ES2901993T3

ES2901993T3 - Gen AlkB mutante

Info

Publication number: ES2901993T3
Application number: ES17737757T
Authority: ES
Inventors: Arne Skerra; Ludwig Kirmair; Steffen Schaffer; Christoph Schorsch; Mirja Wessel; Thomas Haas
Original assignee: Evonik Operations GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2016-07-04
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2022-03-24
Anticipated expiration: 2037-07-03
Also published as: BR112019000198A2; EP3478826A1; SG10202100044PA; EP3336180A1; US11034938B2; EP3478826B1; US20190153405A1; JP2019519237A; AR110615A1; JP7063827B2; CN109689863B; CN109689863A; WO2018007289A1; SG11201811569SA; KR20190025955A; KR102375464B1

Abstract

Una célula microbiana que expresa una enzima AlkB mutante, comprendiendo la enzima AlkB mutante al menos una mutación puntual en la secuencia silvestre de AlkB, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido V129 y/o T136 de la enzima AlkB silvestre, en donde la mutación puntual en el aminoácido V129 se selecciona del grupo que consiste en V129T y V129A, en donde la AlkB silvestre comprende un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 60% con un polipéptido SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Gen AlkB muíante

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una célula microbiana que expresa una enzima AlkB muíante para producir al menos un ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres a partir de al menos un ácido carboxílico C⁶-C¹⁴y a un método para producir al menos un ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres a partir de al menos un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres como sustrato al usar esta célula microbiana. En particular, la célula microbiana puede usar un gen de AlkB mutante que comprenda al menos una mutación puntual específica que puede ser capaz de producir ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres específicamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los derivados de ácido carboxílico hidroxilados en omega (w-hidroxi) tienen muchos usos comerciales como componentes de agentes industriales. Algunos ejemplos de derivados de ácidos w-hidroxicarboxílicos que son útiles en el mundo industrial incluyen ácidos w-hidroxicarboxílicos; ésteres metílicos de ácidos w-hidroxicarboxílicos; ácidos w-oxocarboxílicos; ácidos w-aminocarboxílicos; ésteres metílicos de ácidos w-aminocarboxílicos; alfa-, omegadiácidos (a,w-diácidos); ésteres metílicos de ácidos omega-carboxicarboxílicos (éster metílico de ácido wcarboxicarboxílico); alfa,omega-diésteres (a,w-diésteres); alfa,omega-dioles (a,w-dioles); y similares. Estos compuestos también se pueden usar como precursores para la producción de varios otros compuestos. Por ejemplo, estos precursores se pueden usar para la producción de ácidos a,w-dicarboxílicos, y las moléculas a,w-bifuncionales son productos químicos especialmente importantes en aplicaciones industriales para resinas poliméricas, líquidos de labrado de metales, adhesivos, inhibidores de la corrosión, electrolitos de capacitores, lubricantes sintéticos de tipo diéster, fibras, curativos de revestimientos en polvo, plastificantes, revestimientos de poliéster, resinas epoxídicas, resinas poliamídicas, aromas, fragancias, tensioactivos, detergentes, aditivos, y similares.

Generalmente, los derivados de ácidos w-hidroxicarboxílicos se producen principalmente a partir de materiales basados en petróleo o a partir de bioconversión de parafina y ácidos carboxílicos en un ácido w-hidroxicarboxílico y/o sus derivados. Los métodos químicos para producir estos compuestos requieren el uso de reactivos peligrosos. Los métodos usados en la técnica también consumen mucha energía y provocan mucho daño al medio ambiente. Las rutas de fermentación emergentes alternativas, aunque se consideran procedimientos ecológicos, todavía son demasiado costosas y son limitadas en los tipos y las cantidades de productos que se pueden elaborar.

Según esto, existe una necesidad en la técnica de métodos ecológicos mejorados para producir un ácido whidroxicarboxílico y sus derivados.

En un ejemplo de producción de éster metílico omega-aminoláurico, el precursor puede ser éster metílico de ácido láurico (LAME) donde el producto intermedio puede ser éster metílico de ácido omega-hidroxiláurico (HLAME). La monooxigenasa AlkB es una enzima que se sabe que cataliza la reacción que forma HLAME a partir de LAME. La enzima AlkB también es capaz de catalizar la oxidación de HLAME hasta éster metílico de ácido omega-oxoláurico (OLAME). La monooxigenasa AlkB es capaz así de catalizar ambas etapas de oxidación que dan como resultado la formación de OLAME a partir de LAME a través de HLAME. Sin embargo, la enzima AlkB es capaz además de catalizar la conversión de OLAME en éster monometílico de ácido dodecanodioico (DDAME), lo que da como resultado una reducción en el rendimiento de producto de OLAME.

Existe así una necesidad en la técnica de un método biotecnológico mejorado que incremente el rendimiento de ácidos carboxílicos hidroxilados en omega específicos y/o sus ésteres a partir de los correspondientes ácidos carboxílicos y/o sus ésteres usados como sustrato con producción reducida de subproductos innecesarios. También existe una necesidad en la técnica de incrementar eficazmente el rendimiento de los productos deseados tales como HLAME y/u OLAME.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención intenta resolver los problemas anteriores al proporcionar al menos una célula microbiana que expresa una enzima AlkB mutante, comprendiendo la enzima AlkB mutante al menos una mutación puntual en la secuencia silvestre de AlkB, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido V129 y/o T136 de la enzima AlkB silvestre y en donde la mutación puntual en el aminoácido V129 se selecciona del grupo que consiste en V129T y V129A. La mutación puntual puede estar preferiblemente en la posición T136. La AlkB silvestre comprende un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 60% con un polipéptido SEQ ID NO: 1.

