CN103827309A

CN103827309A - 仲醇的氧化和胺化

Info

Publication number: CN103827309A
Application number: CN201280048033.2A
Authority: CN
Inventors: T.哈斯; M.珀特; J.C.普费弗; W.克劳蒂尔; A.斯克拉; A.莱希纳; K.C.陶贝尔; J.H.萨特勒; S.沙费尔
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-05-28
Also published as: JP2014524245A; BR112014002732A2; CN107034247A; US20140308717A1; CA2844090A1; RU2014108194A; BR112014002732A8; WO2013020839A1; EP2739744A1

Abstract

本发明涉及包括下述步骤的方法：a)提供仲醇，b)通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述仲醇，和c)使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触，其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶，涉及用于施行所述方法的全细胞催化剂，和涉及这样的全细胞催化剂用于氧化仲醇的用途。

Description

仲醇的氧化和胺化

本发明涉及包括下述步骤的方法：

a) 提供仲醇，

b) 通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述仲醇，和

c) 使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触，

其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶，

涉及用于施行所述方法的全细胞催化剂，和涉及这样的全细胞催化剂用于氧化仲醇的用途。

胺类被用作化学工业的众多产品（诸如环氧树脂、聚氨酯泡沫、异氰酸酯和尤其是聚酰胺）的合成基石。后者是以重复的酰胺基为特征的一类聚合物。与化学上有关的蛋白不同，术语“聚酰胺”通常涉及合成的、商购可得的热塑性塑料。聚酰胺衍生自伯胺或仲胺，其通常在烃裂解中得到。但是，也可以使用衍生物，更精确地讲，氨基羧酸、内酰胺和二胺，用于聚合物的生产。另外，短链气态烷烃作为原料是令人感兴趣的，其可以用生物技术方法从再生原料起始得到。

许多在商业上具有巨大需求的聚酰胺是从内酰胺起始制备。例如，“聚酰胺6”可以通过聚合ε-己内酰胺得到，而“聚酰胺12”可以通过聚合月桂内酰胺得到。其它商业上感兴趣的产物包括内酰胺的共聚物，例如ε-己内酰胺和月桂内酰胺的共聚物。

胺类的常规化学工业生产依赖于化石原料的供给，是低效的，且在该过程中产生大量不希望的副产物，在某些合成步骤中最高达80%。这样的方法的一个例子是月桂内酰胺的制备，其通常通过丁二烯的三聚化而得到。氢化该三聚化产物环十二碳三烯，并将由此产生的环十二烷氧化成环癸酮，其随后与羟胺反应生成环十二烷酮肟（Cyclododecanonoxin），其最后经由贝克曼重排转化成月桂内酰胺。

考虑到这些缺点，已经开发了使用生物催化剂从再生原料起始制备胺的方法。PCT/EP 2008/067447描述了使用细胞生产化学相关产物，更精确地讲ω-氨基羧酸的生物体系，所述细胞具有一系列合适的酶活性且能够将羧酸转化成相应的ω-氨基。但是，在该方法中使用的得自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1的AlkBGT-氧化酶体系的一个已知缺点是，它不能提供使脂族烷烃生成仲醇的选择性氧化。相反，产生大化量氧化产物；尤其是，更高度氧化的产物（诸如相应的醛、酮或相应的羧酸）的比例随着反应时间增加而增加(C. Grant, J. M. Woodley和F. Baganz (2011), Enzyme and Microbial Technology 48, 480-486)，这相应地降低了期望的胺的收率。

在该背景下，本发明的目的在于，提供使用生物催化剂氧化和胺化仲醇的改进方法。另一个目的是，如下改进所述方法，即增加收率和/或降低副产物浓度。最后，需要这样的方法，即其允许基于再生原料来生产聚酰胺或用于生产聚酰胺的原材料。

所述目的和其它目的通过本申请的主题和尤其是通过附随的独立权利要求的主题得以实现，其中由从属权利要求得出实施方案。

根据本发明，所述目的在第一方面由包括下述步骤的方法实现：

a) 提供仲醇，

b) 通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述仲醇，和

c) 使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触，

其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶。

在所述第一方面的第一实施方案中，所述仲醇是选自以下的醇：α-羟基羧酸，环烷醇，优选双(对羟基环己基)甲烷，式R¹-CR²H-CR³H-OH的醇及其醚和聚醚，和仲烷醇，优选2-烷醇，

其中R¹选自羟基、烷氧基、氢和胺；R²选自烷基，优选甲基、乙基和丙基，和氢；且R³选自烷基，优选甲基、乙基和丙基。

在所述第一方面的第二实施方案（其也是第一实施方案的一个实施方案）中，所述仲醇是下式的仲醇

H₃C-C(OH)H-(CH₂)_x-R⁴，

其中R⁴选自-OH、-SH、-NH₂和-COOR⁵，x是至少3，且R⁵选自H、烷基和芳基。

在所述第一方面的第三实施方案（其也是第一和第二实施方案的一个实施方案）中，通过用单加氧酶羟基化所述式的相应烷烃来进行步骤a)，所述单加氧酶优选地是重组的或分离的。

在所述第一方面的第四实施方案（其也是第二至第三实施方案的一个实施方案）中，所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶是具有至少一个锌原子作为辅因子的NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶。

在所述第一方面的第五实施方案（其是第一至第四实施方案的一个实施方案）中，所述醇脱氢酶是得自赤红球菌（Rhodococcus ruber）的醇脱氢酶A (数据库代码AJ491307.1)或其变体。

在所述第一方面的第六实施方案（其是第一至第五实施方案的一个实施方案）中，所述单加氧酶选自：恶臭假单胞菌的AlkBGT，得自热带假丝酵母（Candida tropicalis）或得自鹰嘴豆（Cicer arietinum）的细胞色素P450。

在所述第一方面的第七实施方案（其也是第一至第六实施方案的一个实施方案）中，所述转氨酶选自特征如下的转氨酶及其变体：在与青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472(数据库代码NP_901695)的转氨酶的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472(数据库代码NP_901695)的转氨酶的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸，或者所述转氨酶选自：河流弧菌（Vibrio fluvialis）(AEA39183.1)的转氨酶、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）(YP001374792.1)的转氨酶、脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）(CP000490.1)的转氨酶及其变体。

在所述第一方面的第八实施方案（其也是第一至第七实施方案的一个实施方案）中，在分离的或重组的丙氨酸脱氢酶和无机氮源（优选氨或铵盐）存在下进行步骤b)和/或步骤c)。

在所述第一方面的第九实施方案（其也是第一至第八实施方案的一个实施方案）中，在包含NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、单加氧酶和丙氨酸脱氢酶的组中的至少一种酶是重组的，且以具有相应酶的全细胞催化剂的形式提供。

在所述第一方面的第十实施方案（其也是第九实施方案的一个实施方案）中，所有酶以一种或多种全细胞催化剂的形式提供，其中，优选地，一种全细胞催化剂具有所有必需的酶。

在所述第一方面的第十一实施方案（其也是第一至第十实施方案的一个实施方案）中，在步骤b)时，优选在步骤b)和c)时，存在有机共溶剂，其具有大于-1.38、优选-0.5至1.2、更优选-0.4至0.4的logP。

在所述第一方面的第十二实施方案（其也是第十一实施方案的一个实施方案）中，所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，优选油酸。

在所述第一方面的第十三实施方案（其也是第十一实施方案的一个优选实施方案）中，所述共溶剂是式R⁶-O-(CH₂)x-O-R⁷的化合物，其中R⁶和R⁷各自且彼此独立地选自：甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中优选R⁶和R⁷各自是甲基且x是2。

根据本发明，所述目的在第二方面中通过全细胞催化剂得以实现，所述全细胞催化剂具有NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶（优选地，具有至少一个锌原子作为辅因子）、转氨酶、任选的单加氧酶和任选的丙氨酸脱氢酶，其中所述酶是重组酶，其中所述醇脱氢酶优选地识别仲醇作为优选的底物。

根据本发明，所述目的在第三方面中通过根据本发明的第二方面的全细胞催化剂用于氧化和胺化仲醇的用途得以实现，所述仲醇优选式H₃C-C(OH)H-(CH₂)_x-R¹，其中R¹选自-OH、-SH、-NH₂和-COOR²，x是至少3，且R²选自H、烷基和芳基。

在第三方面的第一实施方案（其是第一实施方案的一个实施方案）中，所述用途进一步包括有机共溶剂的存在，所述有机共溶剂具有大于-1.38、优选-0.5至1.2、更优选-0.4至0.4的logP，且最优选地为二甲氧基乙烷。

在第三方面的第二实施方案（其是第二实施方案的一个实施方案）中，所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，且优选地是油酸。

所述第二和第三方面的其它实施方案包括本发明的第一方面的所有实施方案。

本发明的发明人已经惊讶地发现，存在一组醇脱氢酶，其可以用于形成少量副产物实现仲醇的氧化。本发明的发明人此外已惊讶地发现，存在可以使用生物催化剂将醇胺化而不形成大量副产物的酶活性级联，其中不必添加或除去还原当量。本发明的发明人此外已惊讶地发现了可以令人惊讶地使用全细胞催化剂并从再生原料出发生产聚酰胺的方法。本发明的发明人此外已惊讶地发现，事先氧化后的仲醇的胺化可以特别有利地用以某些序列特性为特征的转氨酶集合来实现。

根据本发明的方法可以应用于大量的工业相关的醇。合适的是，例如，α-羟基羧酸，优选可以氧化为α-酮羧酸的那些，也就是说，式R^S-C(OH)H-COOH的那些，其又可以通过胺化转化成蛋白氨基酸，具体地包括必需氨基酸诸如甲硫氨酸和赖氨酸。具体例子包括这样的酸，其中R^S是选自以下的取代基：H、甲基、-(CH₂)₄-NH₂、-(CH₂)₃-NH-NH-NH₂、-CH₂-CH₂-S-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH₂-(1H-吲哚-3-基)、-CH(OH)-CH₃、-CH₂-苯基、-CH(CH₃)-CH₂-CH₃。其它仲醇包括2-烷醇，例如2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇等。另外，考虑多元仲醇，例如烷基二醇诸如乙二醇，烷基三醇诸如甘油和季戊四醇。其它例子包括环烷醇，优选环己醇和双(对羟基环己基)甲烷，H₃C-C(OH)H-(CH₂)_x-R⁴的醇，其中R⁴选自-OH、-SH、-NH₂和-COOR⁵，x是至少3，且R⁵选自H、烷基和芳基。

在醇式H₃C-C(OH)H-(CH₂)_x-R⁴的醇而言的情况中，碳链的长度是可变的，且x是至少3。优选地，所述碳链具有多于3个碳原子，即x = 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。众多仲醇是商购可得的，且可以以市售形式直接使用。或者，所述仲醇可以通过生物技术预先或原位制备，例如通过用合适的烷烃氧化酶、优选单加氧酶将烷烃羟基化。对此，现有技术教导了合适的酶，例如M. W. Peters等人, 2003。

在一个特别优选的实施方案中，在式H₃C-C(OH)H-(CH₂)_x-R⁴的仲醇的情况中，R⁴选自-OH和-COOR⁵，x是至少11，且R⁵选自H、甲基、乙基和丙基。

