ES2640712T3 - Producción de ácidos omega-aminograsos - Google Patents

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ES2640712T3 ES13194396.1T ES13194396T ES2640712T3 ES 2640712 T3 ES2640712 T3 ES 2640712T3 ES 13194396 T ES13194396 T ES 13194396T ES 2640712 T3 ES2640712 T3 ES 2640712T3
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Abstract

Catalizador de célula completa que exprime una α-dioxigenasa recombinante, o la combinación de una reductosa de ácido graso recombinante y una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteiniliza la reductasa de ácido graso, y que exprime adicionalmente una transaminasa, siendo la fosfopanteteinil-transferasa y/o transaminasa preferentemente recombinante.

Description

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DESCRIPCION
Produccion de acidos omega-aminograsos
La invencion se refiere a un catalizador de celula completa que exprime una a-dioxigenasa recombinante, o la combinacion de una reductosa de acido graso recombinante y una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteiniliza la reductasa de acido graso, y que exprime adicionalmente una transaminasa, siendo la fosfopanteteinil-transferasa y/o transaminasa preferentemente recombinante; asf como a un procedimiento para la reaccion de un acido graso, acido w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o de un monoester del mismo para dar una amina, que comprende los pasos oxidacion del acido graso, w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o del monoester del mismo mediante puesta en contacto con una alcanohidrolasa, y en caso dado una alcoholdehidrogenasa, para dar un producto de oxidacion, puesta en contacto del producto de oxidacion con una reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada o de una a-dioxigenasa para dar un aldehndo, y puesta en contacto del aldehndo con una transaminasa, poniendose a disposicion los enzimas reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada, a-dioxigenasa, transaminasa y alcanohidrolasa en forma de un catalizador de celula completa segun una forma de realizacion segun la invencion. Poliamidas son una clase de polfmeros que estan caracterizados por grupos amida recurrentes. A diferencia de las protemas analogas qmmicamente, el concepto “poliamida“ se refiere habitualmente a materiales sinteticos termoplasticos disponibles en el comercio. Las poliamidas se derivan de aminas primarias o de aminas secundarias, que se obtienen habitualmente mediante craqueo de hidrocarburos. No obstante, tambien se pueden emplear derivados, mas exactamente acidos aminocarboxflicos, lactamas y diaminas, para la produccion de polfmeros. Ademas son de interes alcanos gaseosos de cadena corta como eductos, que se pueden obtener partiendo de materias primas regenerativas con procedimientos biotecnologicos. Muchas poliamidas bastante solicitadas comercialmente se producen partiendo de lactamas. Por ejemplo, se puede obtener “poliamida 6“ mediante polimerizacion de £-caprolactama y "poliamida 12" mediante polimerizacion de laurinlactama. Otros productos interesantes comercialmente comprenden copolfmeros de lactamas, por ejemplo copolfmeros de £- caprolactama y laurinlactama. La generacion qmmico-tecnica convencional de aminas es dependiente del abastecimiento con materias primas fosiles, ineficiente, y en este caso se forman grandes cantidades de productos secundarios no deseados, en algunos pasos de la smtesis hasta un 80 %. Un ejemplo de tal proceso constituye la produccion de laurinlactama. Esta se efectua convencionalmente a traves de un procedimiento de muchas etapas, que no solo proporciona un rendimiento reducido, sino que simultaneamente requiere la puesta a disposicion de una costosa infraestructura.
En vista de estos inconvenientes se desarrollaron procedimientos para obtener aminas bajo empleo de biocatalizadores, partiendo de materias primas regenerativas. Como materias primas regenerativas entran en consideracion en especial fuentes de acidos grasos, que se pueden obtener en forma de aceite de colza, aceite de cardo, aceite de palmiste, aceite de coco, aceite de semillas de girasol, y productos naturales similares, a partir de una pluralidad fuentes biologicas, en especial a partir de plantas.
El documento PCT/EP 2008/067447 describe un sistema biotecnologico para la preparacion de productos analogos qmmicamente, mas exactamente acidos w-aminocarboxflicos, bajo empleo de una celula, que presenta una serie de actividades enzimaticas apropiadas y es apta para transformar acidos carboxflicos en los correspondientes acidos w-aminocarboxflicos. El procedimiento comprende una cascada de reacciones catalizadas por via enzimatica, en especial la oxidacion de un acido graso en el atomo de carbono terminal hasta el aldehndo y la siguiente aminacion bajo empleo de una transaminasa y un aminoacido como donador de amina, que se puede regenerar a traves de una dehidrogenasa de aminoacido.
No obstante, un inconveniente conocido del sistema de oxidasa AlkBTG de Pseudomonas putida GPO1 empleado en este caso consiste en que este no es apto para producir una oxidacion selectiva de alcanos alifaticos a alcoholes primarios. Mas bien se presenta una pluralidad de productos de oxidacion; en especial aumenta la proporcion de productos de oxidacion mas elevada, como el correspondiente aldehndo, la correspondiente cetona, o el correspondiente acido carboxflico con tiempo de reaccion creciente (C. Grant, J. M. Woodley and F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486), lo que reduce el rendimiento en amina deseada de modo correspondiente.
El problema de la oxidacion relativamente no selectiva esta agudizado por que los productos de oxidacion que se forman son muy similares estructuralmente. Esto ocasiona que sea muy complicado separar estos de los productos de oxidacion deseados de manera eficiente y sin perdida de rendimiento significativa.
Otro inconveniente de este procedimiento consiste en que los productos secundarios sobreoxidados, a modo de ejemplo el acido dicarboxflico del acido graso empleado como educto, el reciclaje de disolventes hidrofobos e intercambiadores cationicos hidrofobos lfquidos, que se pueden emplear segun el documento PCT/EP2011/071491 para la separacion del producto de la mezcla de reaccion acuosa, reducen la eficiencia en la utilizacion de recursos.
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En este contexto se debe poner de relieve que la complejidad de sistemas biotecnologicos con una cascada de reacciones, como se describen en el documento PCT/EP 2008/067447, de las que respectivamente una reaccion se cataliza por un determinado enzima, dificulta la optimizacion de las condiciones de reaccion. De este modo, en el caso de acidos w-aminograsos reactivos en principio como producto se da la posibilidad de que estos reaccionen con componentes esenciales del organismos en el interior de la celula a partir de una determinada concentracion cntica y, por lo tanto, presenten accion toxica. Si este es el caso, la capacidad de crecimiento y smtesis del organismo se reducen hasta la muerte de la celula, sin que el desarrollador pueda identificar inmediatamente la toxicidad, o incluso sin que esta se pueda asignar a un determinado educto, producto intermedio o producto. Del mismo modo no era previsible que organismo tolera que concentracion de una substancia con reactividad qmmica.
Tampoco respecto a un rendimiento de producto a mejorar y a una formacion reducida de productos secundarios el especialista puede identificar de modo rutinario factores limitantes y decisivos en un sistema, como el descrito en el documento PCT/EP2008/067447. Si el rendimiento de producto es demasiado reducido, esto puede radicar en que uno de los enzimas este presente en una concentracion demasiado reducida, sin que se sepa de cual de los enzimas considerados se trata en este caso, es decir, el educto no se transforma en el intervalo de tiempo previsto o antes de la degradacion debida a enzimas concurrentes en base a una capacidad de smtesis insuficiente. De modo alternativo es completamente posible que un enzima este presente de manera identificable en la celula en forma de un polipeptido, pero no presente el plegamiento esencial para la actividad precisamente en esta celula, o falte un cofactor desconocido hasta la fecha pero esencial para la actividad. Del mismo modo, como ya se ha mencionado, el producto metabolico para la celula puede ser toxico o se puede degradar. Finamente se debe contar con interacciones interferentes con enzimas endogenos, es decir, presentes naturalmente en una celula empleada como catalizador de celula completa.
Los documentos WO2009/077461, US2007/032428 y Coop, J.N. (2006), Applied and Environmental Microbiology; 72 (4):2298-2305 describen el estado de la tecnica.
Por consiguiente, existe una demanda de procedimientos para la produccion de acidos w-aminograsos a partir de acidos grasos, en los que las reacciones catalizadas por via enzimatica transcurran mas selectivamente y se minimice la formacion de productos secundarios no deseados. Ante estos antecedentes, la tarea que motiva la invencion consiste en poner a disposicion un procedimiento biotecnologico para la produccion de acidos w- aminograsos lo mas eficiente posible respecto a rendimiento, balance de carbono y/o nitrogeno. Otra tarea que motiva la invencion consiste en poner a disposicion un procedimiento biotecnologico para la reaccion de carboxilatos para dar carboxilatos aminados lo mas eficiente posible respecto a rendimiento, balance de carbono y/o nitrogeno, reutilizabilidad de agentes empleados y/o pureza del producto. En este contexto se entiende por un balance de carbono y/o nitrogeno eficiente que una proporcion lo mas elevada posible de carbono y/o nitrogeno alimentado a una celula para la reaccion de un carboxilato en forma de substratos apropiados se encuentra de nuevo en el producto final deseado, en lugar de transformarse en productos diferentes al deseado. Otra tarea que motiva la invencion consiste en mejorar la elaborabilidad de una mezcla de reaccion polifasica a partir de la reaccion de un carboxilato, especialmente respecto a la reutilizabilidad para la elaboracion de disolventes hidrofobos e intercambiadores cationicos lfquidos empleados, asf como respecto a la formacion y separacion de fases en un sistema bifasico que comprende una fase acuosa, en la que se desarrolla la reaccion del carboxilato, y una fase organica con disolventes organicos y/o intercambiadores cationicos lfquidos. Esta y otras tareas se solucionan mediante el objeto de la presente invencion, y en especial tambien mediante el objeto de las reivindicaciones independiente adjuntas, resultando formas de realizacion de las reivindicaciones subordinadas.
El problema que motiva la invencion se soluciona en un primer aspecto mediante un catalizador de celula completa que exprime una a-dioxigenasa recombinante o la combinacion de una reductasa de acido graso recombinante y una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteiniliza la reductasa de acido graso, y que exprime adicionalmente una transaminasa, siendo la fosfopanteteinil-transferasa y/o transaminasa preferentemente recombinante.
En una primera forma de realizacion del primer aspecto, el problema se soluciona mediante un catalizador de celula completa, que exprime adicionalmente una dehidrogenasa de aminoacido, que es preferentemente recombinante.
En una segunda forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un catalizador de celula completa, que exprime adicionalmente una alcanohidroxilasa, que es preferentemente recombinante.
En una tercera forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera a la segunda forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un catalizador de celula completa, que exprime adicionalmente un polipeptido de la familia AlkL, que es preferentemente recombinante.
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En una cuarta forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera a la tercera forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un catalizador de celula completa, que exprime adicionalmente una alcoholdehidrogenasa, que es preferente recombinante.
En una quinta forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera a la cuarta forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un catalizador de celula completa, estando reducida la actividad de al menos un enzima implicado en la p-oxidacion frente al tipo salvaje del catalizador de celula completa.
En una sexta forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera a la quinta forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un catalizador de celula completa, estando reducida la actividad de BioH o de una variante del mismo frente al tipo salvaje del catalizador de celula completa.
En una septima forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera a la sexta forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un catalizador de celula completa, estando reducida la actividad de FadL o de una variante del mismo frente al tipo salvaje del catalizador de celula completa.
