ES2670143T3 - Preparación de aminas y diaminas a partir de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos - Google Patents

Preparación de aminas y diaminas a partir de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos Download PDF

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Abstract

Catalizador de células enteras, que expresa una α-dioxigenasa recombinante o la combinación a base de una ácido graso reductasa recombinante y de una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteinila la ácido graso reductasa y que, adicionalmente, expresa una transaminasa.

Description

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DESCRIPCION
Preparación de aminas y diaminas a partir de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos
La invención se refiere a un catalizador de células enteras, que expresa una a-dioxigenasa recombinante y/o la combinación a base de una ácido graso reductasa recombinante y de una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteinila la ácido graso reductasa y que, adicionalmente, expresa una transaminasa, siendo la fosfopanteteinil-transferasa y/o transaminasa preferiblemente recombinante; así como a un procedimiento para la reacción de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos para dar una amina o diamina, que comprende las etapas poner en contacto el ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o el monoéster de los mismos con una ácido graso reductasa fosfopanteteinilada o de una a-dioxigenasa y poner en contacto el producto con una transaminasa.
Las poliamidas son una clase de polímeros que se caracterizan por grupos amido repetitivos. El término “poliamida” se refiere, a diferencia de las proteínas químicamente relacionadas, a materiales sintéticos termoplásticos, habitualmente sintéticos, adquiribles en el comercio. Las poliamidas se derivan de aminas primarias o de aminas secundarias que se obtienen convencionalmente a través de hidrocarburos craqueados. Sin embargo, para la preparación de polímeros también pueden utilizarse derivados, más exactamente ácidos aminocarboxílicos, lactamas y diaminas. Son de interés como eductos, además, alcanos de cadena corta, gaseosos, que pueden obtenerse con procedimientos biotecnológicos partiendo de materias primas renovables.
La producción químico-técnica convencional de aminas y diaminas de este tipo depende del abastecimiento con materias primas fósiles, es ineficaz y en este caso precipitan grandes cantidades de productos secundarios indeseados, en algunas etapas de la síntesis en hasta un 80%. Un ejemplo de un proceso de este tipo lo representa la preparación de laurinlactama. Convencionalmente, ésta tiene lugar a través de un procedimiento multi-etapa que no proporciona sólo un bajo rendimiento, sino que, al mismo tiempo, requiere la provisión de una infraestructura compleja.
A la vista de estos inconvenientes se desarrollaron procedimientos con el fin de obtener aminas y diaminas utilizando biocatalizadores partiendo de materias primas renovables. Como materias primas renovables entran en consideración, en particular, fuentes para ácidos grasos que pueden obtenerse en forma de aceite de colza, aceite de cardo yesquero, aceite de palmiste, aceite de nuez de coco, aceite de semillas de girasol y productos naturales similares a partir de una pluralidad de fuentes biológicas, en particular de plantas.
El documento PCT/EP 2008/067447 describe un sistema biotecnológico para la preparación de productos químicamente relacionados, más concretamente ácidos u>-aminocarboxílicos, utilizando una célula que presenta una serie de actividades enzimáticas adecuadas y que está en condiciones de transformar ácidos carboxílicos en correspondientes ácidos w-aminocarboxílicos. El procedimiento comprende una cascada de reacciones enzimáticamente catalizadas, en particular, la oxidación de un ácido graso en el átomo de carbono en posición terminal al aldehído y la subsiguiente aminación utilizando una transaminasa y un aminoácido como donante de amina que puede ser regenerado a través de una aminoácido deshidrogenasa.
Un inconveniente conocido del sistema AlkBGT-oxidasa de Pseudomonas putida GPO1 utilizado en este caso consiste, sin embargo, en que no está en condiciones de proporcionar una oxidación selectiva de alcanos alifáticos a alcoholes primarios. Más bien, se manifiesta una pluralidad de productos de oxidación; en particular aumenta la proporción de productos más oxidados tal como el correspondiente aldehído, cetona o el correspondiente ácido carboxílico con un tiempo de reacción creciente (C. Grant, J. M. Woodley y F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486), lo cual reduce de manera correspondiente el rendimiento de la amina deseada.
El problema de la oxidación relativamente no selectiva se acentúa debido a que los productos de oxidación resultantes son estructuralmente muy similares. Esto determina que es muy difícil separarlos de manera eficaz de los productos de oxidación deseados y sin una pérdida de rendimiento significativa.
Otro inconveniente de este procedimiento consiste en que productos secundarios oxidados en exceso, por ejemplo el ácido carboxílico del ácido graso empleado como educto, el reciclaje de disolventes hidrofóbicos y de intercambiadores de cationes líquidos hidrofóbicos, que pueden ser utilizados de acuerdo con el documento PCT/EP 2011/071491 para la separación del producto a partir de la mezcla de reacción acuosa, va a expensas de la eficacia del aprovechamiento de los recursos.
A este respecto, se ha de destacar que la complejidad de sistemas biotecnológicos con una cascada de reacciones tal como la descrita en el documento PCT/EP 2008/067447, de las que en cada caso se cataliza una reacción de
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una enzima determinada, dificulta la optimización de las condiciones de reacción. Así, en el caso de los aminoácidos grasos w básicamente reactivos como producto se da la posibilidad de que, a partir de una concentración crítica determinada, reaccionen en el interior de la célula con componentes esenciales del organismo y, por consiguiente, actúen de forma tóxica. Si este es el caso, entonces se perjudica la capacidad de crecimiento y síntesis del organismo hasta la muerte de la célula, sin que el agente de desarrollo pudiera reconocer inmediatamente la toxicidad o incluso asociar un determinado educto, producto intermedio o producto. Asimismo, tampoco es previsible qué organismo soporte qué concentración de una sustancia químicamente reactiva.
También en relación con un rendimiento del producto a mejorar y de una formación a reducir de productos secundarios, el experto en la materia no puede identificar de forma rutinaria factores limitantes y decisivos en un sistema tal como el descrito en el documento PCT/EP 2008/067447. Si el rendimiento de producto es demasiado bajo, esto puede entonces deberse a que una de las enzimas esté presente en una concentración demasiado baja, sin que se conociera de cuál de las enzimas que entran en consideración se trata en este caso, es decir, el educto no reacciona en el marco de tiempo previsto o antes de la degradación por parte de enzimas concurrentes en virtud de una capacidad insuficiente de síntesis. Alternativamente, es sin más posible de que una célula esté presente ciertamente de manera detectable en la célula en forma de un polipéptido, pero precisamente en esta célula no presente el plegamiento esencial para la actividad o que falte un co-factor desconocido hasta la fecha, pero esencial para la actividad. De igual manera, como ya se ha mencionado, el producto metabólico para la célula puede ser tóxico o puede ser degradado. Finalmente, se ha de contar con interacciones interferentes con enzimas endógenas, es decir, que se presentan de forma natural en una célula utilizada como catalizador de células enteras.
Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos para la preparación de alquil-monoaminas y -diaminas a partir de ácidos grasos, en las que las reacciones enzimáticamente catalizadas discurran de forma más selectiva y se minimice la formación de productos secundarios indeseados.
Ante estos antecedentes, la misión en la que se basa la invención consiste en proporcionar un procedimiento biotecnológico, lo más eficaz posible en relación con el rendimiento, el equilibrio de carbono y/o nitrógeno y/o la pureza, para la preparación de alquil-monoaminas y -diaminas a partir de ácidos grasos.
Otra misión en la que se basa la invención consiste en proporcionar un procedimiento biotecnológico lo más eficiente posible en relación con el rendimiento, el equilibrio de carbono y/o nitrógeno, la capacidad de reutilizar agentes utilizados y/o la pureza del producto para la preparación de alquil-monoaminas y -diaminas a partir de ácidos grasos. A este respecto, por un equilibrio carbono y/o nitrógeno eficiente se entiende preferiblemente que una proporción lo más elevada posible del carbono y/o nitrógeno alimentado a una célula para la reacción de un ácido carboxílico o de un éster de ácido carboxílico en forma de sustratos adecuados se encuentre de nuevo en el producto final deseado, en lugar de reaccionar, por ejemplo, para dar otros productos que no sean los deseados.
Otra misión en la que se basa la invención consiste en mejorar la aptitud para el tratamiento de una mezcla de reacción multi-fase de la preparación de alquil-monoaminas y -diaminas a partir de ácidos grasos, particularmente en relación con la capacidad de reutilización para el tratamiento de disolvente hidrofóbicos e intercambiadores de cationes líquidos utilizados, así como en relación con la formación y separación de fases en el caso de un sistema bifásico que comprende una fase acuosa en la que discurre la reacción del ácido carboxílico o del éster de ácido carboxílico, y de una fase orgánica con disolventes orgánicos y/o intercambiadores de cationes líquidos.
Estos y otros problemas se resuelven mediante el objeto de la presente solicitud y, en particular, también mediante el objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas, resultando formas de realización a partir de las reivindicaciones subordinadas.
El problema que se plantea la invención se resuelve en un primer aspecto mediante un catalizador de células enteras que expresa una a-dioxigenasa recombinante o la combinación a base de una ácido graso reductasa recombinante y de una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteinila la ácido graso reductasa y que expresa adicionalmente una transaminasa.
En una primera forma de realización del primer aspecto, el problema se resuelve mediante un catalizador de células enteras que expresa adicionalmente una aminoácido deshidrogenasa.
En una segunda forma de realización, que representa también una forma de realización de la primera forma de realización, el problema se resuelve mediante un catalizador de células enteras que expresa adicionalmente una alcano hidroxilasa.
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En una tercera forma de realización, que representa también una forma de realización de la primera a segunda formas de realización, el problema se resuelve mediante un catalizador de células enteras que expresa adicionalmente un polipéptido de la familia AlkL.
En una cuarta forma de realización, que representa también una forma de realización de la segunda forma de realización, el problema se resuelve mediante un catalizador de células enteras que expresa adicionalmente una alcohol deshidrogenasa.
En una quinta forma de realización, que representa también una forma de realización de la primera a cuarta formas de realización, el problema se resuelve mediante un catalizador de células enteras en donde se reduce la actividad de al menos una enzima que participa en la p-oxidación con respecto al tipo salvaje del catalizador de células enteras.
En una sexta forma de realización, que representa también una forma de realización de la primera a quinta forma de realización, el problema se resuelve mediante un catalizador de células enteras, en donde la actividad de BioH o de una variante del mismo está reducida o incrementada con respecto al tipo salvaje del catalizador de células enteras.
En una séptima forma de realización, que representa también una forma de realización de la primera a sexta formas de realización, el problema se resuelve mediante un catalizador de células enteras, en donde la actividad de FadL o de una variante del mismo está incrementada con respecto al tipo salvaje del catalizador de células enteras.
En un segundo aspecto, el problema en el que se basa la invención se resuelve mediante un procedimiento para la reacción de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos para formar una amina o diamina, que comprende las etapas
a) proporcionar un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o un monoéster de los mismos, para el caso de que se trate de un ácido dicarboxílico,
b) poner en contacto el ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o el monoéster de los mismos con una ácido graso reductasa fosfopanteteinilada o una a-dioxigenasa bajo formación de un producto de aldehído, y
c) poner en contacto el producto de la etapa b) con una transaminasa.
En un segundo aspecto, el problema en el que se basa la invención se resuelve mediante un procedimiento en el que en el caso de la etapa c) está presente una aminoácido deshidrogenasa.
En una primera forma de realización del segundo aspecto, el problema se resuelve mediante un procedimiento, en el que al primer aspecto de la presente invención se proporciona al menos una enzima del grupo que comprende ácido graso reductasa fosfopanteteinilada, a-dioxigenasa, transaminasa, aminoácido deshidrogenasa y alcano hidroxilasa en forma de un catalizador de células enteras.
En una segunda forma de realización, que representa también una forma de realización de la primera forma de realización, el problema se resuelve mediante un procedimiento, en el que en el caso del ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o del monoéster de los mismos se trata de un compuesto de la fórmula (I)
R1 - A -COOR2(I)
en donde R1 se elige del grupo que comprende -H y COOR3,
en donde R2 y R3, en cada caso e independientemente uno de otro, se eligen del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
con la condición de que al menos uno de los radicales R2 y R3 sea H,
en donde A representa un grupo hidrocarbonado con al menos cuatro átomos de carbono no ramificado, ramificado, lineal, cíclico, sustituido o no sustituido.
En una tercera forma de realización, que representa también una forma de realización de la primera a segunda formas de realización, el problema se resuelve mediante un procedimiento, en el que A presenta la fórmula -(CH2V, siendo n al menos 4, preferiblemente al menos 10.
