CN101098967B - 用全细胞催化剂制备光学活性醇 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种借助于全细胞催化剂从酮制备光学活性的醇的方法，所述全细胞催化剂包含醇脱氢酶及能使辅因子再生的酶，进行转化的底物浓度为至少500mM酮，不用加入“外来”辅因子而进行转化。

Description

用全细胞催化剂制备光学活性醇

本发明涉及一种在存在全细胞催化剂(whole-cell catalyst)的条件下，从酮开始制备光学活性醇的方法，所述全细胞催化剂包含醇脱氢酶及能再生辅因子的酶，所述方法的特点是在>500mM的高底物浓度下(不加入辅因子)进行。

光学活性醇制品用于例如制药业和食品业是令人感兴趣的。优选的制备形式是通过在存在醇脱氢酶的条件下还原酮而获得光学活性醇。这种酮的酶促还原已经在文献中详细描述。例如，参见M.-R.Kula，U.Kragl，Dehydrogenases in the Synthesis of Chiral Compounds inStereoselective Biocatalysis(ed.：R.N.Patel)，Dekker，2000，Chapter28，p.839-866及J.D.Stewart，Dehydrogenases and Transaminases inAsymmetric Synthesis in Current Opinion in Chemical Biology2001，5，120-129所述。在这方面也已知的是在反应期间消耗的辅因子的“再生”方法。特别感兴趣的再生辅因子NAD⁺或NADP⁺的方法在于使用另一种脱氢酶，特别是甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶。使用全细胞催化剂进行还原被证明是一种优选实施方式，因为与使用纯化形式的或者其粗提物形式的分离的酶相反，使用全细胞催化剂无细胞破裂和酶纯化的额外成本。同样优选的是使用重组表达系统，因为这样可以达到高表达率。与非重组细胞例如面包酵母(baker′syeast)比较，这种重组全细胞催化剂可以较少量应用。除了较高的反应速度之外的进一步优点是避免了野生型细胞中含有的其他脱氢酶进行的非所需的二级反应。使用已经通过重组DNA技术遗传修饰的微生物的全细胞方法的优点见M.Kataoka，K.Kita，M.Wada，Y.Yasohara，J.Hasegawa，S.Shimizu，Appl.Microbiol.Biotechnol.2003，62，437-445所详述。特别地，表达醇脱氢酶和用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌(E.coli)细胞是特别合适的。

用有商业价值的高底物浓度进行还原一直特别具有挑战性。使用其中存在ADH和葡萄糖脱氢酶的全细胞催化剂，甚至可以使用>500mM的高底物浓度在两相反应系统(two-phase reaction system)中产生光学活性醇。这特别在(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备中已经被证实。然而，必需加入辅因子(在这种情况中是NADP⁺)以制备这些醇。例如N.Kizaki，Y.Yasohara，J.Hasegawa，M.Wada，M.Kataoka，S.Shimizu，Appl.Microbiol.Biotechnol.2001，55，590-595所述，NADP⁺的加入量基于使用的底物为大约0.001摩尔当量。因为NADP⁺的价格较高，因此加入的辅因子即使量较少也会明显增加所述方法的总成本。因此，不用“外来加入”辅因子的方法是有利的。

基于作为辅因子再生酶的醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的活性而不用加入辅因子的全细胞转化(通过全细胞转化底物)最近已经在A.Matsuyama，H.Yamamoto，Y.Kobayashi，Organic Process Research &Development 2002，6，558-561中描述。然而，使用的底物浓度低于250mM(例如196mM和217mM)，并且需要17—48小时的较长反应时间。使用基本上较高的底物浓度和短的反应时间(少于10小时)的相应生物转化方法还未知。

对于全细胞方法，加入辅因子的意义也在N.Itoh，M.Matsuda，M.Mabuchi，T.Dairi，J.Wang，Eur.J.Biochem.2002，269，2394-2402中描述。发现仅加入0.5mM的NAD⁺即达到满意的转化，而不加入NAD⁺则几乎没有任何产物形成。在这方面，Itoh等发现“大肠杆菌细胞中的内源NAD+/NADH不足以顺利进行反应”，伴随着必需“外来”加入辅因子。