根据本发明，在所述方法的步骤b)中，使用NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶用于氧化仲醇。在该情况下，与根据本发明使用的所有的酶活性多肽一样，其可以是包含酶活性多肽的细胞或其裂解物、或处于所有纯化阶段（从粗制的裂解物至纯的多肽）的多肽的制品。本领域技术人员已知大量可以在合适的细胞中过表达酶活性多肽并进行纯化和/或分离的方法。因而，为表达多肽，可以使用本领域技术人员可得到的所有表达体系，例如pET或pGEX型的载体。可以使用色谱方法用于纯化，例如提供了标记的重组蛋白的亲和色谱使用固定化的配体的纯化，所述固定化的配体为例如在组氨酸标记的情况中镍离子、在与靶蛋白融合的谷胱甘肽-S-转移酶的情况中使用固定化的谷胱甘肽或在包含麦芽糖结合蛋白的标签的情况中使用固定化的麦芽糖。

可以以可溶形式或固定化地使用经纯化的酶活性多肽。本领域技术人员已知可以将多肽共价地或非共价地固定至有机或无机固相上的合适方法，例如通过巯基偶联化学(例如得自Pierce的试剂盒)。

在一个优选的实施方案中，所述用作全细胞催化剂或用作表达体系的细胞是原核细胞，优选细菌细胞。在另一个优选的实施方案中，其是哺乳动物细胞。在另一个优选的实施方案中，其是低等真核细胞，优选是酵母细胞。示例性的原核细胞包括埃希氏菌属（Escherichia），特别是大肠杆菌（Escherichia coli），和假单胞菌属（Pseudomonas）和棒状杆菌属（Corynebacterium）的菌株。示例性的低等真核细胞包括酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、耶氏酵母属（Yarrowia）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces）属，特别是热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）和酿酒酵母菌（Saccharomyces cerivisiae）菌株。

所述细胞可以在质粒上包含一个或多于一个编码根据本发明使用的酶的核酸序列，或者将所述核酸序列整合进其基因组中。在一个优选的实施方案中，它包含这样的质粒，所述质粒包含编码选自NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶（优选地，具有至少一个锌原子作为辅因子）、转氨酶、单加氧酶和丙氨酸脱氢酶中的至少一种酶、优选多于一种酶、最优选所有酶的核酸序列。

在一个特别优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是含锌的NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶，即所述催化活性酶包含至少一个锌原子作为辅因子，所述锌原子通过包含半胱氨酸残基的特征序列基序与所述多肽共价结合。在一个特别优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。

本发明的教导不仅可以使用本文描述的生物大分子的精确氨基酸序列或核酸序列来完成，而且也可以使用这样的大分子的变体来完成，所述变体可以通过一个或多于一个氨基酸或核酸的缺失、添加或置换而得到。在一个优选的实施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”（其在下文中与本文中使用的表述“同源体”同义地和可互换地使用）是指另一个核酸-或-氨基酸序列，考虑到相应的原始野生型-核酸-或氨基酸序列，具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性（在这里与同一性同义使用），其中，优选地，除了形成催化活性中心的那些氨基酸或者结构或折叠必需的氨基酸以外的氨基酸被删除或置换，或者后者仅仅是保守置换，例如谷氨酸替代天冬氨酸、或亮氨酸替代缬氨酸。现有技术描述了可以用于计算2个序列的同源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第3版。在本发明的另一个优选的实施方案中，氨基酸序列或核酸序列的所述变体，优选地除了上述的序列同源性以外，基本上具有野生型分子或原始分子的相同的酶活性。例如，作为蛋白酶的酶活性多肽的变体具有与所述多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个特别的实施方案中，表述“基本上相同的酶活性”是指显著高于背景活性或/和与相对于相同底物的野生型多肽所具有的K_M-和/或k_cat-值相差小于3个、更优选2个、还更优选1个数量级的相对于野生型-多肽的底物的活性。在另一个优选的实施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”包含所述核酸-或氨基酸序列的至少一个活性部分/或片段。在另一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“活性部分”是指这样的氨基酸序列或核酸序列，其具有小于所述氨基酸序列的整个长度的长度，或者编码比所述氨基酸序列的全长更短的长度，其中具有比野生型氨基酸序列更短长度的氨基酸序列或编码的氨基酸序列基本上具有与所述野生型多肽或其变体相同的酶活性，例如作为醇脱氢酶、单加氧酶或转氨酶。在一个特殊的实施方案中，表述核酸的“变体”是这样的核酸，其互补链，优选地在严格的条件下，结合在野生型核酸上。杂交反应的严格性可由本领域技术人员容易地确定，并且通常取决于探针的长度、洗涤过程中的温度和盐浓度。通常，较长的探针需要较高的温度才能杂交，而较短的探针需要低温。杂交是否发生通常取决于变性DNA与存在于其环境中的互补链对合的能力，更精确地讲，在解链温度以下。杂交反应的严格性和相应的条件更详细地描述在Ausubel等人，1995中。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述核酸的“变体”是编码与原始核酸相同的氨基酸序列，或者在遗传密码的简并性范围内编码该氨基酸序列的变体的任意的核酸序列。

数十年来，醇脱氢酶是生物化学中与酿造发酵过程有关的受到强烈关注的且在生物技术上高度相关的生物化学酶类别，其包括多种异形体集合。因而，存在恶臭假单胞菌GPO1 AlkJ型的膜结合的、黄素依赖性的醇脱氢酶，其使用黄素辅因子替代NAD⁺。另一组包括含铁的、对氧敏感的醇脱氢酶，其在细菌中且以无活性形式在酵母中被发现。另一组包括NAD⁺依赖性的醇脱氢酶，包括含锌的醇脱氢酶，其中活性中心具有半胱氨酸配位的锌原子，所述锌原子固定醇底物。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的表述“醇脱氢酶”理解为是指将醛或酮氧化为相应的伯醇或仲醇的酶。优选地，在根据本发明的方法中的醇脱氢酶是NAD⁺依赖性的醇脱氢酶，即使用NAD⁺ 作为辅因子来氧化醇或使用NADH来还原相应的醛或酮的醇脱氢酶。在最优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是NAD⁺依赖性的、含锌的醇脱氢酶。合适的NAD⁺依赖性的醇脱氢酶的例子包括醇脱氢酶。在最优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是得自赤红球菌的醇脱氢酶A (数据库代码AJ491307.1)或其变体。其它例子包括真养产碱菌（Ralstonia eutropha）(ACB78191.1)、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）(YP_795183.1)、高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）(ACF95832.1)、马肝、泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus）(ACB78182.1)和矢野口鞘氨醇杆菌（Sphingobium yanoikuyae）(EU427523.1)的醇脱氢酶以及它们各自的变体。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶”表示NAD⁺-和/或NADP⁺依赖性的醇脱氢酶。

根据本发明，在步骤c)中，使用转氨酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“转氨酶”理解为催化α-氨基从供体（优选氨基酸）向受体分子（优选α-酮羧酸）转移的酶。在一个优选的实施方案中，所述转氨酶选自具有以下特征的转氨酶及其变体：在与青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，所述转氨酶选自：青紫色素杆菌DSM30191的ω-转氨酶，得自恶臭假单胞菌W619、铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）PA01、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）A3(2)和除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）MA 4680的转氨酶。

在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶的氨基酸序列的位置X对应的位置”是指，在所研究的分子的比对中，显得与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶的氨基酸序列的位置X同源的对应位置。本领域技术人员已知众多可以用于进行氨基酸序列比对的软件包和算法。示例性的软件包方法包括由EMBL提供的程序包ClustalW，或者列出和描述在Arthur M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版中。

根据本发明使用的酶优选地是重组酶。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的表述“重组的”理解为相应的核酸分子在自然界中不存在，和/或它使用基因工程方法产生。在一个优选的实施方案中，当相应的多肽由重组核酸编码时，提及重组蛋白。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的重组细胞理解为具有至少一个重组核酸或重组多肽的细胞。本领域技术人员已知适合用于生产重组分子或细胞的方法，例如在Sambrook等人, 1989中描述的那些。

根据本发明的教导可以使用分离的酶和使用全细胞催化剂来实行。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的表述“全细胞催化剂”理解为提供所期望的酶活性的完整的、存活的且有代谢活性的细胞。所述全细胞催化剂可以将要代谢的底物（在本发明的情况中，醇）或由所述底物形成的氧化产物运输进细胞内部，在此处被细胞溶质酶代谢，或者其可以将目标酶呈递到它的表面上，在此处直接暴露给培养基中的底物。本领域技术人员已知众多用于生产全细胞催化剂的体系，例如从DE 60216245中已知。

就许多应用而言，推荐使用分离的酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“分离的”是指，所述酶以比它的天然来源更纯和/或更浓的形式存在。在一个优选的实施方案中，如果酶是多肽酶且占相应制品的质量蛋白分数多于60、70、80、90或优选95%，则认为所述酶是分离的。本领域技术人员已知众多用于测量溶液中的蛋白的质量的方法，例如借助SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的对应蛋白带的厚度的视觉估测、NMR光谱法或基于质量-光谱测定法的方法。

根据本发明的方法的酶催化反应通常在溶剂或具有高的水比例的溶剂混合物中进行，优选地在用于建立与酶活性相容的pH-值的合适缓冲体系的存在下进行。但是，在疏水性原料的情况中，特别是在具有包含多于3个碳原子的碳链的醇中，有机共溶剂的额外存在是有利的，所述有机共溶剂可以介导酶与底物的接触。一种或多于一种共溶剂以占溶剂混合物或低于溶剂混合物的95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5体积%的总比例存在。

共溶剂的疏水性在这里起重要作用。它可以由logP表示，所述logP是正辛醇-水-分配系数的以10为底的对数。优选的共溶剂具有大于-1.38、更优选-1至+2、更优选-0.8至1.5、或-0.5至0.5、或-0.4至0.4、或-0.3至0.3、或-0.25至-0.1的logP。

正辛醇-水-分配系数K^ow或P是指示物质在1-辛醇和水的两相体系中的浓度的比例的无量纲分配系数(参见J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry的第2卷, John Wiley & Sons, Chichester, 1997)。更精确地讲，K^ow或P表示物质在富含辛醇的相中的浓度与其在富含水的相中的浓度之比。

K^ow值是物质的亲脂性(脂溶性)和亲水性(水溶性)之间的比例的模型指数（Modellma?）。预见到，使用物质在辛醇-水体系中的分配系数，也能够估测该物质在具有水相的其它体系中的分配系数。如果物质可更好地溶于脂性溶剂诸如正辛醇中，那么K^ow大于1，如果物质可更好地溶于水中，那么K^ow小于1。相应地，亲脂性物质的LogP为正值，亲水性物质的LogP为负值。由于不能测量所有化学试剂的K^OW，因此存在非常多样化的预测模型，例如通过定量构效关系(QSAR)或通过线性自由能关系(LFER)，例如描述于Eugene Kellogg G, Abraham DJ: Hydrophobicity: is LogP(o/w) more than the sum of its parts?. Eur J Med Chem. 2000年7-8月; 35(7-8):651-61或Gudrun Wienke, “Messung und Vorausberechnung von n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten”，博士论文, Oldenburg大学, 1-172, 1993。

在本申请范围内，根据Advanced Chemistry Development Inc., Toronto的方法，借助程序模块ACD/LogP DB确定log P。

优选的共溶剂具有大于-1.38、更优选-1至+2、还更优选-0.5至0.5、-0.4至0.4、或0至1.5的logP。在一个优选的实施方案中，所述共溶剂是式Alk₁-O-Alk₂的二烷基醚，其具有大于-1.38、更优选-1至+2、更优选0至1.5的logP，其中所述2个烷基取代基Alk₁和Alk₂各自彼此独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基和叔丁基。在一个特别优选的实施方案中，所述共溶剂是甲基叔丁基醚(MTBE)。在最优选的实施方案中，所述共溶剂是二甲氧基乙烷(DME)。