En un tercer aspecto, el problema en el que se basa la invención se resuelve mediante un uso del catalizador de células enteras según el primer aspecto o del procedimiento según el segundo aspecto para la aminación de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos.
En un cuarto aspecto, el problema en el que se basa la invención se resuelve mediante una mezcla de reacción que comprende el catalizador de células enteras según el primer aspecto en solución acuosa, así como un ácido graso, ácido w-hidroxi-graso, ácido u>-oxo-graso o un monoéster de los mismos de la fórmula (I)
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R1 - A -COOR2(I)
en donde R1 se elige del grupo que comprende -H - CHO, OH y COOR3,
en donde R2 y R3, en cada caso e independientemente uno de otro, se eligen del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
con la condición de que al menos uno de los radicales R2 y R3 sea H,
en donde A representa un grupo hidrocarbonado con al menos cuatro átomos de carbono no ramificado, ramificado, lineal, cíclico, sustituido o no sustituido.
La presente invención se basa en el reconocimiento de los autores de la misma de que una ácido graso reductasa o a-dioxigenasa funcionalmente recombinante en un catalizador de células enteras, el cual se utiliza para la preparación de aminas y diaminas a partir de ácidos grasos y presenta una dotación enzimática correspondiente, aumenta de manera sorprendente el rendimiento en aminas y diaminas.
Además, la presente invención se basa en el reconocimiento de los autores de la misma de que una ácido graso reductasa o a-dioxigenasa funcionalmente recombinante en un catalizador de células enteras, el cual se utiliza para la preparación de aminas y diaminas a partir de ácidos grasos y presenta una dotación enzimática correspondiente, reduce de manera sorprendente la concentración de productos secundarios perturbadores, en particular de ácidos grasos oxidados en exceso en forma de ácidos dicarboxílicos y ésteres de los mismos en el producto resultante.
Además, la presente invención se basa en el reconocimiento de los autores de la misma de que una ácido graso reductasa o a-dioxigenasa funcionalmente recombinante en un catalizador de células enteras, el cual se utiliza para la preparación de aminas y diaminas y presenta una dotación enzimática correspondiente, mejora la pureza y la capacidad de reutilización de intercambiadores de cationes líquidos tales como ácido oleico que se utilizan para la separación de la amina y diamina a partir de una solución de fermentación que comprende el catalizador de células enteras.
La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para la reacción de un ácido carboxílico o un ácido dicarboxílico o un monoéster de los mismos para formar una amina o diamina, que se caracteriza porque junto a las enzimas que catalizan la transformación del ácido graso en la amina a través de sus diferentes etapas de oxidación, también está presente una ácido graso reductasa o a-dioxigenasa, preferiblemente cuando se emplea un catalizador de células enteras para llevar a cabo el procedimiento. En una forma de realización preferida, por la expresión “ácido graso reductasa”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende una enzima que cataliza la transformación de un ácido w-carboxílico, también denominado ácido dicarboxílico o ácido w-carboxi-graso, para dar el correspondiente ácido w-oxo-graso bajo consumo de ATP y NAD(P)H. En el estado de la técnica, por ejemplo en el documento
WO/2010/135624, se describen ácido graso reductasas para la preparación de ácidos w-hidroxi-grasos, pero no como parte de un sistema para la preparación de w-aminoácidos grasos. En una forma de realización todavía preferida, la ácido graso reductasa se elige del grupo de ácido graso reductasas que comprenden las secuencias de aminoácidos YP_887275.1, ZP_11001941.1, ZP_06852401.1, NP_959974.1, YP_001070587.1, ZP_05217435.1, YP_882653.1, YP_639435.1, ZP_10800193.1, YP_006452763.1, YP_006730440.1,
YP_005349252.1, ZP_05224908.1, YP_005338837.1, YP_006307000.1, YP_005343991.1,
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ZP_06452908.1, ZP_06519578.1, YP_004721827.1, CAJ77696.1, ZP_09680854.1, ZP_09686453.1, YP_884815.1, YP_884815.1, CAB55600.1, ZP_09081423.1, YP_006521568.1, ZP_11440626.1, ZP_15513309.1, ZP_09410778.1, ZP_15374248.1, ZP_15405954.1, YP_001704047.1, ZP_14236911.1, ZP_12873916.1, ZP_14242094.1,
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XP_002669159.1, en particular YP_006731697.1, ZP_09839660.1, YP_001704097.1, YP_889972.1,
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En el caso de las ácido graso reductasas se trata de un grupo de enzimas que para su actividad requieren una fosfopanteteinilación, es decir, la fijación covalente de un cofactor fosfopanteteinilo en la enzima. De manera correspondiente, la ácido graso reductasa utilizada de acuerdo con la invención está fosfopanteteinilada, y expresa un catalizador de células enteras que expresa la ácido graso reductasa, como parte de su dotación de enzimas expresadas de forma endógena o en forma recombinante, una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteinila la ácido graso reductasa. En una forma de realización preferida, por la expresión “fosfopanteteinil-transferasa”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende una enzima que transfiere un radical fosfopanteteinilo de una fosfopanteteinil-CoA a una enzima, preferiblemente a la ácido graso reductasa. En una forma de realización particularmente preferida, la fosfopanteteinil-transferasa se elige del grupo de fosfopanteteinil-transferasas que comprenden las secuencias de aminoácidos ABI83656.1, YP_006811024.1, YP_120266.1, YP_005265173.1 YP_004006671.1, ZP_08152482.1, ZP_11104141.1, ZP_14482198.1, YP_706581.1,
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Alternativa o adicionalmente a la combinación a base de ácido graso reductasa y fosfopanteteinil-transferasa, el catalizador de células enteras puede presentar también una a-dioxigenasa. En una forma de realización preferida, por el término “a-dioxigenasa”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende una enzima que cataliza la transformación de un ácido carboxílico y/o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos, bajo el consumo de una molécula de oxígeno y bajo disociación de una molécula de dióxido de carbono, en un ácido carboxílico y/o ácido dicarboxílico o un monoéster de los mismos, acortado en un átomo de carbono con respecto al ácido carboxílico y/o ácido dicarboxílico o un monoéster de los mismos empleado como educto en el átomo de carbono w en posición terminal y portador de un grupo aldehído en el átomo de carbono w en posición terminal. En una forma de realización particularmente preferida, la a-dioxigenasa se elige del grupo de a-dioxigenasas que comprenden las secuencias de aminoácidos NP_001066718.1, EAY82977.1, BAH79993.1, ABG22011.1, BAJ90503.1, AFD04418.1, AFD04417.1, BAJ87736.1, AFW75180.1, ABG22012.1, XP_002311389.1, CAH05011.1, XP_002279884.1,
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ZP_09648375.1, ZP_09792714.1, ZP_09788527.1, XP_001728273.1, AAC83355.1, YP_890542.1, ZP_11000891.1, XP_002605323.1, EGO58341.1, YP_006249145.1, YP_001507004.1, YP_001704637.1, ZP_12876141.1,
ZP_11150830.1, ZP_14236257.1, ZP_09411385.1, ZP_14243118.1, EKD16664.1, ZP_15416799.1,
ZP_15338016.1, ZP_10080295.1, ZP_11438929.1, ZP_12995210.1, ZP_10946648.1, YP_003409541.1,
XP_001637870.1, YP_005451221.1, XP_001212758.1, ZP_07290489.1, ZP_05781329.1, ZP_19187748.1,
ZP_06574534.1, XP_002605322.1, NP_822950.1, YP_006366425.1, EJP63377.1, EKD21217.1, XP_001795927.1, XP_003042615.1, ZP_06566152.1, EGU88116.1, EFY94417.1, XP_388327.1, EKJ68934.1, ZP_07290463.1, CCC10458.1, YP_001107201.1, XP_003348248.1, T49753, CAD31840.1, XP_001229975.1, CBN77040.1,
YP_004813753.1, XP_002513273.1, XP_001627136.1, AFG52858.1, AFG52857.1, AEW08450.1, NP_841291.1, YP_004512343.1, ACG75701.1 y ZP_03500906.1 y variantes de las mismas. En una forma de realización particularmente preferida, se trata de la a-dioxigenasa con el código del banco de datos NP_001066718.1 o una variante de la misma.
Junto a la a-dioxigenasa o la combinación a base de ácido graso reductasa y fosfopanteteinil-transferasa, el catalizador de células enteras de acuerdo con la invención presenta necesariamente una transaminasa que amina a los grupos aldehído en posición terminal. En una forma de realización preferida, por el término “transaminasa”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende una enzima que cataliza la transferencia de grupos a-amino de una molécula donante, preferiblemente un aminoácido, a una molécula aceptora, preferiblemente un ácido a- cetocarboxílico. En una forma de realización particularmente preferida, la transaminasa se elige del grupo de transaminasas que comprenden las secuencias de aminoácidos 3HMU_A, AAD41041.1, AAK15486.1, ABE03917.1, ADR60699.1, ADR61066.1, ADR62525.1, AEL07495.1, CAZ86955.1, EFW82310.1, EFW87681.1, EGC99983.1, EGD03176.1, EGE58369.1, EGH06681.1, EGH08331.1, EGH24301.1, EGH32343.1, EGH46412.1, EGH55033.1,
EGH62152.1, EGH67339.1, EGH70821.1, EGH71404.1, EGH78772.1, EGH85312.1, EGH97105.1, EGP57596.1,
NP_102850.1, NP_106560.1, NP_248912.1, NP_248990.1, NP_354026.2, NP_421926.1, NP_637699.1,
NP_642792.1, NP_744329.1, NP_744732.1, NP_747283.1, NP_795039.1, NP_901695.1 (, XP_002943905.1, YP_001021095.1, YP_001059677.1, YP_001061726.1, YP_001066961.1, YP_001074671.1, YP_001120907.1,
YP_001140117.1, YP_001170616.1, YP_001185848.1, YP_001188121.1, YP_001233688.1, YP_001268866.1,
YP_001270391.1, YP_001345703.1, YP_001412573.1, YP_001417624.1, YP_001526058.1, YP_001579295.1,
YP_001581170.1, YP_001668026.1, YP_001669478.1, YP_001671460.1, YP_001685569.1, YP_001747156.1,
YP_001749732.1, YP_001765463.1, YP_001766294.1, YP_001790770.1, YP_001808775.1, YP_001809596.1,
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YP_003552364.1, YP_003578319.1, YP_003591946.1, YP_003607814.1, YP_003641922.1, YP_003674025.1,
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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YP
108931.1, YP 110490.1, YP 168667.1, YP 237931.1, YP 260624.1, YP 262985.1, YP 271307.1
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YP
554363.1, YP 608454.1, YP 610700.1, YP 614980.1, YP 622254.1, YP 625753.1, YP 680590.1
YP
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P_983084.1, YP_995622.1, ZP_00948889.1, ZP_00954344.1, ZP_00959736.1, ZP_00998881.1, ZP_01011725.1, ZP_01037109.1, ZP_01058030.1, ZP_01076707.1, ZP_01103959.1, ZP_01167926.1, ZP_01224713.1,
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ZP_02145337.1, ZP_02151268.1, ZP_02152332.1, ZP_02167267.1, ZP_02190082.1, ZP_02242934.1,
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ZP_08527488.1, ZP_08631252.1, ZP_08636687 y variantes de las mismas.
En el caso de la ácido graso reductasa utilizada de acuerdo con la invención y, preferiblemente, también en el caso de otras enzimas utilizadas de acuerdo con la invención se trata de enzimas recombinantes. En una forma de realización preferida, el término “recombinante”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende que la molécula de ácido nucleico que codifica la correspondiente enzima no se presenta en la célula natural y/o se preparó utilizando métodos de tecnología genética. En una forma de realización preferida, se habla de una proteína recombinante cuando el polipéptido correspondiente es codificado por un ácido nucleico recombinante. En una forma de realización preferida, por una célula recombinante, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende una célula que presenta al menos un ácido nucleico recombinante o un polipéptido recombinante. El experto en la materia es conocedor de procedimientos adecuados para la preparación de moléculas o células recombinantes, por ejemplo los descritos en Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición. Enzimas recombinantes se sobre-expresan preferiblemente utilizando sistemas de vectores pET o pGEX que son conocidos por el experto en la materia.
