGGTTCC-3‘(SEQ ID Nr. 5)
carA_H2_fw: 5‘-TGGCATATGACGATCGAAACGCGCG-3‘(SEQ ID Nr. 6)
carA_H3_rv: 5‘-TCCTTCTCTTACAGCAATCCGAGCATCT-3‘(SEQ ID Nr. 7)
npt_H3_fw: 5‘-GCTGTAAGAGAAGGAGTTCTATCATGATCGAG-3‘(SEQ ID Nr. 8)
npt_H4_rv: 5‘-GCAGCCTAGGTTAATTTATCAGGCGTACGCGATCG-3‘(SEQ ID Nr. 9)。
将下述参数用于扩增Placuv5和基因npt的PCR：1 x：最初变性，98℃，0:30 min；35x：变性，98℃，0:10 min，退火，55℃，0:20 min；延伸，72℃，0:15 min；1 x：末端延伸，72℃，10 min。为了扩增基因MSMEG_2956，使用以下参数：1 x：最初变性，98℃，0:30 min；35 x：变性，98℃，0:10 min，退火，65℃，0:20 min；延伸，72℃，1 min；1 x：末端延伸，72℃，10 min。为了扩增，根据生产商的推荐，使用得自New England Biolabs (Frankfurt)的PhusionTMHigh-Fidelity Master Mix。在每种情况下，然后在1%浓度的TAE琼脂糖凝胶上拆分50µlPCR反应物。以本领域技术人员已知的方式进行PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙锭染色和PCR片段大小的确定。在所有情况下，可以扩增预期大小的PCR片段。这些对于Placuv5而言为325个碱基对，对于MSMEG_2956而言为3.5千碱基对，且对于npt而言为718个碱基对。为了从琼脂糖凝胶分离DNA，使用解剖刀从凝胶切出靶DNA，并根据生产商(Qiagen, Hilden)的说明书使用QiaQuick Gel提取试剂盒纯化。根据生产商(Life Technologies, Carlsbad,CA, USA)的说明书，使用Geneart®无缝克隆和装配试剂盒通过重组将纯化的PCR产物克隆进EcoNI-和PacI-切割的pACYCDuet-1载体(Merck, Darmstadt)中。以本领域技术人员已知的方式，转化化学感受态的大肠杆菌DH10β(New England Biolabs, Frankfurt)。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过DNA测序证实插入的基因的真实性。完成的表达载体被称作pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] (SEQ ID No. 10)。
实施例2
生产用于共表达得自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的基因ald和得自紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的基因Cv2025的表达载体
为了生产得自枯草芽孢杆菌的编码丙氨酸脱氢酶(NP_391071.1)的基因ald (SEQID No. 11)和得自紫色色杆菌的编码转氨酶(NP_901695.1)的Cv_2025 (SEQ ID No. 12)的大肠杆菌表达载体，将得自枯草芽孢杆菌的基因ald（替代得自球形芽孢杆菌的基因ald）克隆进大肠杆菌表达载体pJ281_alaD_Bsp_TA_C.v.(ct) (序列和生产，参见WO/2013/024114中的实施例1和其中列出的SEQ ID No. 17)中。通过PCR从得自枯草芽孢杆菌菌株168的染色体DNA扩增得自枯草芽孢杆菌的基因ald。在这方面，使用以下的寡核苷酸：
alaDH_pCR22_fw: 5’-ATGATCATAGGGGTTCCTAAAGAG-3’
(SEQ ID No. 13)
alaDH_pCR22_rev: 5’-TTAAGCACCCGCCACAGATG-3’
(SEQ ID No. 14)。
将下述参数用于PCR：1 x：最初变性，98℃，0:30 min；35 x：变性，98℃，0:10 min，退火，65℃，0:30 min；延伸，72℃，0:20 min；1 x：末端延伸，72℃，10 min。为了扩增，根据生产商的推荐，使用得自New England Biolabs (Frankfurt)的PhusionTM High-FidelityMaster Mix。在每种情况下，然后在1%浓度的TAE琼脂糖凝胶上拆分50µl PCR反应物。以本领域技术人员已知的方式进行PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙锭染色和PCR片段大小的确定。PCR片段显示1137个碱基对的预期大小，且根据得自生产商的信息使用得自Qiagen(Hilden)的Quick PCR纯化试剂盒由PCR积成物（PCR-Ansatz）进行纯化。为连接PCR产物与载体，借助多核苷酸激酶(New England Biolabs, Frankfurt)将5’-磷酸连接至PCR产物。在这方面，遵循生产商的推荐。
将载体用限制性内切核酸酶HindIII和NdeI消化，并由此除去包含的基因球形芽 孢杆菌ald。在1%浓度的TAE琼脂糖凝胶上拆分限制酶切消化的积成物。可识别具有5696 bp和1124 bp大小的2个带。为了从琼脂糖凝胶分离载体DNA，使用解剖刀从凝胶分离5696 bp的DNA带，并根据生产商的信息使用得自Qiagen (Hilden)的Quick Gel Extraction Kit进行纯化。为了制备平头末端，使用DNA聚合酶I (New England Biolabs, Frankfurt)的克列诺片段填充纯化的载体DNA的5’-突出端。在这方面，遵循生产商的信息。将具有5’-磷酸残基的DNA片段枯草芽孢杆菌ald连接进具有平头末端的载体中。完成的大肠杆菌表达载体被称作pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (SEQ ID No. 15)。
实施例3
生产过表达得自耻垢分枝杆菌的基因MSMEG_2956和得自诺卡氏菌属的基因npt、得自枯草芽孢杆菌的ald和得自紫色色杆菌的Cv2025的大肠杆菌菌株
为了制备共表达得自耻垢分枝杆菌的编码脂肪酸还原酶(YP_887275.1)的基因MSMEG_2956和得自诺卡氏菌属的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(ABI83656.1)（其将脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺化）的npt、以及得自枯草芽孢杆菌的编码丙氨酸脱氢酶(NP_391071.1)的基因ald和得自紫色色杆菌的编码转氨酶(NP_901695.1)的Cv2025的大肠杆菌菌株，借助于电穿孔用质粒pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] (SEQ ID No. 10)和pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) (SEQ ID No. 15)转化大肠杆菌菌株W3110，并铺板在含有氯霉素(50µg/ml)和卡那霉素(50µg/ml)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析性的限制分析正确质粒的存在来检查转化体。产生的菌株被称作大肠杆菌W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc]/pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)。使用该菌株研究它从十二烷二酸出发生产十二烷二胺和从十二烷酸出发生产十二烷基胺的能力。基因产物CarA（被过表达的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶npt活化的脂肪酸还原酶）将底物十二烷酸或十二烷二酸分别转化成醛或二醛。基因产物Cv_2505的功能是，将(二)醛最终转化成十二烷基胺或十二烷二胺。基因产物ald从丙酮酸盐提供胺化反应所需的氨基供体丙氨酸。