El arquetipo de esta clase de oxidorreductasas, AlkB, es una proteína redox procedente del sistema AlkBGT de Pseudomonas putida, dependiente de dos polipéptidos auxiliares, AlkG y AlkT. AlkT es una rubredoxina reductasa dependiente de FAD que transfiere electrones de NADH a AlkG. AlkG es una rubredoxina, una proteína redox que contiene hierro que funciona como un donante de electrones directo a AlkB. El término "oxidorreductasas tipo AlkB", según se usa en la presente, se refiere a una oxidorreductasa dependiente de rubredoxina que tiene un sitio de unión a hidrocarburo. En particular, el término "sitio de unión a hidrocarburo", según se usa en la presente, se refiere a un tramo de la superficie de la proteína capaz de unirse a un hidrocarburo, particularmente un alcano y/o alqueno, más particularmente dentro de la extensión del centro catalítico de la proteína. El término "alcanooxidasa dependiente de rubredoxina", según se usa en la presente, se refiere a una oxidorreductasa que reconoce como su sustrato un alcano que recibe electrones a través de una rubredoxina, teniendo la última, en un ejemplo particular, una proteína de hierroazufre que tiene un pliegue de clase a+p con 2 hélices a y de 2 a 3 cadenas p que transfieren electrones a la alcano oxidasa. Más en particular, la oxidorreductasa tipo AlkB es AlkB procedente de Gpo1 de Pseudomonas putida (Código de acceso: CAB54050.1, cualquier código de acceso usado en la solicitud se refiere a la secuencia respectiva procedente de la base de datos de Genbank desarrollada por el NCBI, en donde la publicación mencionada es la disponible en línea el 15 de enero de 2012).

En particular, la AlkB silvestre puede comprender un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91,94, 95, 98 o 100% con un polipéptido SEQ ID NO: 1, preferiblemente la secuencia silvestre de AlkB es SEQ ID NO:1. La enzima AlkB silvestre comprende un aminoácido valina (V) en la posición del aminoácido 129, leucina (L) en la posición del aminoácido 132 y treonina (T) en la posición del aminoácido 136.

La alcano hidroxilasa AlkB es un componente de un sistema de reacción que comprende tres componentes alcano hidroxilasa AlkB de EC 1.14.15.3, AlkT rubredoxina NAD(P)+ reductasa de EC 1.18.1.1 o de Ec 1.18.1.4 y la rubredoxina AlkG. AlkT es una rubredoxina reductasa dependiente de FAD que transfiere electrones de NADH a AlkG. AlkG es una rubredoxina, una proteína redox que contiene hierro que funciona como un donante de electrones directo a AlkB. En una realización preferida, el término "oxidorreductasas tipo AlkB", según se usa en la presente, se refiere a una oxidorreductasa dependiente de rubredoxina que tiene un sitio de unión a hidrocarburo. En particular, la enzima silvestre AlkB puede comprender una identidad de secuencia de al menos 70% con el polipéptido CAB54050.1 (SEQ ID NO:1; cualquier código de acceso usado en la solicitud se refiere a la secuencia respectiva procedente de la base de datos de Genbank desarrollada por el NCBI, en donde la publicación mencionada es la disponible en línea el 28 de abril de 2016).

Una enzima puede ser "natural" o "silvestre", lo que significa que está presente en la naturaleza o tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína natural, respectivamente.

Las formas mutantes de una proteína o molécula de ADN pueden tener las mismas funciones o funciones alteradas en comparación con la silvestre. Para simplificación, los mutantes se pueden mencionar por su variación con respecto al código de aminoácidos a partir del cual surgía la mutación. Por ejemplo, en un formato, el mutante se denomina XPOSY, donde "X" se refiere al código de una sola letra del aminoácido en la secuencia original, "POS" se refiere a la posición de la mutación en la secuencia e Y se refiere al código de una sola letra del nuevo aminoácido que aparece en la posición de la mutación. Por ejemplo, V129T significaría que, en la proteína original, el aminoácido en la posición 129 es valina ("V"), pero en el mutante la valina se reemplaza por una treonina ("T").

En particular, el aminoácido valina en la posición 129 se puede convertir en treonina o alanina. El aminoácido treonina en la posición 136 también se puede convertir en alanina. Las mutaciones puntuales según la presente invención pueden estar en la posición 129 y 136. En otro ejemplo, la enzima AlkB mutante de cualquier célula según la presente invención puede comprender las mutaciones puntuales V129T y T136A o V129A y T136A.

Más en particular, la mutación puntual puede estar en la posición del aminoácido T136. Aún más en particular, la mutación puntual en la posición del aminoácido T136 puede ser T136A.

Se pueden usar cualesquiera técnicas de la biología molecular para producir enzimas AlkB con mutaciones puntuales específicas. El término 'mutación puntual', o modificación de una sola base, es un tipo de mutación que provoca un cambio, una inserción o una eliminación de una sola base nucleotídica del material genético, ADN o ARN. En un ejemplo, mutación puntual se puede referir a una sustitución de aminoácido en una secuencia silvestre del gen de AlkB. Algunos ejemplos de un método que se puede usar incluyen reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores, mutagénesis de casete (en la que la región específica optimizada se reemplaza por un oligonucleótido mutagenizado sintéticamente), mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR paralela (que usa un gran número de diferentes reacciones PCR que se producen en paralelo en el mismo recipiente, de modo que el producto de una reacción cebe al producto de otra reacción), mutagénesis aleatoria (p. ej., mediante fragmentación aleatoria y reensamblaje de los fragmentos mediante cebado mutuo); mutaciones específicas de un sitio (introducidas en secuencias largas mediante fragmentación aleatoria de la platilla seguida por reensamblaje de los fragmentos en presencia de oligonucleótidos mutagénicos); PCR paralela (p. ej., recombinación sobre un conjunto de secuencias de ADN); PCR sexual; y mutagénesis química (p. ej., mediante bisulfito sódico, ácido nitroso, hidroxilamina, hidracina, ácido fórmico, o al añadir nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina y acridina a la reacción PCR en lugar del precursor de nucleótido; o al añadir agentes de intercalado tales como proflavina, acriflavina, quinacrina); irradiación (rayos X o luz ultravioleta y/o sometiendo el polinucleótido a propagación en una célula anfitriona que es deficiente en función de reparación de daños a ADN normal); o barajado de ADN (p. ej., recombinación homologa in vitro o in vivo de conjuntos de fragmentos de ácido nucleico o polinucleótidos).