En un segundo aspecto, el problema que motiva la invencion se soluciona mediante un procedimiento para la reaccion de un acido graso, acido w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o de un monoester del mismo para dar una amina, que comprende los pasos
a) oxidacion del acido graso, w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o del monoester del mismo mediante puesta en contacto con una alcanohidrolasa, y en caso dado una alcoholdehidrogenasa, para dar un producto de oxidacion,
b) puesta en contacto del producto de oxidacion con una reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada o de una a-dioxigenasa para dar un aldetudo, y
c) puesta en contacto del aldetudo con una transaminasa,
poniendose a disposicion los enzimas reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada, a-dioxigenasa, transaminasa y alcanohidrolasa en forma de un catalizador de celula completa segun el primer aspecto de la invencion. En un segundo aspecto, el problema que motiva la invencion se soluciona mediante un procedimiento, estando presente en el paso c) una dehidrogenasa de aminoacido. En una primera forma de realizacion del segundo aspecto, el problema se soluciona mediante un procedimiento, poniendose a disposicion los enzimas reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada, a-dioxigenasa, transaminasa, dehidrogenasa de acido graso y alcanohidrolasa en forma de un catalizador de celula completa segun el primer aspecto de la invencion. En una segunda forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un procedimiento, tratandose en el caso del acido graso, acido w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o del monoester del mismo, de un compuesto de la formula (I)
R1 - A -COOR2 (I)
seleccionandose R1 a partir del grupo que comprende -H, -CHO, -OH y COOR3,
seleccionandose R2 y R3 respectivamente, y de modo independiente entre sf, a partir del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
con la condicion de que al menos uno de los restos R2 y R3 sea H,
representando A un grupo hidrocarburo no ramificado, ramificado, lineal, cfclico, substituido o no substituido, con al menos cuatro atomos de carbono.
En una tercera forma de realizacion, que constituye tambien una forma de realizacion de la primera a la segunda forma de realizacion, el problema se soluciona mediante un procedimiento, presentando A la formula - (CH2)n -, siendo n al menos 4, preferentemente al menos 10.
En un tercer aspecto, el problema que motiva la invencion se soluciona mediante un empleo de un catalizador de celula completa segun el primer aspecto, o del procedimiento segun el segundo aspecto para la aminacion de un acido graso, acido w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o un monoester del mismo.
En un cuarto aspecto, el problema que motiva la invencion se soluciona mediante una mezcla de reaccion que comprende el catalizador de celula completa segun el primer aspecto en disolucion acuosa, asf como un acido
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graso, acido w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o un monoester del mismo de la formula (I) R1 -A -COOR2 (I),
seleccionandose R1 a partir del grupo que comprende -H, -CHO, -OH y COOR3,
seleccionandose R2 y R3 respectivamente, y de modo independiente entre s^ a partir del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
con la condicion de que al menos uno de los restos R2 y R3 sea H,
representando A un grupo hidrocarburo no ramificado, ramificado, lineal, dclico, substituido o no substituido, con al menos cuatro atomos de carbono, preferentemente la formula -(CH2)n -, siendo n al menos 4, de modo especialmente preferente al menos l0.
La presente invencion se basa en el conocimiento del inventor de que una reductosa de acido graso o a-dioxigenasa coexprimida funcionalmente recombinante en un catalizador de celula completa, que se emplea para la produccion de acidos w-aminograsos a partir de acidos grasos y presenta una dotacion enzimatica correspondiente, aumenta sorprendentemente el rendimiento en acidos w-aminograsos.
La presente invencion se basaba ademas en el conocimiento del inventor de que una reductosa de acido graso o a- dioxigenasa coexprimida funcionalmente recombinante en un catalizador de celula completa, que se emplea para la produccion de acidos w-aminograsos a partir de acidos grasos y presenta una dotacion enzimatica correspondiente, reduce sorprendentemente la concentracion de productos secundarios interferentes, en especial de acidos grasos sobreoxidados en forma de acidos dicarboxflicos y esteres de los mismos, en el producto formado.
La presente invencion se basa ademas en el conocimiento del inventor de que una reductosa de acido graso o a- dioxigenasa coexprimida funcionalmente recombinante en un catalizador de celula completa, que se emplea para la produccion de acidos w-aminograsos a partir de acidos grasos y presenta una dotacion enzimatica correspondiente, mejora la pureza y reutilizabilidad de intercambiadores cationicos lfquidos, como acido oleico, que se emplean para la eliminacion de un acido w-aminograso a partir de una disolucion de fermentacion que comprende el catalizador de celula completa.
La presente invencion se refiere a un procedimiento mejorado para la reaccion de un acido graso, acido w-hidroxi- graso, acido w-oxo-graso, o de un monoester del mismo para dar una amina, que se distingue por que, ademas de los enzimas, que catalizan la transformacion del acido graso a traves de sus diferentes etapas de oxidacion para dar la amina, tambien esta presente al menos una reductasa de acido graso o a-dioxigenasa, o la combinacion de ambos enzimas, si se emplea un catalizador de celula completa para la puesta en practica del procedimiento. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “reductasa de acido graso“, como se emplea en este caso, se entiende un enzima que cataliza la transformacion de un w-carboxiacido, tambien denominado acido dicarboxflico o acido w-carboxi-graso, para dar el correspondiente acido w-oxograso bajo consumo de ATP y NAD(P)H. En el estado de la tecnica, a modo de ejemplo en el documento WO/2010/135624, se describen reductasas de acido graso para la produccion de acidos w-hidroxigrasos, pero no como parte de un sistema para la produccion de acidos w-aminograsos. En una forma de realizacion aun mas preferente, la reductasa de acido graso se selecciona a partir
del grupo de reductasas de acido graso que comprenden las secuencias de aminoacido YP_887275.1,
ZP_11001941.1, ZP_06852401.1, NP_959974.1, YP_001070587.1, ZP_05217435.1, YP_882653.1, YP_639435.1,
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YP_005338837.1, YP_006307000.1, YP_005343991.1, ZP_11001942.1, ZP_09979565.1, YP_005003162.1, YP_953393.1, YP_001850422.1, ZP_11011489.1, P_12689264.1, YP_905678.1, ZP_09976919.1, YP_004746059.1, NP_217106.1, YP_004525443.1, NP_337166.1, ZP_09685823.1, YP_978699.1, ZP_06437984.1, ZP_06514086.1, NP 856267.1, CAA19077.1, N 301424.1, ZP 06522140.1, ZP 06518098.1, ZP 11008938.1, ZP 07432374.2,
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YP_005349252.1, y variantes de las mismas.
.1,
1,
.1,
1,
.1,
1,
.1,
1,
1,
.1,
1,
.1,
1,
.1,
1,
.1,
1,
1,
en
1,
y
En el caso de reductasas de acido graso se trata de un grupo de enzimas que requieren para su actividad una fosfopanteteinilizacion, es decir, la fijacion covalente de un cofactor fosfopanteteinilo en el enzima. Por consiguiente, la reductasa de acido graso empleada segun la invencion esta fosfopanteteinilizada, y exprime un catalizador de celula completa que exprime la reductasa de acido graso, como parte de su dotacion de enzimas exprimidos por via endogena o en forma recombinante, una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteiniliza la reductasa de acido graso. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “fosfopanteteinil-transferasa", como se emplea en este caso, se entiende un enzima que transfiere un resto fosfopanteteinilo de un fosfopanteteinil-CoA a un enzima, preferentemente a la reductasa de acido graso. En una forma de realizacion especialmente preferente, la
fosfopanteteinil-transferasa se selecciona a partir del grupo de fosfopanteteinil-transferasas que comprenden las
secuencias de aminoacido ABI83656.1, YP 006811024.1, YP 120266.1,
ZP_08152482.1,
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, ZP_14237113.1, YP_003339468.1, YP_712537.1, ZP ZP 08881396.1,
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YP_614397.1, ZP_11163860.1, YP_003983492.1, YP_004080668.1,
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ZP_10160483.1, ZP_01987188.1, ZP_01755304.1, ZP_08825027.1,
_03392800.1, ZP_01057781.1, AFB69889.1, ZP_08815097.1 y AAO17175.1,
y variantes de las mismas. En una forma de realizacion especialmente preferente, en este caso se trata de la fosfopanteteinil-transferasa con el codigo de banco de datos ABI83656.1 o una variante de la misma.
De modo alternativo o adicionalmente a la combinacion de reductasa de acido graso y fosfopanteteinil-transferasa, el catalizador de celula completa puede presentar tambien una a-dioxigenasa. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “a-dioxigenasa“, como se emplea en este caso, se entiende un enzima que cataliza la transformacion de un acido graso bajo consumo de una molecula de oxigeno, y bajo eliminacion de una molecula de dioxido de carbono para dar un acido graso acortado en un atomo de carbono en el atomo de carbono w terminal frente al acido graso empleado como educto, que porta un grupo aldehndo en el atomo de carbono w terminal. En una forma de realizacion especialmente preferente, la a-dioxigenasa se selecciona a partir del grupo de a- dioxigenasas, que comprenden las secuencias de aminoacido NP_001066718.1, EAY82977.1, BAH79993.1, ABG22011.1, BAJ90503.1, AFD04418.1, AFD04417.1, BAJ87736.1, AFW75180.1, ABG22012.1, XP_002311389.1, CAH05011.1, XP_002279884.1, CBI34957.3, AAG59584.1, NP_001234414.1, NP_001234410.1, XP_003553942.1, XP_002275161.1, XP_003553937.1, CBI34960.3, CAA07589.1, XP_003543402.1, XP_002517402.1,
XP_002882184.1, NP_186791.1, AAK85133.1, CAN77070.1, XP_002529555.1, CAH64542.1, NP_001234061.1, XP_002281357.1, ADM21465.1, XP_002318527.1, NP_177509.1, CAN74266.1, XP_002888940.1,
NP_001185393.1, XP_003631072.1, BAJ33800.1, XP_002517377.1, XP_003530944.1, BAJ34623.1, ABG22013.1, ABP02610.1, XP_001773135.1, XP_002960339.1, ABK95279.1, ABD73303.1, ABD73304.1, YP_001805721.1, ZP_08971815.1, ZP_08430366.1, YP_823013.1, ZP_05026427.1, ZP_11003953.1, YP_007064484.1,
YP_007113008.1, YP_633369.1, ZP_18906570.1, ZP_09251410.1, ZP_10050808.1, ZP_01306662.1,
YP_001516886.1, ZP_05042862.1, AAC49625.1, ZP_09648375.1, ZP_09792714.1, ZP_09788527.1,
XP_001728273.1, AAC83355.1, YP_890542.1, ZP_11000891.1, XP_002605323.1, EGO58341.1, YP_006249145.1, YP_001507004.1, YP_001704637.1, ZP_12876141.1, ZP_11150830.1, ZP_14236257.1, ZP_09411385.1,
ZP_14243118.1, EKD16664.1, ZP_15416799.1, ZP_15338016.1, ZP_10080295.1, ZP_11438929.1,
ZP_12995210.1, ZP_10946648.1, YP_003409541.1, XP_001637870.1, YP_005451221.1, XP_001212758.1,
ZP_07290489.1, ZP_05781329.1, ZP_19187748.1, ZP_06574534.1, XP_002605322.1, NP_822950.1,
YP_006366425.1, EJP63377.1, EKD21217.1, XP_001795927.1, XP_003042615.1, ZP_06566152.1, EGU88116.1, EFY94417.1, XP_388327.1, EKJ68934.1, ZP_07290463.1, CCC10458.1, YP_001107201.1, XP_003348248.1, T49753, CAD31840.1, XP_001229975.1, CBN77040.1, YP_004813753.1, XP_002513273.1, XP_001627136.1, AFG52858.1, AFG52857.1, AEW08450.1, NP_841291.1, YP_004512343.1, ACG75701.1 y ZP_03500906.1, y variantes de las mismas. En una forma de realizacion especialmente preferente se trata de la a-dioxigenasa con el codigo de banco de datos NP_001066718.1.