因此本发明的目的是揭示一种从酮制备光学活性醇的快速、简便、低成本和有效的方法。

本发明的目的通过一种在存在全细胞催化剂的条件下还原酮而制备光学活性醇的方法而实现，所述全细胞催化剂包含醇脱氢酶和能使辅因子再生的酶，所述方法特征在于不用加入“外来”辅因子而对根据所用的起始体积水性溶剂为至少500mM的底物浓度进行转化。根据本发明，这应理解为通过所述方法，根据使用的起始体积水性溶剂(包括缓冲系统)为至少500mM的底物被转化，无论反应混合物中实际达到的浓度是否是至少500mM底物或者基于水性溶剂的起始体积，至少500mM的底物浓度是否全部被转化。所述方法另外特别适于使用>500mM、优选>1000mM及特别优选>1500mM的底物浓度还原酮。

然而，非常特别优选的是其中至少500mM酮的底物浓度被实际上提供用于转化的变化形式。本文提及的基于水性溶剂的起始体积，底物(酮)的浓度实际上是分批达到的，这一起始浓度在使用全细胞催化剂的保温期间何时达到是不重要的。这些浓度的酮可以在全细胞批料开始时直接一批加入，或者全细胞催化剂可以首先被用于特别的光密度，之后加入酮。同样，首先可以使用较低浓度的酮，在细胞批次的保温期间加入达到指定浓度。然而根据本发明，在底物转化为所需醇期间，在细胞批次中至少一次达到至少500mM的底物(酮)浓度。

使用这种方法，甚至不用加入“外来”辅因子即可在至少500mM、特别是>750mM及特别优选>1000mM酮的高底物浓度，令人惊奇地达到至少80％、特别是>90％及特别优选>95％的相应光学活性醇的高度至极高度转化。基于迄今已知的转化方法及已知由于在反应条件下细胞膜的通透性导致的辅因子扩散问题，这种结果是不能预料到的。这种结果特别令人惊奇的是在至少500mM疏水性酮组分的高底物浓度及<75g/l、优选<50g/l生物催化剂的低细胞浓度，细胞膜的通透性显著增大，伴随通过辅因子“洗涤出来(washingout)”进入反应介质中而丧失胞内辅因子。

可以任何希望方式加入酮。优选在开始时加入全部量的酮(“分批(batch)”方法)，或者定量加入。也可以应用连续加入方法(“连续补料方法(continuous feed-in process)”)。

根据本发明，使用本文所述方法制备光学活性醇。本领域技术人员原则上已知借助于醇脱氢酶将酮转化为光学活性醇(见上述参考文献)。为了获得光学活性醇，特别优选使用其取代基彼此不同的酮。本领域技术人员也已知可以从相应酮制备光学活性醇。它们可以纳入在如下通式所表示的化合物：

其中R和R′彼此不同，是(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₈)-烷氧基、HO-(C₁-C₈)-烷基、(C₂-C₈)-烷氧基烷基、(C₆-C₁₈)-芳基、(C₇-C₁₉)-芳烷基、(C₃-C₁₈)-杂芳基、(C₄-C₁₉)-杂芳烷基、(C₁-C₈)-烷基-(C₆-C₁₈)-芳基、(C₁-C₈)-烷基-(C₃-C₁₈)-杂芳基、(C₃-C₈)-环烷基、(C₁-C₈)-烷基-(C₃-C₈)-环烷基、(C₃-C₈)-环烷基-(C₁-C₈)-烷基。

生物催化剂的浓度不超过75g/l，在一个优选实施方案中至多为50g/l、优选至多为25g/l、特别优选至多为15g/l，g是基于湿生物量的g(bio wet mass，BWM)。所述生物催化剂应理解为尤其是全细胞催化剂。

在一个优选的实施方案中，不加入有机溶剂而将酮转化为所需的光学活性醇。这意味着在含有所述生物催化剂的批料中未加入有机溶剂。

另外优选在合适的全细胞催化剂的细胞悬浮液中进行转化，所用的酮可以在细胞悬浮液中悬浮的形式存在或者在细胞悬浮液中的乳浊液或者溶液形式存在。

对于本发明，优选的基因之一是醇脱氢酶基因。本领域技术人员同样能随意选择编码这种醇脱氢酶的基因。优选的醇脱氢酶的例子是来自乳杆菌属(Lactobacillus)菌株的醇脱氢酶，特别是来自高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)和短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的醇脱氢酶，或者来自红球菌属(Rhodococcus)菌株的醇脱氢酶，特别是来自红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)和赤红球菌(Rhodococcus ruber)的醇脱氢酶，或者来自节杆菌属(Arthrobacter)菌株的醇脱氢酶，特别是来自石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)的醇脱氢酶。