实施例4
通过大肠杆菌菌株生产十二烷二胺和十二烷基胺，所述大肠杆菌菌株含有得自耻垢分枝杆菌的基因MSMEG_2956和得自诺卡氏菌属的基因npt的表达载体以及得自枯草芽孢杆菌的基因ald和得自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体
使用在实施例3中制备的菌株，以研究它生产十二烷基胺和十二烷二胺的能力。在DASGIP的8重平行发酵体系中，进行十二烷酸和十二烷二酸分别向十二烷基胺和十二烷二胺的生物转化。该过程的操作如下：
使用1 L反应器进行发酵。使用pH 4.0和pH 7.0的测量溶液，通过2点校准法来校准pH探头。给反应器装入300 mL饮用水，并在121℃高压灭菌20分钟，以确保无菌度。接着，将pO2探头在DASGIP体系上极化过夜(至少6小时)。次日早晨，在洁净台下取出水，并用300mL含有50 mg/L氯霉素和50 mg/L卡那霉素的高细胞密度培养基替换。随后，用1点校准法校准pO2探头(搅拌器: 400 rpm/充气: 10 sL空气/小时)，并通过原位清洁（Clean-in-Place）来清洁补料、校正试剂和诱导试剂管线。为此，将管道用70%乙醇冲洗，然后用1 MNaOH冲洗，然后用无菌的脱矿质水冲洗，最后装入各自的培养基。
首先，在含有前述抗生素的LB培养基(25 mL，在100 mL挡板烧瓶中)中在37℃和200 rpm下将生产十二烷二胺和十二烷基胺的大肠杆菌菌株从冷冻培养物培养过夜约18小时。接着，将2 mL培养物接种进含有前述抗生素的高密度细胞培养基(15 g/L的葡萄糖(30mL/L的单独高压灭菌的500 g/L原溶液，其含有1%MgSO4*7H2O和2.2%NH4Cl)、1.76 g/L(NH4)2SO4、19.08 g/L K2HPO4、12.5 g/L KH2PO4、6.66 g/L酵母浸出物、2.24 g/L柠檬酸三钠二水合物、17 mL/L的柠檬酸铁铵溶液的单独高压灭菌的1%原溶液，5 mL/L的痕量元素溶液的单独高压灭菌的原溶液(36.50 g/L HCl (37%)、1.91 g/L MnCl2*4H2O、1.87 g/LZnSO4*7H2O、0.84 g/L乙二胺四乙酸二水合物、0.30 g/L H3BO3、0.25 g/L Na2MoO4*2H2O、4.70 g/L CaCl2*2H2O、17.80 g/L FeSO4*7H2O、0.15 g/L CuCl2*2H2O)) (在100 mL挡板烧瓶中25 mL)，并在37℃/200 rpm下培养另外5.5小时。
如下以0.1的光密度接种反应器：将适当体积的预培养物吸入5 mL注射器中(在无菌条件下)，并借助插管通过涂有70%乙醇的隔膜接种反应器。
使用下述标准程序：
进行的实验可以分成2个阶段：培植，其中细胞将达到确定的光密度，和随后的生物转化，其中在加入底物十二烷酸、油酸和十二烷二酸以后，将发生由在表达过程中形成的酶实现的向十二烷基胺、油胺和十二烷二胺的转化。用氨(12.5%)将pH值单向地调节至pH6.8。在培植和生物转化过程中，通过搅拌器转速和充气速率将培养物中的溶解氧(DO)调节在30%。以补料分批方式进行发酵，其中通过DO峰触发补料开始，5 g/Lh葡萄糖补料(500 g/L葡萄糖，含有1%MgSO4*7H2O和2.2%NH4Cl)。随补料开始，温度也从以前的37℃降低至30℃。在补料开始以后2小时，通过自动加入1 mM IPTG来诱导转氨酶、丙氨酸脱氢酶、羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的表达。在开始生物转化之前，确定培养液的光密度。
在补料开始以后1 h或12 h，开始生物转化阶段。为此，将150 mL或75 mL十二烷酸或十二烷二酸和油酸(工业级90%)的混合物作为批料加入发酵液中。为了使转氨酶可得到氨基供体，在生物转化开始之前30分钟，将5 mL 3M硫酸铵溶液加入到发酵液中。为取样，从罐中取出2 mL发酵液，并将其一部分在80%乙腈、20%水和0.1%甲酸的混合物中以1/20稀释，并萃取。在生物转化开始以后1.25 h、2.75 h、4.25 h、18.25 h和21.75 h，从所有反应器中取出样品。在发酵过程中，通过在DASGIP体系上的废气分析，确定氧(OTR = 氧传递速率)和碳(CTR =碳传递速率)的转化速率。在生物转化开始以后21.75 h，结束发酵。关闭搅拌器、充气、温度控制和pH调节，并将罐静置5-10分钟。
HPLC-ESI/MS扫描方法
借助于与高分辨率MS检测偶联的HPLC/MS以扫描模式定性地评估样品。
在这里使用下述仪器：
●具有自动采样器、四元泵、PDA检测器和柱恒温箱的Accela HPLC装置(ThermoScientific, Waltham, Massachusetts, USA)
●具有ESI源的LTQ-FT质谱仪(Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts,USA)
● HPLC柱: Kinetex C18, 100 x 2.1 mm, 颗粒尺寸: 2.6µm, 孔径100Å(Phenomenex; Aschaffenburg)
通过将1950µl溶剂(80%(v/v)乙腈、20%双蒸H2O (v/v)、+ 0.1%甲酸)和50µl样品移入2 ml反应容器中，制备样品。将混合物涡旋约10秒，然后在约13 000 rpm下离心5分钟。用移液器取出澄清的上清液。
用前述HPLC柱进行HPLC分离。注射体积为0.5µL，柱温度为40℃，流速为0.3 mL/min。流动相由洗脱液A (0.02%(v/v)浓度的三氟乙酸水溶液)和洗脱液B (含有0.015%(v/v)三氟乙酸的乙腈)组成。使用下述梯度方案：
。
使用ESI源的下述参数，以正模式进行ESI-MS分析：
● ESI电压:4kV
●毛细管温度 300℃
●鞘气体流速 40
● Aux气体流速 5
●清扫气体流速 3
在m/z = 100-1000的质量范围内进行检测。质谱法分辨率为R = 100 000。
结果显示在下表中。
21.75 h处理时间以后大肠杆菌菌株W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc]/pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)的发酵液中的单胺和二胺的定性检测(n.d. = 不可检测，LS = 月桂酸，DDS = 十二烷二酸)。
在图1中解释了其它数据。
在借助于邻苯二甲醛衍生化以后，通过HPLC/UV测量，定量地确定1,12-十二烷二 胺和十二烷基胺。测量甲醇上清液。最重要的色谱参数总结在下表中。
柱 Luna 5u C8, 100Å, 150 x 4.60 mm (Phenomenex; Aschaffenburg)
HPLC装置 Agilent 1200
洗脱液A 2.5 mL乙酸(100%)至1 L双蒸水，用氢氧化钠水溶液将pH调至pH 6.0
洗脱液B 甲醇
柱温度 40℃
流速 1 mL/min
梯度 0.0-1 min: 30.0%B, 1.0-17.0 min: 90.0%B, 17-19.5 min: 90.0%B, 19.6-20.5 min: 30.0%B
检测器 DAD, 334 nm
衍生化/注射体积 借助于注射器程序自动衍生化，使1µL样品与9µL衍生化试剂反应；衍生化试剂的组成：将10 g/L邻苯二甲醛溶解在硼酸盐缓冲液(0.4 mol/L)中，加入巯基乙醇(5 mL/L)和甲醇(100 mL/L)
校准 外部校准，测量范围50-1000 mg/L，5-点校准，在样品系列之前和之后校准，通过两个校准系列取平均值，二次回归
结果显示在下表中。
底物 诱导 十二烷基胺[mg/L] 十二烷二胺[mg/L]
DDS/油酸(75 ml) 1 mM IPTG在H<sub>2</sub>O/乙醇中(12 h) n.n. 40.5
DDS/油酸(150 mL) 1 mM IPTG (1 h) n.n. 3.1
DDS/油酸(150 ml) 1 mM IPTG (12 h) n.n. &lt;1*<sup>)</sup>
LS/油酸(150 ml) 1 mM IPTG (12 h) 11.6 n.n.