在另一个优选的实施方案中，所述共溶剂是羧酸或脂肪酸，优选具有至少6个碳原子的脂肪酸，更优选具有至少12个碳原子的脂肪酸。所述脂肪酸可以是饱和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸或山嵛酸，或不饱和脂肪酸，例如肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、岩芹酸、油酸、反油酸、异油酸、顺-9-二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸或芥酸。不同脂肪酸的混合物同样是可能的，例如主要含有不饱和脂肪酸的蓝刺头油。由于并非所有的脂肪酸在室温时都是显著可溶的，可能需要求助于其它措施，例如升高温度，或者，更优选地，加入其它溶剂来使它可接近水相。在一个特别优选的实施方案中，使用脂肪酸或其酯、优选甲酯、最优选月桂酸甲酯作为这样的其它溶剂。

根据本发明的酶级联可以根据本发明在丙氨酸脱氢酶存在下进行。本发明的一个特别的长处是，该构型能够实现还原当量中性的反应操作，即该反应在没有供给或除去还原当量形式的电子的情况下进行，因为在醇氧化过程中由醇脱氢酶产生的NADH在制备丙氨酸时被消耗，消耗无机氮供体，优选氨或氨源。

在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“丙氨酸脱氢酶”理解为这样的酶：其催化L-丙氨酸的转化，消耗水和NAD⁺，形成丙酮酸、氨和NADH。优选地，所述丙氨酸脱氢酶是细胞内的丙氨酸脱氢酶，还更优选地，细菌全细胞催化剂的重组细胞内的丙氨酸脱氢酶。

在一个优选的实施方案中，将具有所有需要的活性的全细胞催化剂用于根据本发明的方法中，即NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶和任选的单加氧酶和/或丙氨酸脱氢酶。这样的全细胞催化剂的应用具有以下优点：以单一试剂的形式使用所有活性，并且不必大规模地准备生物活性形式的酶。适合用于构建全细胞催化剂的方法是本领域技术人员已知的，尤其是用于表达一种或多于一种重组蛋白的质粒体系的构建，或编码所需重组蛋白的DNA向使用的宿主细胞的染色体DNA中的整合。

另外，另一发明的目的是，提供用于氧化和胺化伯醇的体系。根据本发明，该目的在第四方面中通过包括下述步骤的方法实现：

a) 提供下式的伯醇

HO-(CH₂)_x-R⁷，

其中R⁷选自-OH、-SH、-NH₂和-COOR⁸，x是至少3，且R⁸选自H、烷基和芳基，

b) 通过使所述伯醇与NAD⁺-依赖性的醇脱氢酶接触来氧化所述伯醇，和

c) 使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触，

其中所述NAD⁺-醇脱氢酶和/或所述转氨酶是重组的或分离的酶。

在第四方面的第一实施方案中，通过用单加氧酶羟基化式H-(CH₂)_x-R⁷的烷烃而进行步骤a)，所述单加氧酶优选地为重组的或分离的。

在第四方面的第二实施方案（其也是第一实施方案的一个实施方案）中，所述NAD⁺依赖性的醇脱氢酶是具有至少一个锌原子作为辅因子的NAD⁺依赖性的醇脱氢酶。

在第四方面的第三实施方案（其是第二实施方案的一个实施方案）中，所述醇脱氢酶是嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。

在第四方面的第四实施方案（其是第一个至第三实施方案的一个实施方案）中，所述单加氧酶选自：得自恶臭假单胞菌的AlkBGT，得自热带假丝酵母（Candida tropicalis）或得自鹰嘴豆（Cicer arietinum）的细胞色素P450。

在第四方面的第五实施方案（其也是第一个至第四实施方案的一个实施方案）中，所述转氨酶选自特征如下的转氨酶及其变体：在与青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。

在第四方面的第六实施方案（其也是第一个至第五实施方案的一个实施方案）中，在有分离的或重组的丙氨酸脱氢酶和无机氮源存在下进行步骤b)和/或步骤c)。

在第四方面的第七实施方案（其也是第一个至第七实施方案的一个实施方案）中，由NAD⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、单加氧酶和丙氨酸脱氢酶组成的组中的至少一种酶是重组酶，且以具有相应酶的全细胞催化剂的形式提供。

在第四方面的第八实施方案（其也是第七实施方案的一个实施方案）中，所有酶以一种或多种全细胞催化剂的形式提供，其中，优选地，一种全细胞催化剂包含所有必要的酶。

在第四方面的第九实施方案（其也是第一个至第八实施方案的一个实施方案）中，在步骤b)时，优选在步骤b)和c)时，存在有机共溶剂，其具有大于-1.38、优选-0.5至1.2、还更优选-0.4至0.4的logP。

在第四方面的第十实施方案（其也是第九实施方案的一个实施方案）中，所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，优选油酸。

在第四方面的第十一实施方案（其也是第九实施方案的一个优选实施方案）中，所述共溶剂是式R⁹-O-(CH₂)_x-O-R¹⁰的化合物，其中R⁹和R¹⁰各自且彼此独立地选自甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中特别优选R⁸和R¹⁰各自是甲基且x是2。

根据本发明，所述目的在第五方面中通过全细胞催化剂得以实现，所述全细胞催化剂具有NAD⁺依赖性的醇脱氢酶（优选地，具有至少一个锌原子作为辅因子）、转氨酶、任选的单加氧酶和任选的丙氨酸脱氢酶，其中所述酶是重组酶。

根据本发明，所述目的在第六方面中通过根据本发明的第二方面的全细胞催化剂用于氧化和胺化式HO-(CH₂)_x-R⁷的伯醇的用途得以实现，其中R⁷选自-OH、-SH、-NH₂和-COOR⁸，x是至少3，且R⁸选自H、烷基和芳基。

在第六方面的第一实施方案（其是第一实施方案的一个实施方案）中，所述用途进一步包括有机共溶剂的存在，所述有机共溶剂具有大于-1.38、优选-0.5至1.2、还更优选-0.4至0.4的logP。

在第六方面的第二个实施方案（其是第二实施方案的一个实施方案）中，所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，且优选地是油酸。

所述第五和第六方面的其它实施方案包含本发明的第四方面的所有实施方案。

本发明的发明人已经令人惊讶地发现，存在一组醇脱氢酶，其可以用于实现形成少量副产物的伯醇的氧化。发明人此外已惊讶地发现，存在可以使用生物催化剂将醇胺化而不形成大量副产物的酶活性级联，其中不必添加或除去还原当量。发明人此外已惊讶地发现了可以令人惊讶地使用全细胞催化剂并从再生原料出发生产聚酰胺的方法。本发明的发明人此外已惊讶地发现，事先氧化后的伯醇的胺化可以特别有利地用以某些序列特性为特征的转氨酶集合来进行。

根据本发明的方法可以应用于大量的工业相关的醇。在一个优选的实施方案中，其涉及可氧化和胺化成ω-氨基羧酸的ω-羟基羧酸或酯，优选甲酯。在另一实施方案中，其涉及可氧化和胺化成二胺的二醇。在另一个优选的实施方案中，所述伯醇是羟基烷基胺。在此，碳链的长度是可变的，并且x为至少3。所述碳链优选具有多于3个的C-原子，即x = 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。示例性化合物包括ω-羟基月桂酸、ω-羟基月桂酸甲酯，和链烷二醇，尤其是1,8-辛二醇和1,10-癸二醇。

在一个特别优选的实施方案中，R¹选自-OH和-COOR²，x是至少11，且R²选自H、甲基、乙基和丙基。在最优选的实施方案中，所述伯醇是ω-羟基脂肪酸甲酯。

根据本发明，在所述方法的步骤b)中，使用NAD⁺依赖性的醇脱氢酶氧化伯醇。在该情况下，与根据本发明使用的所有的酶活性多肽一样，其可以是包含酶活性多肽的细胞或其裂解物、或处于所有纯化阶段（从粗制的裂解物至纯的多肽）的多肽的制品。本领域技术人员已知大量可以在合适的细胞中过表达酶活性多肽并进行纯化和/或分离的方法。因而，为表达多肽，可以使用本领域技术人员可得到的所有表达体系。可以使用色谱方法用于纯化，例如提供了标记的重组蛋白的亲和色谱使用固定化的配体的纯化，所述固定化的配体为例如在组氨酸标记的情况中镍离子、在与靶蛋白融合的谷胱甘肽-S-转移酶的情况中使用固定化的谷胱甘肽或在包含麦芽糖结合蛋白的标签的情况中使用固定化的麦芽糖。

可以以可溶形式或固定化地使用经纯化的酶活性多肽。本领域技术人员已知可以将多肽共价地或非共价地固定化至有机或无机固相上的合适方法，例如通过巯基偶联化学(例如得自Pierce或Quiagen的试剂盒)。

在一个特别优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是含锌的NAD⁺依赖性的醇脱氢酶，即所述催化活性酶包含至少一个锌原子作为辅因子，所述锌原子通过包含半胱氨酸残基的特征序列基序与所述多肽共价结合。在一个特别优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶(数据库代码P42328)或其变体。

本发明的教导不仅可以使用本文描述的生物大分子的精确氨基酸序列或核酸序列来完成，而且也可以使用这样的大分子的变体来完成，所述变体可以通过一个或多于一个氨基酸或核酸的缺失、添加或置换而得到。在一个优选的实施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”（其在下文中与本文中使用的表述“同源体”同义地和可互换地使用）是指另一个核酸-或氨基酸序列，考虑到相应的原始野生型-核酸-或-氨基酸序列，具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性（在这里与同一性同义使用），其中，优选地，除了形成催化活性中心的那些氨基酸或者结构或折叠必需的氨基酸以外的氨基酸被删除或置换，或者后者仅仅是保守置换，例如谷氨酸替代天冬氨酸、或亮氨酸替代缬氨酸。现有技术描述了可以用于计算2个序列的同源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第3版。在本发明的另一个优选的实施方案中，氨基酸序列或核酸序列的所述变体，优选地除了上述的序列同源性以外，基本上具有野生型分子或原始分子的相同的酶活性。例如，作为蛋白酶的酶活性多肽的变体具有与所述多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个特别的实施方案中，表述“基本上相同的酶活性”是指显著高于背景活性或/和与相对于相同底物的野生型多肽所具有的K_M-和/或k_cat-值相差小于3个、更优选2个、还更优选1个数量级的相对于野生型-多肽的底物的活性。在另一个优选的实施方案中，表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”包含所述核酸-或氨基酸序列的至少一个活性部分/或片段。在另一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“活性部分”是指这样的氨基酸序列或核酸序列，其具有小于所述氨基酸序列的整个长度的长度，或者编码比所述氨基酸序列的全长更短的长度，其中具有比野生型氨基酸序列更短长度的氨基酸序列或编码的氨基酸序列基本上具有与所述野生型多肽或其变体相同的酶活性，例如作为醇脱氢酶、单加氧酶或转氨酶。在一个特殊的实施方案中，表述核酸的“变体”是这样的核酸，其互补链，优选地在严格的条件下，结合在野生型核酸上。杂交反应的严格性可由本领域技术人员容易地确定，并且通常取决于探针的长度、洗涤过程中的温度和盐浓度。通常，较长的探针需要较高的温度才能杂交，而较短的探针需要低温。杂交是否发生通常取决于变性DNA与存在于其环境中的互补链对合的能力，更精确地讲，在解链温度以下。杂交反应的严格性和相应的条件更详细地描述在Ausubel等人，1995中。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述核酸的“变体”是编码与原始核酸相同的氨基酸序列，或者在遗传密码的简并性范围内编码该氨基酸序列的变体的任意的核酸序列。