本发明特别优选的另一基因是编码脱氢酶的基因。本领域技术人员可以随意选择编码能使辅因子再生的脱氢酶的基因。优选的能使辅因子再生的脱氢酶是葡萄糖脱氢酶，优选来自芽孢杆菌属(Bacillus)、热原体属(Thermoplasma)和假单胞菌属(Pseudomonas)菌株的葡萄糖脱氢酶，或者甲酸脱氢酶，优选来自假丝酵母(Candida)和假单胞菌菌株的甲酸脱氢酶，或者苹果酸脱氢酶(苹果酸酶)，优选来自硫化叶菌属(Sulfolobus)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属和假单胞菌属菌株的苹果酸酶以及来自大肠杆菌、特别是大肠杆菌K12的苹果酸酶。

根据本发明，“全细胞催化剂”是指完整的细胞，其中表达能催化本发明的底物转化为产物的至少一个基因。根据本发明，所述完整细胞能表达醇脱氢酶和能使辅因子再生的脱氢酶。所述全细胞催化剂优选是经遗传修饰的、适合所需转化需要的微生物。特别优选的全细胞催化剂是实验部分描述的两种全细胞催化剂。

对于含有醇脱氢酶和能使辅因子再生的酶的全细胞催化剂，所有已知细胞均是合适的。在这方面可以提及的微生物例如是酵母如多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤氏酵母(Pichiasp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，原核生物如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或者真核生物如哺乳动物细胞、昆虫细胞或者植物细胞。克隆方法为本领域技术人员所熟知(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloning：a laboratory manual，2^nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)。对于该目的优选使用大肠杆菌菌株。特别优选的是：大肠杆菌XL1Blue、NM522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP10-、HB101、BL21codon plus、BL21(DE3)codon plus、BL21、BL21(DE3)、MM294。本领域技术人员已知优选利用其可以将含有本发明的核酸的基因构建体克隆进宿主生物体中的质粒(见PCT/EP03/07148所述；见下文所述)。对于这个目的的合适质粒或者载体原则上是本领域技术人员可以获得的任何形式的质粒或载体。这种质粒和载体可见例如Studier et al.(Studier，W.F.；RosenbergA.H.；Dunn J.J.；Dubendroff J.W.；(1990)，Use of the T7RNApolymerase to direct expression of cloned genes，Methods Enzymol.185，61-89)所述，或者见例如Novagen，Promega，New England Biolabs，Clontech或者Gibco BRL的指导手册所述。进一步优选的质粒和载体可见于Glover，D.M.(1985)，DNA cloning：a practical approach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.and Denhardt，D.T(eds)(1988)，Vectors：a survey of molecular cloning vectors and theiruses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.(1990)，Systemsfor heterologous gene expression，Methods Enzymol.185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloning：a laboratory manual，2^nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork所述。

利用其可以非常优选地将含有本发明核酸序列的基因构建体克隆进宿主生物体中的质粒是或者基于：pUC18/19(RocheBiochemicals)、pKK-177-3H(Roche Biochemicals)、pBTac2(RocheBiochemicals)、pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)、pKK-233-3(Stratagene)或者pET(Novagen)。

在本发明方法的另一个实施方案中，所述全细胞催化剂优选在使用之前进行预处理，由此细胞膜对于底物和产物的通透性与未经处理的系统相比增加。特别优选的是所述全细胞催化剂通过例如冷冻或者用甲苯预处理的方法。

根据本发明，所述方法可以不加入“外来”辅因子进行。这意味着不需要向全细胞批料中加入额外的辅因子，因为该细胞自身已经含有并且能使用适于转化反应的辅因子。适于转化的辅因子是电子可以转移给其的那些辅因子，例如NAD(P)+H⁺和FADH₂系统。