Con relación a la elección del organismo, el catalizador de células enteras empleable de acuerdo con la invención no se ve sometido a limitación alguna, siempre que sea cultivable, estable y eventualmente sea accesible a modificaciones introducibles por tecnología genética, p. ej., procedimientos para el debilitamiento de las actividades enzimáticas, por ejemplo inactivaciones. Así, igualmente se puede tratar de una célula procariótica o eucariótica. En el caso de una célula eucariótica son particularmente preferidos eucariontes unicelulares, particularmente levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Candida albicans y Pichia pastoris. En el caso de células procariontes se puede tratar, por ejemplo, de una bacteria que se elige del grupo que comprende Magnetococcus, Mariprofundus, Acetobacter, Acetobacterium, Acidiphilium, Afipia, Ahrensia, Asticcacaulis, Aurantimonas, Azorhizobium, Azospirillum, Bacillus, Bartonella, tribocorum, Beijerinckia, Bradyrhizobium, Brevundimonas, subvibrioides, Brucella, Caulobacter, Chelativorans, Citreicella, Citromicrobium, Clostridium, Corynebacterium, Dinoroseobacter, Erythrobacter, Fulvimarina, Gluconacetobacter, Granulibacter, Hirschia, Hoeflea, Hyphomicrobium, Hyphomonas, Ketogulonicigenium, Labrenzia, Loktanella, Magnetospirillum, Maricaulis, Maritimibacter, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylocystis, Methylosinus, Nitrobacter, Novosphingobium, Oceanibulbus, Oceanicaulis, Oceanicola, Ochrobactrum, Octadecabacter, Oligotropha, Paracoccus, Parvibaculum, Parvularcula, Pelagibaca, Phaeobacter, Phenylobacterium, Polymorphum, Pseudovibrio, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Roseibium, Roseobacter, Roseomonas, Roseovarius, Ruegeria, Sagittula, Silicibacter, Sphingobium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Starkeya, Sulfitobacter, Thalassiobium, Xanthobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, Orientia, Rickettsia, Wolbachia, Bordetella, Burkholderia, Cupriavidus, Taiwanensis, Lautropia, Limnobacter, Polynucleobacter, Ralstonia, Chromobacterium, Eikenella, corrodens, Basfia, Kingella, Laribacter, Lutiella, Neisseria, Simonsiella, Achromobacter, Acidovorax, Alicycliphilus, Aromatoleum, Azoarcus, Comamonas, Dechloromonas, Delftia, Gallionella, Herbaspirillum, Herminiimonas, Hylemonella, Janthinobacterium, Leptothrix, Methylibium, Methylobacillus, Methylophilales, Methyloversatilis, Methylovorus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Oxalobacter, Parasutterella, Polaromonas, Polaromonas, Pusillimonas, Rhodoferax, Rubrivivax, Sideroxydans, Sutterella, wadsworthensis,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Taylorella, Thauera, Thiobacillus, Thiomonas, Variovorax, Verminephrobacter, Anaeromyxobacter, Bdellovibrio, bacteriovorus, Bilophila, Desulfarculus, Desulfatibacillum, Desulfobacca, Desulfobacterium, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfohalobium, Desulfitobacterium, Desulfomicrobium, Desulfonatronospira, Desulfotalea, Desulfovibrio, Desulfuromonas, Geobacter, Haliangium, Hippea, Lawsonia, Myxococcus, Pelobacter, Plesiocystis, Sorangium, Stigmatella, Syntrophobacter, Syntrophus, Arcobacter, Caminibacter, Campylobacter, Helicobacter, Nitratifractor, Nitratiruptor, Sulfuricurvum, Sulfurimonas, Sulfurospirillum, Sulfurovum, Wolinella, Buchnera, Blochmannia, Hamiltonella, Regiella, Riesia, Citrobacter, Cronobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Pectobacterium, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Shigella, Sodalis, Wigglesworthia, Glossina, Xenorhabdus, Yersinia, Acidithiobacillus, Acinetobacter, Aeromonas, Alcanivorax, Alkalilimnicola, Allochromatium, Alteromonadales, Alteromonas, Baumannia, Beggiatoa, Bermanella, Carsonella, Ruthia, Vesicomyosocius, Cardiobacterium, Chromohalobacter, Colwellia, Congregibacter, Coxiella, Dichelobacter, Endoriftia, Enhydrobacter, Ferrimonas, Francisella, Glaciecola, Hahella, Halomonas, Halorhodospira, Halothiobacillus, Idiomarina, Kangiella, Legionella, Marinobacter, Marinomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylophaga, Moraxella, Moritella, Neptuniibacter, Nitrococcus, Pseudoalteromonas, Psychrobacter, Psychromonas, Reinekea, Rickettsiella, Saccharophagus, Shewanella, Succinatimonas,
Teredinibacter, Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio, Thiomicrospira, Tolumonas, Vibrionales, Actinobacillus, Aggregatibacter, Gallibacterium, Haemophilus, Histophilus, Mannheimia, Pasteurella, Azotobacter, Cellvibrio, Pseudomonas, Aliivibrio, Grimontia, Photobacterium, Photobacterium, Vibrio, Pseudoxanthomonas,
Stenotrophomonas, Xanthomonas, Xylella, Borrelia, Brachyspira, Leptospira, Spirochaeta, Treponema, Hodgkinia, Puniceispirillum, Liberibacter, Pelagibacter, Odyssella, Accumulibacter, en particular B. subtilis, B. megaterium, C. glutamicum, E. coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri,, Acinetobacter sp., Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, cianobacterias, Klebsiella sp., Klebsiella oxytoca, Salmonella sp., Rhizobium sp. y Rhizobium meliloti. En una forma de realización particularmente preferida, se trata de una enterobacteria, lo más preferiblemente de Escherichia coli.
Es ventajoso que el catalizador de células enteras de acuerdo con la invención presente, junto a la ácido graso reductasa, fosfopanteteinil-transferasa y la transaminasa, también una alanino deshidrogenasa, con el fin de regenerar la alanina consumida por la transaminasa durante la aminación del grupo aldehído en posición terminal a partir de moléculas nitrogenadas inorgánicas. En una forma de realización preferida, por la expresión “alanino deshidrogenasa”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende una enzima que cataliza la transformación de L- alanina bajo el consumo de agua y NAD+ en piruvato, amoníaco y NADH y la reacción inversa. En una forma de realización particularmente preferida, la alanino deshidrogenasa se elige del grupo de alanino deshidrogenasas que comprende la secuencia de aminoácidos de la alanino deshidrogenasa de Bacillus subtilis (código del banco de datos L20916), Rhizobium leguminosarum (código del banco de datos CP001622), Vibrio proteolyticus (código del banco de datos AF070716), Mycobacterium tuberculosis (código del banco de datos X63069), Enterobacter aerogenes (código del banco de datos AB013821), EGR93259.1, YP_003654745.1, YP_003651439.1, YP_003637111.1, YP_003631815.1, YP_001327051.1, YP_001262560.1, YP_886996.1, YP_882850.1,
YP_704410.1, YP_703508.1, ZP_08624689.1, YP_001230376.1, P17557.1, P17556.1, CCB94892.1, CCB73698.1, YP_001168635.1, YP_004668736.1, YP_004569425.1, YP_003513168.1, YP_004561169.1, ZP_08554945.1, YP_400777.1, ZP_08311476.1, ZP_08310170.1, ZP_08267322.1, ZP_08263846.1, ZP_07898723.1, YP_149301.1, YP_148605.1, YP_004340432.1, EFT09946.1, EFS80513.1, EFS51332.1, EFS42459.1, YP_003060895.1,
YP_003059033.1, ZP_03305373.1, YP_847214.1, YP_004095847.1, YP_003338282.1, YP_003337256.1,
YP_355846.1, YP_253131.1, ZP_08197563.1, ZP_08196283.1, ADW06447.1, YP_734091.1, NP_372233.1, NP_102173.1, ZP_08170259.1, EGD36706.1, EGD32748.1, ZP_08155540.1, YP_004142849.1, YP_002417649.1, YP_001301040.1, YP_002992892.1, YP_081348.1, YP_080482.1, YP_002476349.1, ZP_08115025.1,
ZP_08114403.1, YP_003552869.1, YP_002358112.1, YP_575010.1, YP_477594.1, YP_474564.1, YP_130399.1, YP_129373.1, YP_123314.1, NP_810467.1, NP_646469.1, NP_626044.1, NP_391071.1 (codificado por SEQ ID NO: 11), ZP_08086822.1, ZP_08084776.1, ZP_08083119.1, ZP_08020768.1, ZP_08013590.1, ZP_08011832.1, YP_003783744.1, YP_002781576.1, YP_002780533.1, ZP_02195873.1, NP_797482.1, ZP_07645051.1,
ZP_07643260.1, ZP_06611917.1, AAT40119.1, ZP_07864946.1, YP_004068409.1, YP_002796203.1,
YP_002774420.1, YP_003600348.1, YP_003599946.1, YP_003565624.1, YP_003565223.1, YP_335198.1,
YP_423850.1, YP_155059.1, ZP_07843538.1, ZP_07841226.1, ZP_06928932.1, ZP_05692073.1, ZP_05687006.1, ZP_04867480.1, YP_775531.1, CBE70214.1, ZP_07721182.1, ZP_04302850.1, ZP_04298961.1, ZP_04287684.1, ZP_04277177.1, ZP_04248389.1, ZP_04235899.1, ZP_02159718.1, ZP_02152178.1, YP_003974610.1,
YP_003546595.1, YP_002317127.1, ZP_07313778.1, ZP_07302778.1, ZP_07298850.1, CBK69442.1,
YP_003413835.1, YP_003595089.1, ZP_06807811.1, YP_003582455.1, YP_003464731.1, YP_003496397.1,
YP_003421918.1, CBL07274.1, CBK64956.1, YP_003508515.1, AAL87460.1, AAC23579.1, AAC23578.1,
AAC23577.1, ACU78652.1, YP_003471439.1, YP_003452777.1, ZP_06384971.1, ACY25368.1, ABC26869.1, AAP44334.1, EEZ80018.1, ZP_05110458.1, 1PJB_A, ZP_04717201.1, ZP_04689103.1, CAO90307.1, CAM75354.1, CAA44791.1, BAA77513.1, EGR96638.1, EGL90046.1, YP_004510847.1, ZP_08450330.1, YP_003387804.1, YP_003058152.1, EFS74272.1, EFS67128.1, ZP_06844564.1, YP_826658.1, YP_001195249.1, YP_003095978.1, YP_469292.1, YP_004442054.1, YP_004461174.1, YP_004055616.1, YP_003576656.1, YP_003094537.1,
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YP_001295973.1, AEE71143.1, YP_004447480.1, YP_003761844.1, YP_040853.1, YP_003154888.1,
YP_003142045.1, YP_002280953.1, NP_371963.1, NP_422368.1, EGC98966.1, EGC76398.1, YP_004263661.1, YP_004252039.1, YP_679036.1, YP_499973.1, ZP_08054972.1, ZP_08053009.1, ZP_04067276.1, ZP_03968868.1, ZP_03963857.1, ZP_03933079.1, ZP_03497046.1, ZP_06668924.1, ZP_06667106.1, ZP_06324464.1,
ZP_06196777.1, ZP_05114159.1, ZP_05083968.1, ZP_05070370.1, ZP_05030022.1, ZP_04673064.1,
ZP_03517011.1, ZP_03505783.1, XP_001310698.1, ABK27691.1 y CAB59281.2 y variantes de las mismas. Para la reacción catalizada por la alanino deshidrogenasa no sólo es necesaria la presencia de piruvato que se forma como parte del metabolismo primario de toda célula que entra en consideración como catalizador de células enteras, sino también de amonio. Este último se proporciona típicamente en forma de sales nitrogenadas inorgánicas, por ejemplo sales de amonio, nitratos o similares. Preferiblemente, al medio de reacción acuoso se añade una sal de amonio, p. ej., cloruro de amonio.
Además, es ventajoso que el catalizador de células enteras de acuerdo con la invención exprese una alcano hidroxilasa y, opcionalmente, otras enzimas esenciales para la actividad de la alcano hidroxilasa, en particular para el caso de que como sustratos para la preparación de una diamina se emplee un ácido graso con sólo una función carboxi en posición terminal. La alcano hidroxilasa y/o una alcohol deshidrogenasa expresada adicionalmente oxidan al átomo de carbono en posición terminal, luego hasta el grupo aldehído que puede ser aminado a continuación por la transaminasa o hasta el grupo carboxi que, mediante una a-dioxigenasa o la combinación a base de ácido graso reductasa y una fosfopanteteinil-transferasa, se transforma en un grupo aldehído en posición terminal, el cual, a continuación, puede ser aminado por la transaminasa. En una forma de realización preferida, por el término “alcano hidroxilasa”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende una enzima que cataliza la hidroxilación de radicales alquilo lineales no sustituidos que comprenden al menos seis, preferiblemente doce radicales hidrocarbonados.