Ademas de la a-dioxigenasa o la combinacion de reductasa de acido graso y fosfopanteteinil-transferasa, el catalizador de celula completa segun la invencion presenta necesariamente una transaminasa, que amina el acido w-oxograso. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “transaminasa", como se emplea en este caso, se entiende un enzima que cataliza la transferencia de grupos a-amino de una molecula de donador, preferentemente un aminoacido, a una molecula de aceptor, preferentemente un acido a-cetocarboxflico. En una forma de realizacion especialmente preferente, la transaminasa se selecciona a partir del grupo de transaminasas, que comprenden las secuencias de aminoacido 3HMU_A, AAD41041.1, AAK15486.1, ABE03917.1, ADR60699.1, ADR61066.1, ADR62525.1, AEL07495.1, CAZ86955.1, EFW82310.1, EFW87681.1, EGC99983.1, EGD03176.1,
EGE58369.1, EGH06681.1, EGH08331.1, EGH24301.1, EGH32343.1, EGH46412.1, EGH55033.1, EGH62152.1,
EGH67339.1, EGH70821.1, EGH71404.1, EGH78772.1, EGH85312.1, EGH97105.1, EGP57596.1, NP_102850.1,
NP_106560.1, NP_248912.1, NP_248990.1, NP_354026.2, NP_421926.1, NP_637699.1, NP_642792.1,
NP_744329.1, NP_744732.1, NP_747283.1, NP_795039.1, NP_901695.1 (, XP_002943905.1, YP_001021095.1, YP_001059677.1, YP_001061726.1, YP_001066961.1, YP_001074671.1, YP_001120907.1, YP_001140117.1,
YP_001170616.1, YP_001185848.1, YP_001188121.1, YP_001233688.1, YP_001268866.1, YP_001270391.1,
YP_001345703.1, YP_001412573.1, YP_001417624.1, YP_001526058.1, YP_001579295.1, YP_001581170.1,
YP_001668026.1, YP_001669478.1, YP_001671460.1, YP_001685569.1, YP_001747156.1, YP_001749732.1,
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YP_001888405.1, YP_001903233.1, YP_001977571.1, YP_002229759.1, YP_002231363.1, YP_002280472.1,
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5
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15
20
25
30
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55
60
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ZP_05095488.1, ZP_05101701.1, ZP_05116783.1,
ZP_05742087.1, ZP_05783548.1, ZP_05786246.1,
ZP_06487195.1, ZP_06492453.1, ZP_06493162.1,
ZP_07007312.1, ZP_07266194.1, ZP_07374050.1,
ZP_08099459.1, ZP_08138203.1, ZP_08141719.1,
ZP_08186468.1, ZP_08208888.1, ZP_08266590.1,
ZP_08527488.1, ZP_08631252.1, ZP_08636687 y varian
ZP_00959736.1, ZP_00998881.1, ZP_01011725.1
ZP_01103959.1, ZP_01167926.1, ZP_01224713.1
ZP_01625518.1, ZP_01745731.1, ZP_01750280.1
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ZP_07662787.1, ZP_07778196.1, ZP_07797983.1
ZP_08142973.1, ZP_08177102.1, ZP_08185821.1
ZP_08402041.1, ZP_08406891.1, ZP_08522175.1
s de las mismas.
En el caso de la reductasa de acido graso empleada segun la invencion y, preferentemente, tambien en el caso de otros enzimas empleados segun la invencion, se trata de enzimas recombinantes. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “recombinante“, como se emplea en este caso, se entiende que la molecula de acido nucleico que codifica para el correspondiente enzima no se presenta en la celula natural y/o se obtuvo bajo empleo de metodos de tecnica genica. En una forma de realizacion preferente se habla de una protema recombinante si el correspondiente polipeptido esta codificado por un acido nucleico recombinante. En una forma de realizacion preferente, bajo una celula recombinante, como se emplea en este caso, se entiende una celula que presenta al menos un acido nucleico recombinante o un polipeptido recombinante. Por el especialista son conocidos procedimientos apropiados para la produccion de moleculas o celulas recombinantes, a modo de ejemplo los descritos en Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edicion. Los enzimas recombinantes se sobreexprimen preferentemente, a modo de ejemplo bajo empleo de sistemas de vectores pET o pGEX, que son conocidos por el especialista.
Respecto a la seleccion del organismo, el catalizador de celula completa empleable segun la invencion no esta sujeto a limitaciones, en tanto este sea cultivable, estable, y en caso dado accesible a modificaciones, que se pueden introducir, en caso dado, mediante tecnica genica, por ejemplo procedimientos para la debilitacion de actividades enzimaticas, a modo de ejemplo Knock outs. De este modo, se puede tratar igualmente de una celula procariota o eucariota. En el caso de una celula eucariota son especialmente preferentes eucariotas unicelulares, especialmente levaduras, como Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Candida albicans y Pichia pastoris. En el caso de celulas procariotas se puede tratar, a modo de ejemplo, de una bacteria, que se selecciona a partir del grupo que comprende Magnetococcus, Mariprofundus, Acetobacter, Acetobacterium, Acidiphilium, Afipia, Ahrensia, Asticcacaulis, Aurantimonas, Azorhizobium, Azospirillum, Bacillus, Bartonella, tribocorum, Beijerinckia, Bradyrhizobium, Brevundimonas, subvibrioides, Brucella, Caulobacter, Chelativorans, Citreicella, Citromicrobium, Clostridium, Corynebacterium, Dinoroseobacter, Erythrobacter, Fulvimarina, Gluconacetobacter, Granulibacter, Hirschia, Hoeflea, Hyphomicrobium, Hyphomonas, Ketogulonicigenium, Labrenzia, Loktanella, Magnetospirillum, Maricaulis, Maritimibacter, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylocystis, Methylosinus, Nitrobacter, Novosphingobium, Oceanibulbus, Oceanicaulis, Oceanicola, Ochrobactrum, Octadecabacter, Oligotropha, Paracoccus, Parvibaculum, Parvularcula, Pelagibaca, Phaeobacter, Phenylobacterium, Polymorphum, Pseudovibrio, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Roseibium, Roseobacter, Roseomonas, Roseovarius, Ruegeria, Sagittula, Silicibacter, Sphingobium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Starkeya, Sulfitobacter, Thalassiobium, Xanthobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia, Orientia, Rickettsia, Wolbachia, Bordetella, Burkholderia, Cupriavidus, Taiwanensis, Lautropia, Limnobacter, Polynucleobacter, Ralstonia, Chromobacterium, Eikenella, corrodens, Basfia, Kingella, Laribacter, Lutiella, Neisseria, Simonsiella, Achromobacter, Acidovorax, Alicycliphilus, Aromatoleum, Azoarcus, Comamonas, Dechloromonas, Delftia, Gallionella, Herbaspirillum, Herminiimonas, Hylemonella, Janthinobacterium, Leptothrix,
5
10
15
20
25
30
35
40
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55
60
Methylibium, Methylobacillus, Methylophilales, Methyloversatilis, Methylovorus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Oxalobacter, Parasutterella, Polaromonas, Polaromonas, Pusillimonas, Rhodoferax, Rubrivivax, Sideroxydans, Sutterella, wadsworthensis, Taylorella, Thauera, Thiobacillus, Thiomonas, Variovorax, Verminephrobacter, Anaeromyxobacter, Bdellovibrio, bacteriovorus, Bilophila, Desulfarculus, Desulfatibacillum, Desulfobacca, Desulfobacterium, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfohalobium, Desulfitobacterium, Desulfomicrobium, Desulfonatronospira, Desulfotalea, Desulfovibrio, Desulfuromonas, Geobacter, Haliangium, Hippea, Lawsonia, Myxococcus, Pelobacter, Plesiocystis, Sorangium, Stigmatella, Syntrophobacter, Syntrophus, Arcobacter, Caminibacter, Campylobacter, Helicobacter, Nitratifractor, Nitratiruptor, Sulfuricurvum, Sulfurimonas, Sulfurospirillum, Sulfurovum, Wolinella, Buchnera, Blochmannia, Hamiltonella, Regiella, Riesia, Citrobacter, Cronobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Pantoea, Pectobacterium, Proteus, Providencia, Rahnella, Salmonella, Serratia, Shigella, Sodalis, Wigglesworthia, Glossina, Xenorhabdus, Yersinia, Acidithiobacillus, Acinetobacter, Aeromonas, Alcanivorax, Alkalilimnicola, Allochromatium, Alteromonadales, Alteromonas, Baumannia, Beggiatoa, Bermanella, Carsonella, Ruthia, Vesicomyosocius, Cardiobacterium, Chromohalobacter, Colwellia, Congregibacter, Coxiella, Dichelobacter, Endoriftia, Enhydrobacter, Ferrimonas, Francisella, Glaciecola, Hahella, Halomonas, Halorhodospira, Halothiobacillus, Idiomarina, Kangiella, Legionella, Marinobacter, Marinomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylomicrobium, Methylophaga, Moraxella, Moritella, Neptuniibacter, Nitrococcus, Pseudoalteromonas, Psychrobacter, Psychromonas, Reinekea, Rickettsiella, Saccharophagus, Shewanella, Succinatimonas, Teredinibacter, Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio, Thiomicrospira, Tolumonas, Vibrionales, Actinobacillus, Aggregatibacter, Gallibacterium, Haemophilus, Histophilus, Mannheimia, Pasteurella, Azotobacter, Cellvibrio, Pseudomonas, Aliivibrio, Grimontia, Photobacterium, Photobacterium, Vibrio, Pseudoxanthomonas, Stenotrophomonas, Xanthomonas, Xylella, Borrelia, Brachyspira, Leptospira, Spirochaeta, Treponema, Hodgkinia, Puniceispirillum, Liberibacter, Pelagibacter, Odyssella, Accumulibacter, en especial B. subtilis, B. megaterium, C. glutamicum, E. coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri" Acinetobacter sp., Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Cyanobakterien, Klebsiella sp., Klebsiella oxytoca, Salmonella sp., Rhizobium sp. y Rhizobium meliloti. En una forma de realizacion especilamente preferente se trata de una enterobacteria, en el mas preferente de los casos se trata de Escherichia coli.