本发明的方法可以在适合所用宿主生物体的任何反应温度下进行。特别合适的反应温度是10—90℃，优选15—50℃，特别优选20—35℃。

本领域技术人员可以随意选择反应的pH值，可以在固定的pH值进行反应，也可以在一定pH范围内变化的pH值进行反应。根据使用的宿主生物体的特别需要选择pH值。优选地，反应是在pH5—9进行，优选在pH6—8、特别优选在pH6.5—7.5进行。

将所用底物转化为所需产物的转化是在细胞培养物中使用合适的全细胞催化剂进行的。根据所用宿主生物体应用合适的营养培养基。适于宿主细胞的培养基是通常已知的并且可以商购的。另外可以向细胞培养物中加入常规的添加剂，例如抗生素、生长促进剂例如血清(胎牛血清等)及相似的已知添加剂。

(C₁-C₈)-烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或者辛基，包括其所有键的异构体。

(C₁-C₈)-烷氧基相应于(C₁-C₈)-烷基，条件是其通过氧原子与分子结合。(C₂-C₈)-烷氧基烷基是其中烷基链由至少一个氧官能团中断，其中两个氧原子可以不彼此结合。碳原子的数目表示基团中含有的碳原子总数。

(C₃-C₅)-亚烷基桥是具有3—5个碳原子的碳链，该链通过两个不同的碳原子与所研究的分子结合。

所述基团可以是由卤素和/或含有N、O、P、S、Si原子的基团单或者多取代的基团。这些特别是上述类型的烷基，在其链中含有一或多个这种杂原子或者其通过这些杂原子之一与分子结合。

(C₃-C₈)-环烷基是环丙基、环丁基、环戊基、环己基或者环庚基等。这些基团可以由一或多个卤素和/或含有N、O、P、S、Si原子的基团取代，和/或在环中可含有N、O、P、S原子，例如1-、2-、3-、4-氮杂环己基，1-、2-、3-吡咯烷基，2-、3-四氢呋喃基，2-、3-、4-吗啉基。

(C₃-C₈)-环烷基-(C₁-C₈)-烷基是如上述的环烷基，其通过上述烷基与分子结合。

在本发明中，(C₁-C₈)-酰氧基是指具有不超过8个碳原子并且通过COO官能团与分子结合的上述烷基。

在本发明中，(C₁-C₈)-酰基是指具有不超过8个碳原子并且通过CO官能团与分子结合的上述烷基。

(C₆-C₁₈)-芳基是指具有6—18个碳原子的芳基。这种基团特别包括如苯基、萘基、蒽基、菲基、联苯基化合物，或者与所研究分子融合的上述类型系统，例如茚基系统，其任选由(C₁-C₈)-烷基、(C₁-C₈)-烷氧基、NR¹R²、(C₁-C₈)-酰基、(C₁-C₈)-酰氧基取代。

(C₇-C₁₉)-芳烷基是通过(C₁-C₈)-烷基与分子结合的(C₆-C₁₈)-芳基。

在本发明中，(C₃-C₁₈)-杂芳基是具有3—18个碳原子的5、6或者7个成员的芳香环系统，在环中含有杂原子例如氮、氧或者硫原子。这种杂芳香化合物可以认为特别是例如1-、2-、3-呋喃基，1-、2-、3-吡咯基，1-、2-、3-噻吩基，2-、3-、4-吡啶基，2-、3-、4-、5-、6-、7-吲哚基，3-、4-、5-吡唑基，2-、4-、5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基，2-、4-、5-、6-嘧啶基。

(C₄-C₁₉)-杂芳烷基是相应于(C₇-C₁₉)-芳烷基的杂芳香系统。

合适的卤素(Hal)氟、氯、溴和碘。

术语水性溶剂是指水或者主要由水及水溶性有机溶剂组成的溶剂混合物，所述水溶性有机溶剂例如是醇，特别是甲醇或乙醇，或者醚，如THF或者二噁烷。

附图简述：

图1示出质粒pNO5c的图谱。

图2示出质粒pNO8c的图谱。

图3示出质粒pNO14c的图谱。

实施例：

包含来自高加索酸奶乳杆菌的(R)-醇脱氢酶和来自嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)的葡萄糖脱氢酶的全细胞催化剂的制备