数十年来，醇脱氢酶是生物化学中与酿造发酵过程有关的受到强烈关注的且在生物技术上高度相关的生物化学酶类别，其包括多种异形体集合。因而，存在恶臭假单胞菌GPO1 AlkJ型的膜结合的、黄素依赖性的醇脱氢酶，其使用黄素辅因子替代NAD⁺。另一组包括含铁的、对氧敏感的醇脱氢酶，其在细菌中且以无活性形式在酵母中被发现。另一组包括NAD⁺依赖性的醇脱氢酶，包括含锌的醇脱氢酶，其中活性中心具有半胱氨酸配位的锌原子，所述锌原子固定醇底物。在一个优选的实施方案中，将本文中使用的表述“醇脱氢酶”理解为是指将醛或酮氧化为相应的伯醇或仲醇的酶。优选地，在根据本发明的方法中的醇脱氢酶是NAD⁺依赖性的醇脱氢酶，即使用NAD⁺作为辅因子来氧化醇或使用NADH来还原相应的醛或酮的醇脱氢酶。在最优选的实施方案中，所述醇脱氢酶是NAD⁺依赖性的、含锌的醇脱氢酶。

根据本发明，在步骤c)中，使用转氨酶。在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“转氨酶”理解为催化α-氨基从供体（优选氨基酸）向受体分子（优选α-酮羧酸）转移的酶。在一个优选的实施方案中，所述转氨酶选自具有以下特征的转氨酶及其变体：在与青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472 的转氨酶(数据库代码NP_901695) 的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472 的转氨酶(数据库代码NP_901695) 的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，所述转氨酶选自：青紫色素杆菌DSM30191的ω-转氨酶，源自恶臭假单胞菌W619、铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）PA01、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）A3(2)和除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）MA 4680的转氨酶。

在一个优选的实施方案中，本文中使用的表述“与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶的氨基酸序列的位置X对应的位置”是指，在所研究的分子的比对中，显得与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶的氨基酸序列的位置X同源的对应位置。本领域技术人员已知众多可以用于进行氨基酸序列比对的软件包和算法。示例性的软件包方法包括由EMBL提供的程序包ClustalW(Larkin et al., 2007; Goujon et al. 2010)，或者列出和描述在Arthur M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版中。

共溶剂的疏水性在这里起重要作用。它可以由logP表示，所述logP是正辛醇-水分配系数的以10为底的对数。优选的共溶剂具有大于-1.38、更优选-1至+2、还更优选-0.5至0.5、或-0.4至0.4、或-0至1.5的logP。

优选的共溶剂具有大于-1.38，更优选-1至+2，还更优选-0.75至1.5、或-0.5至0.5、或-0.4至0.4、或-0.3至-0.1的logP。在一个优选的实施方案中，所述共溶剂是式Alk₁-O-Alk₂的二烷基醚，其具有大于-1.38、更优选-1至+2、还更优选0至1.5的logP，其中所述2个烷基取代基Alk₁和Alk₂各自彼此独立地选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基和叔丁基。在一个特别优选的实施方案中，所述共溶剂是甲基叔丁基醚(MTBE)。在最优选的实施方案中，所述共溶剂是二甲氧基乙烷(DME)。在另一个优选的实施方案中，所述共溶剂是式R¹⁰-O-(CH₂)_x-O-R¹¹的化合物，其中R¹⁰和R¹¹各自且彼此独立地选自甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中优选R¹⁰和R¹¹各自是甲基且x是2。

根据本发明的酶级联可以根据本发明在有丙氨酸脱氢酶存在下进行。本发明的一个特别的长处是，该构型能够实现还原当量中性的反应操作，即该反应在没有供给或除去还原当量形式的电子的情况下进行，因为在醇氧化过程中由醇脱氢酶产生的NADH在制备丙氨酸时被消耗，消耗无机氮供体，优选氨或氨源。

在一个优选的实施方案中，将具有所有需要的活性的全细胞催化剂用于根据本发明的方法中，即NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶和任选的单加氧酶和/或丙氨酸脱氢酶。这样的全细胞催化剂的应用具有以下优点：以单一试剂的形式使用所有活性，并且不必大规模地准备生物活性形式的酶。适合用于构建全细胞催化剂的方法是本领域技术人员已知的，尤其是用于表达一种或多种重组蛋白的质粒体系的构建，或编码所需重组蛋白的DNA向使用的宿主细胞的染色体DNA中的整合。

在先前的描述、权利要求书和附图中公开的本发明的特征单独地和以任意组合以本发明不同实施方案用于实现本发明可能是重要的。

图1显示了包含不同转氨酶，尤其是青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695, “TACV_co”)的示例性比对。在所有序列中，用下划线标记与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶的位置Val224和Gly230对应的氨基酸残基。使用ClustalW进行所述比对。

图2显示了由3种酶RasADH、pCR6(L417M)和AlaDH(D196A/L197R)催化异山梨醇和铵盐的反应96 h以后的FMOC/HPLC分析。所述图显示了：(a) 标准品(各1 mM的根据图3的氨基醇I、II、III和IV + 各1 mM的二胺DAI、DAS和DAM)，(b)由RasADH、pCR6(L417M)和AlaDH(D196A/L197R)催化反应96 h以后，(c)与(b)相同但是不含RasADH对照反应96 h以后。对于衍生化，将20μl各反应样品转移至含有60μl 0.5 M硼酸钠pH 9.0的HPLC瓶中，混合均匀，并加入80μl FMOC试剂(Alltech Grom)。通过加入100μl EVA试剂(Alltech Grom)，捕集多余过量的FMOC试剂。通过加入440μl 50 mM醋酸钠pH 4.2 + 70% 乙腈(v/v)，建立HPLC分析条件。色谱条件：Agilent SB-C8柱(4.6×150 mm)；流速：1 ml/min；注射体积：20μl；缓冲液A。50 mM乙酸钠pH 4.2 + 20% 乙腈(v/v)；缓冲液B：50 mM乙酸钠pH 4.2 + 95% 乙腈(v/v)；梯度：0 min 16% B，5 min 16% B，25 min 18% B，28 min 52% B，40 min 25% B。

图3显示了以下起始底物的化学式：异山梨醇(1,4:3,6-双脱水-D-山梨醇)，氨基醇的立体异构体(I至IV)和二胺终产物的立体异构形式(DAI: 2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-L-艾杜糖醇, DAS: 2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-D-山梨醇，和DAM: 2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-D-甘露醇。

图4显示了由FMOC/HPLC分析得到的在不同铵浓度下通过RasADH、pCR6(L417M)和AlaDH(D196A/L197R)催化的异山梨醇和乙酸铵的反应的单胺和二胺收率。反应条件：300 mM异山梨醇，2 mM NADP⁺，100 - 300 mM NH₄OAc，5 mM L-丙氨酸，0.3 mM PLP，132μM RasADH，40μM pCR6(L417M)，24μM AlaDH(D196A/L197R)，在25 mM Hepes/NaOH（pH 8.3）中在30℃温育。

图5显示了如根据实施例3在根据本发明的氧化和胺化仲醇三丙二醇时得到的样品的分析色谱图。箭头标记了代表氧化的和胺化的三丙二醇的峰。

实施例1：使用根据本发明的方法，与醇脱氢酶AlkJ相比，使用NAD⁺依赖性的醇脱氢酶的不同底物的胺化

底物：

使用的底物是环己醇(1)、(S)-辛烷-2-醇(2)和(S)-4-苯基丁-2-醇(3)。

酶：

丙氨酸脱氢酶：

在大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶。首先，制备过夜培养物，然后将其用于接种主要培养物(LB-氨苄西林培养基)。将细胞在摇床上在30℃和120 Upm温育24小时。然后，在无菌条件下加入IPTG (0.5 mM, 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷, Sigma)进行诱导，并将培养物在20℃振摇另外24小时。

将细胞离心出(8000 Upm, 20 min 4℃)，洗涤，并抛弃上清液。然后使用超声(1 s脉冲, 4 s暂停，时间：10 min, 振幅: 40%)破碎细胞，将混合物离心(20 min, 18000 Upm, 4℃)，并使用His-prep柱纯化酶。

嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶 ( ADH-hT; P42328.1))

为了制备嗜热脂肪芽孢杆菌的NAD⁺依赖性的醇脱氢酶(Fiorentino G, Cannio R, Rossi M, Bartolucci S: Decreasing the stability and changing the substrate specificity of the Bacillus stearothermophilus alcohol dehydrogenase by single amino acid replacements. Protein Eng 1998, 11: 925-930)，首先制备过夜培养物(10 ml LB/氨苄西林培养基, 氨苄西林100μg/ml, 30℃, 120 Upm)，然后将其用于接种培养容器，再将其在37℃和120 Upm振摇约12小时。将细胞离心出(8000 Upm, 20分钟, 4℃)，洗涤，抛弃上清液，并将沉淀物冻干。最后，使用超声(1 s脉冲，4 s暂停，时间：10 min，振幅：40%)破碎细胞，并将混合物离心(20 min, 18000 Upm, 4℃)和用作粗提取物。借助SDS-PAGE估测蛋白浓度。

AlkJ-醇脱氢酶(得自食油假单胞菌（ Pseudomonas oleovirans ）Gpo1)：

除了使用质粒pTZE03_AlkJ (SEQ ID NO 20)和使用卡那霉素作为抗生素(50μg/ml)以外，在与嗜热脂肪芽孢杆菌的醇脱氢酶相同的条件下制备该酶。同样借助SDS-PAGE估测蛋白浓度。

得自青紫色素杆菌的转氨酶CV-ωTA：

为了从青紫色素杆菌制备CV-ωTA(U. Kaulmann, K. Smithies, M. E. B. Smith, H. C. Hailes, J. M. Ward, Enzyme Microb. Technol. 2007, 41, 628-637; b) M. S. Humble, K. E. Cassimjee, M. H?kansson, Y. R. Kimbung, B. Walse, V. Abedi, H.-J. Federsel, P. Berglund, D. T. Logan, FEBS Journal 2012, 279, 779-792; c) D. Koszelewski, M. G?ritzer, D. Clay, B. Seisser, W. Kroutil, ChemCatChem 2010, 2, 73-77)，首先制备过夜培养物(LB/氨苄西林培养基, 30℃, 120 rpm)，然后将其用于接种含有相同培养基的培养瓶，将其在37℃和120 Upm下振摇约3小时，直到达到在600 nm为0.7的光密度。然后，加入IPTG储备溶液(0.5 mM)，在20℃和120 Upm诱导3小时。将细胞离心出，抛弃上清液，并在4℃储存细胞。最后，使用超声(1 s脉冲，4 s暂停，时间：10 min，振幅：40%)破碎细胞，将混合物离心(20 min, 18000 Upm, 4℃)，并将上清液用作粗提取物。

实验操作：

实验溶液描述在表1中。

表1:实验溶液

实验溶液	ADH-hT或AlkJ (粗制物)	200μl
			转氨酶	200μl
	AlaDH	10μl (250 U)
			L-丙氨酸	250 mM
	NAD⁺	2 mM
			NH₄Cl	21 mg (500μmol)
	PLP	0.5 mM
			6 M NaOH	7.5μl
	H₂O/共溶剂	400μl
			底物	50μmol

			最终pH	8.5
	总体积	1.22 mL

将底物溶解在适当量的共溶剂(DME)中，并加入溶解在300μl水中的L-丙氨酸。在75μl水中，加入氯化铵。加入各自溶解在25μl水中的NAD⁺和PLP。通过加入7.5μl 6 M NaOH溶液，调节pH-值。加入转氨酶和丙氨酸脱氢酶。通过加入醇脱氢酶，开始反应。22小时以后，通过加入下述的衍生化试剂，停止反应。