21.75 h处理时间以后大肠杆菌菌株W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc]/pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)的发酵液中的单胺和二胺的定量(n.n. = 不可检测, *)低于检测限，DDS = 十二烷二酸，LS = 月桂酸)。
证实了所述菌株能够从十二烷酸、十二烷二酸和油酸分别生产胺十二烷基胺、十二烷二胺和油胺。
实施例5
生产用于表达得自亚洲栽培稻（Oryza sativa）的编码α-双加氧酶的基因αDOX的表达载体
为了生产用于表达得自亚洲栽培稻的编码α-双加氧酶(NP_001066718.1)的αDOX(Os12g0448900, SEQ ID No. 16)的载体，对该基因为在大肠杆菌中表达进行密码子优化，合成，并同时引入上游NdeI限制位点和下游AvrII限制位点。将合成的DNA片段用限制性内切核酸酶NdeI和AvrII消化，并连接进相应地切割的除去了基因carA_Ms和npt_Noc的载体pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] (SEQ ID No. 10)中。保留含于载体中的lacuv5启动子(SEQ ID No. 3)。完成的载体被称作pACYC{Placuv5}[DOX_Os(co_Ec)] (SEQ ID No.17)。载体pACYC是大肠杆菌载体，其介导氯霉素抗性且也带有p15A复制起点且因而具有低拷贝数(10-15个拷贝/细胞)。
实施例6
生产大肠杆菌菌株，其具有在基因bioH中的缺失，其过表达得自亚洲栽培稻的基因αDOX、得自枯草芽孢杆菌的基因ald和得自紫色色杆菌的基因Cv2025
为了制备这样的大肠杆菌菌株：其共表达得自亚洲栽培稻的编码α-双加氧酶(NP_001066718.1)的基因αDOX以及得自枯草芽孢杆菌的编码丙氨酸脱氢酶(NP_391071.1)的基因ald (SEQ ID No. 11)和得自紫色色杆菌的编码转氨酶(NP_901695.1)的Cv2025 (SEQID No. 12)，将大肠杆菌菌株W3110ΔbioH (生产：参见EP12007663,实施例1)借助于电穿孔用质粒pACYC{Placuv5}[DOX_Os(co_Ec)] (SEQ ID No. 17)和pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) (SEQ ID No. 15)转化，并铺板在含有氯霉素(50µg/ml)和卡那霉素(50µg/ml)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析性限制分析正确质粒的存在来检查转化体。制备的菌株被称作大肠杆菌∆bioH pACYC{Placuv5}[DOX_Os(co_Ec)]/pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)。
使用该菌株来研究它从十二烷二酸甲酯起始生产氨基十一烷酸甲酯的能力。
实施例7
通过大肠杆菌菌株从十二烷二酸甲酯起始生产氨基十一烷酸甲酯，所述大肠杆菌菌株含有得自亚洲栽培稻的基因αDOX的表达载体以及得自枯草芽孢杆菌的基因ald和得自紫色色杆菌的基因Cv_2025的表达载体
使用在实施例8中描述的菌株来研究它生产氨基十一烷酸甲酯的能力。该过程的操作如下：
首先将研究的菌株涂抹在含有50µg/ml氯霉素和50µg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，并在37℃温育过夜。作为对照，另外将大肠杆菌菌株W3110∆bioH涂抹在不含有抗生素的LB琼脂平板上。然后在含有50µg/ml氯霉素和50µg/ml卡那霉素(对于带有质粒的菌株)的Luria-Bertani液体培养基Miller (Merck, Darmstadt)中培养所述菌株，作为得自每一单一菌落的20 ml预培养物。作为主要培养物，预先将100 ml含有50µg/ml氯霉素和50µg/ml卡那霉素的LB液体培养基装入具有挡板的500 ml锥形瓶中，并接种2 ml预培养物。首先在培养箱振荡器中在37℃和200转/分钟进行培养。达到0.5 - 0.7的光密度(600 nm)时，通过加入1 mM IPTG来诱导基因表达。在22℃和200转/分钟进一步培养过夜。次日，通过在4℃和5525 x g离心10分钟，收获培养物。将上清液抛弃，并将细胞沉淀物在200 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)中洗涤。最后将细胞沉淀物溶解于含有50 mM氯化铵和0.5%(w/v)葡萄糖的200 mM磷酸钾缓冲液中，由此达到20的OD (600 nm)。将12.5 mM十二烷二酸甲酯(abcr,Karlsruhe)在乙醇中的溶液加入细胞混悬液中，并在30℃和300 rpm轻轻摇动4小时。在温育过程中，在时间0 min、60 min、120 min、180 min和240 min取样，并在80%乙腈、20%水和0.1%甲酸的混合物中萃取。借助于HPLC/MS分析，分析上清液。结果显示在下表中。
用过表达得自亚洲栽培稻的αDOX、得自枯草芽孢杆菌的ald和得自紫色色杆菌的Cv_2025的大肠杆菌W3110∆bioH生产氨基十一烷酸甲酯。数据是峰面积(n.n. = 不可检测)。
已能证实，大肠杆菌菌株W3110ΔbioH pACYC{Placuv5}[DOX]/pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)能够由十二烷二酸甲酯起始形成氨基十一烷酸甲酯。
序列表
<110> Evonik Industries AG
<120> 从羧酸或二羧酸或其单酯生产胺和二胺
<130> 2012000206
<160> 17
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 3507
<212> DNA
<213> 耻垢分枝杆菌
<400> 1
atgacgatcg aaacgcgcga agaccgcttc aaccggcgca ttgaccactt gttcgaaacc 60
gacccgcagt tcgccgccgc ccgtcccgac gaggcgatca gcgcggctgc cgccgatccg 120
gagttgcgcc ttcctgccgc ggtcaaacag attctggccg gctatgcgga ccgccctgcg 180
ctcggcaagc gcgccgtcga gttcgtcacc gacgaagaag gccgcaccac cgcgaagctc 240
ctgccccgct tcgacaccat cacctaccgt cagctcgcag gccggatcca ggccgtgacc 300
aatgcctggc acaaccatcc ggtgaatgcc ggtgaccgcg tggccatcct gggtttcacc 360
agtgtcgact acacgacgat cgacatcgcc ctgctcgaac tcggcgccgt gtccgtaccg 420
ctgcagacca gtgcgccggt ggcccaactg cagccgatcg tcgccgagac cgagcccaag 480
gtgatcgcgt cgagcgtcga cttcctcgcc gacgcagtcg ctctcgtcga gtccgggccc 540
gcgccgtcgc gactggtggt gttcgactac agccacgagg tcgacgatca gcgtgaggcg 600
ttcgaggcgg ccaagggcaa gctcgcaggc accggcgtcg tcgtcgagac gatcaccgac 660
gtactggacc gcgggcggtc actcgccgac gcaccgctct acgtgcccga cgagaccgac 720
ccgctgaccc ttctcatcta cacctccggc agcaccggca ctcccaaggg cgcgatgtac 780
cccgagtcca agaccgccac gatgtggcag gccgggtcca aggcccggtg ggacgagacc 840
ctcggcgtga tgccgtcaat caccctgaac ttcatgccca tgagtcacgt catggggcgc 900
ggcatcctgt gcagcacact cgccagcggc ggaaccgcgt acttcgccgc acgcagcgac 960
ctgtccacct tcctggagga cctcgccctc gtgcggccca cgcagctcaa cttcgttcct 1020
cgcatctggg acatgctgtt ccaggagtac cagagccgcc tcgacaaccg ccgcgccgag 1080
ggatccgagg accgagccga agccgcagtc ctcgaagagg tccgcaccca actgctcggc 1140
gggcgattcg tttcggccct gaccggatcg gctcccatct cggcggagat gaagagctgg 1200
gtcgaggacc tgctcgacat gcatctgctg gagggctacg gctccaccga ggccggcgcg 1260
gtgttcatcg acgggcagat ccagcgcccg ccggtcatcg actacaagct ggtcgacgtg 1320
cccgatctcg gctacttcgc cacggaccgg ccctacccgc gcggcgaact tctggtcaag 1380
tccgagcaga tgttccccgg ctactacaag cgtccggaga tcaccgccga gatgttcgac 1440
gaggacgggt actaccgcac cggcgacatc gtcgccgagc tcgggcccga ccatctcgaa 1500
tacctcgacc gccgcaacaa cgtgctgaaa ctgtcgcagg gcgaattcgt cacggtctcc 1560
aagctggagg cggtgttcgg cgacagcccc ctggtacgcc agatctacgt ctacggcaac 1620
agcgcgcggt cctatctgct ggcggtcgtg gtcccgaccg aagaggcact gtcacgttgg 1680
gacggtgacg aactcaagtc gcgcatcagc gactcactgc aggacgcggc acgagccgcc 1740
ggattgcagt cgtatgagat cccgcgtgac ttcctcgtcg agacaacacc tttcacgctg 1800
gagaacggcc tgctgaccgg tatccgcaag ctggcccggc cgaaactgaa ggcgcactac 1860
ggcgaacgcc tcgaacagct ctacaccgac ctggccgagg ggcaggccaa cgagttgcgc 1920
gagttgcgcc gcaacggagc cgaccggccc gtggtcgaga ccgtcagccg cgccgcggtc 1980
gcactgctcg gtgcctccgt cacggatctg cggtccgatg cgcacttcac cgatctgggt 2040
ggagattcgt tgtcggcctt gagcttctcg aacctgttgc acgagatctt cgatgtcgac 2100
gtgccggtcg gcgtcatcgt cagcccggcc accgacctgg caggcgtcgc ggcctacatc 2160
gagggcgaac tgcgcggctc caagcgcccc acatacgcgt cggtgcacgg gcgcgacgcc 2220
accgaggtgc gcgcgcgtga tctcgccctg ggcaagttca tcgacgccaa gaccctgtcc 2280
gccgcgccgg gtctgccgcg ttcgggcacc gagatccgca ccgtgctgct gaccggcgcc 2340
accgggttcc tgggccgcta tctggcgctg gaatggctgg agcgcatgga cctggtggac 2400
ggcaaggtga tctgcctggt gcgcgcccgc agcgacgacg aggcccgggc gcgtctggac 2460
gccacgttcg acaccgggga cgcgacactg ctcgagcact accgcgcgct ggcagccgat 2520
cacctcgagg tgatcgccgg tgacaagggc gaggccgatc tgggtctcga ccacgacacg 2580
tggcagcgac tggccgacac cgtcgatctg atcgtcgatc cggccgccct ggtcaatcac 2640
gtcctgccgt acagccagat gttcggaccc aatgcgctcg gcaccgccga actcatccgg 2700
atcgcgctga ccaccacgat caagccgtac gtgtacgtct cgacgatcgg tgtgggacag 2760
ggcatctccc ccgaggcgtt cgtcgaggac gccgacatcc gcgagatcag cgcgacgcgc 2820
cgggtcgacg actcgtacgc caacggctac ggcaacagca agtgggccgg cgaggtcctg 2880
ctgcgggagg cgcacgactg gtgtggtctg ccggtctcgg tgttccgctg cgacatgatc 2940
ctggccgaca cgacctactc gggtcagctg aacctgccgg acatgttcac ccgcctgatg 3000
ctgagcctcg tggcgaccgg catcgcgccc ggttcgttct acgaactcga tgcggacggc 3060
aaccggcagc gcgcccacta cgacgggctg cccgtggagt tcatcgccga ggcgatctcc 3120
accatcggct cgcaggtcac cgacggattc gagacgttcc acgtgatgaa cccgtacgac 3180
gacggcatcg gcctcgacga gtacgtggac tggctgatcg aggccggcta ccccgtgcac 3240
cgcgtcgacg actacgccac ctggctgagc cggttcgaaa ccgcactgcg ggccctgccg 3300
gaacggcaac gtcaggcctc gctgctgccg ctgctgcaca actatcagca gccctcaccg 3360
cccgtgtgcg gtgccatggc acccaccgac cggttccgtg ccgcggtgca ggacgcgaag 3420