Según cualquier aspecto de la presente invención, la célula microbiana se puede seleccionar de las especies de bacterias de Abiotrophia, Acaryochloris, Accumulibacter, Acetivibrio, Acetobacter, Acetohalobium, Acetonema, Achromobacter, Acidaminococcus, Acidimicrobium, Acidiphilium, Acidithiobacillus, Acidobacterium, Acidothermus, Acidovorax, Acinetobacter, Actinobacillus, Actinomyces, Actinosynnema, Aerococcus, Aeromicrobium, Aeromonas, Afipia, Aggregatibacter, Agrobacterium, Ahrensia, Akkermansia, Alcanivorax, Alicycliphilus, Alicyclobacillus, Aliivibrio, Alkalilimnicola, Alkaliphilus, Allochromatium, Alteromonadales, Alteromonas, Aminobacterium, Aminomonas, Ammonifex, Amycolatopsis, Amycolicicoccus, Anabaena, Anaerobaculum, Anaerococcus, Anaerofustis, Anaerolinea, Anaeromyxobacter, Anaerostipes, Anaerotruncus, Anaplasma, Anoxybacillus, Aquifex, Arcanobacterium, Arcobacter, Aromatoleum, Arthrobacter, Arthrospira, Asticcacaulis, Atopobium, Aurantimonas, Azoarcus, Azorhizobium, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bartonella, Basfia, Baumannia, Bdellovibrio, Beggiatoa, Beijerinckia, Bermanella, Beutenbergia, Bifidobacterium, Bilophila, Blastopirellula, Blautia, Blochmannia, Bordetella, Borrelia, Brachybacterium, Brachyspira, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevibacterium, Brevundimonas, Brucella, Buchnera, Bulleidia, Burkholderia, Butyrivibrio, Caldalkalibacillus, Caldanaerobacter, Caldicellulosiruptor, Calditerrivibrio, Caminibacter, Campylobacter, Carboxydibrachium, Carboxydothermus, Cardiobacterium, Carnobacterium, Carsonella, Catenibacterium, Catenulispora, Catonella, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Centipeda, Chelativorans, Chloroflexus, Chromobacterium, Chromohalobacter, Chthoniobacter, Citreicella, Citrobacter, Citromicrobium, Clavibacter, Cloacamonas, Clostridium, Collinsella, Colwellia, Comamonas, Conexibacter, Congregibacter, Coprobacillus, Coprococcus, Coprothermobacter, Coraliomargarita, Coriobacterium, corrodens, Corynebacterium, Coxiella, Crocosphaera, Cronobacter, Cryptobacterium, Cupriavidus, Cyanobium, Cyanothece, Cylindrospermopsis, Dechloromonas, Deferribacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas, Deinococcus, Delftia, Denitrovibrio, Dermacoccus, Desmospora, Desulfarculus, Desulphateibacillum, Desulfitobacterium, Desulfobacca, Desulfobacterium, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfohalobium, Desulfomicrobium, Desulfonatronospira, Desulforudis, Desulfotalea, Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Desulfurispirillum, Desulfurobacterium, Desulfuromonas, Dethiobacter, Dethiosulfovibrio, Dialister, Dichelobacter, Dickeya, Dictyoglomus, Dietzia, Dinoroseobacter, Dorea, Edwardsiella, Ehrlichia, Eikenella, Elusimicrobium, Endoriftia, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Epulopiscium, Erwinia, Erysipelothrix, Erythrobacter, Escherichia, Ethanoligenens, Eubacterium, Eubacterium, Exiguobacterium, Faecalibacterium, Ferrimonas, Fervidobacterium, Fibrobacter, Finegoldia, Flexistipes, Francisella, Frankia, Fructobacillus, Fulvimarina, Fusobacterium, Gallibacterium, Gallionella, Gardnerella, Gemella, Gemmata, Gemmatimonas, Geobacillus, Geobacter, Geodermatophilus, Glaciecola, Gloeobacter, Glossina, Gluconacetobacter, Gordonia, Granulibacter, Granulicatella, Grimontia, Haemophilus, Hahella, Halanaerobiumns, Haliangium, Halomonas, Halorhodospira, Halothermothrix, Halothiobacillus, Hamiltonella, Helicobacter, Heliobacterium, Herbaspirillum, Herminiimonas, Herpetosiphon, Hippea, Hirschia, Histophilus, Hodgkinia, Hoeflea, Holdemania, Hydrogenivirga, Hydrogenobaculum, Hylemonella, Hyphomicrobium, Hyphomonas, Idiomarina, Ilyobacter, Intrasporangium, Isoptericola, Isosphaera, Janibacter, Janthinobacterium, Jonesia, Jonquetella, Kangiella, Ketogulonicigenium, Kineococcus, Kingella, Klebsiella, Kocuria, Koribacter, Kosmotoga, Kribbella, Ktedonobacter, Kytococcus, Labrenzia, Lactobacillus, Lactococcus, Laribacter, Lautropia, Lawsonia, Legionella, Leifsonia, Lentisphaera, Leptolyngbya, Leptospira, Leptothrix, Leptotrichia, Leuconostoc, Liberibacter, Limnobacter, Listeria, Loktanella, Lutiella, Lyngbya, Lysinibacillus, Macrococcus, Magnetococcus, Magnetospirillum, Mahella, Mannheimia, Maricaulis, Marinithermus, Marinobacter, Marinomonas, Mariprofundus, Maritimibacter, Marvinbryantia, Megasphaera, Meiothermus, Melissococcus, Mesorhizobium, Methylacidiphilum, Methylibium, Methylobacillus, Methylobacter, Methylobacterium, Methylococcus, Methylocystis, Methylomicrobium, Methylophaga, Methylophilales, Methylosinus, Methyloversatilis, Methylovorus, Microbacterium, Micrococcus, Microcoleus, Microcystis, Microlunatus, Micromonospora, Mitsuokella, Mobiluncus, Moorella, Moraxella, Moritella, Mycobacterium, Myxococcus, Nakamurella, Natranaerobius, Neisseria, Neorickettsia, Neptuniibacter, Nitratifractor, Nitratiruptor, Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrospira, Nocardia, Nocardioides, Nocardiopsis, Nodularia, Nostoc, Novosphingobium, Oceanibulbus, Oceanicaulis, Oceanicola, Oceanithermus, Oceanobacillus, Ochrobactrum, Octadecabacter, Odyssella, Oligotropha, Olsenella, Opitutus, Oribacterium, Orientia, Ornithinibacillus, Oscilatoria, Oscillochloris, Oxalobacter, Paenibacillus, Pantoea, Paracoccus, Parascardovia, Parasutterella, Parvibaculum, Parvimonas, Parvularcula, Pasteurella, Pasteuria, Pectobacterium, Pediococcus, Pedosphaera, Pelagibaca, Pelagibacter, Pelobacter, Pelotomaculum, Peptoniphilus, Peptostreptococcus, Persephonella, Petrotoga, Phaeobacter, Phascolarctobacterium, Phenylobacterium, Photobacterium, Pirellula, Planctomyces, Planococcus, Plesiocystis, Polaromonas, Polaromonas, Polymorphum, Polynucleobacter, Poribacteria, Prochlorococcus, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Pseudoalteromonas, Pseudoflavonifractor, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoramibacter, Pseudovibrio, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Psychromonas, Puniceispirillum, Pusillimonas, Pyramidobacter, Rahnella, Ralstonia, Raphidiopsis, Regiella, Reinekea, Renibacterium, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodococcus, Rhodoferax, Rhodomicrobium, Rhodopirellula, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rickettsia, Rickettsiella, Riesia, Roseburia, Roseibium, Roseiflexus, Roseobacter, Roseomonas, Roseovarius, Rothia, Rubrivivax, Rubrobacter, Ruegeria, Ruminococcus, Ruthia, Saccharomonospora, Saccharophagus, Saccharopolyspora, Sagittula, Salinispora, Salmonella, Sanguibacte, Scardovia, Sebaldella, Segniliparus, Selenomonas, Serratia, Shewanella, Shigella, Shuttleworthia, Sideroxydans, Silicibacter, Simonsiella, Sinorhizobium, Slackia, Sodalis, Solibacter, Solobacterium, Sorangium, Sphaerobacter, Sphingobium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Spirochaeta, Sporosarcina, Stackebrandtia, Staphylococcus, Starkeya, Stenotrophomonas, Stigmatella, Streptobacillus, Streptococcus, Streptomyces, Streptosporangium, Subdoligranulum, subvibrioides, Succinatimonas, Sulfitobacter, Sulfobacillus, Sulfuricurvum, Sulfurihydrogenibium, Sulfurimonas, Sulfurospirillum, Sulfurovum, Sutterella, Symbiobacterium, Synechocystis, Syntrophobacter, Syntrophobotulus, Syntrophomonas, Syntrophothermus, Syntrophus, taiwanensis, Taylorella, Teredinibacter, Terriglobus, Thalassiobium, Thauera, Thermaerobacter, Thermanaerovibrio, Thermincola, Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium, Thermobaculum, Thermobifida, Thermobispora, Thermocrinis, Thermodesulphateator, Thermodesulfobacterium, Thermodesulfobium, Thermodesulfovibrio, Thermomicrobium, Thermomonospora, Thermosediminibacter, Thermosinus, Thermosipho, Thermosynechococcus, Thermotoga, Thermovibrio, Thermus, Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio, Thiobacillus, Thiomicrospira, Thiomonas, Tolumonas, Treponema, tribocorum, Trichodesmium, Tropheryma, Truepera, Tsukamurella, Turicibacter, Variovorax, Veillonella, Verminephrobacter, Verrucomicrobium, Verrucosispora, Vesicomyosocius, Vibrio, Vibrionales, Victivallis, Weissella, Wigglesworthia, Wolbachia, Wolinella, Xanthobacter, Xanthomonas, Xenorhabdus, Xylanimonas, Xylella, Yersinia, Zinderia y Zymomonas,