Es ventajoso que el catalizador de celula completa segun la invencion, ademas de la reductasa de acido graso, fosfopanteteinil-transferasa y la transaminasa, presente tambien una alanindehidrogenasa, para regenerar la alamina de moleculas inorganicas nitrogenadas consumida por la transaminasa en la aminacion del acido w- oxograso. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “alanindehidrogenasa", como se emplea en este caso, se entiende un enzima que cataliza la transformacion de L-alanina bajo consumo de agua y NAD+ para dar piruvato, amoniaco y NADH, y cataliza la reaccion inversa. En una forma de realizacion especialmente preferente, la alanindehidrogenasa se selecciona a partir del grupo de alanindehidrogenasas que comprenden la secuencia de aminoacidos de alanindehidrogenasa de Bacillus subtilis (codigo de banco de datos L20916), Rhizobium leguminosarum (codigo de banco de datos CP001622), Vibrio proteolyticus (codigo de banco de datos AF070716), Mycobacterium tuberculosis (codigo de banco de datos X63069), Enterobacter aerogenes (codigo de banco de datos AB013821), EGR93259.1, YP_003654745.1, YP_003651439.1, YP_003637111.1, YP_003631815.1,
YP_001327051.1, YP_001262560.1, YP_886996.1, YP_882850.1, YP_704410.1, YP_703508.1, ZP_08624689.1, YP_001230376.1, P17557.1, P17556.1, CCB94892.1, CCB73698.1, YP_001168635.1, YP_004668736.1,
YP_004569425.1, YP_003513168.1, YP_004561169.1, ZP_08554945.1, YP_400777.1, ZP_08311476.1,
ZP_08310170.1, ZP_08267322.1, ZP_08263846.1, ZP_07898723.1, YP_149301.1, YP_148605.1, YP_004340432.1, EFT09946.1, EFS80513.1, EFS51332.1, EFS42459.1, YP_003060895.1, YP_003059033.1, ZP_03305373.1, YP_847214.1, YP_004095847.1, YP_003338282.1, YP_003337256.1, YP_355846.1, YP_253131.1,
ZP_08197563.1, ZP_08196283.1, ADW06447.1, YP_734091.1, NP_372233.1, NP_102173.1, ZP_08170259.1, EGD36706.1, EGD32748.1, ZP_08155540.1, YP_004142849.1, YP_002417649.1, YP_001301040.1,
YP_002992892.1, YP_081348.1, YP_080482.1, YP_002476349.1, ZP_08115025.1, ZP_08114403.1,
YP_003552869.1, YP_002358112.1, YP_575010.1, YP_477594.1, YP_474564.1, YP_130399.1, YP_129373.1, YP_123314.1, NP_810467.1, NP_646469.1, NP_626044.1, NP_391071.1, ZP_08086822.1, ZP_08084776.1, ZP_08083119.1, ZP_08020768.1, ZP_08013590.1, ZP_08011832.1, YP_003783744.1, YP_002781576.1,
YP_002780533.1, ZP_02195873.1, NP_797482.1, ZP_07645051.1, ZP_07643260.1, ZP_06611917.1, AAT40119.1, ZP_07864946.1, YP_004068409.1, YP_002796203.1, YP_002774420.1, YP_003600348.1, YP_003599946.1, YP_003565624.1, YP_003565223.1, YP_335198.1, YP_423850.1, YP_155059.1, ZP_07843538.1, ZP_07841226.1, ZP_06928932.1, ZP_05692073.1, ZP_05687006.1, ZP_04867480.1, YP_775531.1, CBE70214.1, ZP_07721182.1, ZP_04302850.1, ZP_04298961.1, ZP_04287684.1, ZP_04277177.1, ZP_04248389.1, ZP_04235899.1,
ZP_02159718.1, ZP_02152178.1, YP_003974610.1, YP_003546595.1, YP_002317127.1, ZP_07313778.1, ZP_07302778.1, ZP_07298850.1, CBK69442.1, YP_003413835.1, YP_003595089.1, ZP_ 06807811.1,
YP_003582455.1, YP_003464731.1, YP_003496397.1, YP_003421918.1, CBL07274.1, CBK64956.1,
YP_003508515.1, AAL87460.1, AAC23579.1, AAC23578.1, AAC23577.1, ACU78652.1, YP_003471439.1, YP_003452777.1, ZP_06384971.1, ACY25368.1, ABC26869.1, AAP44334.1, EEZ80018.1, ZP_05110458.1, 1PJB_A, ZP_04717201.1, ZP_04689103.1, CAO90307.1, CAM75354.1, CAA44791.1, BAA77513.1, EGR96638.1, EGL90046.1, YP_004510847.1, ZP_08450330.1, YP_003387804.1, YP_003058152.1, EFS74272.1, EFS67128.1, ZP_06844564.1, YP_826658.1, YP_001195249.1, YP_003095978.1, YP_469292.1, YP_004442054.1,
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YP_004447480.1, YP_003761844.1, YP_040853.1, YP_003154888.1, YP_003142045.1, YP_002280953.1,
NP_371963.1, NP_422368.1, EGC98966.1, EGC76398.1, YP_004263661.1, YP_004252039.1, YP_679036.1, YP_499973.1, ZP_08054972.1, ZP_08053009.1, ZP_04067276.1, ZP_03968868.1, ZP_03963857.1,
ZP_03933079.1, ZP_03497046.1, ZP_06668924.1, ZP_06667106.1, ZP_06324464.1, ZP_06196777.1,
ZP_05114159.1, ZP_05083968.1, ZP_05070370.1, ZP_05030022.1, ZP_04673064.1, ZP_03517011.1,
ZP_03505783.1, XP_001310698.1, ABK27691.1 y CAB59281.2, y variantes de los mismos. Para la reaccion catalizada por alanindehidrogenasa no solo es necesaria la presencia de piruvato, que se forma como parte del metabolismo primario de cada celula que entra en consideracion como catalizador de celula completa, sino tambien de amonio. Este ultimo se pone a disposicion tipicamente en forma de sales nitrogenadas inorganicas, a modo de ejemplo sales amonicas, nitratos, o similares. Preferentemente se anade al medio de reaccion acuoso una sal amonica, por ejemplo cloruro amonico.
Ademas es ventajoso que el catalizador de celula completa segun la invencion exprima una alcanohidroxilasa y opcionalmente otros enzimas esenciales para la actividad de la alcanohidroxilasa, en especial en el caso de emplear como substratos para la obtencion del acido u>-aminograso un acido graso con una etapa de oxidacion en el atomo de carbono w terminal, que se situa por debajo del grado de oxidacion del aldehndo. La alcanohidroxilasa y/o una alcoholdehidrogenasa exprimida adicionalmente oxidan el atomo de carbono terminal hasta el grupo aldetndo, que se puede aminar a continuacion por la transaminasa. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “alcanohidroxilasa", como se emplea en este caso, se entiende un enzima que cataliza la hidroxilacion de restos alquilo lineales no substituidos, que comprenden seis, preferentemente doce restos de carbono.
Como alcanohidroxilasas, segun la invencion son apropiados numersos sistemas de oxidacion, como se describen, entre otros, en el documento PCT/EP 2008/067447. En una forma de realizacion preferente, en el caso de la alcanohidroxilasa se trata de una citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153" se entiende una oxidasa citosolica, que es parte de un sistema de 3 componentes, que comprende ademas una ferredoxina y una ferredoxina-reductasa, con un punto de enlace de alcano y la capacidad de hidroxilar alcanos. En una forma de realizacion especialmente preferente, se trata de un enzima que presenta en al menos un 80, preferentemente un 90, en el mas preferente de los casos un 95 a un 99 por ciento de identidad de secuencia respecto a citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (codigo de banco de datos YP_691921), o de un enzima que comprende una secuencia de polipeptidos que presenta al menos un 80, preferentemente un 90, en el mas preferente de los casos un 95 a un 99 por ciento de identidad de secuencia respecto a citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153-Familie de Alcanivorax borkumensis SK2 (codigo de banco de datos YP_691921), y presenta ademas actividad de alcanohidroxilasa. Los citados codigos de banco de datos se refieren en este caso, como continuamente en esta solicitud, a los bancos de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA), mas exactamente la version disponible online el 21 de Noviembre de 2012. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153" se entiende una oxidasa no unida a membrana, que comprende un punto de enlace para alcanos, restos alquilo lineales no substituidos que comprenden al menos cinco, preferentemente doce restos de carbono, o alcanos monohidroxilados, y cuya cadena de polipeptidos comprende el motivo LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN. En una forma de realizacion preferente, en el caso de una “citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153", como se emplea en este caso, se trata de una citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (codigo de banco de datos YP_691921) o de una variante de la misma, que presenta preferentemente actividad de alcanohidroxilasa.
Para el abastecimiento optimo de la citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153 con electrones del agente reductor, preferentemente NADH, es preferente que la celula exprima la monooxigenasa junto con ferredoxina- reductasa, que interacciona funcionalmente con la misma, y ferredoxina, que interacciona funcionalmente con esta. En este caso se puede tratar de polipeptidos aislados o, en el caso de empleo de un catalizador de celula completa, de polipeptidos coexprimidos, o de polipeptidos fusionados en posicion N- o C-terminal con la citocromo P450- monooxigenasa de la familia CYP153. El especialista puede determinar facilmente si una ferredoxina-reductasa o una ferredoxina interaccionan funcionalmente con la citocromo P450-monooxigenasa dada, de la familia CYP153, al oxidarse el agente reductor en presencia de un substrato de alcano y los tres polipeptidos mas eficientemente que en el caso de que falte al menos uno de los tres. Alternativamente se puede emplear el ensayo enzimatico descrito por Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, y Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727, que muestra un claro aumento de la velocidad de reaccion en el caso de polipeptidos que interaccionan funcionalmente. En una forma de realizacion especialmente preferente, la citocromo p450-monooxigenasa procede de la familia CYP153, la ferredoxina y la ferredoxina-reductasa proceden del mismo organismo. En una forma de realizacion especialmente preferente se trata de la ferredoxina-reductasa de aus Alcanivorax borkumensis SK2 (codigo de banco de datos YP_691923) o una variante de la misma, la ferredoxina de Alcanivorax borkumensis SK2 (codigo de banco de datos YP_691920) o una variante de la misma, y la citocromo P450-monooxigenasa de la familia CYP153 de Alcanivorax borkumensis SK2 (codigo de banco de datos YP_691921) o una variante de la misma.
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En otra forma de realizacion preferente, en el caso de la alcanohidroxilasa se trata de una AlkB-monooxigenasa. AlkB representa una oxidorreductasa conocida por el sistema AlkBGT de Pseudomonas putida Gpo1, que es dependiente de dos polipeptidos ulteriores, AlkG y AlkT. AlkT se caracteriza como rubredoxina-reductasa dependiente de FAD, que transmite electrones de NADh y AlkG. En el caso de AlkG se trata de una rubredoxina, una protema redox que contiene hierro, que actua como donador de electrones directo para AlkB. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “AlkB-monooxigenasa“ se entiende un polipeptido con una homologfa de secuencia de al menos, indicado en orden de preferencia creciente, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 o 99 % respecto a la secuencia de AlkB de Pseudomonas putida Gpo1 (codigo de banco de datos: CAB54050.1; este codigo de banco de datos, como todos los demas empleados en la solicitud, procede del estado de la tecnica, esto es, del banco de datos NCBI, mas exactamente de la edicion disponible on line el 15 de Octubre de 2012), con la capacidad de oxidar alcanos. En una forma de realizacion especialmente preferente, en el caso de la AlkB-monooxigenasa se trata de una oxidorreductasa que interacciona funcionalmente con los polipeptidos AlkG (CAB54052.1) y AlkT (CAB54063.1) de Pseudomonas putida Gpo1, que oxida alcanos. Para el abastecimiento optimo de la AlkB-alcanohidroxilasa con electrones es preferente que la celula exprima la monooxigenasa junto con protemas auxiliares que interaccionan funcionalmente con la misma, preferentemente AlkG y/o AlkT, o variantes de las mismas en cada caso, tratandose de nuevo de polipeptidos AlkG (CAB54052.1) y AlkT (CAB54063.1) de Pseudomonas putida Gpo1 en una forma de realizacion especialmente preferente.
En el caso de empleo de un catalizador de celula completa se puede plantear el problema de tener que poner en contacto un substrato con un enzima localizado intracelularmente, para llegar a la reaccion deseada. En el caso de alcanos de cadena larga y derivados de los mismos es preferente que el catalizador de celula completa presente un polipeptido de la familia AlkL. AlkL es una protema de membrana de Pseudomonas putida, que puede importar acidos grasos de cadena larga y derivados de los mismos en celulas bacterianas. En una forma de realizacion preferente, en el caso de un "polipeptido de la familia AlkL", como se emplea en este caso, se trata de un polipeptido que, a lo largo de una longitud de 230 aminoacidos sucesivos, presenta una identidad de secuencia de al menos un 80, preferentemente un 90, de modo aun mas preferente del 90 % respecto a AlkL de Pseudomonas putida (codigo de banco de datos CAB69081) o una variante de AlkL de Pseudomonas putida, y preferentemente presenta la capacidad de favorecer la importacion de alcanos de cadena larga al interior de una celula. En otra forma de realizacion, en el caso de un "polipeptido de la familia AlkL", como se emplea en este caso, se trata de un polipeptido localizado en la membrana externa de una bacteria gram-negativa, que presenta el motivo de secuencia DXWAPAXQ(V/A)GXR, representando X un aminoacido proteinogeno, y de modo preferentemente AlkL de Pseudomonas putida (codigo de banco de datos CAB69081) o una variante del mismo. Miembros ejemplares de la familia AlkL comprenden AlkL de Pseudomonas putida (codigo de banco de datos CAB69081), Marinobacter aquaeolei VT8 (codigo de banco de datos YP_957722), Oceanicaulis alexandrii HTCC2633 (codigo de banco de datos ZP_00953584), Marinobacter manganoxydans MnI7-9 (codigo de banco de datos ZP_09158756), Caulobacter sp. K31 (codigo de banco de datos YP_001672217), Pseudomonas oleovorans (codigo de banco de datos Q00595) y variantes de los mismos.