atcggccccg acaaggacat tccgcacgtc acggccgacg tgatcgtcaa gtacatcagc 3480
aacctgcaga tgctcggatt gctgtaa 3507
<210> 2
<211> 672
<212> DNA
<213> 诺卡氏菌属
<400> 2
atgatcgaga caattttgcc tgctggtgtc gagtcggctg agctgctgga gtatccggag 60
gacctgaagg cgcatccggc ggaggagcat ctcatcgcga agtcggtgga gaagcggcgc 120
cgggacttca tcggggccag gcattgtgcc cggctggcgc tggctgagct cggcgagccg 180
ccggtggcga tcggcaaagg ggagcggggt gcgccgatct ggccgcgcgg cgtcgtcggc 240
agcctcaccc attgcgacgg atatcgggcc gcggcggtgg cgcacaagat gcgcttccgt 300
tcgatcggca tcgatgccga gccgcacgcg acgctgcccg aaggcgtgct ggattcggtc 360
agcctgccgc cggagcggga gtggttgaag accaccgatt ccgcactgca cctggaccgt 420
ttactgttct gcgccaagga agccacctac aaggcgtggt ggccgctgac cgcgcgctgg 480
ctcggcttcg aggaagcgca catcaccttc gagatcgaag acggctccgc cgattccggc 540
aacggcacct ttcacagcga gctgctggtg ccgggacaga cgaatgacgg tgggacgccg 600
ctgctttcgt tcgacggccg gtggctgatc gccgacgggt tcatcctcac cgcgatcgcg 660
tacgcctgat aa 672
<210> 3
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子
<400> 3
ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtaagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttga 60
cactttatgc ttccggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca ataacaattt 120
cacacaggat ctaggaacca aggagagtgg cat 153
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ttatgcgact cctgctggct atggtgggat ttcc 34
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gatcgtcata tgccactctc cttggttcc 29
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
tggcatatga cgatcgaaac gcgcg 25
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
tccttctctt acagcaatcc gagcatct 28
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gctgtaagag aaggagttct atcatgatcg ag 32
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gcagcctagg ttaatttatc aggcgtacgc gatcg 35
<210> 10
<211> 8047
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体
<400> 10
attaacctag gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 60
acgggtcttg aggggttttt tgctgaaacc tcaggcattt gagaagcaca cggtcacact 120
gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta tttaacgacc 180
ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaat ttctgccatt catccgctta 240
ttatcactta ttcaggcgta gcaccaggcg tttaagggca ccaataactg ccttaaaaaa 300
attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc attctgccga 360
catggaagcc atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt 420
cgccttgcgt ataatatttg cccatagtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg 480
ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat 540
tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg 600
aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg 660
tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct 720
caccgtcttt cattgccata cggaactccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt 780
gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa 840
tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat 900
gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca 960
ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc 1020
ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc 1080
aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga 1140
agtgatcttc cgtcacaggt atttattcgg cgcaaagtgc gtcgggtgat gctgccaact 1200
tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt ttctatcagc 1260
tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg gtgcgtaacg gcaaaagcac cgccggacat 1320
cagcgctagc ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt gtcagtgaag 1380
tgcttcatgt ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata tgtgatacag 1440
gatatattcc gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac tgcggcgagc 1500
ggaaatggct tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga tacttaacag 1560
ggaagtgaga gggccgcggc aaagccgttt ttccataggc tccgcccccc tgacaagcat 1620
cacgaaatct gacgctcaaa tcagtggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 1680
gcgtttcccc tggcggctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc tgcctttcgg tttaccggtg 1740
tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag ttccgggtag 1800
gcagttcgct ccaagctgga ctgtatgcac gaaccccccg ttcagtccga ccgctgcgcc 1860
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggaaagac atgcaaaagc accactggca 1920
gcagccactg gtaattgatt tagaggagtt agtcttgaag tcatgcgccg gttaaggcta 1980
aactgaaagg acaagttttg gtgactgcgc tcctccaagc cagttacctc ggttcaaaga 2040
gttggtagct cagagaacct tcgaaaaacc gccctgcaag gcggtttttt cgttttcaga 2100
gcaagagatt acgcgcagac caaaacgatc tcaagaagat catcttatta atcagataaa 2160
atatttctag atttcagtgc aatttatctc ttcaaatgta gcacctgaag tcagccccat 2220
acgatataag ttgtaattct catgttagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact 2280
gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg cctaatgagt gagctaactt 2340
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 2400
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt 2460
ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga 2520
gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt 2580
ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat 2640
gtccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg 2700
atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg 2760
ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt 2820
gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg 2880
gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg 2940
cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag 3000
aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca atggcatcct ggtcatccag 3060
cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt 3120
acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc 3180
ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt 3240
ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat 3300
gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct 3360
ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc 3420
gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca 3480
tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc gggatctcga cgctctccct 3540
tatgcgactc ctgctggcta tggtgggatt tcccttgctg aaatgggaga tccgatcatg 3600
ttcgagctct tattcaaata cactgctgtg ttggcggtaa gcgttctcga gcgcggccgc 3660
gcgatcgcac ctggtgttta aacggccggc ccctgcaggg gcagtgagcg caacgcaatt 3720
aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccc caggcttgac actttatgct tccggctcgt 3780
ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa taacaatttc acacaggatc taggaaccaa 3840
ggagagtggc atatgacgat cgaaacgcgc gaagaccgct tcaaccggcg cattgaccac 3900
ttgttcgaaa ccgacccgca gttcgccgcc gcccgtcccg acgaggcgat cagcgcggct 3960
gccgccgatc cggagttgcg ccttcctgcc gcggtcaaac agattctggc cggctatgcg 4020