Como alcano hidroxilasas son adecuados, conforme a la invención, numerosos sistemas de oxidación tal como se describen, entre otros, en el documento PCT/EP 2008/067447. En una forma de realización preferida, en el caso de la alcano hidroxilasa se trata de una citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153. En una forma de realización preferida, por la expresión “citrocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153” se entiende una oxidasa citosólica que es parte de un sistema de 3 componentes que comprende, además, una ferredoxina y una ferredoxina-reductasa, con un lugar de unión de alcano y la capacidad de hidroxilar alcanos. En una forma de realización particularmente preferida, se trata de una enzima que presenta al menos un 80, preferiblemente un 90, lo más preferiblemente un 95 o 99 por ciento de identidad de la secuencia con respecto a la citocromo P450- monooxigenasa de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código del banco de datos YP_691921) o de una enzima que comprende una secuencia de polipéptidos que presenta al menos un 80, preferiblemente un 90, lo más preferiblemente un 95 o 99 por ciento de identidad de la secuencia con respecto a la citocromo P450- monooxigenasa de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código del banco de datos YP_691921) y, además de ello, presenta actividad de alcano hidroxilasa. Los códigos del banco de datos mencionados se refieren en este caso, tal como a lo largo de esta solicitud, a los bancos de datos de NCBI) (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, EE.UU.), mejor dicho la versión disponible en línea el 21 de noviembre de 2012. En una forma de realización preferida, por la expresión “citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153” se entiende una oxidasa no unida a membrana que comprende un lugar de unión para alcanos, radicales alquilo lineales no sustituidos que comprenden al menos cinco, preferiblemente doce radicales hidrocarbonados o alcanos hidroxilados una vez y cuya cadena polipeptídica comprende el motivo LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN. En una forma de realización preferida, en el caso de una “citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153”, tal como se utiliza en esta memoria, se trata de una citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código del banco de datos YP_691921) o de una variante de la misma, que presenta preferiblemente actividad de alcano hidroxilasa.
Para el abastecimiento óptimo de la citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153 con electrones del agente reductor, preferiblemente NADH, se prefiere que la célula exprese la alcano hidroxilasa junto con ferredoxina- reductasa que interactúa funcionalmente con la misma y ferredoxina que interactúa funcionalmente con la misma. En este caso, se puede tratar de polipéptidos aislados o, en el caso de utilizar un catalizador de células enteras, de polipéptidos co-expresados o de polipéptidos condensados en el extremo N o C con la citocromo P450- monooxigenasa de la familia CYP153. El que una ferredoxina-reductasa o una ferredoxina pueda interactuar con una citocromo P450-monooxigenasa dada de la familia CYP153 funcionalmente entre sí, el experto en la materia lo puede comprobar fácilmente si el agente reductor es oxidado en presencia de un sustrato de alcano o de los tres polipéptidos con mayor eficacia que para el caso de que falte al menos uno de los tres. Alternativamente, puede utilizarse el ensayo enzimático descrito por Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M. y Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727, que en el caso de polipéptidos de interacción funcional muestra un claro aumento de la velocidad de la reacción. En una forma de realización particularmente preferida, la citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina-reductasa proceden del mismo organismo. En una forma de realización particularmente preferida, se trata de la ferredoxina-reductasa de Alcanivorax borkumensis SK2 (código del banco de datos YP_691923) o de una variante de la misma, de la ferredoxina de Alcanivorax borkumensis SK2
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(código del banco de datos YP_691920) o de una variante de la misma y de la citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (código del banco de datos YP_691921) o de una variante de la misma.
En otra forma de realización preferida, en el caso de la alcano hidroxilasa se trata de una AlkB-monooxigenasa. AlkB representa una óxido-reductasa dada a conocer en principio a partir del sistema AlkBGT de Pseudomonas putida Gpo1, que depende de otros dos polipéptidos, AlkG y AlkT. AlkT se caracteriza como rubredoxina-reductasa dependiente de FAD, que transmite electrones a AlkG a partir de NADH. En el caso de AlkG se trata de una rubredoxina, una proteína redox con contenido en hierro que actúa como donante directo de electrones para AlkB. En una forma de realización preferida, por el término “AlkB-monooxigenasa” se entiende un polipéptido con una homología de la secuencia de al menos, indicada en la secuencia de una preferencia creciente, 75, 80 85, 90, 92, 94, 96, 98 o 99% con respecto a la secuencia de la AlkB de Pseudomonas putida Gpo1 (código del banco de datos: CAB54050.1; este código del banco de datos procede, como todos los otros utilizados en la solicitud, del estado de la técnica, a saber del banco de datos NCBI, más exactamente de la descarga disponible en línea el 15 de octubre de 2012), con la capacidad de oxidar alcanos. En una forma de realización particularmente preferida, en el caso de la AlkB-monooxigenasa se trata de una óxido reductasa que oxida alcanos, que coopera funcionalmente con los polipéptidos AlkG (CAB54052.1) y AlkT (CAB54063.1) de Pseudomonas putida Gpo1. Para el abastecimiento óptimo con electrones de la AlkB-alcano hidroxilasa, se prefiere que la célula exprese la alcano hidroxilasa junto con proteínas auxiliares que interactúan funcionalmente con la misma, preferiblemente AlkG y/o AlkT o en cada caso variantes de la misma, tratándose en una forma de realización particularmente preferida de nuevo de polipéptidos AlkG (CAB54052.1) y AlkT (CAB54063.1) de Pseudomonas putida Gpo1.
En el caso de utilizar un catalizador de células enteras, se puede plantear el problema de que se tenga que poner en contacto el sustrato con una enzima localizada intracelularmente, con el fin de que se produzca la reacción deseada. En el caso de alcanos de cadena larga y derivados de los mismos se prefiere que el catalizador de células enteras presente un polipéptido de la familia AlkL. AlkL es una proteína de la membrana de Pseudomonas putida que puede importar ácidos grasos de cadena larga y derivados de los mismos a células bacterianas. En una forma de realización preferida, en el caso de un “polipéptido de la familia AlkL”, tal como se utiliza en esta memoria, se trata de un polipéptido que a lo largo de una longitud de 230 aminoácidos consecutivos presenta una identidad de la secuencia de al menos 80, preferiblemente 90, todavía más preferiblemente 90% con respecto a AlkL de Pseudomonas putida (código del banco de datos CAB69081) o una variante de AlkL de Pseudomonas putida y presenta preferiblemente la capacidad de sustentar la importación de alcanos de cadena larga al interior de una célula. En otra forma de realización, en el caso de un “polipéptido de la familia AlkL”, tal como se utiliza en esta memoria, se trata de un polipéptido localizado en la membrana externa de una bacteria Gram-negativa que presenta el motivo de secuencia DXWAPAXQ(V/A)GXR, representando X un aminoácido proteinógeno y de preferencia, adicionalmente es AlkL de Pseudomonas putida (código del banco de datos CAB69081) o una variante de la misma. Miembros a modo de ejemplo de la familia AlkL comprenden AlkL de Pseudomonas putida (código del banco de datos CAB69081), Marinobacter aquaeolei VTB8 (código del banco de datos YP_957722), Oceanicaulis alexandrii HTCC2633 (código del banco de datos ZP_00953584), Marinobacter manganoxydans Mnl7-9 (código del banco de datos ZP_09158756), Caulobacter sp. K31 (código del banco de datos YP_001672217), Pseudomonas oleovorans (código del banco de datos Q00595) y variantes de los mismos.
La enseñanza de la presente invención no sólo se puede realizar utilizando macromoléculas con las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos exactas, a las que se hace referencia en esta memoria, o bien no sólo utilizando una célula con una actividad de un polipéptido, reducida con relación al tipo salvaje respectivo, con las secuencias de aminoácidos exactas a las que se hace referencia en esta memoria, sino también utilizando una variante de macromoléculas de este tipo o de una célula con una actividad reducida con relación al tipo salvaje respectivo de la célula respectiva de una variante del polipéptido que se puede obtener por deleción, adición o sustitución de uno o más de un aminoácido o ácido nucleico. En una forma de realización preferida, el término “variante” de una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos en lo que sigue, con el mismo significado y de manera intercambiable con el término “homólogo”, tal como se utiliza en esta memoria, significa otra secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprende o representa una secuencia que, con relación a la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de tipo salvaje original correspondiente presenta una homología, utilizada en este caso de manera equivalente a identidad, de 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% o más por ciento, en donde preferiblemente otros aminoácidos que configuran el centro catalíticamente activo o aminoácidos esenciales para la estructura o el plegamiento están suprimidos o sustituidos o aquellos que únicamente están sustituidos de forma conservativa, por ejemplo un glutamato en lugar de un aspartato o una leucina en lugar de una valina. El estado de la técnica describe algoritmos que pueden utilizarse con el fin de calcular la magnitud de homología de dos secuencias, p. ej. Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3a edición. En otra forma de realización preferida de la presente invención, la variante de una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos presenta preferiblemente, de manera adicional a la homología de secuencia arriba mencionada, esencialmente la misma actividad enzimática de la molécula de tipo salvaje o bien de la molécula original. Por ejemplo, una variante de un
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polipéptido enzimáticamente activo como proteasa presenta la misma o esencialmente la misma actividad proteolítica que la enzima polipeptídica, es decir, la capacidad de catalizar la hidrólisis de un enlace peptídico. En una forma de realización particular, la expresión “esencialmente la misma actividad enzimática” significa una actividad en relación con los sustratos del polipéptido de tipo salvaje que se encuentra claramente por encima de la actividad de fondo y/o que se diferencia en menos de 3, preferiblemente 2, todavía más preferiblemente un orden de magnitud de valores Km y/o kcat que presenta el polipéptido de tipo salvaje con relación a los mismos sustratos. En otra forma de realización preferida, el término “variante” comprende una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de al menos una parte/o fragmento activo de la secuencia de ácidos nucleicos o bien de aminoácidos. En otra forma de realización preferida, la expresión “parte activa”, tal como se utiliza en esta memoria, significa una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos que presenta una longitud menor que la longitud completa de la secuencia de aminoácidos o bien codifica una longitud menor que la longitud completa de la secuencia de aminoácidos, presentando la secuencia de aminoácidos o la secuencia de aminoácidos codificada con una longitud menor que la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje esencialmente la misma actividad enzimática que el polipéptido de tipo salvaje o una variante del mismo, por ejemplo como proteasa. En una forma de realización particular, el término “variante” de un ácido nucleico comprende un ácido nucleico, cuya cadena complementaria, preferiblemente bajo condiciones rigurosas, se une al ácido nucleico de tipo salvaje. La rigurosidad de la reacción de hibridación se puede determinar fácilmente por el experto en la materia y depende, en general, de la longitud de la sonda, de las temperaturas durante el lavado y de la concentración salina. En general, sondas largas requieren temperaturas más elevadas para la hibridación, mientras que, por el contrario, sondas más cortas se contentan con temperaturas bajas. El que tenga lugar una hibridación depende, en general, de la capacidad del ADN desnaturalizado de reasociarse a cadenas complementarias que estén presentes en su entorno, a saber, por debajo de la temperatura de fusión. La rigurosidad de la reacción de hibridación y correspondientes condiciones se describen con detalle en F M Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Instrucciones para la identificación de secuencias de ADN mediante hibridación las encuentra el experto en la materia, entre otros, en el manual “The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” de la razón social Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). La hibridación tiene lugar en una forma de realización preferida bajo condiciones rigurosas, es decir, se forman sólo híbridos en los que la sonda y la secuencia diana, es decir, los polinucleótidos tratados con la sonda, son al menos un 70% idénticas. Es sabido que la rigurosidad de la hibridación, incluidas las etapas de lavado, se ve afectada o bien determinada por variación de la composición del tampón, la temperatura y la concentración salina. La reacción de hibridación se lleva a cabo, por lo general, con una rigurosidad relativamente baja en comparación con las etapas de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996). Para la reacción de hibridación puede emplearse, por ejemplo, un tampón correspondiente al tampón 5x SSC a una temperatura de aprox. 50°C - 68°C. En este caso, las sondas pueden hibridarse también con polinucleótidos que presenten menos de un 70% de identidad con respecto a la secuencia de la sonda. Híbridos de este tipo son menos estables y se separan mediante lavado bajo condiciones rigurosas. Esto puede alcanzarse, por ejemplo, mediante la reducción de la concentración salina a 2x SSC y eventualmente a continuación 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustándose una temperatura en la secuencia de una preferencia creciente de aprox. 50°C - 68°C, de aprox. 52°C - 68°C, de aprox. 54°C - 68°C, de aprox. 56°C - 68°C, de aprox. 58°C - 68°C, de aprox. 60°C - 68°C, de aprox. 62°C - 68°C, de aprox. 64°C - 68°C, de aprox. 66°C - 68°C. Se prefieren intervalos de temperaturas de aprox. 64°C - 68°C o de aprox. 66°C - 68°C. Eventualmente, es posible reducir la concentración salina hasta una concentración correspondiente a 0,2 x SSC o 0,1 x SSC. Mediante el aumento escalonado de la temperatura de hibridación en pasos de aprox. 1 - 2°C desde 50°C a 68°C pueden aislarse fragmentos de polinucleótidos que, por ejemplo en la secuencia de una preferencia creciente, presentan al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de identidad con la secuencia de la molécula de ácido nucleico empleada. Instrucciones adicionales para la hibridación se pueden adquirir en el comercio en forma de los denominados kits (p. ej. DIG Esay Hyb de la razón social Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, N° de catálogo 1603558). En una forma de realización preferida, el término “variante” de un ácido nucleico, tal como se utiliza en esta memoria, comprende una secuencia de ácidos nucleicos arbitraria que codifica la misma secuencia de aminoácidos que el ácido nucleico original o una variante de esta secuencia de aminoácidos en el marco de la degeneración del código genético.