En particular, la célula microbiana puede ser de E. coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Acinetobacter sp., Burkholderia sp., Burkholderia thailandensis, Cyanobakterien, Klebsiella sp., Klebsiella oxytoca, Salmonella sp., Rhizobium sp. y Rhizobium meliloti, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Clostridium sp., Corynebacterium sp., Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium sp., Chlorella sp. y Nostoc sp.. Más en particular, la célula microbiana puede ser E. coli.

En otro ejemplo, la célula microbiana puede ser una célula de levadura. Levaduras adecuadas según cualquier aspecto de la presente invención pueden pertenecer a los géneros listados en http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm. En particular, la levadura se puede seleccionar del grupo que consiste en Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris.

Las células según cualquier aspecto de la presente invención se transforman genéticamente según cualquier método conocido en la técnica. En particular, las células se pueden producir según el método divulgado en el documento WO2013024114.

La enzima AlkB mutante es capaz de

(a) catalizar la conversión de ácidos carboxílicos C⁶-C¹⁴y/o sus ésteres como sustrato en los correspondientes ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o sus ésteres; o

(b) catalizar la conversión de ácidos carboxílicos C⁶-C¹⁴y/o sus ésteres como sustrato en los correspondientes ácidos omega-oxocarboxílicos y/o sus ésteres.

El término "sustrato" significa cualquier sustancia o compuesto que se convierta o esté destinado a convertirse en otro compuesto por la acción de un catalizador enzimático. El término incluye compuestos aromáticos y alifáticos e incluye no solo un compuesto individual, sino también combinaciones de compuestos, tales como soluciones, mezclas y otros materiales que contengan al menos un sustrato. El sustrato puede ser al menos un ácido carboxílico C⁶-C¹⁴y/o sus ésteres. El sustrato puede ser una combinación de ácido carboxílico C⁶-C¹⁴y/o sus ésteres. En particular, el sustrato puede ser al menos un ácido carboxílico C⁸-C¹²y/o uno de sus ésteres, al menos un ácido carboxílico C⁶-C¹⁰y/o uno de sus ésteres o al menos un ácido carboxílico C⁸-C¹⁰y/o uno de sus ésteres. Por ejemplo, el sustrato puede ser ácido láurico y/o uno de sus ésteres. En particular, el éster puede ser un éster etílico o metílico del ácido carboxílico. Por ejemplo, el éster como sustrato puede ser éster metílico de ácido metil-láurico (LAME). En este ejemplo, la AlkB mutante es capaz de catalizar la reacción de oxidación de conversión de ácido láurico y/o éster metílico de ácido láurico (LAME) en ácido omega-hidroxiláurico y/o éster metílico de ácido omega-hidroxiláurico (HLAME), respectivamente. En otro ejemplo, la AlkB mutante es capaz de catalizar la conversión de ácido láurico y/o éster metílico de ácido láurico (LAME) en ácido omega-oxoláurico y/o éster metílico de ácido omega-oxoláurico (OLAME), respectivamente. La AlkB mutante también puede ser capaz de catalizar la conversión de ácido láurico y/o éster metílico de ácido láurico (LAME) en ácido omega-hidroxiláurico y/o éster metílico de ácido omega-hidroxiláurico (HLAME) y ácido omega-oxoláurico y/o éster metílico de ácido omega-oxoláurico (OLAME) simultáneamente.

La enzima AlkB mutante es capaz de producir más ácidos omega-hidroxi- y/u omega-oxocarboxílicos y/o sus ésteres a partir de ácidos carboxílicos que una enzima AlkB silvestre. También se formarán menos subproductos.

El efecto de la expresión heteróloga de los mutantes de AlkB se puede analizar usando Escherichia coli como la célula anfitriona. Estas enzimas AlkB mutantes se pueden transformar en E.coli y estas células transformadas se pueden hacer crecer bajo condiciones pertinentes para el procedimiento en un biorreactor en presencia de un sustrato tal como LAME. En comparación con cualquier cepa de referencia que exprese AlkB silvestre, se puede mostrar que las cepas mutantes tienen un incremento significativo en la velocidad de bioconversión de LAME en HLAME así como una relación mejorada hasta dos veces de HLAME:DDAME. Esta relación puede indicar una especificidad reducida hacia el HLAME, puesto que HLAME es el precursor de la producción de DDAME en la cascada de reacción de AlkB. Las células según cualquier aspecto de la presente invención pueden dar lugar así a un procedimiento más eficaz energéticamente en el que se pueden incrementar el rendimiento espacio-tiempo así como el rendimiento de producto, contribuyendo a un procedimiento de producción de poliamida 12 más económico.

En particular, la célula y/o el método según la presente invención puede ser capaz de incrementar la relación de éster metílico de ácido omega-hidroxiláurico (HLAME) a éster monometílico de ácido dodecanodioico (DDAME) (HLAME/DDAME) con respecto a la relación HLAME/DDAME en una célula silvestre. En particular, este método comprende poner en contacto la célula según la presente invención con el sustrato, LAME. Esta relación se calcula al dividir la cantidad total de HLAME producido en la mezcla de reacción por la cantidad total de DDAME producido en la reacción en un momento dado. La concentración de HLAME y/o DDAME se puede medir, p. ej., usando cromatografía de gases o líquidos acoplada con espectrometría de masas. Cuanto mayor sea la concentración de HLAME, mayor será la relación. En particular, la relación HLAME/DDAME puede ser al menos 1:1.

La célula y/o el método según la presente invención pueden ser capaces de incrementar la relación de éster metílico de ácido omega-aminoláurico (ALAME) a éster monometílico de ácido dodecanodioico (DDAME) (ALAME/DDAME) con respecto a la relación ALAME/DDAME en una célula silvestre. En particular, este método comprende poner en contacto la célula según cualquier aspecto de la presente invención con el sustrato, LAME. Esta relación se calcula al dividir la cantidad total de ALAME producido en la mezcla de reacción por la cantidad total de DDAME producido en la reacción en un momento dado. La concentración de ALAME y/o DDAME se puede medir, p. ej., usando cromatografía de gases o líquidos acoplada con espectrometría de masas. Cuanto mayor sea la concentración de ALAME, mayor será la relación. En particular, la relación ALAME/DDAME puede ser al menos 1:1.

La célula según cualquier aspecto de la presente invención puede estar genéticamente modificada adicionalmente para comprender una expresión incrementada con relación a una célula silvestre de una enzima E¹, una wtransaminasa. En particular, la enzima E¹puede ser capaz de catalizar la conversión de los ácidos omegaoxocarboxílicos y/o sus ésteres en los correspondientes ácidos omega-aminocarboxílicos y/o sus ésteres.