La ensenanza de la presente invencion se puede exponer no solo bajo empleo de macromoleculas con la secuencia exacta de aminoacidos o acidos nucleicos a la que se hace referencia en este caso, o bien no solo bajo empleo de una celula con actividad de un polipeptido con la secuencia exacta de aminoacidos reducida respecto al respectivo tipo salvaje, a la que se hace referencia en este caso, sino tambien bajo empleo de una variante de tales macromoleculas o de una celula con una actividad de una variante del polipeptido reducida relativamente al respectivo tipo salvaje de la celula en cuestion, que se puede obtener mediante delecion, adicion o substitucion de uno o mas aminoacidos o acidos nucleicos. En una forma de realizacion preferente, el concepto "variante" de una secuencia de acidos nucleicos o secuencia de aminoacidos, a continuacion utilizado de modo equivalente e intercambiable con el concepto "homologo", como se emplea en este caso, significa otra secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos que comprende o representa una secuencia, que presenta, respecto a la correspondiente secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos de tipo salvaje original, una homologfa, en este caso empleada como sinonimo de identidad, de 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99 %, o un mayor porcentaje, sometiendose a delecion o a substitucion preferentemente aminoacidos diferentes a los que forman el centro catalfticamente activo, o estando substituidos los mismos unicamente de manera conservadora, a modo de ejemplo un glutamato en lugar de un aspartato, o una leucina en lugar de una valina. El estado de la tecnica describe algoritmos que se pueden emplear para calcular la medida de la homologfa de dos secuencias, por ejemplo Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3a edicion. En otra forma mas preferente de realizacion de la presente invencion, la variante de una secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos, de modo preferente adicionalmente a la homologfa de secuencia citada con anterioridad, presenta esencialmente la misma actividad enzimatica de la molecula de tipo salvaje, o bien de la molecula original. Por ejemplo, una variante de un polipeptido con actividad enzimatica como proteasa presenta la misma, o esencialmente la misma actividad proteolttica que el enzima polipeptfdico, es decir, la capacidad de catalizar la hidrolisis de un enlace peptfdico. En una forma de realizacion especial, el concepto “esencialmente la misma actividad enzimatica" significa una actividad respecto a los substratos del polipeptido de tipo salvaje, que se situa claramente sobre la actividad basica y/o se diferencia en menos de 3, preferentemente 2, de modo aun mas preferente en un orden de magnitud, de los valores Km y/o kcat, que presenta el polipeptido de tipo
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salvaje respecto a los mismos substratos. En otra forma de realizacion preferente, el concepto "variante" de una secuencia de acido nucleicos o de aminoacidos comprende al menos una parte activa y/o fragmento de la secuencia de acidos nucleicos, o bien aminoacidos. En otra forma de realizacion preferente, el concepto "parte activa", como se emplea en este caso, significa una secuencia de aminoacidos o una secuencia de acidos nucleicos que presenta una longitud mas reducida que la longitud total de la secuencia de aminoacidos, o bien codifica para una longitud menor que la longitud total de la secuencia de aminoacidos, presentando la secuencia de aminoacidos o la secuencia de aminoacidos codificante con menor longitud que la secuencia de aminoacidos de tipo salvaje, esencialmente la misma actividad enzimatica que el polipeptido de tipo salvaje, o una variante del mismo, a modo de ejemplo que la proteasa. En una forma de realizacion especial, el concepto "variante" de un acido nucleico significa un acido nucleico cuya hebra complementaria, preferentemente bajo condiciones restrictivas, se une al acido nucleico de tipo salvaje. La restriccion de la reaccion de hibridacion es facilmente determinable por el especialista, y depende generalmente de la longitud de la sonda, las temperaturas en el lavado y la concentracion de sales. Sondas mas largas requieren generalmente temperaturas mas elevadas para la hibridacion, mientras que muestras mas cortas tienen suficiente con bajas temperaturas. Que tenga lugar una hibridacion depende en general de la capacidad del ADN desnaturalizado de condensarse en hebras complementarias, que estan presentes en su entorno, y precisamente por debajo de la temperatura de fusion. La restriccion de la reaccion de hibridacion y condiciones correspondientes se describen mas minuciosamente en F M Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. El especialista encuentra instrucciones para la identificacion de secuencias de aDn por medio de hibridacion, entre otros, en el manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) y en Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). En una forma de realizacion preferente, la hibridacion tiene lugar bajo condiciones restrictivas, es decir, se forman solo hnbridos en los que sonda y secuencia objetivo, es decir, los polinucleotidos tratados con la sonda, son identicos al menos en un 70 %. Es sabido que se puede influir sobre la restriccion de la hibridacion, incluyendo los pasos de lavado, o bien se puede determinar la misma mediante variacion de la composicion tampon, la temperatura y la concentracion de sales. La reaccion de hibridacion se lleva a cabo en general con restriccion relativamente reducida en comparacion con los pasos de lavado (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). Para la reaccion de hibridacion se puede emplear, a modo de ejemplo, un tampon correspondiente a tampon 5x SSC a una temperatura de aproximadamente 50°C - 68°C. En este caso se pueden hibridar tambien sondas con polinucleotidos que presentan menos de un 70 % de identidad respecto a la secuencia de la sonda. Tales hnbridos son menos estables y se eliminan mediante lavado bajo condiciones restrictivas. Esto se puede conseguir, a modo de ejemplo, mediante reduccion de la concentracion de sales a 2x SSC, y en caso dado a continuacion 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania, 1995), ajustandose una temperatura, en orden de preferencia creciente, de aproximadamente 50°C - 68°C, aprox. 52°C - 68°C, aprox. 54°C - 68°C, aprox. 56°C - 68°C, aprox. 58°C - 68°C, aprox. 60°C - 68°C, aprox. 62°C - 68°C, aprox. 64°C - 68°C, aprox. 66°C - 68°C. Son preferentes intervalos de temperatura de aprox. 64°C - 68°C o aprox. 66°C - 68°C. En caso dado es posible reducir la concentracion de sales hasta una concentracion correspondiente a 0,2 x SSC o 0,1 x SSC. Mediante aumento gradual de la temperatura de hidridacion en pasos de aproximadamente 1 - 2°C de 50°C a 68°C se pueden aislar fragmentos de polinucleotido, que presentan, en orden de preferencia creciente, al menos un 70 % o al menos un 80 % o al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad respecto a la secuencia de la molecula de acido nucleico empleada. Otras instrucciones respecto a la hibridacion se encuentran disponibles en el mercado en forma de los denominados kits (por ejemplo DIG Easy Hyb de la firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, catalogo n° 1603558). En una forma de realizacion preferente, el concepto "variante" de un acido nucleico, como se emplea en este caso, comprende una secuencia de acido nucleico arbitraria, que codifica para la misma secuencia de aminoacidos que el acido nucleico original, o una variante de esta secuencia de aminoacidos en el ambito de la degenerabilidad del codigo genetico.
En una forma de realizacion preferente, la celula segun la invencion presenta una actividad de al menos un enzima reducida frente a su tipo salvaje, que cataliza una de las reacciones de p-oxidacion de acidos grasos, tratandose preferentemente de un enzima del grupo que comprende CoA-ligasa de acido graso, Acyl-CoA-dehidrogenasa, 2,4- dienoil-CoA-reductasa, enoil-CoA-hidratasa y 3-cetoacil-CoA-tiolasa, un importador de acidos grasos, o una variante de las mismas. La p-oxidacion de acidos grasos es una via metabolica muy extendida, que permite a organismos procariotas y eucariotas al mismo tiempo oxidar acidos grasos y proporcionar al metabolismo la energfa qmmica contenida en los mismos. En otro sentido, esta comienza con la absorcion de un acido graso en la celula. En esta, el acido graso se oxida, en tanto las condiciones lo requieran, primeramente en la posicion p del ester de acido graso CoA a traves de una acil-CoA-dehidrogenasa, en el caso de E. coli FadE. Una molecula similar se puede formar tambien alternativamente a partir de un acido graso de insaturacion doble mediante reduccion por medio de una 2,4- dienoil-CoA-reductasa, en el caso de E. coli FadH. Un enzima multifuncional, la enoil-CoA-hidratasa/3-hidroxiacil- CoA-dehidrogenasa, en el caso de E. coli FadB, cataliza a continuacion la hidratacion bajo formacion del alcohol secundario y su oxidacion subsiguiente para dar la cetona. En el ultimo paso, una 3-cetoacil-CoA-tiolasa, en el caso de E. coli FadA, cataliza la disociacion de cetoacil-CoA, resultando que se liberan acetil-CoA y un CoA-ester de acido graso acortado en dos atomos de carbono en comparacion con la molecula de partida. En tanto no se trate
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igualmente de acetil-CoA, este ultimo se puede alimentar de nuevo al ciclo de p-oxidacion, y acortar bajo oxidacion. En la regulacion de la p-oxidacion de acidos grasos tambien participa FadR, un regulador de operon Fad, que comprende los genes necesarios para la degradacion de acidos grasos, sin que FadR catalice una reaccion de p- oxidacion. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto "enzima que cataliza una de las reacciones de p- oxidacion de acidos grasos" se entiende cualquier enzima que interaccione directamente con el substrato de acido graso o una molecula producida a partir del mismo por la via a acetil-CoA, identifique preferentemente la misma como substrato, y catalice su transformacion a un producto metabolico mas proximo a acetil-CoA por esta via de degradacion, incluyendo preferentemente el importador de acidos grasos, que efectua la absorcion del acido graso en la celula. A modo de ejemplo, entre estos enzimas cuenta, segun la anterior definicion, la acil-CoA- dehidrogenasa, ya que interacciona con el ester de acido graso-CoA, y cataliza su transformacion a eniol-CoA, que es mas proximo a acetil-CoA que el ester de acido graso-CoA en la via metabolica de p-oxidacion. En una forma de realizacion especialmente preferente, bajo el concepto "enzima que cataliza una de las reacciones de p-oxidacion de acidos grasos", como se emplea en este caso, se entiende cualquier enzima del grupo que comprende los productos genicos FadA, FadB, FadD, FadL y FadE de E. coli y/o sus variantes u homologos de otros organismos. Los productos genicos FadA, FadB, FadD, FadL y FadE de E. Coli, asf como variantes y homologos de muchos otros organimos utilizables desde el punto de vista biotecnologico y sus secuencias de acidos nucleicos y polipeptidos, se describen en el estado de la tecnica, a modo de ejemplo FadA bajo el numero de acceso AP009048.1, FadB bajo el numero de acceso BAE77457.1, FadD bajo el numero de acceso BAA15609.1, y FadE bajo el numero de acceso BAA77891.2. el estado de la tecnica da a conocer numerosos ensayos, que son apropiados especialmente para la medida de la actividad, que catalizan una de las reacciones de p-oxidacion de acidos grasos, a modo de ejemplo en K Kameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, Hi Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y So et al. (2003) Biochem. J. 370, 1055-1062, Lobo et al. (2001) y X Yu, T Liu, F Zhu, and C Khosla (2011) PNAS, publicacion electronica e impresion.