胺的衍生化：

将200μl三乙胺和ESOF (琥珀酰亚胺基氧基甲酸乙酯) (80或40 mg)在乙腈(500μl)中的溶液加入到500μl样品中。然后将样品在45℃振摇1小时，然后用二氯甲烷萃取，经硫酸钠干燥，并使用GC-MS测量。如果不采用丙氨酸脱氢酶，则在pH 8.5(通过加入NaOH来调节)下向水溶液中加入L-丙氨酸(500 mM)、NAD⁺ (2 mM)和PLP (0.5 mM) 和在DME中的底物(120μl, 25 mM)。通过加入各200μl的醇脱氢酶(NAD⁺依赖性的)或AlkJ)和转氨酶，开始反应。将样品在25℃和300 Upm振摇24小时。将样品如上所述进行处理，并用GC-MS进行分析。

结果：

n.d. 未测出。

总结：

对于一系列在结构上不同的仲醇，在每种情况下表明，与使用醇脱氢酶AlkJ相比，使用嗜热脂肪芽孢杆菌的NAD⁺依赖性的醇脱氢酶会显著更有效地进行反应。

实施例2：通过醇脱氢酶、转氨酶和丙氨酸脱氢酶的偶联酶反应由异山梨醇和铵盐合成单胺和二胺

下述实施例显示了使用另一种在结构上不同的底物和NADP+依赖性的醇脱氢酶的根据本发明教导的操作。

使用质粒pEam-RasADH (Lavandera等人(2008) J. Org. Chem. 73, 6003-6005)的寡脱氧核苷酸ADHfw (SEQ ID NO: 35)和ADHrv (SEQ ID NO: 36)，通过PCR扩增得自罗尔斯通氏菌属的醇脱氢酶的结构基因(SEQ ID NO: 25)，用限制性内切酶KpnI在3’-末端处切割，最后与已经使用限制性内切酶EheI和KpnI切割的表达载体pASK-IBA35(+)连接。通过分析限制消化和DNA测序，验证得到的表达质粒pASK-IBA35(+)-RasADH，在其上面编码具有N-端His₆-标签的醇脱氢酶。

使用质粒pET21a(+)-pCR6的寡脱氧核苷酸pCR6fw (SEQ ID NO: 38)和pCR6rv (SEQ ID NO: 39)，通过PCR扩增得自脱氮副球菌的转氨酶的基因(SEQ ID NO: 37)，使用限制性内切酶HindIII在3’-末端处切割，并最后与已经使用限制性内切酶EheI和HindIII切割的表达载体pASK-IBA35(+)连接。通过分析限制消化以及DNA测序，验证得到的表达质粒pASK-IBA35(+)-pCR6，在其上面编码具有N-端His₆-标签的转氨酶。使用寡脱氧核苷酸pCR6_L417Mfw (SEQ ID NO: 20)和pCR6_L417Mrv (SEQ ID NO: 41)，根据QuikChange-方法(Agilent, Waldbronn)借助质粒pASK-IBA35(+)-pCR6的定位诱变，制备编码转氨酶的酶变体L417M的质粒。借助DNA测序，验证得到的表达质粒pASK-IBA35(+)-pCR6(L417M)。

使用pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R)作为得自枯草芽孢杆菌的AlaDH(SEQ ID NO: 21)的D196A/L197R突变体的表达质粒。

然后将所述3种酶的表达质粒pASK-IBA35(+)-RasADH、pASK-IBA35(+)-pCR6(L417M)和pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R)用于转化大肠杆菌BL21。在每种情况下，在含有100 μg/ml氨苄西林的LB培养介质(在5L摇瓶中2 L培养体积)中在30℃在OD₅₅₀ = 0.5的指数生长期，通过加入0.2μg/ml aTc来诱导3种得到的菌株的基因表达。3 h的诱导时间以后，收获培养物，并将细胞溶解于40 mM Hepes/NaOH pH 7.5、0.5 M NaCl中，并在弗氏压碎匀浆器中机械破碎。将澄清的上清液施加在载有Zn²⁺的Chelating Sepharose?Fast Flow柱上，并使用线性咪唑/HCl浓度梯度（0-500 mM，在40 mM Hepes/NaOH pH 7.5、0.5 M NaCl中）洗脱与His₆标签融合的酶。通过超滤浓缩洗脱级分，并介质凝胶过滤在Superdex200上在25 mM Hepes/NaOH pH 8.3存在下进行色谱纯化。

将3种经纯化的酶直接用于胺化异山梨醇(1,4:3,6-双脱水-D-山梨醇)，回收氧化还原因子NADP⁺和L-丙氨酸。酶试验的组成如下：

试剂或酶	在溶液中的终浓度
		Hepes/NaOH缓冲液pH 8.3	25 mM
异山梨醇	300 mM
		NADP⁺	2 mM
L-丙氨酸	5 mM
		磷酸吡哆醛(PLP)	0.3 mM
乙酸铵(NH₄OAc)	100 - 300 mM
		醇脱氢酶	132μM
转氨酶(L417M)	40μM
		丙氨酸脱氢酶(D196A/L197R)	24μM
总体积	250μl

在30℃温育0-96 h的时段以后，通过加入过量的FMOC试剂(Alltech Grom, Rottenburg-Hailfingen)，通过具有荧光检测器的HPLC (Agilent 1200系列；参见图2)检测并定量作为反应产物的单胺和二胺的形成。

因此，使用异山梨醇也能够显示出根据本发明的氧化和胺化。这证实了在广谱底物上也能实现根据本发明的教导。

实施例3：三丙二醇的氧化和胺化

除了不含转氨酶的空白样品以外，向含有1 mM NAD+、1 mM PLP、5当量的L-丙氨酸、4当量的氯化铵、50 mM三丙二醇的缓冲溶液(1 ml 50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.5)中，加入得自赤红球菌的丙氨酸脱氢酶(300μl/样品，经过热处理)，20μl得自河流弧菌、巨大芽孢杆菌、节杆菌属、青紫色素杆菌的转氨酶和pCR6。然后将样品在30℃和450 Upm下温育24小时。

对于后处理，将样品在微波中在600 W加热大约15秒，然后离心。进行如在实施例1中所述的检测。

使用三丙二醇作为仲醇也能够检测氧化和胺化产物的形成。这证实了在广谱底物上可实现根据本发明的教导。

参考文献：

序列表

<110> Evonik Degussa GmbH

<120> 醇的氧化

<130> 2011E00340DE

<160> 43

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 1

Val Val Ala Ala Arg Trp Leu Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala

1 5 10 15

Asp Lys Val Ala Ala Phe Val Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Val Ile Val Pro Pro Ala Thr Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys

35 40 45

Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu Val Ala

50 55

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 2

Ala His Cys Val Ala Glu Leu Glu Ala Leu Ile Glu Arg Glu Gly Ala

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly Glu Pro Ile Leu Gly Thr Gly Gly

20 25 30

Ile Val Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Trp Glu Ala Ile Gln Thr Val Leu

35 40 45

Asn Lys His Asp Ile Leu Leu Val Ala

50 55

<210> 3

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 3

Gln His Cys Ala Asp Lys Leu Glu Glu Met Ile Leu Ala Glu Gly Pro

1 5 10 15

Glu Thr Ile Ala Ala Phe Ile Gly Glu Pro Ile Leu Gly Thr Gly Gly

20 25 30

Ile Val Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Trp Glu Lys Ile Gln Ala Val Leu

35 40 45

Lys Lys Tyr Asp Val Leu Leu Val Ala

50 55

<210> 4

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 4

Asp Asp Leu Val Gln Glu Phe Glu Asp Arg Ile Glu Ser Leu Gly Pro

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ala Ala Phe Leu Ala Glu Pro Ile Leu Ala Ser Gly Gly

20 25 30

Val Ile Ile Pro Pro Ala Gly Tyr His Ala Arg Phe Lys Ala Ile Cys

35 40 45

Glu Lys His Asp Ile Leu Tyr Ile Ser

50 55

<210> 5

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 5

Ala Glu Leu Ala Asn Glu Leu Glu Arg Ile Val Ala Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Val Ala Gly Ser Thr Gly

20 25 30

Val Ile Leu Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Gln Lys Leu Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Thr Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 6

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 6

Ala Glu Leu Ala Asn Glu Leu Glu Arg Ile Val Ala Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Val Ala Gly Ser Thr Gly

20 25 30

Val Ile Leu Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Gln Lys Leu Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Thr Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 7

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 7

Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Ile Ala Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ala Gly Ser Thr Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Lys Gly Tyr Leu Glu Lys Leu Arg Glu Ile Thr

35 40 45

Ala Arg His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 8

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 8

Ala His Leu Ala Asp Glu Leu Glu Arg Ile Val Ala Leu His Asp Pro

1 5 10 15

Ser Thr Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Leu Ala Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Val Gly Tyr Leu Asp Lys Leu Arg Glu Ile Thr

35 40 45

Thr Lys His Gly Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 9

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 9

Val Glu Leu Ala Asn Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Asn Ile Ala Ala Val Ile Val Glu Pro Met Ser Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Val Gly Tyr Leu Gln Arg Leu Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Asp Gln His Asn Ile Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 10

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 10

Ile Ala Leu Ala Asp Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Leu His Asp Ala

1 5 10 15

Ser Asn Ile Ala Ala Val Phe Val Glu Pro Leu Ala Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Val Leu Val Pro Pro Glu Gly Tyr Leu Lys Arg Asn Arg Glu Ile Cys

35 40 45

Asn Gln His Asn Ile Leu Leu Val Phe

50 55

<210> 11

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 11

Pro Ala Tyr Ser Ala Ala Phe Glu Ala Gln Leu Ala Gln His Ala Gly

1 5 10 15

Glu Leu Ala Ala Val Val Val Glu Pro Val Val Gln Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Met Arg Phe His Asp Pro Arg Tyr Leu His Asp Leu Arg Asp Ile Cys

35 40 45

Arg Arg Tyr Glu Val Leu Leu Ile Phe

50 55

<210> 12

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 12

Glu Arg Asp Met Val Gly Phe Ala Arg Leu Met Ala Ala His Arg His

1 5 10 15

Glu Ile Ala Ala Val Ile Ile Glu Pro Ile Val Gln Gly Ala Gly Gly

20 25 30

Met Arg Met Tyr His Pro Glu Trp Leu Lys Arg Ile Arg Lys Ile Cys

35 40 45

Asp Arg Glu Gly Ile Leu Leu Ile Ala

50 55

<210> 13

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 13

Asp Gln Cys Leu Arg Glu Leu Ala Gln Leu Leu Glu Glu His His Glu

1 5 10 15

Glu Ile Ala Ala Leu Ser Ile Glu Ser Met Val Gln Gly Ala Ser Gly

20 25 30

Met Ile Val Met Pro Glu Gly Tyr Leu Ala Gly Val Arg Glu Leu Cys

35 40 45

Thr Thr Tyr Asp Val Leu Met Ile Val

50 55

<210> 14

<211> 54

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 14

Ala Asn Glu Ile Asp Arg Ile Met Thr Trp Glu Leu Ser Glu Thr Ile

1 5 10 15

Ala Gly Val Ile Met Glu Pro Ile Ile Thr Gly Gly Gly Ile Leu Met

20 25 30

Pro Pro Asp Gly Tyr Met Lys Lys Val Glu Asp Ile Cys Arg Arg His

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Ile Cys

50

<210> 15

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 15

Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu Asn Tyr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln Gly Ala Gly Ser