La expresión "actividad incrementada de una enzima", según se usa en la presente, se ha de entender como actividad intracelular incrementada. Básicamente, un incremento en la actividad enzimática se puede conseguir al incrementar el número de copias de la secuencia génica o las secuencias génicas que codifican la enzima, usando un promotor fuerte o empleando un gen o alelo que codifique una enzima correspondiente con actividad incrementada, alterando la utilización codónica del gen, incrementando la semivida del ARNm o de la enzima de diversos modos, modificando la regulación de la expresión del gen y opcionalmente al combinar estas medidas. Las células genéticamente modificadas usadas según cualquier aspecto de la presente invención se producen, por ejemplo, mediante transformación, transducción, conjugación o una combinación de estos métodos con un vector que contiene el gen deseado, un alelo de este gen o sus partes y un vector que haga posible la expresión del gen. La expresión heteróloga se consigue en particular mediante la integración del gen o de los alelos en el cromosoma de la célula o un vector que se replica extracromosómicamente. En un ejemplo, la célula según cualquier aspecto de la presente invención puede comprender una expresión incrementada con relación a la célula silvestre de w-transaminasa (E¹). En particular, la wtransaminasa (E¹) procede de EC 2.6.1. En particular, la enzima E¹puede ser una aminotransferasa (Eh) seleccionada del grupo que consiste en Pseudomonas putida (WP_016502144; WP_016500675.1), Chromobacterium violaceum (NP_901695.1), Rhodobacter sphaeroides 2.4.7(YP_353455.1) y 3HMU_A, AAD41041.1, AAK15486.1, ABE03917.1, ADR60699.1, ADR61066.1, ADR62525.1, AEL07495.1, CAZ86955.1, EFW82310.1, EFW87681.1, EGC99983.1, EGD03176.1, EGE58369.1, EGH06681.1, EGH08331.1, EGH24301.1, EGH32343.1, EGH46412.1, EGH55033.1, EGH62152.1, EGH67339.1, EGH70821.1, EGH71404.1, EGH78772.1, EGH85312.1, EGH97105.1, EGP57596.1, NP_102850.1 NP_106560.1, NP_248912.1, NP_248990.1, NP_354026.2, NP_421926.1, NP_637699.1, NP_642792.1 NP_744329.1, NP_744732.1, NP_747283.1, NP_795039.1, XP_002943905.1, YP_001021095.1, YP_001059677.1 YP 001061726.1, YP 001066961.1, YP 001074671.1, YP 001120907.1, YP 001140117.1, YP_001170616.1, YP_ 001185848.1, YP 001188121.1, YP 001233688.1, YP 001268866.1, YP 001270391.1, YP_001345703.1, YP_ 001412573.1, YP 001417624.1, YP 001526058.1, YP 001579295.1, YP 001581170.1, YP_001668026.1, YP_ 001669478.1, YP 001671460.1, YP 001685569.1, YP 001747156.1, YP 001749732.1, YP_001765463.1, YP_ 001766294.1, YP 001790770.1, YP 001808775.1, YP 001809596.1, YP 001859758.1, YP_001888405.1, YP_ 001903233.1, YP 001977571.1, YP 002229759.1, YP 002231363.1, YP 002280472.1, YP_002297678.1, YP_ 002543874.1, YP 002549011.1, YP 002796201.1, YP 002801960.1, YP 002875335.1, YP_002897523.1, YP_ 002912290.1, YP 002974935.1, YP 003060891.1, YP 003264235.1, YP 003552364.1, YP_003578319.1, YP_ 003591946.1, YP 003607814.1, YP 003641922.1, YP 003674025.1, YP 003692877.1, YP_003755112.1, YP_ 003896973.1, YP 003907026.1, YP 003912421.1, YP 004086766.1, YP 004142571.1, YP_004147141.1, YP_ 004228105.1, YP 004278247.1, YP 004305252.1, YP 004356916.1, YP 004361407.1, YP_004378186.1, YP_ 004379856.1, YP 004390782.1, YP 004472442.1, YP 004590892.1, YP _004612414.1, YP_004676537.1, YP 004693233.1, YP 004701580.1, YP 004701637.1, YP 004704442.1 YP_108931.1, YP_110490.1 YP 168667.1, YP 237931.1, YP 260624.1, YP 262985.1, YP 271307.1 YP_276987.1, YP_334171.1 YP 337172.1, YP 350660.1, YP 351134.1, YP 364386.1, YP 366340.1 YP_369710.1, YP_370582.1 YP 426342.1, YP 440141.1, YP 442361.1, YP 468848.1, YP 521636.1 YP_554363.1, YP_608454.1 YP 610700.1, YP 614980.1, YP 622254.1, YP 625753.1, YP 680590.1 YP_751687.1, YP_767071.1. YP 774090.1, YP 774932.1, YP 788372.1, YP 858562.1, YP 928515.1 YP_983084.1, YP_995622.1, ZP_00948889.1, ZP_00954344.1, ZP_00959736.1, ZP_00998881.1, ZP_01011725.1. ZP_01037109.1, ZP_01058030.1, ZP_01076707.1, ZP_01103959.1, ZP_01167926.1, ZP_01224713.1, ZP_01442907.1, ZP_01446892.1, ZP_01550953.1, ZP_01625518.1, ZP_01745731.1, ZP_01750280.1, ZP_01754305.1, ZP_01763880.1, ZP_01769626.1, ZP_01865961.1, ZP_01881393.1, ZP_01901558.1, ZP_02145337.1, ZP 02151268.1, ZP 02152332.1, ZP 02167267.1, ZP 02190082.1, ZP 02242934.1, ZP 02360937.1, ZP_02367056.1, ZP_02385477.1 ZP_02456487.1, ZP_02883670.1, ZP_03263915.1, ZP_03263990.1, ZP_03400081.1, ZP_03452573.1 ZP_03456092.1, ZP_03517291.1, ZP_03529055.1, ZP_03571515.1, ZP_03572809.1, ZP_03587785.1 ZP_03588560.1, ZP_03697266.1, ZP_03697962.1, ZP_04521092.1, ZP_04590693.1, ZP_04890914.1 ZP_04891982.1, ZP_04893793.1, ZP_04902131.1, ZP_04905327.1, ZP_04941068.1, ZP_04944536.1 ZP_04945255.1, ZP_04959332.1, ZP_04964181.1, ZP_05053721.1, ZP_05063588.1, ZP_05073059.1 ZP_05077806.1, ZP_05082750.1, ZP_05091128.1, ZP_05095488.1, ZP_05101701.1, ZP_05116783.1 ZP_05121836.1, ZP_05127756.1, ZP_05637806.1, ZP_05742087.1, ZP_05783548.1, ZP_05786246.1 ZP_05843149.1, ZP_05945960.1, ZP_06459045.1, ZP_06487195.1, ZP_06492453.1, ZP_06493162.1 ZP_06703644.1, ZP_06731146.1, ZP_06839371.1, ZP_07007312.1, ZP_07266194.1, ZP_07374050.1 ZP_07662787.1, ZP_07778196.1, ZP_07797983.1, ZP_08099459.1, ZP_08138203.1, ZP_08141719.1 ZP_08142973.1, ZP_08177102.1, ZP_08185821.1, ZP_08186468.1, ZP_08208888.1, ZP_08266590.1 ZP_08402041.1, ZP_08406891.1, ZP_08522175.1, ZP_08527488.1, ZP_08631252.1 y ZP 08636687.1.