gaccgccctg cgctcggcaa gcgcgccgtc gagttcgtca ccgacgaaga aggccgcacc 4080
accgcgaagc tcctgccccg cttcgacacc atcacctacc gtcagctcgc aggccggatc 4140
caggccgtga ccaatgcctg gcacaaccat ccggtgaatg ccggtgaccg cgtggccatc 4200
ctgggtttca ccagtgtcga ctacacgacg atcgacatcg ccctgctcga actcggcgcc 4260
gtgtccgtac cgctgcagac cagtgcgccg gtggcccaac tgcagccgat cgtcgccgag 4320
accgagccca aggtgatcgc gtcgagcgtc gacttcctcg ccgacgcagt cgctctcgtc 4380
gagtccgggc ccgcgccgtc gcgactggtg gtgttcgact acagccacga ggtcgacgat 4440
cagcgtgagg cgttcgaggc ggccaagggc aagctcgcag gcaccggcgt cgtcgtcgag 4500
acgatcaccg acgtactgga ccgcgggcgg tcactcgccg acgcaccgct ctacgtgccc 4560
gacgagaccg acccgctgac ccttctcatc tacacctccg gcagcaccgg cactcccaag 4620
ggcgcgatgt accccgagtc caagaccgcc acgatgtggc aggccgggtc caaggcccgg 4680
tgggacgaga ccctcggcgt gatgccgtca atcaccctga acttcatgcc catgagtcac 4740
gtcatggggc gcggcatcct gtgcagcaca ctcgccagcg gcggaaccgc gtacttcgcc 4800
gcacgcagcg acctgtccac cttcctggag gacctcgccc tcgtgcggcc cacgcagctc 4860
aacttcgttc ctcgcatctg ggacatgctg ttccaggagt accagagccg cctcgacaac 4920
cgccgcgccg agggatccga ggaccgagcc gaagccgcag tcctcgaaga ggtccgcacc 4980
caactgctcg gcgggcgatt cgtttcggcc ctgaccggat cggctcccat ctcggcggag 5040
atgaagagct gggtcgagga cctgctcgac atgcatctgc tggagggcta cggctccacc 5100
gaggccggcg cggtgttcat cgacgggcag atccagcgcc cgccggtcat cgactacaag 5160
ctggtcgacg tgcccgatct cggctacttc gccacggacc ggccctaccc gcgcggcgaa 5220
cttctggtca agtccgagca gatgttcccc ggctactaca agcgtccgga gatcaccgcc 5280
gagatgttcg acgaggacgg gtactaccgc accggcgaca tcgtcgccga gctcgggccc 5340
gaccatctcg aatacctcga ccgccgcaac aacgtgctga aactgtcgca gggcgaattc 5400
gtcacggtct ccaagctgga ggcggtgttc ggcgacagcc ccctggtacg ccagatctac 5460
gtctacggca acagcgcgcg gtcctatctg ctggcggtcg tggtcccgac cgaagaggca 5520
ctgtcacgtt gggacggtga cgaactcaag tcgcgcatca gcgactcact gcaggacgcg 5580
gcacgagccg ccggattgca gtcgtatgag atcccgcgtg acttcctcgt cgagacaaca 5640
cctttcacgc tggagaacgg cctgctgacc ggtatccgca agctggcccg gccgaaactg 5700
aaggcgcact acggcgaacg cctcgaacag ctctacaccg acctggccga ggggcaggcc 5760
aacgagttgc gcgagttgcg ccgcaacgga gccgaccggc ccgtggtcga gaccgtcagc 5820
cgcgccgcgg tcgcactgct cggtgcctcc gtcacggatc tgcggtccga tgcgcacttc 5880
accgatctgg gtggagattc gttgtcggcc ttgagcttct cgaacctgtt gcacgagatc 5940
ttcgatgtcg acgtgccggt cggcgtcatc gtcagcccgg ccaccgacct ggcaggcgtc 6000
gcggcctaca tcgagggcga actgcgcggc tccaagcgcc ccacatacgc gtcggtgcac 6060
gggcgcgacg ccaccgaggt gcgcgcgcgt gatctcgccc tgggcaagtt catcgacgcc 6120
aagaccctgt ccgccgcgcc gggtctgccg cgttcgggca ccgagatccg caccgtgctg 6180
ctgaccggcg ccaccgggtt cctgggccgc tatctggcgc tggaatggct ggagcgcatg 6240
gacctggtgg acggcaaggt gatctgcctg gtgcgcgccc gcagcgacga cgaggcccgg 6300
gcgcgtctgg acgccacgtt cgacaccggg gacgcgacac tgctcgagca ctaccgcgcg 6360
ctggcagccg atcacctcga ggtgatcgcc ggtgacaagg gcgaggccga tctgggtctc 6420
gaccacgaca cgtggcagcg actggccgac accgtcgatc tgatcgtcga tccggccgcc 6480
ctggtcaatc acgtcctgcc gtacagccag atgttcggac ccaatgcgct cggcaccgcc 6540
gaactcatcc ggatcgcgct gaccaccacg atcaagccgt acgtgtacgt ctcgacgatc 6600
ggtgtgggac agggcatctc ccccgaggcg ttcgtcgagg acgccgacat ccgcgagatc 6660
agcgcgacgc gccgggtcga cgactcgtac gccaacggct acggcaacag caagtgggcc 6720
ggcgaggtcc tgctgcggga ggcgcacgac tggtgtggtc tgccggtctc ggtgttccgc 6780
tgcgacatga tcctggccga cacgacctac tcgggtcagc tgaacctgcc ggacatgttc 6840
acccgcctga tgctgagcct cgtggcgacc ggcatcgcgc ccggttcgtt ctacgaactc 6900
gatgcggacg gcaaccggca gcgcgcccac tacgacgggc tgcccgtgga gttcatcgcc 6960
gaggcgatct ccaccatcgg ctcgcaggtc accgacggat tcgagacgtt ccacgtgatg 7020
aacccgtacg acgacggcat cggcctcgac gagtacgtgg actggctgat cgaggccggc 7080
taccccgtgc accgcgtcga cgactacgcc acctggctga gccggttcga aaccgcactg 7140
cgggccctgc cggaacggca acgtcaggcc tcgctgctgc cgctgctgca caactatcag 7200
cagccctcac cgcccgtgtg cggtgccatg gcacccaccg accggttccg tgccgcggtg 7260
caggacgcga agatcggccc cgacaaggac attccgcacg tcacggccga cgtgatcgtc 7320
aagtacatca gcaacctgca gatgctcgga ttgctgtaag agaaggagtt ctatcatgat 7380
cgagacaatt ttgcctgctg gtgtcgagtc ggctgagctg ctggagtatc cggaggacct 7440
gaaggcgcat ccggcggagg agcatctcat cgcgaagtcg gtggagaagc ggcgccggga 7500
cttcatcggg gccaggcatt gtgcccggct ggcgctggct gagctcggcg agccgccggt 7560
ggcgatcggc aaaggggagc ggggtgcgcc gatctggccg cgcggcgtcg tcggcagcct 7620
cacccattgc gacggatatc gggccgcggc ggtggcgcac aagatgcgct tccgttcgat 7680
cggcatcgat gccgagccgc acgcgacgct gcccgaaggc gtgctggatt cggtcagcct 7740
gccgccggag cgggagtggt tgaagaccac cgattccgca ctgcacctgg accgtttact 7800
gttctgcgcc aaggaagcca cctacaaggc gtggtggccg ctgaccgcgc gctggctcgg 7860
cttcgaggaa gcgcacatca ccttcgagat cgaagacggc tccgccgatt ccggcaacgg 7920
cacctttcac agcgagctgc tggtgccggg acagacgaat gacggtggga cgccgctgct 7980
ttcgttcgac ggccggtggc tgatcgccga cgggttcatc ctcaccgcga tcgcgtacgc 8040
ctgataa 8047
<210> 11
<211> 1137
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 11
atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60
gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120
cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180
ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240
tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300
gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360
gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420
caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480
gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540
gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgactt aaacgcagac 600
cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660
gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720
ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780
gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840
acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900
ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960
ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020
ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080
gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaa 1137
<210> 12
<211> 1380
<212> DNA
<213> 紫色色杆菌
<400> 12
atgcagaaac agcgtaccac ctctcagtgg cgtgaactcg atgcggcgca tcatctccat 60
ccgtttaccg ataccgcgag cctcaatcag gcgggtgcgc gtgtgatgac ccgtggcgaa 120
ggcgtgtatc tctgggatag cgaaggcaac aaaattattg atggcatggc gggcctctgg 180
tgcgtgaacg tgggctatgg ccgtaaagat tttgcggaag cggcgcgtcg tcagatggaa 240
gaactcccgt tttataacac cttctttaaa accacccatc cggcggtggt ggaactcagc 300
agcctcctcg ccgaagttac cccggcaggt tttgatcgtg tgttttatac caacagcggc 360
agcgaaagcg tggataccat gattcgtatg gtgcgtcgtt attgggatgt gcagggcaaa 420
ccggaaaaaa aaaccctcat tggccgttgg aacggctatc acggcagcac cattggcggt 480
gcgagcctcg gcggcatgaa atatatgcat gaacagggcg atctcccgat tccgggcatg 540