20 25 30

Ala Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Phe Arg Lys Met Thr Lys

35 40 45

Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Asn

50 55

<210> 16

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 16

Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu Asn Tyr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln Gly Ala Gly Ser

20 25 30

Ala Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Ile Pro Gln Ile Arg Lys Met Thr Lys

35 40 45

Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Asn

50 55

<210> 17

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 17

Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu Asn Tyr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln Gly Val Gly Ser

20 25 30

Thr Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Val Pro Gln Ile Arg Lys Met Thr Lys

35 40 45

Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Ser

50 55

<210> 18

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 18

Lys Tyr Ala Ser Asp Val His Asp Leu Ile Gln Phe Gly Thr Ser Gly

1 5 10 15

Gln Val Ala Gly Phe Ile Gly Glu Ser Ile Gln Gly Val Gly Gly Ile

20 25 30

Val Glu Leu Ala Pro Gly Tyr Leu Pro Ala Ala Tyr Asp Ile Val Arg

35 40 45

Lys Ala Gly Gly Val Cys Ile Ala

50 55

<210> 19

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 序列部分

<400> 19

Leu Ala Glu Leu Asp Tyr Ala Phe Asp Leu Ile Asp Arg Gln Ser Ser

1 5 10 15

Gly Asn Leu Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Leu Ser Ser Gly Gly

20 25 30

Ile Ile Glu Leu Pro Asp Gly Tyr Met Ala Ala Leu Lys Arg Lys Cys

35 40 45

Glu Ala Arg Gly Met Leu Leu Ile Leu

50 55

<210> 20

<211> 6949

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒 ptZE03_aLKj

<400> 1

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacg atgtacgact atataatcgt tggtgctgga 5100

tctgcaggat gtgtgcttgc taatcgtctt tcggccgacc cctctaaaag agtttgttta 5160

cttgaagctg ggccgcgaga tacgaatccg ctaattcata tgccgttagg tattgctttg 5220

ctttcaaata gtaaaaagtt gaattgggct tttcaaactg cgccacagca aaatctcaac 5280

ggccggagcc ttttctggcc acgaggaaaa acgttaggtg gttcaagctc aatcaacgca 5340

atggtctata tccgagggca tgaagacgat taccacgcat gggagcaggc ggccggccgc 5400

tactggggtt ggtaccgggc tcttgagttg ttcaaaaggc ttgaatgcaa ccagcgattc 5460

gataagtccg agcaccatgg ggttgacgga gaattagctg ttagtgattt aaaatatatc 5520

aatccgctta gcaaagcatt cgtgcaagcc ggcatggagg ccaatattaa tttcaacgga 5580

gatttcaacg gcgagtacca ggacggcgta gggttctatc aagtaaccca aaaaaatgga 5640

caacgctgga gctcggcgcg tgcattcttg cacggtgtac tttccagacc aaatctagac 5700

atcattactg atgcgcatgc atcaaaaatt ctttttgaag accgtaaggc ggttggtgtt 5760

tcttatataa agaaaaatat gcaccatcaa gtcaagacaa cgagtggtgg tgaagtactt 5820

cttagtcttg gcgcagtcgg cacgcctcac cttctaatgc tttctggtgt tggggctgca 5880

gccgagctta aggaacatgg tgtttctcta gtccatgatc ttcctgaggt ggggaaaaat 5940

cttcaagatc atttggacat cacattgatg tgcgcagcaa attcgagaga gccgataggt 6000

gttgctcttt ctttcatccc tcgtggtgtc tcgggtttgt tttcatatgt gtttaagcgc 6060

gaggggtttc tcactagtaa cgtggcagag tcgggtggtt ttgtaaaaag ttctcctgat 6120

cgtgatcggc ccaatttgca gtttcatttc cttccaactt atcttaaaga tcacggtcga 6180

aaaatagcgg gtggttatgg ttatacgcta catatatgtg atcttttgcc taagagccga 6240

ggcagaattg gcctaaaaag cgccaatcca ttacagccgc ctttaattga cccgaactat 6300

cttagcgatc atgaagatat taaaaccatg attgcgggta ttaagatagg gcgcgctatt 6360

ttgcaggccc catcgatggc gaagcatttt aagcatgaag tagtaccggg ccaggctgtt 6420

aaaactgatg atgaaataat cgaagatatt cgtaggcgag ctgagactat ataccatccg 6480

gtaggtactt gtaggatggg taaagatcca gcgtcagttg ttgatccgtg cctgaagatc 6540

cgtgggttgg caaatattag agtcgttgat gcgtcaatta tgccgcactt ggtcgcgggt 6600

aacacaaacg ctccaactat tatgattgca gaaaatgcgg cagaaataat tatgcggaat 6660

cttgatgtgg aagcattaga ggctagcgct gagtttgctc gcgagggtgc agagctagag 6720

ttggcctggc gcgccctcga gggatcccac gtgctggtgc cgcgtggcag cgcggccgca 6780

ctggagcacc accaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag 6840

gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct 6900

aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 6949

<210> 21

<211> 378

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 21

Met Ile Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ala Leu Thr Pro Gly Gly Val Ser Gln Leu Ile Ser Asn Gly His Arg

20 25 30

Val Leu Val Glu Thr Gly Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe Glu Asn Glu

35 40 45

Ala Tyr Glu Ser Ala Gly Ala Glu Ile Ile Ala Asp Pro Lys Gln Val

50 55 60

Trp Asp Ala Glu Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Pro Glu Glu

65 70 75 80

Tyr Val Tyr Phe Arg Lys Gly Leu Val Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu

85 90 95

Ala Ala Glu Pro Glu Leu Ala Gln Ala Leu Lys Asp Lys Gly Val Thr

100 105 110

Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val Ser Glu Gly Arg Thr Leu Pro Leu Leu

115 120 125

Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Ile Gly Ala

130 135 140

Gln Phe Leu Glu Lys Pro Lys Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ala Gly

145 150 155 160

Val Pro Gly Val Ser Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Val

165 170 175

Val Gly Thr Asn Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp Val

180 185 190

Thr Ile Ile Ala Arg Asn Ala Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp Ile

195 200 205

Phe Gly His Gln Ile Lys Thr Leu Ile Ser Asn Pro Val Asn Ile Ala

210 215 220

Asp Ala Val Ala Glu Ala Asp Leu Leu Ile Cys Ala Val Leu Ile Pro

225 230 235 240

Gly Ala Lys Ala Pro Thr Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys Gln Met

245 250 255

Lys Pro Gly Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly Ile

260 265 270

Val Glu Thr Val Asp His Ile Thr Thr His Asp Gln Pro Thr Tyr Glu

275 280 285

Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val

290 295 300

Pro Arg Thr Ser Thr Ile Ala Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr Ala

305 310 315 320

Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Asn Thr

325 330 335

Ala Leu Arg Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asn Gly His Val Thr Tyr Glu

340 345 350

Ala Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Pro Ala Glu Lys Ala

355 360 365

Leu Gln Asp Glu Ser Ser Val Ala Gly Ala

370 375

<210> 22

<211> 1137

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 22

atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60

gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120

cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180

ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240

tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300

gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360

gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420

caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480

gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540

gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgcccg taacgcagac 600

cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660

gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720

ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780

gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840

acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900

ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960

ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020

ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080

gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaa 1137

<210> 23

<211> 353

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 23

Met Leu Tyr Thr Ser Gln Thr Thr Pro Glu Lys Asp Gln Lys Met Ser

1 5 10 15

Met Ile Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Val

20 25 30

Tyr Glu Tyr Asp Pro Gly Glu Leu Arg Pro Gln Asp Val Glu Val Gln

35 40 45

Val Asp Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu Ser Met Ile Asp Asn

50 55 60

Glu Trp Gly Phe Ser Gln Tyr Pro Leu Val Ala Gly His Glu Val Ile

65 70 75 80

Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Ser Ala Ala Gln Asp Lys Gly Leu Gln

85 90 95

Val Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Arg Ser Cys Gly His

100 105 110

Cys Asp Ala Cys Ile Ser Gly Asn Gln Ile Asn Cys Glu Gln Gly Ala

115 120 125

Val Pro Thr Ile Met Asn Arg Gly Gly Phe Ala Glu Lys Leu Arg Ala

130 135 140

Asp Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Glu Asn Ile Asp Ile Glu Ser

145 150 155 160

Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe Lys Pro Leu Leu

165 170 175

Met His His Ile Thr Ala Thr Ser Arg Val Gly Val Ile Gly Ile Gly

180 185 190

Gly Leu Gly His Ile Ala Ile Lys Leu Leu His Ala Met Gly Cys Glu

195 200 205

Val Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Gln Glu Val Leu Ala

210 215 220

Met Gly Ala Asp Lys Val Val Asn Ser Arg Asp Pro Gln Ala Leu Lys

225 230 235 240

Ala Leu Ala Gly Gln Phe Asp Leu Ile Ile Asn Thr Val Asn Val Ser

245 250 255

Leu Asp Trp Gln Pro Tyr Phe Glu Ala Leu Thr Tyr Gly Gly Asn Phe

260 265 270

His Thr Val Gly Ala Val Leu Thr Pro Leu Ser Val Pro Ala Phe Thr

275 280 285

Leu Ile Ala Gly Asp Arg Ser Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Pro

290 295 300

Tyr Glu Leu Arg Lys Leu Met Arg Phe Ala Ala Arg Ser Lys Val Ala

305 310 315 320

Pro Thr Thr Glu Leu Phe Pro Met Ser Lys Ile Asn Asp Ala Ile Gln

325 330 335

His Val Arg Asp Gly Lys Ala Arg Tyr Arg Val Val Leu Lys Ala Asp

340 345 350

Phe

<210> 24

<211> 349

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 24

Met Lys Ile Lys Ala Val Gly Ala Tyr Ser Ala Lys Gln Pro Leu Glu

1 5 10 15

Pro Met Asp Ile Thr Arg Arg Glu Pro Gly Pro Asn Asp Val Lys Ile

20 25 30

Glu Ile Ala Tyr Cys Gly Val Cys His Ser Asp Leu His Gln Val Arg

35 40 45

Ser Glu Trp Ala Gly Thr Val Tyr Pro Cys Val Pro Gly His Glu Ile

50 55 60

Val Gly Arg Val Val Ala Val Gly Asp Gln Val Glu Lys Tyr Ala Pro

65 70 75 80

Gly Asp Leu Val Gly Val Gly Cys Ile Val Asp Ser Cys Lys His Cys

85 90 95

Glu Glu Cys Glu Asp Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Asp His Met Thr Gly

100 105 110

Thr Tyr Asn Ser Pro Thr Pro Asp Glu Pro Gly His Thr Leu Gly Gly

115 120 125

Tyr Ser Gln Gln Ile Val Val His Glu Arg Tyr Val Leu Arg Ile Arg

130 135 140

His Pro Gln Glu Gln Leu Ala Ala Val Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly

145 150 155 160

Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Arg His Trp Gln Ala Gly Pro Gly Lys

165 170 175

Lys Val Gly Val Val Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Met Gly Ile Lys