En particular, la enzima E¹puede ser una aminotransferasa seleccionada del grupo que consiste en NP_901695.1, ZP_03697266.1, AAD41041.1, YP_002796201.1, ZP_03697962.1, YP_001859758.1, YP_002229759.1, YP_001120907.1, YP_110490.1, ZP_04964181.1, YP_774932.1, YP_001766294.1, YP_001581170.1, YP_622254.1, ZP_03588560.1, YP_001809596.1, YP_370582.1, ZP_03572809.1, NP_248990.1, YP_001888405.1, ZP_04905327.1, YP_001061726.1, YP_001668026.1, ZP_01750280.1, ZP_07778196.1, EGH71404.1, NP_744329.1, YP_004147141.1, ADR61066.1, ZP_05783548.1, YP_004701637.1, YP_366340.1, YP_003264235.1, EGD03176.1, YP_001268866.1, ZP_01901558.1, ZP_05121836.1, YP_003692877.1, ZP_03517291.1, YP_002974935.1, YP_001668026.1, ADR61066.1, NP_744329.1, YP_001268866.1, YP_004701637.1, ZP_08142973.1, ADR62525.1, YP_610700.1, NP_747283.1, ADR62525.1, YP_001270391.1, YP_004704442.1, YP_610700.1, YP_001747156.1, ZP_08138203.1, ZP_07266194.1, EGH70821.1, YP_351134.1, EGH32343.1, EGH08331.1, EGH67339.1, YP_001668026.1, YP_004701637.1, YP_237931.1, ZP_03400081.1, ZP_05116783.1, ZP_01550953.1, ZP_07662787.1, YP_928515.1, YP_788372.1, YP_001021095.1, ZP_07797983.1, YP_003578319.1, YP_004305252.1, NP_248912.1, ZP_08636687.1, YP_003912421.1, YP_751687.1, ZP_08142973.1, YP_271307.1, ZP_05082750.1, YP_001417624.1 e YP_353455.1.

Aún más en particular, la enzima E¹puede ser la transaminasa CV2025 procedente de Chromobacterium violaceum DSM30191. La enzima E¹según cualquier aspecto de la presente invención puede comprender al menos 50% de identidad de secuencia con relación a SEQ ID NO:2. Más en particular, E¹puede comprender un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91,94, 95, 98 o 100% con un polipéptido SEQ ID NO:2.

Las enzimas, por ejemplo E¹, pueden comprender una secuencia polipeptídica en la que hasta 60%, preferiblemente hasta 25%, particularmente hasta 15%, en particular hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% de los residuos de aminoácido están modificados en comparación con las secuencias de referencia posteriores (números de registro mediante eliminación, inserción, sustitución o una de sus combinaciones y que todavía posee al menos 50%, preferiblemente 65%, de forma particularmente preferible 80%, en particular más de 90% de la actividad de la proteína con la correspondiente secuencia de referencia posterior, en donde se entiende que 100% de actividad de la proteína de referencia significa el incremento de la actividad de las células usadas como un biocatalizador, es decir, la cantidad de sustancia convertida por unidad de tiempo basándose en la cantidad de células usada (unidades por gramo de peso seco de células [U/g CDW]) en comparación con la actividad del biocatalizador en ausencia de la proteína de referencia. Modificaciones de residuos de aminoácido de una secuencia polipeptídica dada que conducen a modificaciones no significativas de las propiedades y la función del polipéptido dado son conocidas por los expertos en la técnica. Así, por ejemplo, muchos aminoácidos se pueden intercambiar a menudo por otros sin problemas; ejemplos de sustituciones de aminoácidos adecuadas son: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gln; Ile por Leu o Val; Leu por Met o Val; Lys por Arg o Gln o Glu; Met por Leu o Ile; Phe por Met o Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; Val por Ile o Leu. También se sabe que las modificaciones, particularmente en el extremo N o C de un polipéptido en la forma de, por ejemplo, inserciones o eliminaciones de aminoácidos, a menudo no ejercen una influencia significativa sobre la función del polipéptido.

La expresión de las enzimas y los genes mencionados anteriormente y todos los mencionados posteriormente se puede determinar por medio de separación en gel mono- y bidimensional de proteínas seguida por identificación óptima de la concentración de proteína en el gel con un programa de evaluación apropiado.