菌株的制备

将大肠杆菌DSM14459的化学感受态细胞(在WO03/042412中描述)用质粒pNO5c转化(Sambrook et al.1989，Molecular cloning：ALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。这一质粒编码来自高加索酸奶乳杆菌的醇脱氢酶(Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase：a useful catalyst for synthesis.Bradshaw et al.JOC1992，571532-6，Reduction of acetophenone toR(+)-phenylethanol by a new alcohol dehydrogenase from Lactobacilluskefir.Hummel W.Ap Microbiol Biotech1990，34，15-19)。如此制备的重组大肠杆菌菌株DSM14459(pNO5c)被制成化学感受态，将其用编码来自嗜酸热原体的密码子优化的葡萄糖脱氢酶基因的质粒pNO8c转化(Bright，J.R.et al.，1993Eur.J.Biochem.211：549-554)。这两个基因均在鼠李糖启动子的控制下(Stumpp，Tina；Wilms，Burkhard；Altenbuchner，Josef.A new，L-rhamnose-inducibleexpression system for Escherichia coli.BIOspektrum(2000)，6(1)，33-36)。质粒pNO5c和pNO8c的序列和质粒图在下文示出。

活性细胞的制备

将大肠杆菌DSM14459(pNO5c，pNO8c)的一个菌落在加入了抗生素(50μg/l氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素)的2ml LB培养基中在37℃摇动(250rpm)保温18小时。将该培养物在具有鼠李糖(2g/l)作为诱导剂的新鲜LB培养基中1:100稀释，加入抗生素(50μg/l氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素)及1mM ZnCl₂，在30℃摇动(250rpm)保温18小时。通过离心(10,000g，10分钟，4℃)收获细胞，弃去上清，将细胞沉淀直接或者在-20℃贮存后用于生物转化试验中。

包含来自红串红球菌的(S)-醇脱氢酶和来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的全细胞催化剂的制备

菌株的制备

将大肠杆菌DSM14459的化学感受态细胞(在WO03/042412中描述)用质粒pNO14c转化(Sambrook et al.1989，Molecular cloning：ALaboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。这一质粒编码来自红串红球菌的醇脱氢酶(Cloning，sequenceanalysis and heterologous expression of the gene encoding a(S)-specificalcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis DSM43297.Abokitse，K.；Hummel，W.Applied Microbiology and Biotechnology2003，62380-386)和来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(Glucosedehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli.I：Purification，characterization and comparison with glucosedehydrogenase from Bacillus megaterium.Hilt W；Pfleiderer G；Fortnagel P Biochimica et biophysica acta(1991Jan29)，1076(2)，298-304)。所述醇脱氢酶是在鼠李糖启动子的控制下(Stumpp，Tina；Wilms，Burkhard；Altenbuchner，Josef.A new，L-rhamnose-inducibleexpression system for Escherichia coli.BIOspektrum(2000)，6(1)，33-36)。质粒pNO14c的序列和质粒图在下文示出。

活性细胞的制备

将大肠杆菌DSM14459(pNO14c)的一个菌落在加入了抗生素(50μg/l氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素)的2ml LB培养基中在37℃摇动(250rpm)保温18小时。将该培养物在具有鼠李糖(2g/l)作为诱导剂的新鲜LB培养基中1:100稀释，加入抗生素(50μg/l氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素)及1mM ZnCl₂，在30℃摇动(250rpm)保温18小时。通过离心(10,000g，10分钟，4℃)收获细胞，弃去上清，将细胞沉淀直接或者在-20℃贮存后用于生物转化试验中。

合成实施例1：使用包含(R)-选择性醇脱氢酶的全细胞催化剂在0.5M溶液中还原对氯代苯乙酮

在室温向Titrino反应容器中加入50ml磷酸盐缓冲液(调节为pH7.0)、25g BWM/l细胞浓度的上述具有(R)-选择性醇脱氢酶的全细胞催化剂大肠杆菌DSM14459(pNO5c，pNO8c)(大肠杆菌，来自高加索酸奶乳杆菌的(R)-醇脱氢酶，来自嗜酸热原体的葡萄糖脱氢酶)、1.5当量葡萄糖(基于使用的对氯代苯乙酮量的当量)和25mmol的对氯代苯乙酮(基于使用的磷酸盐缓冲液相应于0.5M底物浓度)。将反应混合物在室温搅拌7小时，通过加入氢氧化钠溶液(1M NaOH)保持pH恒定。在一定间隔取样本，对氯代苯乙酮的转化通过HPLC确定。在7小时的反应时间之后，转化率>99％。