180 185 190

Leu Ala His Ala Met Gly Ala His Val Val Ala Phe Thr Thr Ser Glu

195 200 205

Ala Lys Arg Glu Ala Ala Lys Ala Leu Gly Ala Asp Glu Val Val Asn

210 215 220

Ser Arg Asn Ala Asp Glu Met Ala Ala His Leu Lys Ser Phe Asp Phe

225 230 235 240

Ile Leu Asn Thr Val Ala Ala Pro His Asn Leu Asp Asp Phe Thr Thr

245 250 255

Leu Leu Lys Arg Asp Gly Thr Met Thr Leu Val Gly Ala Pro Ala Thr

260 265 270

Pro His Lys Ser Pro Glu Val Phe Asn Leu Ile Met Lys Arg Arg Ala

275 280 285

Ile Ala Gly Ser Met Ile Gly Gly Ile Pro Glu Thr Gln Glu Met Leu

290 295 300

Asp Phe Cys Ala Glu His Gly Ile Val Ala Asp Ile Glu Met Ile Arg

305 310 315 320

Ala Asp Gln Ile Asn Glu Ala Tyr Glu Arg Met Leu Arg Gly Asp Val

325 330 335

Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Asn Arg Thr Leu Thr Asp

340 345

<210> 25

<211> 789

<212> DNA

<213> 罗尔斯通氏菌属

<400> 25

atggctagca gaggatcgca tcaccatcac catcacggcg cctatcgact attaaacaaa 60

acagccgtca taaccggtgg aaacagcggc attggcctcg ccacagcgaa gcgcttcgtt 120

gccgagggtg cctatgtatt cattgtcggt cgccggcgga aggaactcga gcaggcggcc 180

gcagaaatcg gtcggaatgt cacggcggtc aaagccgatg tgacaaagct tgaagacctg 240

gaccgacttt acgcgattgt gcgtgagcaa cggggtagca tcgacgtact atttgcgaat 300

tccggcgcaa tcgagcaaaa gacgcttgag gagattactc cggaacacta tgacaggact 360

ttcgatgtca acgttcgggg attgatcttc accgtgcaga aggcacttcc tctgctgcga 420

gacggcggca gcgtgatcct gacaagctcg gtagccggcg tcctaggatt acaggcgcac 480

gacacgtata gtgccgccaa ggcagcggta aggtcgctcg cgaggacatg gaccactgag 540

ttgaaaggtc gcagcattcg tgtcaacgcg gtaagcccag gggcgatcga cacgcctatc 600

atagaaaacc aggtctctac acaggaagaa gctgacgagc tgcgtgcgaa atttgcagct 660

gcgacgcccc tgggtcgcgt cggacgacct gaagagctgg cagcggccgt gttatttctt 720

gcatcggacg acagtagcta cgtagccggc attgagctgt ttgtggacgg tggattgacc 780

caggtctaa 789

<210> 26

<211> 459

<212> PRT

<213> 青紫色素杆菌 ATCC 12472

<400> 26

Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala

1 5 10 15

His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu

35 40 45

Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val

85 90 95

Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp

100 105 110

Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile

115 120 125

Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys

130 135 140

Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly

180 185 190

Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu

195 200 205

Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val

210 215 220

Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys

290 295 300

Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val

325 330 335

Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile

340 345 350

Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu

355 360 365

His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu

370 375 380

Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile

385 390 395 400

Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg

405 410 415

Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg

420 425 430

Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu

435 440 445

Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala

450 455

<210> 27

<211> 452

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 27

Met Ser Glu Gln Asn Ser Gln Thr Gln Ala Trp Gln Ala Leu Ser Arg

1 5 10 15

Asp His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Val Lys Gln Leu Ala Glu Lys

20 25 30

Gly Pro Arg Ile Ile Thr Ser Ala Lys Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser

35 40 45

Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala Ser Gln Gln Met

65 70 75 80

Lys Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro

85 90 95

Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Gln Gly Met

100 105 110

Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Val

115 120 125

Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Lys Lys Asn Lys

130 135 140

Asn Val Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Val Ala

145 150 155 160

Gly Ala Ala Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His Gln Gln Gly Gly Val

165 170 175

Ile Pro Asp Ile Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu Gly

180 185 190

Gly Asp Met Thr Glu Ala Asp Phe Gly Val Trp Ala Ala Glu Gln Leu

195 200 205

Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Val Asp Asn Val Ala Ala Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Gln Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Arg Tyr Asp Ile Leu Phe

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly Thr Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Leu Met Thr Ile Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Ile Val Arg Asp

290 295 300

Glu Val Ala Lys Val Ile Ser Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Gly Leu Glu Asn Leu

325 330 335

Arg Ile Leu Arg Asp Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val His Asp Lys Thr

340 345 350

Ala Pro Tyr Leu Gln Gln Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asp His Pro Leu

355 360 365

Val Gly Glu Val Arg Gly Leu Gly Met Leu Gly Ala Ile Glu Leu Val

370 375 380

Lys Asp Lys Ala Thr Arg Ala Arg Tyr Glu Gly Lys Gly Val Gly Met

385 390 395 400

Ile Cys Arg Gln His Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala Val

405 410 415

Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser Val Glu Glu

420 425 430

Ile Asp Glu Leu Val Gln Lys Ala Arg Lys Cys Leu Asp Leu Thr Tyr

435 440 445

Glu Ala Val Arg

450

<210> 28

<211> 452

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 28

Met Ser Glu Gln Asn Ser Gln Thr Gln Ala Trp Gln Ala Leu Ser Arg

1 5 10 15

Asp His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Val Lys Gln Leu Ala Glu Lys

20 25 30

Gly Pro Arg Ile Ile Thr Ser Ala Lys Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser

35 40 45

Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala Ser Gln Gln Met

65 70 75 80

Lys Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro

85 90 95

Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Gln Gly Met

100 105 110

Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Val

115 120 125

Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Lys Lys Asn Lys

130 135 140

Asn Val Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Val Ala

145 150 155 160

Gly Ala Ala Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His Gln Gln Gly Gly Val

165 170 175

Ile Pro Asp Ile Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu Gly

180 185 190

Gly Asp Met Thr Glu Ala Asp Phe Gly Val Trp Ala Ala Glu Gln Leu

195 200 205

Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Val Asp Asn Val Ala Ala Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Gln Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Arg Tyr Asp Ile Leu Phe

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly Thr Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Leu Met Thr Ile Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Ile Val Arg Asp

290 295 300

Glu Val Ala Lys Val Ile Ser Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Gly Leu Glu Asn Leu

325 330 335

Arg Ile Leu Arg Asp Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val His Asp Lys Thr

340 345 350

Ala Pro Tyr Leu Gln Gln Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asp His Pro Leu

355 360 365

Val Gly Glu Val Arg Gly Leu Gly Met Leu Gly Ala Ile Glu Leu Val

370 375 380

Lys Asp Lys Ala Thr Arg Ala Arg Tyr Glu Gly Lys Gly Val Gly Met

385 390 395 400

Ile Cys Arg Gln His Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala Val

405 410 415

Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser Val Glu Glu

420 425 430

Ile Asp Glu Leu Val Gln Lys Ala Arg Lys Cys Leu Asp Leu Thr Tyr

435 440 445

Glu Ala Val Arg

450

<210> 29

<211> 453

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 29

Met Ser Val Asn Asn Pro Gln Thr Arg Glu Trp Gln Thr Leu Ser Gly

1 5 10 15

Glu His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Tyr Lys Gln Leu Lys Glu Lys

20 25 30

Gly Pro Arg Ile Ile Thr Lys Ala Gln Gly Val His Leu Trp Asp Ser

35 40 45

Glu Gly His Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Glu Lys Gln Met

65 70 75 80

Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro

85 90 95

Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Thr Asp Val Ala Pro Gln Gly Met

100 105 110

Thr His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Val

115 120 125

Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Lys Pro His Lys

130 135 140

Gln Thr Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Phe Ala

145 150 155 160

Gly Ala Cys Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His Glu Gln Gly Gly Leu

165 170 175

Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu

180 185 190

Gly Gly Asp Met Thr Pro Asp Ala Phe Gly Val Trp Ala Ala Glu Gln

195 200 205

Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Asp Asn Val Ala Ala Phe

210 215 220

Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Glu

225 230 235 240

Thr Tyr Trp Pro Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp Ile Leu

245 250 255

Phe Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp

260 265 270

Phe Gly Ser Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Leu Met Thr Ile Ala

275 280 285

Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Ile Val Arg

290 295 300

Asp Thr Val Ala Lys Val Ile Ser Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly

305 310 315 320

Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Gly Leu Glu Asn

325 330 335

Leu Arg Ile Leu Arg Asp Glu Lys Ile Val Glu Lys Ala Arg Thr Glu

340 345 350

Ala Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His Pro

355 360 365

Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Leu Gly Met Leu Gly Ala Ile Glu Leu

370 375 380

Val Lys Asp Lys Ala Thr Arg Ser Arg Tyr Glu Gly Lys Gly Val Gly

385 390 395 400

Met Ile Cys Arg Thr Phe Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala

405 410 415

Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser His Ala

420 425 430

Glu Ile Asp Glu Leu Val Glu Lys Ala Arg Lys Cys Leu Asp Leu Thr

435 440 445

Leu Glu Ala Ile Asn

450

<210> 30

<211> 455

<212> PRT

<213> 球形红杆菌

<400> 10

Met Arg Asp Asp Ala Pro Asn Ser Trp Glu Ser Arg Ala Asp Ala Ser

1 5 10 15

Ser Phe Tyr Gly Phe Thr Asp Leu Pro Ser Val His Gln Arg Gly Thr

20 25 30

Val Val Leu Thr His Gly Lys Gly Pro Tyr Ile Tyr Asp Val His Gly

35 40 45

Arg Ala Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly

50 55 60

Phe Asp His Pro Gly Leu Ile Glu Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg

65 70 75 80

Phe Pro Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val

85 90 95

Met Leu Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Ala Arg Gly Arg

100 105 110

Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys

115 120 125

Met Leu Trp Phe Leu Gly Ala Ala Glu Gly His Pro Glu Arg Arg Lys

130 135 140

Ile Ile Thr Arg Val Asn Ser Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala

145 150 155 160

Ser Met Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Leu Phe Gly Leu Pro Leu Pro

165 170 175

Gly Phe Ile His Val Gly Cys Pro His Tyr Trp Arg Phe Gly Gln Ala

180 185 190

Gly Glu Thr Glu Ala Glu Phe Thr Gln Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu

195 200 205

Ala Thr Ile Ile Lys Glu Gly Pro Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala

210 215 220

Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ser Glu Gly Tyr

225 230 235 240

Phe Gln Ala Val Gln Pro Val Leu Lys Arg Tyr Gly Ile Pro Leu Ile

245 250 255

Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly

260 265 270

Cys Gln Thr Tyr Asp Phe Met Pro Asp Gly Ile Ile Ser Ser Lys Asn

275 280 285

Ile Thr Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu

290 295 300

Leu Ala Asp Arg Leu Gln Ala Ala Ser Glu Ala Val Glu Glu Phe Pro

305 310 315 320

His Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu

325 330 335

Lys Ala Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg

340 345 350

Ala Leu Thr Pro Lys Phe Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Leu Ala Glu Asn

355 360 365

Pro Asn Ile Gly Glu Trp Arg Gly Lys Gly Leu Met Gly Ala Leu Glu

370 375 380

Ala Val Lys Asp Lys Ala Thr Lys Thr Pro Phe Pro Gly Asp Leu Ser

385 390 395 400

Val Ser Glu Arg Ile Ala Asn Ser Cys Thr Asp His Gly Leu Ile Cys

405 410 415

Arg Pro Leu Gly Gln Ser Ile Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Met Thr

420 425 430

Glu Ala Gln Met Asp Glu Met Phe Glu Lys Leu Gly Ala Ala Leu Lys

435 440 445

Lys Val Phe Ala Glu Val Ala

450 455

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gccatcatag gggttcctaa aga 23

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

actgatggta ccttaagcac ccgccacaga 30

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

gtgacgatca ttgcccgtaa cgcagaccgc ttg 33

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

caagcggtct gcgttacggg caatgatcgt cac 33

<210> 35

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gcctatcgac tattaaacaa aacagcc 27