gcgcatattg aacagccgtg gtggtataaa catggcaaag atatgacccc ggatgaattt 600
ggcgtggttg cggcgcgttg gctcgaagaa aaaattctcg aaatcggcgc ggataaagtg 660
gcggcgtttg tgggcgaacc gattcagggt gcgggcggtg tgattgttcc gccggcaacc 720
tattggccgg aaattgaacg tatttgccgc aaatatgatg tgctcctcgt tgcggatgaa 780
gtgatttgcg gctttggccg taccggcgaa tggtttggcc atcagcattt tggctttcag 840
ccggacctct ttaccgcggc gaaaggcctc agcagcggct atctcccgat tggcgcggtg 900
tttgtgggca aacgtgttgc ggaaggtctc attgcgggcg gtgattttaa ccatggcttt 960
acctatagcg gccatccggt gtgtgcggcg gtggcgcatg cgaatgttgc ggcgctccgt 1020
gatgaaggca ttgtgcagcg tgtgaaagat gatattggcc cgtatatgca gaaacgttgg 1080
cgtgaaacct ttagccgttt tgaacatgtg gatgatgtgc gtggcgtggg catggtgcag 1140
gcgtttaccc tcgtgaaaaa caaagcgaaa cgtgaactct ttccggattt tggcgaaatt 1200
ggcaccctct gccgcgatat tttttttcgc aacaacctca ttatgcgtgc gtgcggcgat 1260
cacattgtgt ctgcaccgcc gctcgttatg acccgtgcgg aagtggatga aatgctcgcc 1320
gtggcggaac gttgcctcga agaatttgaa cagaccctca aagcgcgtgg cctcgcctaa 1380
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
atgatcatag gggttcctaa agag 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
ttaagcaccc gccacagatg 20
<210> 15
<211> 6866
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体
<400> 15
atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60
gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120
cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180
ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240
tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300
gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360
gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420
caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480
gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540
gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgactt aaacgcagac 600
cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660
gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720
ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780
gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840
acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900
ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960
ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020
ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080
gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaatta 1140
aggagatata atatgcagaa acagcgtacc acctctcagt ggcgtgaact cgatgcggcg 1200
catcatctcc atccgtttac cgataccgcg agcctcaatc aggcgggtgc gcgtgtgatg 1260
acccgtggcg aaggcgtgta tctctgggat agcgaaggca acaaaattat tgatggcatg 1320
gcgggcctct ggtgcgtgaa cgtgggctat ggccgtaaag attttgcgga agcggcgcgt 1380
cgtcagatgg aagaactccc gttttataac accttcttta aaaccaccca tccggcggtg 1440
gtggaactca gcagcctcct cgccgaagtt accccggcag gttttgatcg tgtgttttat 1500
accaacagcg gcagcgaaag cgtggatacc atgattcgta tggtgcgtcg ttattgggat 1560
gtgcagggca aaccggaaaa aaaaaccctc attggccgtt ggaacggcta tcacggcagc 1620
accattggcg gtgcgagcct cggcggcatg aaatatatgc atgaacaggg cgatctcccg 1680
attccgggca tggcgcatat tgaacagccg tggtggtata aacatggcaa agatatgacc 1740
ccggatgaat ttggcgtggt tgcggcgcgt tggctcgaag aaaaaattct cgaaatcggc 1800
gcggataaag tggcggcgtt tgtgggcgaa ccgattcagg gtgcgggcgg tgtgattgtt 1860
ccgccggcaa cctattggcc ggaaattgaa cgtatttgcc gcaaatatga tgtgctcctc 1920
gttgcggatg aagtgatttg cggctttggc cgtaccggcg aatggtttgg ccatcagcat 1980
tttggctttc agccggacct ctttaccgcg gcgaaaggcc tcagcagcgg ctatctcccg 2040
attggcgcgg tgtttgtggg caaacgtgtt gcggaaggtc tcattgcggg cggtgatttt 2100
aaccatggct ttacctatag cggccatccg gtgtgtgcgg cggtggcgca tgcgaatgtt 2160
gcggcgctcc gtgatgaagg cattgtgcag cgtgtgaaag atgatattgg cccgtatatg 2220
cagaaacgtt ggcgtgaaac ctttagccgt tttgaacatg tggatgatgt gcgtggcgtg 2280
ggcatggtgc aggcgtttac cctcgtgaaa aacaaagcga aacgtgaact ctttccggat 2340
tttggcgaaa ttggcaccct ctgccgcgat attttttttc gcaacaacct cattatgcgt 2400
gcgtgcggcg atcacattgt gtctgcaccg ccgctcgtta tgacccgtgc ggaagtggat 2460
gaaatgctcg ccgtggcgga acgttgcctc gaagaatttg aacagaccct caaagcgcgt 2520
ggcctcgcct aataatctag atcaacaact ctcctggcgc accatcgtcg gctacagcct 2580
cgggaattgc tgcaagtcga cggatcgccg gaattaattc tcatgtttga cagcttatca 2640
ctgatcagtg aattaatggc gatgacgcat cctcacgata atatccgggt aggcgcaatc 2700
actttcgtct ctactccgtt acaaagcgag gctgggtatt tcccggcctt tttgggccgg 2760
ccggatcccc ccacttcaga agttcctata cactagagaa taggaacttc actatagagt 2820
cgaataaggg cgacaccccc taattagccc gggcgaaagg cccagtcttt cgactgagcc 2880
tttcgtttta tttgatgcct ggcagttccc tactctcgca tggggagtcc ccacactacc 2940
atcggcgcta cggcgtttca cttctgagtt cggcatgggg tcaggtggga ccaccgcgct 3000
actgccgcca ggcaaacaag gggtgttatg agccatattc aggtataaat gggctcgcga 3060
taatgttcag aattggttaa ttggttgtaa cactgacccc tatttgttta tttttctaaa 3120
tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 3180
gaaaaaggaa gaatatgagc catattcaac gggaaacgtc gaggccgcga ttaaattcca 3240
acatggatgc tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg 3300
cgacaatcta tcgcttgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca 3360
aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat 3420
ttatgccact tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca 3480
ccactgcgat ccccggaaaa acagcgttcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg 3540
aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcactcgatt cctgtttgta 3600
attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc gcctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata 3660
acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag 3720
tctggaaaga aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg 3780
atttctcact tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg 3840
gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg 3900
agttttctcc ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata 3960
tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaaaagcgg cgcgccatcg 4020
aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg 4080
tggtgaatat gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc 4140
agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag 4200
tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg 4260
gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc 4320
aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga 4380
tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac 4440
gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag 4500
ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca 4560
gtattatttt ctcccatgag gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg 4620
gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc 4680
tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag 4740
gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg 4800
ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta 4860
ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac gataccgaag 4920
atagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc 4980
aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc 5040
tgttgccagt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct 5100
ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 5160
gcgggcagtg actcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt acgcgcgcgt cgttccactg 5220
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 5280
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 5340
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 5400
tgttcttcta gtgtagccgt agttagccca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 5460
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 5520
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 5580
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 5640
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 5700
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 5760
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 5820
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 5880
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 5940
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 6000
cgagtcagtg agcgaggaag cggaaggcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaactaag 6060
cagaaggccc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actctttctg tgttgtaaaa 6120
cgacggccag tcttaagctc gggccccctg ggcggttctg ataacgagta atcgttaatc 6180
cgcaaataac gtaaaaaccc gcttcggcgg gtttttttat ggggggagtt tagggaaaga 6240
gcatttgtca gaatatttaa gggcgcctgt cactttgctt gatatatgag aattatttaa 6300
ccttataaat gagaaaaaag caacgcactt taaataagat acgttgcttt ttcgattgat 6360
gaacacctat aattaaacta ttcatctatt atttatgatt ttttgtatat acaatatttc 6420
tagtttgtta aagagaatta agaaaataaa tctcgaaaat aataaaggga aaatcagttt 6480
ttgatatcaa aattatacat gtcaacgata atacaaaata taatacaaac tataagatgt 6540
tatcagtatt tattatgcat ttagaataaa ttttgtgtcg cccttattcg actcactata 6600
gaagttccta ttctctagta agtataggaa cttcacttca ttttggatcc ggccggcctg 6660
cagccccgca gggcctgtct cggtcgatca ttcagcccgg ctcatagata tgcgggcagt 6720
gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccccaggc ttgacacttt 6780
atgcttccgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaataaca atttcacaca 6840
ggatctagga accaaggaga gtggca 6866
<210> 16
<211> 1857
<212> DNA
<213> 亚洲栽培稻
<400> 16
atgggttctg gtctgttcaa gccgcgtgtt cacccggatc tgcgtgacgt tttctctaaa 60
atgtctttct tcgacaaaat cggtttcctg ttcatccacg cgttcgacaa acgtaacctg 120
tggcacaaag ttccggttcc gatcggtctg ctgtacctga acacccgtcg taccctgctg 180
gaaaaataca atctgctggc cgttggtcgt tcttctcacg gtgcgctgtt cgacccaaaa 240
gaattcctgt accgtaccga agatggtaaa tacaatgacc cgcacaacgc ggaagccggc 300
tctcaaaaca ccttctttgg tcgcaacatg gagccggttg accagcagga cgaactgatg 360
tctccggacc cgttcgttgt tgcgaccaaa ctgctggcgc gtcgtgaata caaagacacc 420
ggcaaacagt tcaacatcct ggcggcagcg tggatccagt tcatggttca cgattggatg 480
gaccacatgg aggacaccgg tcaaattggt atcaccgcgc cgaaagaagt tgcgaacgaa 540
tgcccgctga aatctttcaa attccacccg acgaaagaac tgccgaccaa ctctgacggt 600
atcaaaatcg gtcactacaa catccgtacc gcgtggtggg acggttctgc ggtttacggt 660
aacaatgaag aacgtgcgga aaaactgcgt acctacgttg acggtaaact ggttatcggt 720
gatgacggtc tgctgctgca caaagaaaac ggtgttgcgc tgtctggtga catccgcaac 780
tcttgggcgg gcgtttctat cctgcaggct ctgttcgtta aagaacacaa cgcggtttgc 840
gacgcgatca aggaagaaca cccgaacctg tctgacgaag aactgtaccg ttacgcgaaa 900
ctggttacct ctgcggttat cgcgaaagtt cacaccatcg actggaccgt tgaactgctg 960
aagaccaaaa ccatgcgtgc ggcgatgcgt gcgaactggt acggcctgct gggtaaaaaa 1020
atcaaagaca cctttggcca catcggtggt ccgatcctgg gtggtctggt tggtctgaaa 1080
aaaccaaaca accacggtgt tccgtactct ctgactgaag aattcacctc tgtgtatcgt 1140
atgcactctc tgatcccgtc taccctgaaa ctgcgtgacc cgaccggtca gccggacgcg 1200
aataactctc cgccgtgcct ggaagacatc gacatcggtg agatgatcgg tctgaaaggt 1260
gaggaacagc tgtctaaaat tggcttcgaa aaacaggcgc tgtctatggg ttaccaggcg 1320
tgtggtgcgc tggaactgtg gaactacccg tctttcttcc gtaacctgat cccacagaac 1380
ctggacggta ccaatcgttc tgaccgtatc gacctggcgg cgctggaagt ttatcgtgac 1440
cgtgaacgtt ctgttccgcg ttacaacgaa ttccgtcgtc gtctgttcct gatcccgatc 1500
aaatcttggg aagacctgac ctctgacaaa gacgcgattg aaaccatccg tgcgatctac 1560
ggtgacgacg ttgaaaaact ggacctgctg gttggtctga tggcggaaaa gaaaatcaaa 1620
ggcttcgcga tctctgaaac cgcgttcaac atcttcatcc tgatggcttc tcgtcgtctg 1680
gaagcggacc gtttcttcac ctccaacttc aacgaagaga cgtacaccaa aaaaggtatg 1740
cagtgggtta aaaccaccga aggtctgcgc gacgttatca accgtcacta tccggaaatc 1800
accgcgaaat ggatgaaatc ttcttctgcg ttctctgttt gggacgcgga ctactag 1857
<210> 17
<211> 5704
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体
<400> 17
ctaggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt 60
cttgaggggt tttttgctga aacctcaggc atttgagaag cacacggtca cactgcttcc 120
ggtagtcaat aaaccggtaa accagcaata gacataagcg gctatttaac gaccctgccc 180
tgaaccgacg accgggtcga atttgctttc gaatttctgc cattcatccg cttattatca 240
cttattcagg cgtagcacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg 300
ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga 360
agccatcaca gacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt 420
gcgtataata tttgcccata gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt 480
ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa 540
taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata 600
tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag 660
tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt 720
ctttcattgc catacggaac tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa 780
aggccggata aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca 840
gctgaacggt ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt 900
tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag 960
cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt 1020
cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt 1080
tggcccaggg cttcccggta tcaacaggga caccaggatt tatttattct gcgaagtgat 1140
cttccgtcac aggtatttat tcggcgcaaa gtgcgtcggg tgatgctgcc aacttactga 1200
tttagtgtat gatggtgttt ttgaggtgct ccagtggctt ctgtttctat cagctgtccc 1260
tcctgttcag ctactgacgg ggtggtgcgt aacggcaaaa gcaccgccgg acatcagcgc 1320
tagcggagtg tatactggct tactatgttg gcactgatga gggtgtcagt gaagtgcttc 1380
atgtggcagg agaaaaaagg ctgcaccggt gcgtcagcag aatatgtgat acaggatata 1440
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctacg ctcggtcgtt cgactgcggc gagcggaaat 1500
ggcttacgaa cggggcggag atttcctgga agatgccagg aagatactta acagggaagt 1560
gagagggccg cggcaaagcc gtttttccat aggctccgcc cccctgacaa gcatcacgaa 1620
atctgacgct caaatcagtg gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 1680