Para la efectividad del catalizador de celula completa segun la invencion es ventajoso que el substrato a transformar, preferentemente el acido graso, acido oo-hidroxi- o w-oxo-graso, pueda entran facilmente en contacto con los enzimas necesarios segun la invencion, que estan localizados en el interior del catalizador de celula completa. Por lo tanto es decisivo que el substrato pueda llegar al interior de la celula. Para facilitar esto, es preferente que el catalizador de celula completa exprima un importador de acidos grasos, en el caso de un catalizador de celula completa bacteriano, en especial gram-negativo, de modo especialmente preferente el importador de acidos grasos FadL (codigo de banco de datos: BAA16205.1) o una variante, preferentemente en una concentracion y con una actividad que esta incrementada frente a la actividad del tipo salvaje del correspondiente catalizador de celula completa. El aumento de la actividad de un polipeptido frente al tipo salvaje de la celula se puede obtener a traves de diversas vfas accesibles al especialista de modo rutinario, a modo de ejemplo la incorporacion de copias adicionales, unidas funcionalmente al promotor, de la secuencia de nucleotidos codificante para el polipeptido, o el intercambio del promotor natural por uno mas fuerte.
Se ha mostrado que los acidos w-aminograsos se producen segun la invencion en rendimiento y pureza mas elevados si el fondo en enzimas exprimidos de manera endogena en el catalizador de celula completa esta optimizado de modo que se reduzca o elimine la actividad de enzimas endogenos, los eductos, productos intermedios o productos del procedimiento segun la invencion, o bajo empleo de la celula segun la invencion, preferentemente acidos w-aminograsos, se degradan o se modifican de otro modo por vfas metabolicas por vfas metabolicas que se alejan de la formacion del producto deseado. Ante estos antecedentes es ventajoso que, en el caso del catalizador de celula completa segun la invencion, se trate de una celula que presenta, frente a su tipo salvaje, una actividad reducida de esterasa BioH [codigo de banco de datos YP_492020.1] o una variante de la misma. Tales celulas con actividad BioH reducida, su produccion y ensayos para la determinacion de la actividad, se describen en la solicitud de Patente Europea EP 12007663.3.
El catalizador de celula completa segun la invencion se puede emplear en un procedimiento para la reaccion de un acido graso, acido w-hidroxi o w-oxo-graso, para dar la amina correspondiente, preferentemente un acido w- aminograso, tratandose en el caso del acido graso, acido w-hidroxi o w-oxo-graso, o el monoester del mismo, de un compuesto de la formula (I)
R1-A-COOR2 (I)
seleccionandose R1 a partir del grupo que comprende -H, -CHO, -OH y COOR3, seleccionandose R2 y R3 respectivamente, y de modo independiente entre sf, a partir del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo, con la condicion de que al menos uno de los restos R2 y R3 sea H, representando A un grupo hidrocarburo no ramificado, ramificado, lineal, dclico, substituido o no substituido, con al menos cuatro atomos de carbono. En una forma de
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realizacion preferente, en el caso de A se trata de una estructura de la formula -(CH2)n -, siendo n 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30. En la forma de realizacion mas preferente, en el caso del acido graso, acido w-hidroxi- o w-oxo-graso se trata de acido laurico, acido w-hidroxi- o w- oxo-laurico. En otra forma de realizacion de las mas preferentes, en el caso del acido graso, acido w-hidroxi- o w- oxo-graso, se trata de acido hexanoico, acido w-hidroxi- o w-oxo-hexanoico. En otra forma de realizacion de las mas preferentes, en el caso del acido graso, acido w-hidroxi- o w-oxo-graso se trata de acido decanoico, acido w-hidroxi- o w-oxo-decanoico.
Respecto al acido graso, como para cualquier compuesto qmmico descrito en esta solicitud, se considera que la respectiva forma indicada comprende todas las sales, protonadas o desprotonadas, del compuesto en cuestion. A modo de ejemplo, el acido laurico comprende no solo la forma protonada, sino tambien la sal laureato con todos los cationes, a modo de ejemplo laureato sodico.
El procedimiento segun la invencion requiere que los enzimas empleados para el procedimiento segun la invencion, dispuestos opcionalmente en forma del catalizador de celula completa segun la invencion, se pongan en contacto con acido graso, acido w-hidroxi- o w-oxo-graso en una disolucion acuosa. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto “puesta en contacto", como se emplea en este caso, se entiende que el enzima en cuestion entran en contacto inmediato con su substrato, en especial sin que se establezcan de modo intermedio barreras ffsicas, como barreras impermeables o similares. En el mas sencillo de los casos, la puesta en contacto se efectua anadiendose el substrato a una disolucion acuosa, en la que se encuentra el enzima o el catalizador de celula completa.
Para la descripcion de la ensenanza segun la invencion es apropiada una mezcla de reaccion que comprende el catalizador de celula completa segun la invencion en disolucion acuosa, asf como un acido graso, acido w-hidroxi o w-oxo-graso, o un monoester del mismo de la formula (I), seleccionandose R1 a partir del grupo que comprende -H, - CHO, -OH y COOR3, seleccionandose R2 y R3 respectivamente, y de modo independiente entre sf, a partir del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo, con la condicion de que al menos uno de los restos R2 y R3 sea H, representando A un grupo hidrocarburo no ramificado, ramificado, lineal, dclico, substituido o no substituido, con al menos cuatro atomos de carbono, preferentemente la formula -(CH2)n -, siendo n al menos 4, de modo especialmente preferente al menos 10. En este caso, la disolucion acuosa, a modo de ejemplo respecto a composicion, valor de pH y temperatura, se debe concebir de modo que apoye la durabilidad o al menos la capacidad catalftica del catalizador de celula completa al menos temporalmente. Para el especialista son conocidos numerosos medios de cultivo acuosos apropiados como disolucion acuosa, que son aptos para el mantenimiento o cultivo de celulas, en especial celulas signficativas desde el punto de vista biotecnologico. A estos corresponden del mismo modo medios completos, como medios LB, medios mrnimos, como medios M9, asf como medios selectivos, a modo de ejemplo aquellos que contienen una alta concentracion de sales y, por lo tanto, posibilitan solo el crecimiento de organismos halofilos, o al menos halotolerantes. En una forma de realizacion preferente, bajo el concepto "medio de cultivo acuoso", como se emplea en este caso, se entiende un medio de reaccion a base de agua, que, respecto a todos los factores relevantes, en especial valor de pH, contenido en sales y temperatura, esta concebido de modo que conserve o favorezca la durabilidad de celulas contenidas en el mismo, preferentemente microorganismos, y tanto el medio de cultivo acuoso, como tambien la fase hidrofoba organica, se presenten en forma lfquida. Las exigencias de temperatura de diversas celulas significativas desde el punto de vista biotecnologico se pueden extraer de libros de texto de microbiologfa y biologfa molecular, por ejemplo Fuchs/Schlegl, 2008. En una forma de realizacion preferente, el valor de pH del medio de cultivo acuoso en el momento de la puesta en contacto se situa entre 4 y 9, de modo mas preferente entre 4,5 y 8,5, en el mas preferente de los casos entre 6,5 y 7,5. En otra forma de realizacion preferente, la temperatura se situa entre 0 y 45 °C, preferentemente entre 15 y 40 °C, en el mas preferente de los casos entre 20 y 37 °C. La mezcla de reaccion esta contenida tfpicamente en un fermentador. Como fermentador puede actuar cualquier recipiente de reaccion que se pueda esterilizar, preferentemente tratar en autoclave, y que permita el cultivo del catalizador de celula completa, la ventilacion y el control de las condiciones de reaccion, a modo de ejemplo del contenido en oxfgeno y de la temperatura.
En una forma de realizacion preferente, la mezcla de reaccion comprende, adicionalmente a la disolucion acuosa, una fase hidrofoba organica. Esta puede comprender un disolvente organico y/o un intercambiador cationico hidrofobo lfquido para la eliminacion de acido w-aminograso de la disolucion acuosa. En el documento EP11191520.3 se describen disolventes e intercambiadores cationicos apropiados.
La presente invencion se ilustra ademas mediante las siguientes figuras y ejemplos no limitantes, cuyas caractensticas, formas de realizacion, aspectos y ventajas ulteriores se pueden extraer de la presente invencion.
Ejemplo 1
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Produccion de vectores de expresion para la coexpresion de genes que codifican para una reductasa de acido graso con npt de Nocardia sp.
Para la produccion de vectores para la coexpresion de los genes que codifican para una reductasa de acido graso con npt (SEQ ID Nr. 1, codificada para ABI83656.1) de Nocardia sp., que codifica para una fosfopanteteiniltransferasa, se optimizaron en codon los genes para la expresion en Escherichia coli y se sintetizaron junto con un promotor lacuv5 (SEQ ID Nr. 2), y al mismo tiempo se introdujo cada punto de corte de restriccion en lmea de salida y en lmea de entrada. Se emplearon los siguientes genes de reductasa de acido graso:
• MSMEG_2956 de Mycobacterium smegmatis (carA, SEQ ID Nr. 3, codificada para YP_887275.1)
• MSMEG_5739 de Mycobacterium smegmatis (carB, SEQ ID Nr. 4, codificada para YP_889972.1)
• fadD9 de Mycobacterium intracellulare MOTT-64 (car_Mint, SEQ ID Nr. 5, codificada para YP_005349252.1)
• MFORT_07381 de Mycobacterium fortuitum subsp. fortuitum DSM 46621 (car_Mfort, SEQ ID Nr. 6, codificada para ZP_11001941.1)
• FadD9 de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 (car_Mavi, SEQ ID Nr. 7, codificada para NP_959974.1)
• CPCC7001_1320 de Cyanobium sp. PCC 7001 (car_Cs, SEQ ID Nr. 8, codificada para ZP_05045132.1)
• MAB_3367 de Mycobacterium abscessus ATCC 19977 (car_Mab, SEQ ID Nr. 9, codificada para YP_001704097.1)
• FadD9 de Nocardia brasiliensis ATCC 700358 (car_nbr, SEQ ID Nr. 10, codificada para ZP_09839660.1)
• MIP_06852 de Mycobacterium indicus pranii MTCC 9506 (car_Mip, SEQ ID Nr. 11, codificada para YP_006731697.1)
• nfa20150 de Nocardia farcinica IFM 10152 (car_nfa, SEQ ID Nr. 12, codificada para YP_118225.1)
• MUL_1722 de Mycobacterium ulcerans Agy99 (car_Mul, SEQ ID Nr. 13, codificada para YP_905678.1)
• Saci8_010100039603 de Streptomyces acidiscabies 84-104 (car_Sac, SEQ ID Nr. 14, codificada para ZP_10456477.1)
• MCOL_V203220 de Mycobacterium colombiense CECT 3035 (car_Mcol, SEQ ID Nr. 15, codificada para WP_007769435.1)
El fragmento de ADN sintetizado se digirio con las endonucleasas de restriccion NdeI y AvrII y se ligo en el vector cortado correspondientemente pSC101 (SEQ ID Nr. 16). El vector pSC101 es un vector de copia muy reducida, que transmite resistencia a tetraciclina, y presenta asimismo un numero de copias reducido de aproximadamente 4 copias por celula. De este modo se obtuvieron los siguientes vectores de expresion:
• pSC101{Placuv5}[carA_Ms(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 17)
• pSC101{Placuv5}[carB_Ms(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 18)
• pSC101{Placuv5}[car_Mint(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 19)
• pSC101{Placuv5}[car_Mfort(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 20)
• pSC101{Placuv5}[car_Mavi(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 21)
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• pSC101{Placuv5}[car-Csp(co_Ec)-npt_Noc(co-Ec)] (SEQ ID Nr. 22)
• pSC101{Placuv5}[car_Mab(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 23)
• pSC101{Placuv5}[car_nbr(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 24)
• pSC101{Placuv5}[car_Mip(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 25)
• pSC101{Placuv5}[car_nfa(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 26)
• pSC101{Placuv5}[car_Mul(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 27)
• pSC101{Placuv5}[car_Sac(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 28)
• pSC101{Placuv5}[car_Mcol(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] (SEQ ID Nr. 29)
El producto genico npt transfiere un resto fosfopanteteinilo del coenzima A al enzima reductasa de acido graso para la activacion de la reductasa de acido graso.