合成实施例2：使用包含(S)-选择性醇脱氢酶的全细胞催化剂在0.5M溶液中还原对氯代苯乙酮

在室温向Titrino反应容器中加入50ml磷酸盐缓冲液(调节为pH7.0)、50g BWM/l细胞浓度的上述具有(S)-选择性醇脱氢酶的全细胞催化剂大肠杆菌DSM14459(pNO14c)(大肠杆菌，来自高加索酸奶乳杆菌的(S)-醇脱氢酶，来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶)、6当量葡萄糖(基于使用的对氯代苯乙酮量的当量)和25mmol的对氯代苯乙酮(基于使用的磷酸盐缓冲液相应于0.5M底物浓度)。将反应混合物在室温搅拌7.5小时，通过加入氢氧化钠溶液(1M NaOH)保持pH恒定。在一定间隔取样本，对氯代苯乙酮的转化通过HPLC确定。在7.5小时的反应时间之后，转化率为92％。

合成实施例3：使用包含(R)-选择性醇脱氢酶的全细胞催化剂在1.5M溶液中还原苯乙酮

在室温向Titrino反应容器中加入40ml磷酸盐缓冲液(调节为pH7.0)、产生光密度OD＝21.15细胞浓度的上述具有(R)-选择性醇脱氢酶的全细胞催化剂大肠杆菌DSM14459(pNO5c，pNO8c)(大肠杆菌，来自高加索酸奶乳杆菌的(R)-醇脱氢酶，来自嗜酸热原体的葡萄糖脱氢酶)、1.05当量葡萄糖(基于使用的苯乙酮量的当量)和60mmol的苯乙酮(基于使用的磷酸盐缓冲液相应于1.5M底物浓度)。将反应混合物在室温搅拌23小时，通过加入氢氧化钠溶液(2M NaOH)保持pH恒定。在一定间隔取样本，苯乙酮的转化通过HPLC确定。在16.5和23小时的反应时间之后，转化率分别为93％和97％。

序列表

<110>德古萨股份公司

<120>用全细胞催化剂制备光学活性醇

<130>040175OC

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5740

<212>DNA

<213>pNO5c with Lactobacillus kefir-ADH

<400>1

aattcttaag aaggagatat acatatgact gatcgtttaa aaggcaaagt agcaattgta     60

actggcggta ccttgggaat tggcttggca atcgctgata agtttgttga agaaggcgca    120

aaggttgtta ttaccggccg tcacgctgat gtaggtgaaa aagctgccaa atcaatcggc    180

ggcacagacg ttatccgttt tgtccaacac gatgcttctg atgaagccgg ctggactaag    240

ttgtttgata cgactgaaga agcatttggc ccagttacca cggttgtcaa caatgccgga    300

attgcggtca gcaagagtgt tgaagatacc acaactgaag aatggcgcaa gctgctctca    360

gttaacttgg atggtgtctt cttcggtacc cgtcttggaa tccaacgtat gaagaataaa    420

ggactcggag catcaatcat caatatgtca tctatcgaag gttttgttgg tgatccaact    480

ctgggtgcat acaacgcttc aaaaggtgct gtcagaatta tgtctaaatc agctgccttg    540

gattgcgctt tgaaggacta cgatgttcgg gttaacactg ttcatccagg ttatatcaag    600

acaccattgg ttgacgatct tgaaggggca gaagaaatga tgtcacagcg gaccaagaca    660

ccaatgggtc atatcggtga acctaacgat atcgcttgga tctgtgttta cctggcatct    720

gacgaatcta aatttgccac tggtgcagaa ttcgttgtcg atggtggata cactgctcaa    780

taaggatccg aattcgagct caggaggtat catatgcagc caagcttctg ttttggcgga    840

tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa    900

cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa    960

gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc   1020

caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg   1080

tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc   1140

gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat   1200

taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc ttttgtttat   1260

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc   1320

aataatatcg tccattccga cagcatcgcc agtcactatg gcgtgctgct agcgctatat   1380

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ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac   1620