cccctggcgg ctccctcgtg cgctctcctg ttcctgcctt tcggtttacc ggtgtcattc 1740
cgctgttatg gccgcgtttg tctcattcca cgcctgacac tcagttccgg gtaggcagtt 1800
cgctccaagc tggactgtat gcacgaaccc cccgttcagt ccgaccgctg cgccttatcc 1860
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggaa agacatgcaa aagcaccact ggcagcagcc 1920
actggtaatt gatttagagg agttagtctt gaagtcatgc gccggttaag gctaaactga 1980
aaggacaagt tttggtgact gcgctcctcc aagccagtta cctcggttca aagagttggt 2040
agctcagaga accttcgaaa aaccgccctg caaggcggtt ttttcgtttt cagagcaaga 2100
gattacgcgc agaccaaaac gatctcaaga agatcatctt attaatcaga taaaatattt 2160
ctagatttca gtgcaattta tctcttcaaa tgtagcacct gaagtcagcc ccatacgata 2220
taagttgtaa ttctcatgtt agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg 2280
aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta 2340
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 2400
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct 2460
tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg 2520
cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa 2580
cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatgtccgc 2640
accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt 2700
ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa 2760
accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt 2820
gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc 2880
taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc 2940
gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa 3000
cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata 3060
gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc 3120
ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg 3180
agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac 3240
gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt 3300
cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg 3360
gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga catcgtataa 3420
cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat 3480
accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc tcgacgctct cccttatgcg 3540
actcctgctg gctatggtgg gatttccctt gctgaaatgg gagatccgat catgttcgag 3600
ctcttattca aatacactgc tgtgttggcg gtaagcgttc tcgagcgcgg ccgcgcgatc 3660
gcacctggtg tttaaacggc cggcccctgc aggggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 3720
agttagctca ctcattaggc accccaggct tgacacttta tgcttccggc tcgtataatg 3780
tgtggaattg tgagcggata acaataacaa tttcacacag gatctaggaa ccaaggagag 3840
tggcatatgg gttctggtct gttcaagccg cgtgttcacc cggatctgcg tgacgttttc 3900
tctaaaatgt ctttcttcga caaaatcggt ttcctgttca tccacgcgtt cgacaaacgt 3960
aacctgtggc acaaagttcc ggttccgatc ggtctgctgt acctgaacac ccgtcgtacc 4020
ctgctggaaa aatacaatct gctggccgtt ggtcgttctt ctcacggtgc gctgttcgac 4080
ccaaaagaat tcctgtaccg taccgaagat ggtaaataca atgacccgca caacgcggaa 4140
gccggctctc aaaacacctt ctttggtcgc aacatggagc cggttgacca gcaggacgaa 4200
ctgatgtctc cggacccgtt cgttgttgcg accaaactgc tggcgcgtcg tgaatacaaa 4260
gacaccggca aacagttcaa catcctggcg gcagcgtgga tccagttcat ggttcacgat 4320
tggatggacc acatggagga caccggtcaa attggtatca ccgcgccgaa agaagttgcg 4380
aacgaatgcc cgctgaaatc tttcaaattc cacccgacga aagaactgcc gaccaactct 4440
gacggtatca aaatcggtca ctacaacatc cgtaccgcgt ggtgggacgg ttctgcggtt 4500
tacggtaaca atgaagaacg tgcggaaaaa ctgcgtacct acgttgacgg taaactggtt 4560
atcggtgatg acggtctgct gctgcacaaa gaaaacggtg ttgcgctgtc tggtgacatc 4620
cgcaactctt gggcgggcgt ttctatcctg caggctctgt tcgttaaaga acacaacgcg 4680
gtttgcgacg cgatcaagga agaacacccg aacctgtctg acgaagaact gtaccgttac 4740
gcgaaactgg ttacctctgc ggttatcgcg aaagttcaca ccatcgactg gaccgttgaa 4800
ctgctgaaga ccaaaaccat gcgtgcggcg atgcgtgcga actggtacgg cctgctgggt 4860
aaaaaaatca aagacacctt tggccacatc ggtggtccga tcctgggtgg tctggttggt 4920
ctgaaaaaac caaacaacca cggtgttccg tactctctga ctgaagaatt cacctctgtg 4980
tatcgtatgc actctctgat cccgtctacc ctgaaactgc gtgacccgac cggtcagccg 5040
gacgcgaata actctccgcc gtgcctggaa gacatcgaca tcggtgagat gatcggtctg 5100
aaaggtgagg aacagctgtc taaaattggc ttcgaaaaac aggcgctgtc tatgggttac 5160
caggcgtgtg gtgcgctgga actgtggaac tacccgtctt tcttccgtaa cctgatccca 5220
cagaacctgg acggtaccaa tcgttctgac cgtatcgacc tggcggcgct ggaagtttat 5280
cgtgaccgtg aacgttctgt tccgcgttac aacgaattcc gtcgtcgtct gttcctgatc 5340
ccgatcaaat cttgggaaga cctgacctct gacaaagacg cgattgaaac catccgtgcg 5400
atctacggtg acgacgttga aaaactggac ctgctggttg gtctgatggc ggaaaagaaa 5460
atcaaaggct tcgcgatctc tgaaaccgcg ttcaacatct tcatcctgat ggcttctcgt 5520
cgtctggaag cggaccgttt cttcacctcc aacttcaacg aagagacgta caccaaaaaa 5580
ggtatgcagt gggttaaaac caccgaaggt ctgcgcgacg ttatcaaccg tcactatccg 5640
gaaatcaccg cgaaatggat gaaatcttct tctgcgttct ctgtttggga cgcggactac 5700
tagc 5704

Claims (24)

1.全细胞催化剂，其包含下述的异源表达：
重组α-双加氧酶；和
转氨酶，
其中在所述全细胞催化剂中表达所述重组α-双加氧酶和转氨酶，并且所述全细胞催化剂是微生物。
2.根据权利要求1所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外表达氨基酸脱氢酶。
3.根据权利要求2所述的全细胞催化剂，其中所述氨基酸脱氢酶是重组体。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外表达烷烃羟化酶。
5.根据权利要求4所述的全细胞催化剂，其中所述烷烃羟化酶是重组体。
6.根据权利要求1-3中的任一项所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外表达AlkL家族的多肽。
7.根据权利要求6所述的全细胞催化剂，其中所述多肽是重组体。
8.根据权利要求1-3中的任一项所述的全细胞催化剂，所述全细胞催化剂另外表达醇脱氢酶。
9.根据权利要求8所述的全细胞催化剂，其中所述醇脱氢酶是重组体。
10.根据权利要求1-3中的任一项所述的全细胞催化剂，其中至少一种参与β-氧化的酶的活性相对于所述全细胞催化剂的野生型降低。
11.根据权利要求1-3中的任一项所述的全细胞催化剂，其中BioH或其变体的活性相对于所述全细胞催化剂的野生型降低或升高。
12.根据权利要求1-3中的任一项所述的全细胞催化剂，其中FadL或其变体的活性相对于所述全细胞催化剂的野生型升高。
13.将羧酸或二羧酸或其单酯转化成胺或二胺的方法，所述方法包括下述步骤：
a)提供羧酸或二羧酸或其单酯，
b)使所述羧酸或二羧酸或其单酯与α-双加氧酶接触，形成醛产物，和
c)使得自步骤b)的醛产物与转氨酶接触。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤a）中通过使羧酸与烷烃羟化酶和/或醇脱氢酶接触来提供羧酸或二羧酸或其单酯。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中步骤c)中存在氨基酸脱氢酶。
16.根据权利要求13或14所述的方法，其中选自α-双加氧酶、转氨酶、氨基酸脱氢酶和烷烃羟化酶组成的组的至少一种酶以根据权利要求1-12中的任一项所述的全细胞催化剂的形式提供。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所使用的选自该组的所有酶以根据权利要求1-12中的任一项所述的全细胞催化剂的形式提供。
18.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述羧酸或二羧酸或其单酯是式(I)的化合物
R1 - A - COOR2 (I)，
其中R1选自-H和COOR3，
其中R2和R3各自彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，
前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，
其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳的烃基。
19.根据权利要求18所述的方法，其中A具有式- (CH2)n -，其中n是至少4。
20.根据权利要求19所述的方法，其中n是至少10。
21.根据权利要求1-12中的任一项所述的全细胞催化剂或根据权利要求13-20中的任一项所述的方法用于胺化羧酸或二羧酸或其单酯的用途。
22.反应混合物，其包含在水溶液中的根据权利要求1-12中的任一项所述的全细胞催化剂以及式(I)的羧酸或二羧酸或其单酯
R1 - A - COOR2 (I)，
其中R1选自-H和COOR3，
其中R2和R3各自彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基，
前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H，
其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳的烃基。
23.根据权利要求22所述的反应混合物，其中A具有式- (CH2)n -，其中n是至少4。
24.根据权利要求23所述的反应混合物，其中n是至少10。
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