En una forma de realización preferida, la célula utilizada de acuerdo con la invención presenta una actividad reducida con respecto a su tipo salvaje de al menos una enzima que cataliza una de las reacciones de la p oxidación de ácidos grasos, tratándose preferiblemente de una enzima del grupo que comprende la ácido graso-CoA-ligasa, acil-CoA-deshidrogenasa, 2,4-dienoil-CoA-reductasa, enoil-CoA-hidratasa y 3-cetoacil-CoA-tiolasa, un importador de ácidos grasos o variantes de los mismos. La p oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica ampliamente difundida que permite a organismos procariontes y eucariontes de igual manera oxidar a ácidos grasos y poner a disposición del metabolismo la energía química contenida en los mismos. En un sentido amplio, comienza con la captación de un ácido graso en la célula. Allí, siempre que las condiciones lo requieran, el ácido graso es oxidado primeramente en la posición p del éster de CoA-ácido graso por una acil-CoA-deshidrogenasa, en el caso de E. coli
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FadE. Una molécula similar puede formarse alternativamente también a partir de un ácido graso doblemente insaturado por reducción mediante una 2,4-dienoil-CoA-reductasa, en el caso de E. coli FadH. Una enzima multifuncional, la enoil-CoA-hidratasa/3-hidroxiacil-CoA-deshidrogenasa, en el caso de E. coli FadB, cataliza a continuación la hidratación bajo formación del alcohol secundario y su subsiguiente oxidación a la cetona. En la última etapa, una 3-cetoacil-CoA-tiolasa, en el caso de E.coli FadA, cataliza la disociación de la cetoacil-CoA con el resultado de que se liberan acetil-CoA y un CoA-éster del ácido graso acortado en dos átomos de carbono en comparación con la molécula de partida. En la medida en que no se trate asimismo de acetil-CoA, este último se puede alimentar de nuevo al ciclo de p-oxidación y acortarse bajo oxidación. En la regulación de la p oxidación de ácidos grasos participa también FadR, un regulador del operón Fad que comprende los genes necesarios para la degradación de ácidos grasos, sin que FadR catalice una reacción de la p oxidación. En una forma de realización preferida, por la expresión “enzima que cataliza una de las reacciones de la p oxidación de ácidos grasos” se entiende cualquier tipo de enzima que interactúe directamente con el sustrato de ácido graso o una molécula que resulta en la vía a la acetil-CoA del mismo, preferiblemente lo reconozca como sustrato y catalice su transformación en un producto metabólico situado en esta vía de degradación más próximo a la acetil-CoA, preferiblemente incluido el importador de ácidos grasos que determina la captación del ácido graso en la célula. Por ejemplo, a estas enzimas, según la definición precedente, pertenece la acil-CoA-deshidrogenasa, dado que ésta interactúa con el éster CoA de ácido graso y cataliza su transformación en enoil-CoA que en la vía metabólica de la p oxidación se encuentra más próxima a la acetil-CoA que el éster CoA de ácido graso. En una forma de realización particularmente preferida por la expresión “enzima que cataliza una de las reacciones de la p oxidación de ácidos grasos”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende toda enzima del grupo que comprende los productos génicos FadA, FadB, FadD, FadL y FadE de E. coli y sus variantes u homólogos de otros organismos. Los productos génicos FadA, FadB, FadD, FadL y FadE de E. coli, al igual que las variantes y homólogos de numerosos otros organismos biotecnológicamente aprovechables y sus secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos, se describen en el estado de la técnica, por ejemplo FadA bajo el número de acceso AP009048.1, FadB bajo el número de acceso BAE77457.1, FadD bajo el número de acceso BAA15609.1 y FadE bajo el número de acceso BAA77891.2. El estado de la técnica da a conocer numerosos ensayos que son especialmente adecuados para la medición de la actividad de enzimas que catalizan una de las reacciones de la p oxidación de ácidos grasos, por ejemplo en K Kameda y W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, Hi Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y So et al. (2003) Biochem. J. 370, 1055-1062, Lobo et al. (2001) y X Yu, T Liu, F Zhu y C Khosia (2011) PNAS, publicación electrónica antes de la impresión.
Para la efectividad del catalizador de células enteras de acuerdo con la invención es ventajoso que el sustrato a reaccionar, preferiblemente el ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o un monoéster de los mismos, pueda entrar en contacto fácilmente con las enzimas necesarias de acuerdo con la invención que están localizadas en el interior del catalizador de células enteras. Por lo tanto, es decisivo que el sustrato pueda acceder al interior de la célula. Con el fin de facilitar esto, se prefiere que el catalizador de células enteras exprese un importador de ácidos grasos, en el caso de un catalizador de células enteras bacteriano, en particular Gram-negativo, de manera particularmente preferida el importador de ácidos grasos FadL (código del banco de datos: BAA16205.1) o una variante, preferiblemente en una concentración y con una actividad que esté incrementada con respecto a la actividad del tipo salvaje del catalizador de células enteras correspondiente. El aumento de la actividad de un polipéptido con respecto al tipo salvaje de la célula puede alcanzarse a través de diferentes vías accesibles de forma rutinaria por el experto en la materia, por ejemplo la incorporación de copias adicionales, unidas funcionalmente con un promotor de la secuencia de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido o el intercambio del promotor natural por un promotor más potente.
Se ha demostrado que las aminas y diaminas se producen, de acuerdo con la invención, con un mayor rendimiento y pureza cuando el fondo de enzimas expresadas de forma endógena y el catalizador de células enteras esté optimizado de modo que se reduzca o elimine la actividad de enzimas endógenas de degradar o modificar de otro modo los eductos, productos intermedios o productos del procedimiento de acuerdo con la invención o utilizando la célula de acuerdo con la invención, preferiblemente ésteres metílicos de ácidos w-aminocarboxílicos, ácidos w- hidroxicarboxílicos, ácidos w-oxocarboxílicos y ácidos dicarboxílicos, en vías metabólicas que se apartan de la formación del producto deseado. Ante estos antecedentes, puede ser ventajoso que en el caso del catalizador de células enteras de acuerdo con la invención se trate de una célula que presente una actividad de la esterasa BioH [código del banco de datos YP_492020.1] reducida con respecto a su tipo salvaje o una variante de la misma. Células de este tipo con una actividad BioH reducida, su preparación y ensayos para la determinación de la actividad se describen en la solicitud de patente europea EP 12007663.3.
Para el caso de que como ácido carboxílico, ácido dicarboxílico o monoésteres de los mismos se empleen mezclas de compuestos en los que los grupos carboxi en posición terminal se presenten en una medida elevada, preferiblemente en al menos un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento en forma de un éster, por ejemplo por motivos de la mejor disponibilidad de estos sustratos o de la toxicidad de ácidos carboxílicos o ácidos dicarboxílicos libres, el monoéster puede proporcionarse por hidrólisis parcial o completa de ácidos dicarboxílicos totalmente esterificados o
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bien el ácido carboxílico libre puede proporcionarse por hidrólisis parcial o completa de ácidos carboxílicos totalmente esterificados. Para este caso puede ser ventajoso aumentar la capacidad de la célula para la hidrólisis del éster por sobre-expresión de una esterasa adecuada. En una forma de realización preferida, para ello se aumenta la actividad de la éster hidrolasa BioH o de una variante de la misma con respecto al tipo salvaje del catalizador de células enteras empleado, de manera particularmente por sobre-expresión. El monoéster correspondiente y/o el ácido carboxílico o ácido dicarboxílico no esterificado se proporciona entonces in situ mediante hidrólisis del éster. La hidrólisis parcial o completa de un ácido dicarboxílico totalmente esterificado puede tener lugar también por hidrólisis catalizada químicamente, por ejemplo a valores de pH bajos.
El catalizador de células enteras de acuerdo con la invención puede emplearse preferiblemente en un procedimiento para la reacción de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos para dar la correspondiente amina o diamina, tratándose en el caso del ácido carboxílico o ácido dicarboxílico del monoéster de los mismos de un compuesto de la fórmula (I)
R1 - A -COOR2(I)
en donde R1 se elige del grupo que comprende -H y COOR3, en donde R2 y R3 se eligen, en cada caso independientemente uno del otro, del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo, con la condición de que al menos uno de los radicales R2 y R3 sea H, representando A un grupo hidrocarbonado con al menos cuatro átomos de carbono no ramificado, ramificado, lineal, cíclico, sustituido o no sustituido. En una forma de realización preferida, en el caso de A se trata de una estructura de la fórmula -(CH2)n-, siendo n preferiblemente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30. En una forma de realización más preferida, en el caso del ácido carboxílico o ácido dicarboxílico se trata de ácido láurico o de ácido w-carboxiláurico. En otra forma de realización más preferida, en el caso del ácido carboxílico se trata de un ácido carboxílico de la fórmula CH3- (CH2VCOOH, siendo n preferiblemente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, preferiblemente se trata de ácido hexanoico o ácido decanoico. En otra forma de realización más preferida, en el caso del ácido carboxílico o ácido dicarboxílico se trata de un ácido dicarboxílico de la fórmula HOOC-(CH2)n-COOH, siendo n preferiblemente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, preferiblemente de ácido w-carboxihexanoico o ácido w-carboxidecanoico. En otra forma de realización más preferida, en el caso del ácido carboxílico o ácido dicarboxílico se trata de ácido w- carboxitetradecanoico. De manera correspondiente, en el caso de la amina o bien diamina preparada conforme a la invención se trata preferiblemente de un compuesto de la fórmula CH3-(CH2)n-NH2 o bien NH2-(CH2)n-NH2, siendo n en cada caso preferiblemente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.
Con relación al ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o del monoéster de los mismos, al igual que a cualquier compuesto químico descrito en esta solicitud, se cumple que la fórmula indicada respectiva comprende todas las sales, protonadas o desprotonadas, del compuesto respectivo. Por ejemplo, el ácido láurico comprende no sólo la forma protonada, sino también la sal laureato con todos los cationes, por ejemplo laureato de sodio.
El procedimiento de acuerdo con la invención requiere que las enzimas empleadas para el procedimiento de acuerdo con la invención, opcionalmente proporcionadas en forma del catalizador de células enteras de acuerdo con la invención, se pongan en contacto con el ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o el monoéster de los mismos en una solución acuosa. En una forma de realización preferida, por la expresión “poner en contacto”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende que la enzima respectiva entra en contacto directo con su sustrato, en particular sin que se intercalen barreras físicas tales como membranas impermeables o similares. La puesta en contacto tiene lugar en el caso más sencillo debido a que el sustrato se añade a una solución acuosa en la que se encuentra la enzima o el catalizador de células enteras.