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<210>2

<211>5341

<212>DNA

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<400>2

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cggctatatc aaaaagggcg atctggtggt gccgctggtg cgtcgtccgg gtaaatgcat     300

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gggcattacc ggcctgcatg gctttatgcg cgatgtgatc tatgatgata ttgaatatct     420

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ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga    1320

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gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc    l500

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cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca    1740

tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc    1800

caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg    1860

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taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg    2040

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cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg    2160

caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat    2220

taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg    2280

ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg    2340

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aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt    2640

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag    2700

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca    2760

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ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag    3660

aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg    3720

tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc    3780

agaagcgtta atgtctggct tctgataaag cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt    3840

ttggtcactt gatgcctccg tgtaaggggg aatttctgtt catgggggta atgataccga    3900

tgaaacgaga gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg    3960

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aggacccaac gctgcccgag atgcgccgcg tgcggctgct ggagatggcg gacgcgatgg    4380

atatgttctg ccaagggttg gtttgcgcat tcacagttct ccgcaagaat tgattggctc    4440

caattcttgg agtggtgaat ccgttagcga ggtgccgccg gcttccattc aggtcgaggt    4500

ggcccggctc catgcaccgc gacgcaacgc ggggaggcag acaaggtata ccatgccaac    4560

ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg tccagtgatc    4620

gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg gtcgtcatct    4680

acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga agcgagaaga    4740

atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac gtagcccagc    4800

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ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag cgacaggccg    4920

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acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac gatagtcatg    5040

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tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc    5160

accgccgccg caaggaatgg tgcatgcatc gatcaccaca attcagcaaa ttgtgaacat    5220

catcacgttc atctttccct ggttgccaat ggcccatttt cctgtcagta acgagaaggt    5280

cgcgaattca ggcgcttttt agactggtcg taatgaacaa ttcttaagaa ggagatatac    5340

a                                                                    5341

<210>3

<211>6269

<212>DNA

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<400>3

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atctcacgaa atgccgctca aggattggga taaagtcatc ggcacgaact taacgggtgc     360

ctttttagga agccgtgaag cgattaaata tttcgtagaa aacgatatca agggaaatgt     420

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cggttaatag tagaagcttc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga     840

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accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg    1800

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acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa    2280

aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg    2340

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gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac    2460

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca    2520

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt    2580

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ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg    2700

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cgtattgggg tgcgcgcaac gaactgattg aactgatcga tctggcgcat gcgggcatct    6000

ttgatatcgc ggtggaaacc ttcagcctgg ataatggcgc ggaagcgtat cgtcgtctgg    6060

cggcgggcac cctgagcggt cgtgcggttg ttgttccggg tctgtaagct tctgcatcga    6120

tcaccacaat tcagcaaatt gtgaacatca tcacgttcat ctttccctgg ttgccaatgg    6180

cccattttcc tgtcagtaac gagaaggtcg cgaattcagg cgctttttag actggtcgta    6240

atgaacaatt cttaagaagg agatataca                                      6269

Claims (7)

1.通过在存在全细胞催化剂的条件下还原酮制备光学活性醇的方法，所述全细胞催化剂包含醇脱氢酶及能使辅因子再生的酶，所述方法特征在于不用加入“外来”辅因子而对根据所用的水性溶剂的起始体积为至少500mM浓度的底物进行转化，所述能使辅因子再生的酶是葡萄糖脱氢酶或苹果酸脱氢酶，其中所述醇脱氢酶选自来自乳杆菌菌株的醇脱氢酶、和/或来自红球菌菌株的醇脱氢酶、和/或来自节杆菌菌株的醇脱氢酶组成的组。

2.权利要求1的方法，特征在于使用的生物催化剂的浓度不超过75g/l。

3.权利要求1的方法，特征在于所述方法是在无有机溶剂的条件下进行。

4.权利要求1的方法，特征在于反应温度为10-90℃。

5.权利要求1的方法，特征在于pH值为pH 5-9。

6.权利要求1的方法，特征在于在开始时加入全部量的底物。

7.权利要求1的方法，特征在于所述底物在反应期间计量加入。

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