Ejemplo 2
Produccion de cepas de E.coli con delecion en el gen bioH con actividad de reductasa de acido graso y fosfopanteteiniltransferasa intensificada para la produccion de aminolaurato de metilo a partir de laurato de metilo
Para la generacion de cepas de E.coli con delecion del gen bioH, que codifica para una esterasa, y actividad de reductasa de acido graso intensificada para la produccion de aminolaurato de metilo, se transformo la cepa Escherichia coli W3110 AbioH (preparacion, vease el documento EP12007663) con los plasmidos pBT10_alkL (secuencia y preparacion, vease ejemplo 1 del documento WO/2011/131420, o bien la Seq Id NR: 8), pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) indicada en el mismo (vease ejemplo 1 del documento WO/2013/024114 y la SeQ ID Nr. 17 indicada en el mismo), y uno de los vectores generados en el ejemplo 1 para la expresion de una reductasa de acido graso por medio de electroporacion, y se cultivaron en placas de LB-agar con canamicina (50 |jg/ml), ampicilina (100 jg/ml) y tetraciclina (5 jg/ml). Se analizaron las cepas transformadas mediante preparacion de plasmido y analisis de restriccion respecto a la presencia de los plasmidos correctos. De este modo se generaron las siguientes cepas:
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[carA_Ms(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[carB_Ms(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mint(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mfort(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mavi(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Csp(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mab(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_nbr(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
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• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mip(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_nfa(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mul(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Sac(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
• E.coli W3110 AbioH pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mcol(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
Se emplearon estas cepas para investigar su capacidad para la produccion de aminolaurato de metilo partiendo de laurato de metilo.
El vector de expresion pBT10_alkL contiene los genes alkB, alkG, alkT, alkS y alkL del operon alk de Pseudomonas putida. Mediante los productos genicos se cataliza la oxidacion del substrato laurato de metilo a traves de hidroxilaurato de metilo para dar oxolaurato de metilo. El vector pJ294_alaDH_B.s_TA_C.v.(Ct) contiene los genes ald de Bacillus subtilis (codificantes para una alanindehidrogenasa, NP_391071.1) y Cv_2505 de Chromobacterium violaceum (codificante para una w-transaminasa, NP_901695.1). El producto genico Cv_2505 es apto para transformar oxolaurato de metilo en aminolaurato de metilo, el donador de amina alanina requerido a tal efecto es proporcionado por el producto genico ald de piruvato. Por medio de una reductasa de acido graso exprimida adicionalmente, que se activo mediante la fosfopanteteiniltransferasa npt, igualmente sobreexprimida, los productos secundarios formados en la produccion de aminolaurato de metilo, en especial ester metilico de diacido dodecanoico, se deben reducir para aumentar la relacion de aminolaurato de metilo de metilo respecto a ester metilico de diacido dodecanoico.
Ejemplo 3
Produccion de cepas de E.coli con actividad de reductasa de acido graso y fosfopanteteiniltransferasa intensificada para la produccion de aminolaurato de metilo a partir de laurato de metilo
La cepa huesped empleada E.coli W3110 se transformo con los vectores de expresion pBT10_alkL (secuencia y preparacion, vease ejemplo 1 del documento WO/2011/131420, o bien la Seq ID NR: 8) indicada en el mismo, pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) indicada en el mismo (vease ejemplo 1 del documento wO/2013/024114 y la SEQ ID Nr. 17), y pSC101{Placuv5}[carB_Ms(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] o pSC101, vector vado, por medio de electroporacion, y se cultivo en placas de LB-aga con canamicina (50 pg/ml), ampicilina (100 pg/ml) y tetraciclina (5 |jg/ml). Las cepas transformadas se analizaron mediante preparacion de plasmido y analisis de restriccion respecto a la presencia de los plasmidos correctos. De este modo se generaron las cepas E.coli W3110 pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s_TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[carB_Ms(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)] y E.coli W3110 pBT10_alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101.
Ejemplo 4
Produccion de acido aminolaurico mediante cepas de E.coli con un vector de expresion para un gen reductasa de acido graso y el gen npt de Nocardia sp. y vectores de expresion para los genes ald de Bacillus subtilis, Cv_2025 de Chromobacterium violaceum en combinacion con un vector de expresion para los genes alkB, alkG, alkT y alkL del operon alk de Pseudomonas putida.
Se emplearon las cepas generadas en el ejemplo 2 y 3 para investigar su capacidad de produccion de aminolaurato de metilo.
La biotransformacion de laurato de metilo en aminolaurato de metilo se llevo a cabo en sistema de fermentacion paralelo de DASGIP de factor 8. En este caso se procedio como sigue: para la fermentacion se emplearon reactores de 1 L. Las sondas de pH se calibraron por medio de un calibrado de dos puntos con disoluciones de medida de de pH 4,0 y pH 7,0. Los reactores se cargaron con 300 mL de agua potable y se trataron en autoclave 20 min a 121°C para garantizar la esterilidad. A continuacion, las sondas de pO2 se polarizaron durante la noche (al menos durante 6 h) en el sistema DASGIP. A la manana siguiente se extrajo el
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agua bajo la vitrina y se substituyo por 300 mL de medio de alta densidad celular con 100 mg/L de ampicilina, 50 mg/L de canamicina y 5 mg/L de tetraciclina. A continuacion se calibraron las sondas de pO2 con una calibracion de un punto (agitador: 400 rpm/gasificacion 10 sL/h de aire), y se purificaron los tramos medios de alimentacion, agente de correccion e induccion por medio de limpieza en sitio. A tal efecto se lavaron los tubos flexibles con un 70 % de 5 etanol, a continuacion con NaOH 1 M, despues con agua VE esteril, y en ultimo lugar se cargaron con el respectivo medio.
Las cepas de E. Coli productoras de ALS y ALSME se cultivaron en primer lugar desde los respectivos criocultivos en medio LB (25 mL en un matraz con deflectores de 100 mL) con 100 mg/L de ampicilina durante la noche a 37°C y 200 rpm durante aproximadamente 18 h. A continuacion se sobreinocularon respectivamente 2 mL de los cultivos en 10 medio de alta densidad celular (glucosa 15 g/L (30 mL / L de una disolucion madre tratada en autoclave por separado de 500 g/L con un 1 % de MgSO4*7H2O y un 2,2 % deNH4Cl), (NH4)2SO4 1,76 g/L, K2HPO4 19,08 g/L, KH2PO4 12,5 g/L, extracto de levadura 6,66 g/L, citrato trisodico dihidrato, 2,24 g/L, disolucion de citrato de hierro amonico 17 mL/L de una disolucion madre al 1 % tratada en autoclave por separado, disolucion de oligoelementos 5 mL/L de disolucion madre tratada en autoclave por separado (HCl (37 %) 36,50 g/L, MnCl2*4H2O 1,91 g/L, 15 ZnSO4*7H2O 1,87 g/L, acido etilendiaminotetraacetico dihidrato 0,84 g/L, H3BO3 0,30 g/L. Na2MoO4*2H2O 0,25 g/L,
CaCl2*2H2O 4,70 g/L, FeSO4*7H2O 17,80 g/L, CuCl2*2H2O 0,15 g/L)) (por cada cepa 25mL en un matraz con deflectores de 100 mL) con 100 mg/L de ampicilina, 50 mg/L de canamicina y 5 mg/L de tetraciclina, y se incubaron a 37°C / 200 rpm durante 5,5 h mas.
Los reactores se inocularon con una densidad optica de 0,1 criandose un volumen correspondiente de cultivo previo 20 en una jeringa de 5 mL (bajo condiciones esteriles), y los reactores se inocularon por medio de una canula a traves de un septum cubierto con un 70 % de etanol.
Se empleo el siguiente programa estandar:
Regulador de DO
Regulador de pH
Preset
0% Preset 0 ml/h
P
0,1 P 5
Ti
300 s Ti 200 s
Min
0% Min 0 mlL/h
Max
100% Max 40 mL/h
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15
20
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30
35
N (Rotacion)
De A XO2 (mezcla gaseosa) De A F (flujo gaseoso) De A
0% 30% 0% 100% 15% 80%
Crecimiento
y 400 1500 Crecimiento y 21 Crecimiento y 6 72
biotransformacion
rpm rpm biotransformacion % 21% biotransformacion sL/h sL/h
Secuencia
Desencadenante fuerte
31% DO (1/60h)
Inducdon IPTG
2 h tras comienzo de alimentacion
Desencadenante de alimentacion
50% DO
Tasa de alimentacion
3 [mL/h]
El experimento llevado a cabo se puede dividir en dos fases, el cultivo, en el que las celulas deben alcanzar una determinada densidad optica, y la subsiguiente biotransformacion, en la que, tras adicion del substrato laurinmetilester, debe tener lugar una reaccion para dar aminolaurato de los enzimas formados en la expresion. Los valores de pH se regularon una vez con amoniaco (12,5 %) a pH 6,8. Durante el cultivo y la biotransformacion se regulo el oxfgeno disuelto (DO, dissolved oxygen) en el cultivo en un 30 % a traves del mdice de revoluciones del agitador y la tasa de gasificacion. La fermentacion se llevo a cabo como carga de alimentacion, desencadenandose el inicio de la alimentacion, 5 g/Lh de alimentacion de glucosa (500 g/L de glucosa con un 1 % de MgSO4*7H2O y un 2,2% de NH4Cl), a traves de un pico de DO. Con el inicio de la alimentacion se redujo tambien la temperatura de 37°C previamente a 30°C. La expresion de la transaminasa, de la alanindehidrogenasa y de la reductasa de acido graso se indujo 2 h despues del comienzo de la alimentacion mediante la adicion automatica de IPTG (1 mM). la induccion de los genes alk se efectuo mediante la adicion manual de DCPK (0,025 % v/v) 10 h despues del inicio de la alimentacion. Antes del inicio de la biotransformacion se determino la densidad optica de los caldos de cultivo.
El inico de la fase de biotransformacion se efectuo 14 h despues del comienzo de la alimentacion. A tal efecto se anadieron 150 mL de una mezcla de laurato de metilo y el cambiador ionico acido oleico (90 % tecnico) como carga al caldo de fermentacion. Para disponer un donador de grupos amino para la transaminasa se anadieron 5 mL de una disolucion de sulfato amonico 3m media hora antes del inicio de la biotransformacion. Para la toma de muestras se extrajeron de la caldera 2 mL de caldo de fermentacion de la caldera, y una parte de estos se diluyeron 1/20 en una mezcla de acetona-HCl (c(HCl) = 0,1 mol/L) y se extrajeron. Se tomaron muestras de todos los reactores 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 7,5 h, 10,5 h, 19,5 h y 21 h tras el inicio de la biotransformacion. Las tasas de conversion para oxfgeno (OTR = oxygen transfer rate) y carbono (CTR = carbon transfer rate) durante la fermentacion se determinaron a traves de la analftica de gas de escape en los sistemas DASGIP. La fermentacion se concluyo 21 h tras el inicio de la biotransformacion. Se desconectaron el agitador, la gasificacion, la regulacion de temperatura y la regulacion de pH, y se dejo reposar la caldera 5-10 minutos.
Para la cuantificacion de DDS (C12-di-acido carboxflico), DDSME (C12-di-carboxilato de metilo), LS (acido laurico), LSME (laurato de metilo), HLS (acido omega-hidroxi-laurico), HLSME(omega-hidroxi-laurato de metilo), OLS (acido omega-oxo-laurico), OLSME OLS (omega-oxo-laurato de metilo), ALS (acido omega-amino-laurico) y ALSME (omega-amino-laurato de metilo) en muestras de fermentacion se extrajeron muestras durante el cultivo. Estas muestras se prepararon para la analftica (vease cuantificacion de productos basada en LC-ESI/MS2).