Para la realización de la enseñanza de acuerdo con la invención se adecua una mezcla de reacción que comprende el catalizador de células enteras 8 de acuerdo con la invención en solución acuosa, así como un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o el monoéster de los mismos de la fórmula (I), en donde R1 se elige del grupo que comprende -H y COOR3, en donde R2 y R3 se eligen, en cada caso independientemente uno del otro, del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo, con la condición de que al menos uno de los radicales R2 y R3 sea H, representando A un grupo hidrocarbonado con al menos cuatro átomos de carbono no ramificado, ramificado, lineal, cíclico, sustituido o no sustituido, preferiblemente de la fórmula -(CH2V, siendo n al menos 4, de manera particularmente preferida al menos 10. La solución acuosa debe estar constituida en este caso, por ejemplo en relación con la composición, el valor del pH y la temperatura, de modo que sustente al menos temporalmente la durabilidad o al menos la capacidad catalítica del catalizador de células enteras. El experto en la materia conoce numerosos medios de cultivo acuosos adecuados como solución acuosa que son adecuados para la obtención o el cultivo de células, en particular de células de importancia biotecnológica. A ellos pertenecen de igual manera medios completos tales como medios LB, medios mínimos tales como medios M9, así como medios selectivos, por ejemplo aquellos que contienen una
elevada concentración salina y, por lo tanto, únicamente posibilitan el crecimiento de organismos halófilos o al menos halotolerantes. En una forma de realización preferida, por la expresión “medio de cultivo acuoso”, tal como se utiliza en esta memoria, se entiende un medio de reacción a base de agua que, en relación con todos los factores relevantes, en particular valor del pH, contenido de sales y temperatura, esté constituido de manera que mantenga o 5 fomente la viabilidad de células contenidas en el mismo, preferiblemente microorganismos y tanto el medio de cultivo acuoso como también la fase orgánica hidrofóbica estén presentes en forma líquida. Los requisitos de temperatura de diferentes células de importancia biotecnológica pueden deducirse de libros de texto microbiológicos y de biología molecular, p. ej., Fuchs/Schlegl, 2008. En una forma de realización preferida, el valor del pH del medio de cultivo acuoso en el momento del contacto oscila entre 4 y 9, preferiblemente entre 4,5 y 8,5, lo más preferiblemente entre 10 6,5 y 7,5. En otra forma de realización preferida, la temperatura oscila entre 0 y 45aC, preferiblemente entre 15 y
40°C, lo más preferiblemente entre 20 y 37°C. La mezcla de reacción está contenida típicamente en un fermentador. Como fermentador puede actuar cualquier recipiente de reacción que pueda ser esterilizado, preferiblemente sometido a autoclave y permita el cultivo del catalizador de células enteras, la ventilación y el control de las condiciones de reacción, por ejemplo del contenido en oxígeno y de la temperatura.
15 En una forma de realización preferida, la mezcla de reacción comprende, adicionalmente a la solución acuosa, una fase orgánica hidrofóbica. Ésta puede comprender un disolvente orgánico y/o un intercambiador de cationes líquido hidrofóbico para la separación del w-aminoácido graso a partir de la solución acuosa. Disolventes e intercambiadores de cationes adecuados se describen en el documento EP 11191520.3.
La presente invención se explica adicionalmente mediante las siguientes Figuras y Ejemplos no limitantes, de los 20 que se pueden deducir características, formas de realización, aspectos y ventajas adicionales de la presente invención.
Figura 1: Detección de mono- y di-aminas en el caldo de fermentación de la cepa E.coli W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) tras un tiempo de proceso de 21,75 h.
Ejemplo 1
25 Preparación de un vector de expresión para la expresión de los genes MSMEG_2956 de Mycobacterium smegmatis y npt de Nocardia sp.
Para la preparación de vectores para la co-expresión de MSMEG_2956 (carA, SEQ ID NO 1) de Mycobacterium smegmatis que codifica una ácido graso reductasa (YP_887275.1) y con npt (SEQ ID NO 2) de Nocardia sp que codifica una fosfopanteteinil-transfersa (ABI83656.1) que fosfopanteteinila ácido graso reductasa, ambos genes 30 fueron amplificados mediante PCR bajo la incorporación de regiones homólogas para la clonación por recombinación. En este caso, el ADN genómico del organismo donante servía para la amplificación del gen MSMEG_2956 y un fragmento de ADN sintetizado servía para la amplificación del gen npt como muestra. Los genes se encuentran bajo el control de un promotor lacuv5 (SEQ ID NO 3), el cual fue asimismo amplificado mediante PCR partiendo de un vector presente bajo incorporación de regiones homólogas para la clonación por recombinación.
35 En este caso, pasaron a emplearse los siguientes oligonucleótidos:
Plac_H1_dir: 5'-TTATGCGACTCCTGCTGGCTATGGTGGGATTTCC-3' (SEQ ID NO 4)
Plac_H2_inv: 5'-GATCGTCATATGCCACTCTCCTTGGTTCC-3' (SEQ ID NO 5)
carA_H2_dir: 5'-TGGCATATGACGATCGAAACGCGCG-3' (SEQ ID NO 6)
carA_H3_inv: 5'-TCCTTCTCTTACAGCAATCCGAGCATCT-3' (SEQ ID NO 7)
40 npt_H3_dir: 5'-GCTGTAAGAGAAGGAGTTCTATCATGATCGAG-3' (SEQ ID NO 8)
npt_H4_inv: 5'-GCAGCCTAGGTTAATTTATCAGGCGTACGCGATCG-3' (SEQ ID NO 9)
Para la PCR para la amplificación del Placuv5 y del gen npt se emplearon los siguientes parámetros: 1 x: desnaturalización inicial, 98°C, 0:30 min; 35 x: desnaturalización, 98°C, 0:10 min, reasociación, 55°C, 0:20 min; elongación, 72°C, 0:15 min; 1 x: elongación terminal, 72°C, 10 min. Para la amplificación del gen MSMEG_2956 se 45 emplearon los siguientes parámetros: 1 x: desnaturalización inicial, 98°C, 0:30 min; 35 x: desnaturalización, 98°C, 0:10 min, reasociación, 65°C, 0:20 min; elongación, 72°C, 1 min; 1 x: elongación terminal, 72°C, 10 min. Para la amplificación se utilizó la Mezcla Maestra de Alta Fidelidad Phusion™ de New England Biolabs (Frankfurt) correspondiente a los consejos del fabricante. En cada caso 50 pl de las reacciones PCR se separaron a continuación en un gel de TAE-agarosa al 1%. La realización de la PCR, la electroforesis en gel de agarosa, la
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tinción con bromuro de etidio del ADN y la determinación de los tamaños de fragmentos por PCR tuvieron lugar de la manera conocida por el experto en la materia. En todos los casos se podían amplificar fragmentos de PCR del tamaño esperado. Estos ascendían Placuv5 a 325 pares de bases, MSMEG_2956 a 3,5 pares de kilobases y npt a 718 pares de bases. Para el aislamiento del ADN a partir del gel de agarosa se recortó del gel con un bisturí el ADN diana y se purificó con el kit de extracción de gel QiaQuick según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Hilden). Los productos de PCR purificados se clonaron en un vector pACYDuet-1 cortado con EcoNi y PacI (Merck, Darmstadt) mediante recombinación utilizando el kit de clonación y ensamblaje sin costuras Geneart® según las instrucciones del fabricante (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). La transformación de E. coli DH10p químicamente competente (New England Biolabs, Frankfurt) tuvo lugar según el modo conocido por el experto en la materia. La inserción correcta de los genes diana se examinó mediante análisis por restricción y se confirmó la autenticidad de los genes incorporados mediante secuenciación de ADN. El vector de expresión preparado se designó pACYC(Placuv5)[carA_Ms-npt_Noc] (SEQ ID NO 10).
Ejemplo 2
Preparación de un vector de expresión para la co-expresión de los genes ald de Bacillus subtilis y Cv2025 de Chromobacterium violaceum
Para la preparación de un vector de expresión de E. coli para los genes ald (SEQ ID NO 11) de Bacillus subtilis que codifica una alanino deshidrogenasa (NP_391071.1) y Cv_2025 (SEQ ID No 12) de Chromobacterium violaceum que codifica una transaminasa (NP_901695.1) se clonó el gen ald de Bacillus subtilis en intercambio por el gen ald de Bacillus sphaericus en el vector de expresión de E. coli pJ281_alaD_Bsp_TA_C.v.(ct) (secuencia y preparación, véase el Ejemplo 1 del documento WO/2013/024114 y la SEQ ID NO 17 allí recogida). El gen ald de Bacillus subtilis se amplificó por PCR a partir de ADN cromosómico de la cepa Bacillus subtilis str. 168. En este caso pasaron a emplearse los siguientes oligonucleótidos:
alaDH_pCR22_dir: 5'-ATGATCATAGGGGTTCCTAAAGAG-3'
(SEQ ID NO 13)
alaDH_pCR22_inv: 5-TTAAGCACCCGCCACAGATG-3'
(SEQ ID NO 14)
Para la PCR se emplearon los siguientes parámetros: 1x: desnaturalización inicial, 98°C, 0:30 min; 35 x: desnaturalización, 98°C, 0:10 min, reasociación, 65°C, 0:30 min; elongación, 72°C, 0:20 min; 1 x: elongación terminal, 72°C, 10 min. Para la amplificación se utilizó la Mezcla Maestra de Alta Fidelidad Phusion™ de New England Biolabs (Frankfurt) correspondiente a los consejos del fabricante. En cada caso 50 pl de las reacciones PCR se separaron a continuación en un gel de TAE-agarosa al 1%. La realización de la PCR, la electroforesis en gel de agarosa, la tinción con bromuro de etidio del ADN y la determinación de los tamaños de fragmentos por PCR tuvieron lugar de la manera conocida por el experto en la materia. El fragmento de PCR mostró el tamaño esperado de 1137 pares de bases y se purificó con el kit de purificación de PCR Quick de Qiagen (Hilden) según las instrucciones del fabricante. Para el ligamiento del producto de PCR con el vector se colgaron 5'-fosfatos con ayuda de la polinucleótido quinasa (New England Biolabs, Frankfurt) al producto de PCR. En este caso, se siguieron los consejos del fabricante.
El vector se digirió con las endonucleasas de restricción HindIII y NdeI, con lo cual se separó el gen de Bacillus sphaericus ald contenido. La tanda de la digestión de restricción se separó en un gel de TAE-agarosa al 1%. Se pudieron identificar dos bandas con los tamaños de 5696 pb y 1124 pb. Para el aislamiento del ADN del vector a partir del gel de agarosa, la banda de ADN de 5696 pb se aisló del gel con un bisturí y se purificó con el kit de extracción de gel Quick de Qiagen (Hilden) según los datos del fabricante. Para la generación de extremos romos los colgantes 5' del ADN del vector purificado se rellenaron con ayuda del fragmento Klenow de la ADN-polimerasa I (New England Biolabs, Frankfurt). En este caso, se siguieron los datos del fabricante. El fragmento de ADN de Bacillus subtilis ald con restos 5'-fosfato se ligó en el vector con extremos romos. El vector de expresión de E. coli acabado se designó pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) (SEQ ID NO 15).
Ejemplo 3
Preparación de una cepa de E. coli que sobre-expresa los genes MSMEG_2956 de Mycobacterium smegmatis y npt de Nocardia sp., ald de Bacillus subtilis y Cv2025 de Chromobacterium violaceum
Para la generación de una cepa de E. coli que co-expresa los genes MSMEG_2956 de Mycobacterium smegmatis que codifica una ácido graso reductasa (YP_887275.1) y npt de Nocardia sp. que codifica una fosfopanteteinil- transferasa que fosfopanteteinila la ácido graso reductasa (ABI83656.1) en combinación con los genes ald de Bacillus subtilis que codifican una alanino deshidrogenasa (NP_391071.1) y Cv2025 de Chromobacterium violaceum que codifica una transaminasa (NP_901695.1), la cepa de E. coli W3110 se transformó con los plásmidos
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pACYC(Placuv5)[carA_Ms_npt_Noc] (SEQ ID NO 10) y pJ281_alaDH_B.s_TA_C.v.(ct) (SEQ ID NO 15) mediante electroporación y se sembró en placas de agar LB con cloranfenicol (50 |jg/ml) y canamicina (50 |jg/mol). Los transformantes se verificaron mediante preparación de plásmidos y análisis de restricción analítico en relación con la presencia de los plásmidos correctos. La cepa generada se designó E. coli W3110 pACYC(Placvu5)[carA_Ms- npt_Noc] / pJ281-alaDH_B.s._TA_C.v.(ct). La cepa se utilizó con el fin de examinar su capacidad para la producción de dodecandiamina partiendo de ácido dodecanodioico y dodecilamina partiendo de ácido dodecanoico. El producto génico CarA, una ácido graso reductasa, que es activado por la fosfopanteteinil-transferasa npt sobre-expresada, hace reaccionar el sustrato ácido dodecanoico o bien ácido dodecanodioico para dar el aldehido o bien dialdehído respectivo. La función del producto génico Cv_2505 consiste en hacer reaccionar el (di)-aldehído en posición terminal para dar dodecilamina o bien dodecanodiamina. El donante de amino alanina, requerido para la reacción de aminación, es proporcionado por el producto génico ald a partir de piruvato.