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

actgatggta ccttagacct gggtcaatcc 30

<210> 37

<211> 1401

<212> DNA

<213> 脱氮副球菌

<400> 37

atggctagca gaggatcgca tcaccatcac catcacggcg ccaaccaacc gcaaagctgg 60

gaagcccggg ccgagaccta ttcgctctac ggtttcaccg acatgccctc ggtccatcag 120

cggggcacgg tcgtcgtgac ccatggcgag gggccctata tcgtcgatgt ccatggccgc 180

cgctatctgg atgccaattc gggcctgtgg aacatggtcg cgggcttcga ccacaagggc 240

ctgatcgagg ccgccaaggc gcaatacgac cgctttcccg gctatcacgc ctttttcggc 300

cgcatgtccg accagaccgt gatgctgtcg gaaaagctgg tcgaggtctc gccattcgac 360

aacggccggg tcttctatac caattccggc tccgaggcga acgacaccat ggtcaagatg 420

ctgtggttcc tgcatgccgc cgagggcaag ccgcaaaagc gcaagatcct gacgcgctgg 480

aacgcctatc acggcgtgac cgcggtttcg gcctcgatga ccggcaagcc ctacaactcg 540

gtcttcggcc tgccgctgcc cggcttcatc cacctgacct gcccgcatta ctggcgctat 600

ggcgaggaag gcgagaccga ggcgcaattc gtcgcccgcc tggcacgcga gcttgaggat 660

accatcaccc gcgagggcgc cgacaccatc gccggcttct tcgccgagcc ggtgatgggc 720

gcgggggggg tgatcccgcc ggcgaagggt tatttccagg ccatcctgcc gatcttgcgc 780

aagtatgaca tcccgatgat ctcggacgag gtgatctgcg gcttcgggcg caccggcaac 840

acctggggct gcctgaccta cgacttcatg cccgatgcga tcatctcgtc caagaacctg 900

actgcgggct tcttcccgat gggcgccgtc atcctcgggc ccgacctcgc caagcgggtc 960

gaggccgcgg tcgaggcgat cgaggagttc ccgcacggct tcaccgcctc gggccatccg 1020

gtcggctgcg ccatcgcgct gaaggccatc gacgtggtga tgaacgaggg gctggccgag 1080

aatgtccgcc gcctcgcacc ccgcttcgag gcggggctga agcgcatcgc cgaccgcccg 1140

aacatcggcg aataccgcgg catcggcttc atgtgggcgc tggaggcggt caaggacaag 1200

ccgaccaaga cccccttcga cgccaatctt tcggtcagcg agcgcatcgc caatacctgc 1260

accgatctgg ggctgatctg ccggccgctg ggccagtcca tcgtgctgtg cccgcccttc 1320

atcctgaccg aggcgcagat ggacgagatg ttcgaaaagc tggaaaaggc gctcgacaag 1380

gtctttgccg aggtggccta a 1401

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

gccaaccaac cgcaaagctg gga 23

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

actgataagc ttttaggcca cctcggcaaa gac 33

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

ctgccggcca atgggccagt ccat 24

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

atggactggc ccattggccg gcag 24

<210> 42

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有His-标签的枯草芽孢杆菌蛋白

<400> 42

Met Ala Ser Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ala Ile Ile

1 5 10 15

Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val Ala Leu Thr

20 25 30

Pro Gly Gly Val Ser Gln Leu Ile Ser Asn Gly His Arg Val Leu Val

35 40 45

Glu Thr Gly Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe Glu Asn Glu Ala Tyr Glu

50 55 60

Ser Ala Gly Ala Glu Ile Ile Ala Asp Pro Lys Gln Val Trp Asp Ala

65 70 75 80

Glu Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Pro Glu Glu Tyr Val Tyr

85 90 95

Phe Arg Lys Gly Leu Val Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu Ala Ala Glu

100 105 110

Pro Glu Leu Ala Gln Ala Leu Lys Asp Lys Gly Val Thr Ala Ile Ala

115 120 125

Tyr Glu Thr Val Ser Glu Gly Arg Thr Leu Pro Leu Leu Thr Pro Met

130 135 140

Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Ile Gly Ala Gln Phe Leu

145 150 155 160

Glu Lys Pro Lys Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ala Gly Val Pro Gly

165 170 175

Val Ser Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Val Val Gly Thr

180 185 190

Asn Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp Val Thr Ile Ile

195 200 205

Ala Arg Asn Ala Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp Ile Phe Gly His

210 215 220

Gln Ile Lys Thr Leu Ile Ser Asn Pro Val Asn Ile Ala Asp Ala Val

225 230 235 240

Ala Glu Ala Asp Leu Leu Ile Cys Ala Val Leu Ile Pro Gly Ala Lys

245 250 255

Ala Pro Thr Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys Gln Met Lys Pro Gly

260 265 270

Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly Ile Val Glu Thr

275 280 285

Val Asp His Ile Thr Thr His Asp Gln Pro Thr Tyr Glu Lys His Gly

290 295 300

Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val Pro Arg Thr

305 310 315 320

Ser Thr Ile Ala Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr Ala Leu Gln Ile

325 330 335

Ala Asn Lys Gly Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Asn Thr Ala Leu Arg

340 345 350

Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asn Gly His Val Thr Tyr Glu Ala Val Ala

355 360 365

Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Pro Ala Glu Lys Ala Leu Gln Asp

370 375 380

Glu Ser Ser Val Ala Gly Ala

385 390

<210> 43

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有His-标签的枯草芽孢杆菌蛋白

<400> 43

atggctagca gaggatcgca tcaccatcac catcacggcg ccatcatagg ggttcctaaa 60

gagataaaaa acaatgaaaa ccgtgtcgca ttaacacccg ggggcgtttc tcagctcatt 120

tcaaacggcc accgggtgct ggttgaaaca ggcgcgggcc ttggaagcgg atttgaaaat 180

gaagcctatg agtcagcagg agcggaaatc attgctgatc cgaagcaggt ctgggacgcc 240

gaaatggtca tgaaagtaaa agaaccgctg ccggaagaat atgtttattt tcgcaaagga 300

cttgtgctgt ttacgtacct tcatttagca gctgagcctg agcttgcaca ggccttgaag 360

gataaaggag taactgccat cgcatatgaa acggtcagtg aaggccggac attgcctctt 420

ctgacgccaa tgtcagaggt tgcgggcaga atggcagcgc aaatcggcgc tcaattctta 480

gaaaagccta aaggcggaaa aggcattctg cttgccgggg tgcctggcgt ttcccgcgga 540

aaagtaacaa ttatcggagg aggcgttgtc gggacaaacg cggcgaaaat ggctgtcggc 600

ctcggtgcag atgtgacgat cattgcccgt aacgcagacc gcttgcgcca gcttgatgac 660

atcttcggcc atcagattaa aacgttaatt tctaatccgg tcaatattgc tgatgctgtg 720

gcggaagcgg atctcctcat ttgcgcggta ttaattccgg gtgctaaagc tccgactctt 780

gtcactgagg aaatggtaaa acaaatgaaa cccggttcag ttattgttga tgtagcgatc 840

gaccaaggcg gcatcgtcga aactgtcgac catatcacaa cacatgatca gccaacatat 900

gaaaaacacg gggttgtgca ttatgctgta gcgaacatgc caggcgcagt ccctcgtaca 960

tcaacaatcg ccctgactaa cgttactgtt ccatacgcgc tgcaaatcgc gaacaaaggg 1020

gcagtaaaag cgctcgcaga caatacggca ctgagagcgg gtttaaacac cgcaaacgga 1080

cacgtgacct atgaagctgt agcaagagat ctaggctatg agtatgttcc tgccgagaaa 1140

gctttacagg atgaatcatc tgtggcgggt gcttaa 1176

Claims

1.包括下述步骤的方法：

a) 提供仲醇，

b) 通过与NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶接触氧化所述仲醇，和

c) 使步骤a)的氧化产物与转氨酶接触，

2.根据权利要求1的方法，其中所述仲醇是选自以下的醇：α-羟基羧酸，环烷醇，优选双(对羟基环己基)甲烷，式R¹-CR²H-CR³H-OH的醇及其醚和聚醚，和仲烷醇，优选2-烷醇，

其中R¹选自羟基、烷氧基、氢和胺，R²选自烷基，优选甲基、乙基和丙基，和氢，且R³选自烷基，优选甲基、乙基和丙基。

3.根据权利要求2的方法，其中所述仲醇是下式的仲醇

H₃C-C(OH)H-(CH₂)_x-R⁴，

4.根据权利要求1的方法，其中通过用单加氧酶羟基化所述式的相应烷烃进行步骤a)，所述单加氧酶优选地是重组的或分离的。

5.根据权利要求1-4中的任一项的方法，其中所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶是具有至少一个锌原子作为辅因子的NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶。

6.根据权利要求5的方法，其中所述醇脱氢酶是赤红球菌的醇脱氢酶A (数据库代码AJ491307.1)或其变体。

7.根据权利要求4-6中的任一项的方法，其中所述单加氧酶选自：恶臭假单胞菌的AlkBGT，得自热带假丝酵母或得自鹰嘴豆的细胞色素P450。

8.根据权利要求1-7中的任一项的方法，其中所述转氨酶选自这样的转氨酶及其变体，其特征在于，在与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Val224对应的氨基酸序列的位置处，其具有选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸，且在与青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶(数据库代码NP_901695)的Gly230对应的氨基酸序列的位置处，其具有除了苏氨酸以外的氨基酸，且优选选自丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸，或者所述转氨酶选自：河流弧菌的转氨酶(AEA39183.1)、巨大芽孢杆菌的转氨酶(YP001374792.1)、脱氮副球菌的转氨酶(CP000490.1)及其变体。

9.根据权利要求1-8中的任一项的方法，其中在分离的或重组的丙氨酸脱氢酶和无机氮源存在下进行步骤b)和/或步骤c)。

10.根据权利要求1-9中的任一项的方法，其中由NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、单加氧酶和丙氨酸脱氢酶组成的组中的至少一种酶是重组的，且以具有相应酶的全细胞催化剂的形式提供。

11.根据权利要求10的方法，其中所有酶以一种或多种全细胞催化剂的形式提供，且优选地，一种全细胞催化剂具有所有必要的酶。

12.根据权利要求1-11中的任一项的方法，其中在步骤b)中，优选地在步骤b)和c)中，存在有机共溶剂，所述有机共溶剂具有大于-1.38、优选-0.5至1.2、还更优选-0.4至0.4的logP。

13.根据权利要求12的方法，其中所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，优选油酸。

14.根据权利要求13的方法，其中所述共溶剂是式R⁶-O-(CH₂)_x-O-R⁷的化合物，其中R⁶和R⁷各自且彼此独立地选自甲基、乙基、丙基和丁基，且x是1-4，其中优选地R⁶和R⁷各自是甲基且x是2。

15.全细胞催化剂，其具有NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶、转氨酶、任选的单加氧酶和任选的丙氨酸脱氢酶，所述NAD(P)⁺依赖性的醇脱氢酶优选地具有至少一个锌原子作为辅因子，其中所述酶是重组酶。

16.根据权利要求15的全细胞催化剂用于氧化和胺化仲醇的用途，其中所述仲醇优选地是下式的仲醇

H₃C-C(OH)H-(CH₂)_x-R⁴，

17.根据权利要求16的用途，进一步包括有机共溶剂的存在，所述有机共溶剂具有大于-1.38、优选-0.5至1.2、还更优选-0.4至0.4的logP。

18.根据权利要求17的用途，其中所述共溶剂选自不饱和脂肪酸，优选油酸。