Cuantificacion de productos basada en LC-ESI/MS2
La cuantificacion de ALS, ALSME, DDS, DDSME, LS, LSME, HLS, HLSME, OLS y OLSME en muestras de fermentacion se efectuo por medio de LC-ESI/MS en base a un calibrado externo para todos los analitos (0,1 - 50 mg/L) y bajo empleo del patron interno acido aminoundecanoico (AUD para HLS, DDS, OLS, HLSME, OLSME), d4- ALSME (para ALSME), 13C-DDSME (para DDSME), d3-LS (para LS) y d3-LSME (para LSME).
En este caso se emplearon los siguientes aparatos:
5
• Instalacion de HPLC 1260 (Agilent; Boblingen) con automuestreador (G1367E), bomba binaria (G1312B) y horno de columna (G1316A)
• Espectrometro de masas TripelQuad 6410 (Agilent; Boblingen) con fuente de ESI
• Columna de HPLC: Kinetex C18, 100 x 2,1 mm, tamano de partfcula: 2,6 pm, tamano de poro 100 A (Phenomenex; Aschaffenburg)
• Columna previa: KrudKatcher Ultra HPLC de filtro en linea; profundidad de filtro 0,5 pm y 0,004 mm de diametro interno (Phenomenex; Aschaffenburg)
Se prepararon las muestras pipeteandose 1900 pL de disolvente (80% (v/v) ACN, 20% de H2O bidest. (v/v), + 0.1% 10 de acido formico) y 100 pL de muestra en un recipiente de reaccion de 2 mL. La mezcla se sometio a vortice aproximadamente 10 segundos, y a continuacion se centrifugo a aproximadamente 13000 rpm durante 5 min. El exceso claro se extrajo con una pipeta y se analizo tras dilucion correspondiente con diluyente (80% (v/v) de ACN, 20% de H2O bidest. (v/v), + 0.1% de acido formico). Respectivamente a 900 pL de muestra se anadieron con la pipeta 100 pL de ISTD (10 pL con un volumen de muestra de 90 pL).
15 La separacion por HPLC se efectuo con la columna, o bien columna previa citada anteriormente. El volumen de inyeccion asciende a 0,7 pL, la temperatura de columna asciende a 50°C, la tasa de flujo asciende a 0,6 mL/min. La fase movil esta constituida por eluyente A (acido formico acuoso al 0,1 % (v/v)) y eluyente B (acetonitrilo con un 0,1 % (v/v) de acido formico). Se utilizo el siguiente perfil de gradiente:
Tiempo [min]
Eluyente A [%] Eluyente B [%]
0
77 23
0.3
77 23
0.4
40 60
2.5
40 60
2.6
2 98
5.5
2 98
5.6
77 23
9
77 23
20 El analisis por MS2 se efectuo en modo positivo con los siguientes parametros de la fuente de ESI:
• Temperatura de gas 280°C
• Flujo de gas 11 L/min
• Presion de nebulizador 50 psi
• Tension capilar 4000 V
La deteccion y cuantificacion de los compuestos ALS, ALSME, DDS, DDSME, HLS, HLSME, OLS, OLSME se efectuo con los siguientes parametros MRM, utilizandose respectivamente un ion producto como cualificador y uno como cuantificador.
Analito
Ion precursor [m/z] Ion producto [m/z] Tiempo de residencia [ms] Energfa de colision [eV]
DDSME
245,2 167,1 25 6
DDSME
245,2 149,1 50 8
HLSME
231,3 181,2 15 2
HLSME
231,3 163,2 25 5
DDS
231,2 213,2 50 0
DDS
231,2 149,1 25 9
ALSME
230,3 198,1 25 10
ALSME
230,3 163,2 15 10
OLSME
229,2 197,2 50 0
OLSME
229,2 161,1 25 5
HLS
217,2 181,2 35 0
HLS
217,2 163,1 20 4
OLS
215,2 161,2 25 0
OLS
215,2 95,2 60 13
5
Los analitos LS y LSME se detectaron en modo SIM (m/z 201 y 215).
Se mostro que las cepas son aptas para producir aminolaurato de metilo a partir de laurato de metilo a traves de las etapas intermedias hidroxilaurato de metilo y oxolaurato de metilo, y reducir productos secundarios formados en este caso, como ester metilico de diacido dodecanoico y diacido dodecanoico con ayuda de una actividad de reductasa 10 de acido graso, e introducir de nuevo los mismos en el metabolismo para la formacion de aminolaurato de metilo (tab. 1 y 2). Ademas se mostro que, mediante la introduccion de las diferentes reductasas de acido graso, se aumento la relacion de productos deseados (aminolaurato de metilo y acido aminolaurico) para dar productos secundarios (ester metflico de diacido dodecanoico y diacido dodecanoico) (tab. 1 y 2). Tambien se mostro que, mediante la introduccion de las diferentes reductasas de acido graso se aumento la concentracion de producto final 15 de aminolaurato de metilo (tab. 1 y 2). Finalmente se mostro que, mediante la introduccion de reductasa de acido graso se aumento el rendimiento espacio-tiempo de la formacion de aminolaurato de metilo (medida entre 1 y 19 h tras comienzo de la biotransformacion) y se redujo el correspondiente consumo de glucosa espedfico del producto (tab. 2).
Tab. 1: formacion de productos y productos secundarios de las cepas generadas en el ejemplo 2 con reductasa de acido graso sobreexprimida y el gen npt de Nocardia sp. relativamente a la cepa sin actividad de reductasa de acido graso
Cepa
Formacion de ALSME relativa [%] Formacion de DDSME relativa [%] Relacion ALSME/DDSME
E.coli W3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct)
100 100 4,5
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[carA_Ms(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
103 12 38,8
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[carB_Ms(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
105 26 18,9
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mint(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
106 27 17,7
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mfort(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
103 37 12,3
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mavi(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
112 21 23,3
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101 {Placuv5}[car_Csp(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
101 87 5,2
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mab(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
111 20 24,9
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_nbr(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
109 24 20,4
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mip(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
101 66 6,8
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_nfa(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
110 25 19,6
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) /
107 35 13,6
Cepa
Formacion de ALSME relativa [%] Formacion de DDSME relativa [%] Relacion ALSME/DDSME
pSC101{Placuv5}[car_Mul(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
E.coli W3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Sac(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
102 87 5,3
E.coliW3110 AbioH pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[car_Mcol(co_Ec)-npt_Noc(co_Ec)]
107 31 15,4
Tab. 2: formacion de productos y productos secundarios, tasa de formacion de productos y rendimiento a traves de la cepa generada en el ejemplo 3, que sobreexprime una reductasa de acido graso y el gen npt de Nocardia sp. respecto a la cepa sin actividad de reductasa de acido graso.
Cepa
Formacion de ALS(ME)- relativa [%] Formacion de DDS(ME)- relativa [%] Relacion ALS(ME)/ DDS(ME) Rendimiento espacio-tiempo relativo [%] Rendimiento relativo ALS(ME)/ glucosa [%]
E.coliW3110 pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101{Placuv5}[carB_Ms(co_Ec)- npt_Noc(co_Ec)]
121 40 37,02 133 123
E.coliW3110 pBT10 alkL / pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct) / pSC101
100 100 12,15 100 100
5

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    1. - Catalizador de celula completa que exprime una a-dioxigenasa recombinante, o la combinacion de una reductosa de acido graso recombinante y una fosfopanteteinil-transferasa que fosfopanteteiniliza la reductasa de acido graso, y que exprime adicionalmente una transaminasa, siendo la fosfopanteteinil-transferasa y/o transaminasa preferentemente recombinante.
  2. 2. - Catalizador de celula completa segun la reivindicacion 2, exprimiendo el catalizador de celula completa adicionalmente una dehidrogenasa de acido graso, que es preferentemente recombinante.
  3. 3. - Catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 2, exprimiendo el catalizador de celula completa adicionalmente una alcanohidrogenasa, que es preferentemente recombinante.
  4. 4. - Catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 3, exprimiendo el catalizador de celula completa adicionalmente un polipeptido de la familia AlkL, que es preferentemente recombinante.
  5. 5. - Catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 4, que exprime adicionalmente una alcoholdehidrogenasa, que es preferentemente recombinante.
  6. 6. - Catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 5, estando reducida la actividad de al menos uno de los enzimas participates en la p-oxidacion frente al tipo salvaje del catalizador de celula completa.
  7. 7. - Catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 6, estando reducida la actividad de BioH o de una variante del mismo frente al tipo salvaje de un catalizador de celula completa.
  8. 8. - Catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 6, estando aumentada la actividad de FadL o de una variante del mismo frente al tipo salvaje de un catalizador de celula completa.
  9. 9. - Procedimiento para la reaccion de un acido graso, acido w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o de un monoester del mismo para dar una amina, que comprende los pasos
    a) oxidacion del acido graso, w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o del monoester del mismo mediante puesta en contacto con una alcanohidrolasa, y en caso dado una alcoholdehidrogenasa, para dar un producto de oxidacion,
    b) puesta en contacto del producto de oxidacion con una reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada o de una a-dioxigenasa para dar un aldehudo, y
    c) puesta en contacto del aldehudo con una transaminasa,
    poniendose a disposicion los enzimas reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada, a-dioxigenasa, transaminasa y alcanohidrolasa en forma de un catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 8.
  10. 10. - Procedimiento segun la reivindicacion 9, estando presente una dehidrogenasa de aminoacido en el paso c).
  11. 11. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 9 a 10, poniendose a disposicion los enzimas reductasa de acido graso fosfopanteteinilizada, a-dioxigenasa, transaminasa, dehidrogenasa de aminoacido y alcanohidrolasa en forma de un catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 2 a 8.
  12. 12. - Procedimiento segun una de las reivindicaciones 9 a 11, tratandose en el caso del acido graso, acido w-hidroxi- graso, acido w-oxo-graso, o del monoester del mismo, de un compuesto de la formula (I)
    R1 - A -COOR2 (I)
    seleccionandose R1 a partir del grupo que comprende -H, -CHO, -OH y COOR3,
    seleccionandose R2 y R3 respectivamente, y de modo independiente entre sf, a partir del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
    con la condicion de que al menos uno de los restos R2 y R3 sea H,
    representando A un grupo hidrocarburo no ramificado, ramificado, lineal, dclico, substituido o no substituido, con al menos cuatro atomos de carbono.
  13. 13.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 9 a 12, presentando A preferentemente la formula -(CH2)n -, siendo n al menos 4, de modo especialmente preferente al menos 10.
    5 14.- Empleo del catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 8 o del procedimiento segun
    una de las reivindicaciones 8 a 12 para la aminacion de un acido graso, acido w-hidroxigraso, acido w-oxo-graso, o un monoester del mismo.
  14. 15.- Mezcla de reaccion que comprende el catalizador de celula completa segun una de las reivindicaciones 1 a 8 en disolucion acuosa, asf como un acido graso, acido w-hidroxi-graso, acido w-oxo-graso, o un monoester del 10 mismo de la formula (I)
    R1 - A -COOR2 (I)
    seleccionandose R1 a partir del grupo que comprende -H, -CHO, -OH y COOR3,
    seleccionandose R2 y R3 respectivamente, y de modo independiente entre sf, a partir del grupo que comprende H, metilo, etilo y propilo,
    15 con la condicion de que al menos uno de los restos R2 y R3 sea H,
    representando A un grupo hidrocarburo no ramificado, ramificado, lineal, dclico, substituido o no substituido, con al menos cuatro atomos de carbono, preferentemente la formula - (CH2)n -, siendo n al menos 4, preferentemente al menos 10.
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