Ejemplo 4
Producción de dodecandiamina y dodecilamina por parte de cepas de E. coli con un vector de expresión para los genes MSMEG_2956 de Mycobacterium smegmatis y npt de Nocardia sp. en combinación con un vector de expresión para los genes ald de Bacillus subtilis y Cv_2025 de Chromobacterium violaceum
Se utilizó la cepa producida en el Ejemplo 3 con el fin de examinar su capacidad para la producción de dodecilamina y dodecandiamina. La biotransformación de ácido dodecanoico o bien dodecandiamina. La biotransformación de ácido dodecanoico o bien ácido dodecanodioico en dodecilamina o ben dodecandiamina se llevó a cabo en el sistema de fermentación paralela óctuplo de DASGIP. En este caso, se procedió de la siguiente manera: para la fermentación se utilizaron reactores de 1 L. Las sondas de pH se calibraron mediante una calibración de dos puntos con soluciones estándares de pH 4,0 y pH 7,0. Los reactores se cargaron con 300 mL de agua potable y se sometieron a autoclave durante 20 min a 121°C con el fin de garantizar la esterilidad. A continuación, las sondas de pO2 se polarizaron durante la noche (al menos durante 6 h) en el sistema DASGIP. A la mañana siguiente, se retiró el agua debajo de la cámara limpia y se reemplazó por 300 mL de medio de densidad celular elevada y 50 mg/L de cloranfenicol y 50 mg/L de canamicina. Seguidamente, las sondas de pO2 se calibraron con una calibración de un punto (agitador: 400 rpm / gasificación: 10 sL/h de aire) y los tramos de alimentación, de agente de corrección y de agente de inducción se limpiaron mediante limpieza in situ. Para ello, las mangueras se lavaron con etanol al 70%, a continuación con NaOH 1 M, después con agua totalmente desalada estéril, y finalmente se cargaron con los medios respectivos.
Las cepas de E. coli productoras de dodecandiamina y dodecilamina se cultivaron primeramente a partir del crio- cultivo en medio LB (25 mL en un matraz con deflectores de 100 mL) con los antibióticos arriba mencionados a lo largo de una noche a 37°C y 200 rpm durante aprox. 18 h. A continuación, 2 mL del cultivo en medio de alta densidad celular (glucosa 15 g/L (30 mL/L de una solución madre de 500 g/L sometida a autoclave por separado con MgSO4*7H2O al 1% y NH4Cl al 2,2%), (NH4)2SO4 1,76 g/L, K2HPO4 19,08 g/L, KH2PO4 12,5 g/L, extracto de levadura 6,66 g/L, citrato trisódico dihidrato 2,24 g/L, solución de citrato de amonio-hierro 17 mL/L de una solución madre al 1% sometida a autoclave por separado, solución de oligoelementos 5 mL/L de solución madre sometida a autoclave por separado (HCl (al 37%) 36,50 g/L, MnCl2*4H2O 1,91 g/L, ZnSO4*7H2O 1,87 g/L, ácido etilendiaminotetraacético dihidrato 0,84 g/L, H3BO3 0,30 g/L, Na2MoO4*2H2O 0,25 g/L, CaCl2*2H2O 4,70 g/L, FeSO4*7H2O 17,80 g/L, CuCl2*2H2O 0,15 g/L)) (25 mL en un matraz con deflectores de 100 mL) se sobre-inocularon con los antibióticos arriba mencionados y se incubaron a 37°C / 200 rpm durante otras 5,5 h.
Los reactores se inocularon con una densidad óptica de 0,1 al extraer un volumen correspondiente del cultivo previo en una jeringa de 5 mL (bajo condiciones estériles) y los reactores se inocularon mediante cánula a través de un tabique revestido con etanol al 70%.
Se utilizó el siguiente programa estándar:
Regulador de DO
Regulador del pH
Pre-ajuste
0% Pre-ajuste 0 ml/h
P
0,1 P 5
Ti
300 s Ti 200 s
Min
0% Min 0 mlL/h
Máx
100% Máx 40 mL/h
5
10
15
20
25
30
35
40
N (Rotación)
de a XO2 (mezcla gaseosa) de a F (flujo de gas) de a
Crecimiento y biotransformación
0% 30% Crecimiento y biotransformación 0% 100% Crecimiento y biotransformación 15% 80%
400 rpm
1500 rpm 21 % 21% 6 sL/h 72 sL/h
Guión
Activador nítido
31% DO (1/60h)
Inducción de IPTG
2 h después comienzo de alimentación
Activador de alimentación
50% DO
Tasa de alimentación
3 [mL/h]
El experimento llevado a cabo se puede dividir en dos fases, el cultivo, en el que las células deben alcanzar una determinada densidad óptica, y la subsiguiente biotransformación en la que, después de la adición de los sustratos ácido dodecanoico, ácido oleico o bien ácido dodecanodioico, ha de tener lugar una reacción para dar dodecilamina, oleilamina o bien dodecandiamina de enzimas formadas en la expresión. Los valores del pH se regularon parcialmente con amoníaco (12,5%) a pH 6,8. Durante el cultivo y la biotransformación se reguló en 30% el oxígeno disuelto (DO, disolved oxygen) en el cultivo a través del número de revoluciones del agitador y de la tasa de gasificación. La fermentación se llevó a cabo como tanda discontinua, activando el comienzo de la alimentación, 5 g/Lh de alimentación de glucosa (500 g/L de glucosa con MgSO4*7H2O al 1% y NH4Cl al 2,2%) por encima de un pico de DO. Con el inicio de la alimentación se redujo también la temperatura de previamente 37°C a 30°C. La expresión de la transaminasa, alanino deshidrogenasa, ácido carboxílico reductasa y fosfopanteteinil transferasa se indujo 2 h después del inicio de la alimentación mediante la adición automática de IPTG 1 mM. Antes del inicio de la biotransformación se determinó la densidad óptica de los caldos de cultivo.
El inicio de la fase de biotransformación tuvo lugar durante 1 h o bien 12 h después del inicio de la alimentación. Para ello, al caldo de fermentación se añadieron en forma de tanda 150 mL o 75 mL de una mezcla a base de ácido dodecanoico o bien ácido dodecanodioico y ácido oleico (90% técnico). Con el fin de proporcionar un donante de grupos amino para la transaminasa, media hora antes del inicio de la biotransformación se añadieron al caldo de fermentación 5 mL de una solución de sulfato de amonio 3 M. Para la toma de muestras se retiraron 2 mL de caldo de fermentación de la caldera y una parte de los mismos se diluyeron en la relación 1/20 en uno y en una mezcla a base de 80% de acetonitrilo, 20% de agua y ácido fórmico al 0,1% y se extrajeron. De todos los reactores se tomaron muestras a las 1,25 h, 2,75 h, 4,25 h, 18,25 h y 21,75 h después del inicio de la biotransformación. Las tasas de conversión para el oxígeno (OTR = oxygen transfer rate) y carbono (CTR = carbon transfer rate) se determinaron durante la fermentación a través de la analítica de los gases de escape en los sistemas DASGIP. La fermentación finalizó 21,75 h después del inicio de la biotransformación. El agitador, la gasificación, la regulación de la temperatura y la regulación del pH se expusieron y la caldera se dejó reposar durante 5-10 minutos.
Método del escaneo por HPLC-ESI/MS
La evaluación cualitativa de las muestras tuvo lugar mediante acoplamiento HPLC/MS con detección MS de alta resolución en el modo de escaneo.
En este caso pasaron a emplearse los siguientes aparatos:
• Instalación de HPLC Accela (Thermo Scientic, Waltham, Massachusetts, EE.UU.) con automuestreador, bomba cuaternaria, detector de PDA y horno de columna
• Espectrómetro de masas LTQ-FT (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE.UU.) con fuente ESI
• Columna de HPLC: Kinetex C18, 100 x 2,1 mm, tamaño de partícula: 2,6 pm, tamaño de poro: 100 A (Phenomenex; Aschaffenburg)
Las muestras se prepararon pipeteando 1950 pL de disolvente (80% (v/v) de acetonitrilo, 20% de H2O bidest. (v/v) + ácido fórmico al 0,1%) y 50 pL de muestra en un recipiente de reacción de 2 mL. La mezcla se sometió a vórtice durante aprox. 10 segundos y, a continuación, se centrifugó a aprox. 13000 rpm durante 5 min. El sobrenadante transparente se retiró con una pipeta.
5
10
15
20
25
La separación por HPLC tuvo lugar con la columna de HPLC arriba mencionada. El volumen de inyección ascendió a 0,5 |jL, la temperatura de la columna a 40°C y el caudal a 0,3 mL/min. La fase móvil se componía de eluyente A (ácido trifluoroacético acuoso al 0,02% (v/v)) y eluyente B (acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,015% (v/v)). Se utilizó el siguiente perfil de gradiente:
Tiempo [min] Eluyente A [%] Eluyente B [%]
0
98 2
2
98
2
17
2 98
32
2 98
El análisis ESI-MS tuvo lugar en un modo positivo con los siguientes parámetros de la fuente ESI:

• tensión ESI: 4kV

• temperatura del capilar 300°C

• flujo de gas de la envoltura 40

• flujo de gas auxiliar 5

• flujo de gas de barrido 3
La detección tuvo lugar en un intervalo de masas de m/z = 100 a 1000. La resolución por espectrometría de masas ascendió a R = 100.000.
Los resultados se representan en la siguiente tabla.
Intensidad MS [-]
Sustrato
Inducción Dodecandiamina Dodecilamina Oleilamina
LS/ ácido oleico (150 ml)
IPTG 1 mM (12h) n.d. 1.160.000 23.700
DDS/ ácido oleico (75 ml)
IPTG 1 mM en H2O/ etanol (12h) 742.000 n.d. 18.000
DDS/ ácido oleico (150 ml)
IPTG 1 mM (1h) 30.700 n.d. n.d.
DDS/ ácido oleico (150 ml)
IPTG 1 mM (12h) 23.500 n.d. n.d.
Determinación cuantitativa de mono- y di-aminas en el caldo de fermentación de la cepa E.coli W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] / pj281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) tras un tiempo de proceso de 21,75 h (n.d. = no detectable; lS = ácido láurico, DDS = ácido dodecanodioico).
La Figura 1 aclara datos adicionales.
La determinación cuantitativa de 1,12-dodecandiamina y dodecilamina tuvo lugar mediante medición HPLC/UV, después de derivatización mediante orto-ftaldialdehído. Se midió el sobrenadante metanólico. Los parámetros cromatográficos más importantes están recopilados en la siguiente Tabla.
Columna
Luna 5u C8, 100 A, 150 x 4.60 mm, (Phenomenex; Aschaffenburg)
Instalación de HPLC
Agilent 1200
Eluyente A
2,5 mL de ácido acético (100 %) en 1 L de agua bidest., ajuste del pH con lejía de sosa a pH 6,0
Eluyente B
Metanol
Temp. de la columna
O 0 O
Caudal
1 mL/min
Gradiente
0,0-1 min: 30,0% de B, 1,0-17,0 min: 90.0% de B, 17-19,5 min: 90,0% de B, 19,6-20,5 min: 30,0% de B
Detector
DAD, 334 nm
Derivatización/ volumen de inyección
Derivatización automática mediante programa de inyector, 1 jL de muestra se hace reaccionar con 9 jL de reactivo de derivatización; composición del reactivo de derivatización: 10 g/L de o-ftaldialdehído disuelto en tampón borato (0,4 mol/L), bajo adición de
5
10
15
20
25
30
35
mercaptoetanol (5 mL/L) y metanol (100 mL/L)
Calibrado
Calibrado externo, intervalo de medición 50-1000 mg/L, calibrado de 5 puntos, calibrado antes y después de la serie de muestras, notificación sobre las dos series de calibrado, regresión cuadrática
Los resultados están representados en las siguientes tablas.
Sustrato
lnducción Dodecilamina [mg/L] Dodecandiamina [mg/L]
DDS/ ácido oleico (75 ml)
lPTG 1 mM en H2O/ etanol (12h) n.d. 40,5
DDS/ ácido oleico (150 ml)
lPTG 1 mM (1h) n.d. 3,1
DDS/ ácido oleico (150 ml)
lPTG 1 mM (12h) n.d. <1*>
LS/ ácido oleico (150 ml)
lPTG 1 mM (12h) 11,6 n.d.
Cuantificación de mono- y di-aminas en el caldo de fermentación de la cepa E.coli W3110 pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) tras un tiempo de proceso de 21,75 h (n.d. = no detectable, * menor que el límite de detección, DDS = ácido dodecanodioico, LS = ácido láurico).
Se demostró que las cepas están en condiciones de preparar las respectivas aminas dodecilamina, dodecandiamina y oleilamina a partir de ácido dodecanoico, ácido dodecanodioico y ácido oleico.
Ejemplo 5
Preparación de un vector de expresión para la expresión del gen aDOX que codifica una a-dioxigenasa de Oryza sativa
Para la preparación de un vector para la expresión de aDOX (Os12g0448900, SEQ ID NO 16) de Oryza sativa que codifica una a-dioxigenasa (NP_001066718.1) se optimizó en codones el gen para la expresión en Escherichia coli, se sintetizó y al mismo tiempo se introdujo un lugar de corte Ndel aguas arriba y un lugar de corte Avrll aguas abajo. El fragmento de ADN sintetizado se digirió con las endonucleasas de restricción Ndel y Avrlll y se ligó en el vector correspondientemente cortado pACYC(Placvu5)[carA_Ms-npt_Noc] (SEQ lD NO 10) bajo separación de los genes carA_Ms y npt_Noc. El promotor lacuv5 contenido en el vector (SEQ lD NO 3) se obtuvo con ello. El vector acabado se designo pACYC(Placuv5)[DOX_Os(co_Ec] (SEQ lD NO 17). El vector pACYC es un vector de E. coli que induce resistencia a cloranfenicol, así como porta un origen de replicación de p15A y, con ello, presenta un bajo número de copias (10-15 copias por célula).
Ejemplo 6
Preparación de una cepa de E. coli con deleción en el gen bioH que sobre-expresa los genes aDOX de Oryza sativa, ald de Bacillus subtilis y Cv2025 de Chromobacterium violaceum
Para la generación de una cepa de E. coli que co-expresa el gen aDOX de Oryza sativa que codifica una a- dioxigenasa (NP_001066718.1) en combinación con los genes ald (SEQ lD NO 11) de Bacillus subtilis que codifica una alanino deshidrogenasa (NP_391071.1) y Cv2025 (SEQ lD NO 12) de Chromobacterium violaceum que codifica una transaminasa (NP_901695.1), la cepa de E. coli W3110 AbioH (preparación, véase el documento EP 12007663, Ejemplo 1) se transformó con los plásmidos pACYC(Placuv5)[DOX_Os(co_Ec)] (SEQ lD NO 17) y pJ281_alaDH_B.s_TA_C.v.(ct) (SEQ lD NO 15) mediante electroporación y se sembró en placas de agar LB con cloranfenicol (50 pg/ml) y canamicina (50 pg/mol). Los transformantes se verificaron mediante preparación de plásmidos y análisis de restricción analítico en relación con la presencia de los plásmidos correctos. La cepa generada se designó E. coli AbioH pACYC(Placvu5)[DOX_Os(co_Ec)] / pJ281-alaDH_B.s._TA_C.v.(ct). La cepa se utilizó con el fin de examinar su capacidad para la producción de éster metílico del ácido aminoundecanoico partiendo de éster metílico del ácido dodecandioico.
Ejemplo 7
Producción de éster metílico del ácido aminoundecanoico partiendo de éster metílico del ácido dodecanodioico mediante una cepa de E. coli con un vector de expresión para el gen aDOX de Oryza sativa en combinación con un vector de expresión para los genes ald de Bacillus subtilis y Cv_2025 de Chromobacterium violaceum
Se utilizó la cepa descrita en el Ejemplo 8 con el fin de examinar su capacidad para la producción de éster metílico del ácido aminoundecanoico. En este caso, se procedió de la siguiente manera: la cepa a examinar se extendió primeramente sobre una placa de agar LB con 5o pg/ml de cloranfenicol y 50 pg/ml de canamicina y se incubó a 37°C durante la noche. Como control se extendió adicionalmente la cepa E. coli W3110 AbioH sobre una placa de 5 agar LB sin antibióticos. Las cepas se cultivaron entonces en caldo de Luria-Bertani según Miller (Merck, Darmstadt) con 50 pg/ml de cloranfenicol y 50 pg/ml de canamicina (para la cepa portadora del plásmido) como cultivo previo de 20 ml a partir de en cada caso una colonia individual. Como cultivo principal se dispusieron 100 ml de caldo de LB con 50 pg/ml de cloranfenicol y 50 pg/ml de canamicina en un matraz Erlenmeyer de 500 ml con deflectores y se inocularon con 2 ml del cultivo previo. El cultivo tuvo lugar primeramente a 37°C y 200 rpm en un agitador de 10 incubación. Al alcanzar una densidad óptica (600 nm) de 0,5-0,7, se indujo la expresión del gen mediante la adición de IPTG 1 mM. El cultivo ulterior tuvo lugar a 22°C y 200 rpm a lo largo de la noche. Al día siguiente, los cultivos se recogieron mediante centrifugación durante 10 minutos a 4°C y 5525 x g. El sobrenadante se desechó y el sedimento de células se lavó en tampón fosfato de potasio 200 mM (pH 7,5). Finalmente, el sedimento celular se recogió en tampón fosfato de potasio 200 mM con cloruro de amonio 50 mM y glucosa al 0,5% (p/v), de modo que 15 se alcanzó una DO (600 nm) de 20. A la suspensión de células se añadió éster metílico del ácido dodecanodioico 12,5 mM (abcr, Karlsruhe) en etanol y se agitó ligeramente durante 4 horas a 30°C y 300 rpm. Durante la incubación se tomaron muestras en los momentos de 0 min, 60 min, 120 min, 180 min y 240 min y se extrajeron en una mezcla a base de 80% de acetonitrilo, 20% de agua y ácido fórmico al 0,1%. El sobrenadante se analizó mediante analítica HPLC/MS. Los resultados están representados en la siguiente Tabla.
Cepa
Tiempo [min] Superficie pico éster metílico del ácido aminoundecanoico
E.coli W3110 AbioH
0 n.d.
120
n.d.
180
n.d.
240
n.d.
E.coli W3110 AbioH pACYC{Placuv5}[DOX] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct)
0 n.d.
120
57616
180
371989
240
1764605
20 Producción de éster metílico del ácido aminoundecanoico con E.coli W3110 AbioH, sobre-expresados aDOX de Oryza sativa, ald de Bacillus subtilis y Cv_2025 de Chromobacterium violaceum. Se indican las superficies pico (n.d. = no detectable).
Pudo demostrarse que la cepa E. coli W3110 AbioH pACYC(Placuv5)[DOX] / pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v.(ct) está capacitada para la formación de éster metílico del ácido aminoundecanoico partiendo de éster metílico del ácido 25 dodecanodioico.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Evonik Industries AG
<120> Preparación de aminas y diaminas a partir de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos
5 <130> 2012000206
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5 <210> 1 < 211> 3507 10 < 212> ADN
< 213> Mycobacterium smegmatis
<400>
atgacgatcg gacccgcagt gagttgcgcc ctcggcaagc ctgccccgct aatgcctggc agtgtcgact ctgcagacca gtgatcgcgt gcgccgtcgc ttcgaggcgg gtactggacc ccgctgaccc cccgagtcca ctcggcgtga ggcatcctgt ctgtccacct cgcatctggg ggatccgagg gggcgattcg gtcgaggacc gtgttcatcg
aaacgcgcga
tcgccgccgc
ttcctgccgc
gcgccgtcga
tcgacaccat
acaaccatcc
acacgacgat
gtgcgccggt
cgagcgtcga
gactggtggt
ccaagggcaa
gcgggcggtc
ttctcatcta
agaccgccac
tgccgtcaat
gcagcacact
tcctggagga
acatgctgtt
accgagccga
tttcggccct
tgctcgacat
acgggcagat
agaccgcttc
ccgtcccgac
ggtcaaacag
gttcgtcacc
cacctaccgt
ggtgaatgcc
cgacatcgcc
ggcccaactg
cttcctcgcc
gttcgactac
gctcgcaggc
actcgccgac
cacctccggc
gatgtggcag
caccctgaac
cgccagcggc
cctcgccctc
ccaggagtac
agccgcagtc
gaccggatcg
gcatctgctg
ccagcgcccg
aaccggcgca
gaggcgatca
attctggccg
gacgaagaag
cagctcgcag
ggtgaccgcg
ctgctcgaac
cagccgatcg
gacgcagtcg
agccacgagg
accggcgtcg
gcaccgctct
agcaccggca
gccgggtcca
ttcatgccca
ggaaccgcgt
gtgcggccca
cagagccgcc
ctcgaagagg
gctoccatct
gagggctacg
ccggtcatcg
ttgaccactt gcgcggctgc gctatgcgga gccgcaccac gccggatcca tggccatcct tcggcgccgt tcgccgagac ctctcgtcga tcgacgatca tcgtcgagac acgtgcccga ctcccaaggg aggcccggtg tgagtcacgt acttcgccgc cgcagctcaa tcgacaaccg tccgcaccca cggcggagat gctccaccga actacaagct
gttcgaaacc
cgccgatccg
ccgccctgcg
cgcgaagctc
ggccgtgacc
gggtttcacc
gtccgtaccg
cgagcccaag
gtccgggccc
gcgtgaggcg
gatcaccgac
cgagaccgac
cgcgatgtac
ggacgagacc
catggggcgc
acgcagcgac
cttcgttcct
ccgcgccgag
actgctcggc
gaagagctgg
ggccggcgcg
ggtcgacgtg
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Catalizador de células enteras, que expresa una a-dioxigenasa recombinante o la combinación a base de una ácido graso reductasa recombinante y de una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteinila la ácido graso reductasa y que, adicionalmente, expresa una transaminasa.
  2. 2. Catalizador de células enteras según la reivindicación 1, en donde el catalizador de células enteras expresa adicionalmente una aminoácido deshidrogenasa.
  3. 3. Catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el catalizador de células enteras expresa adicionalmente una alcano hidroxilasa.
  4. 4. Catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el catalizador de células enteras expresa adicionalmente un polipéptido de la familia AlkL.
  5. 5. Catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 4, que expresa adicionalmente una alcohol deshidrogenasa.
  6. 6. Catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la actividad de al menos una enzima que participa en la p oxidación está reducida con respecto al tipo salvaje del catalizador de células enteras.
  7. 7. Catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la actividad de BioH o de una variante del mismo está reducida o incrementada con respecto al tipo salvaje del catalizador de células enteras.
  8. 8. Catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la actividad de FadL o de una variante del mismo está incrementada con respecto al tipo salvaje del catalizador de células enteras.
  9. 9. Procedimiento para la reacción de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos para formar una amina o diamina, que comprende las etapas
    a) proporcionar un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o un monoéster de los mismos, para el caso de que se trate de un ácido dicarboxílico,
    b) poner en contacto el ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o el monoéster de los mismos con una ácido graso reductasa fosfopanteteinilada o una a-dioxigenasa bajo formación de un producto de aldehido, y
    c) poner en contacto el producto de la etapa b) con una transaminasa.
  10. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que en la etapa c) está presente una aminoácido deshidrogenasa.
  11. 11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 10, en el que se proporciona al menos una enzima del grupo que comprende ácido graso reductasa fosfopanteteinilada, a-dioxigenasa, transaminasa, aminoácido deshidrogenasa y alcano hidroxilasa en forma de un catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 8.
  12. 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, en el que en el caso del ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o del monoéster de los mismos se trata de un compuesto de la fórmula (I)
    R1 - A -COOR2(I)
    en donde R1 se elige del grupo que comprende -H y COOR3,
    en donde R2 y R3, en cada caso e independientemente uno de otro, se eligen del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
    con la condición de que al menos uno de los radicales R2 y R3 sea H,
    en donde A representa un grupo hidrocarbonado con al menos cuatro átomos de carbono no ramificado, ramificado, lineal, cíclico, sustituido o no sustituido.
  13. 13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 12, en el que A presenta la fórmula -(CH2V, siendo n al menos 4, preferiblemente al menos 10.
  14. 14. Uso del catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 8 o del procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 12, para la aminación de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos.
  15. 15. Mezcla de reacción que comprende el catalizador de células enteras según una de las reivindicaciones 1 a 8 en solución acuosa, así como un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o un monoéster de los mismos de la fórmula (I)
    R1 - A -COOR2(I)
    en donde R1 se elige del grupo que comprende -H y COOR3,
    5 en donde R2 y R3, en cada caso e independientemente uno de otro, se eligen del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
    con la condición de que al menos uno de los radicales R2 y R3 sea H,
    en donde A representa un grupo hidrocarbonado con al menos cuatro átomos de carbono no ramificado, ramificado, lineal, cíclico, sustituido o no sustituido.
    Figura 1
    imagen1
ES13810940.0T 2012-12-21 2013-12-18 Preparación de aminas y diaminas a partir de un ácido carboxílico o ácido dicarboxílico o de un monoéster de los mismos Active ES2670143T3 (es)

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