Si el incremento de una actividad enzimática se basa exclusivamente en incrementar la expresión del gen correspondiente, entonces la cuantificación del incremento de la actividad enzimática se puede determinar simplemente mediante una comparación de las separaciones mono- o bidimensionales de proteínas entre una célula silvestre y genéticamente modificada. Un método común para la preparación de los geles proteínicos con bacterias y para la identificación de las proteínas es el procedimiento descrito por Hermann y cols. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001). La concentración de proteína también se puede analizar mediante hibridación por transferencia Western con un anticuerpo específico para la proteína que se vaya a determinar (Sambrook y cols., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. EE. UU. de A., 1989) seguido por una evaluación óptica con un programa apropiado para la determinación de la concentración (Lohaus y Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647). Este método también es siempre una opción cuando los posibles productos de la reacción que vaya a ser catalizada por la actividad enzimática que se va a determinar se puedan metabolizar rápidamente en el microorganismo o también la actividad en el tipo silvestre es por sí misma demasiado baja para que sea posible determinar adecuadamente la actividad enzimática que se vaya a determinar sobre la base de la formación de producción.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir al menos un ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres a partir de al menos un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres como sustrato, comprendiendo el método

- poner en contacto al menos una célula genéticamente modificada que expresa una enzima AlkB mutante con el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato,

en donde el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato es un ácido carboxílico C⁶-C¹⁴y/o uno de sus ésteres; y la enzima AlkB mutante comprende al menos una mutación puntual en la secuencia silvestre de AlkB, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido seleccionada del grupo que consiste en V129, L132 y T136 de la enzima AlkB silvestre. La AlkB silvestre comprende un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 60% con un polipéptido SEQ ID NO: 1.

En particular, la mutación puntual se puede seleccionar del grupo que consiste en V129T, T136A, V129A y L132V.

- poner en contacto la célula según la presente invención, es decir la célula microbiana que expresa una enzima AlkB mutante, comprendiendo la enzima AlkB mutante al menos una mutación puntual en la secuencia silvestre de AlkB, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido V129 y/o T136 de la enzima AlkB silvestre, en donde la mutación puntual en el aminoácido V129 se selecciona del grupo que consiste en V129T y V129A y en donde la AlkB silvestre comprende un polipéptido con identidad de secuencia de al menos 60% con un polipéptido SEQ ID NO: 1, con el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato.

Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para producir al menos un ácido omega-aminocarboxílico y/o uno de sus ésteres a partir de al menos un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres como sustrato, comprendiendo el método

- poner en contacto la célula según cualquier aspecto de la presente invención, que adicionalmente está genéticamente modificada para comprender una expresión incrementada con relación a una célula silvestre de una enzima E1, una w-transaminasa capaz de catalizar la conversión de los ácidos omega-oxocarboxílicos y/o sus ésteres en los correspondientes ácidos omega-aminocarboxílicos y/o sus ésteres, con el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato.

Según un aspecto adicional más de la presente invención, se proporciona un uso de la célula según la presente invención, es decir la célula microbiana que expresa una enzima AlkB mutante, comprendiendo la enzima AlkB mutante al menos una mutación puntual en la secuencia silvestre de AlkB, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido V129 y/o T136 de la enzima AlkB silvestre, en donde la mutación puntual en el aminoácido V129 se selecciona del grupo que consiste en V129T y V129A y en donde la AlkB silvestre comprende un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 60% con un polipéptido SEQ ID NO: 1, para catalizar la conversión de un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres en un ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres y/o un ácido omega-aminocarboxílico y/o uno de sus ésteres correspondientes.

El término "poner en contacto", según se usa en la presente, significa efectuar un contacto directo entre el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usado como sustrato con la célula según cualquier aspecto de la presente invención en una solución acuosa. Por ejemplo, la célula y el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres pueden no estar en compartimentos diferentes separados por una barrera tal como una membrana inorgánica. Si el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres es soluble o se hace soluble y puede ser recogido por la célula o se puede difundir a través de membranas biológicas, simplemente se puede añadir a la célula según cualquier aspecto de la presente invención en una solución acuosa. En caso de que sea insuficientemente soluble, se puede disolver en un disolvente orgánico adecuado antes de la adición a la solución acuosa. El experto en la técnica es capaz de preparar soluciones acuosas de ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres que tengan solubilidad insuficiente al añadir disolventes orgánicos y/o polares adecuados. Estos disolventes se pueden proporcionar en la forma de una fase orgánica que comprende un disolvente orgánico líquido. En un ejemplo, el disolvente o la fase orgánicos se pueden considerar líquidos cuando son líquidos a 25°C y presión atmosférica estándar. En otro ejemplo, los compuestos y los catalizadores se pueden poner en contacto in vitro, es decir en un estado más o menos enriquecido o incluso purificado, o se pueden poner en contacto in situ, es decir se elaboran como parte del metabolismo de la célula y posteriormente reaccionan dentro de la célula.

El término "una solución acuosa" se usa intercambiablemente con el término “medio acuoso” y se refiere a cualquier solución que comprenda agua, principalmente agua como disolvente que se pueda usar para mantener la célula según cualquier aspecto de la presente invención, al menos temporalmente, en un estado metabólicamente activo y/o viable y comprende, si esto es necesario, cualesquiera sustratos adicionales. El experto en la técnica está familiarizado con la preparación de numerosas soluciones acuosas, habitualmente denominadas medios, que se pueden usar para mantener las células de la invención, por ejemplo medio LB en el caso de E. coli. Es ventajoso usar como una solución acuosa un medio mínimo, es decir un medio de composición razonablemente simple que comprenda solamente el conjunto mínimo de sales y nutrientes indispensables para mantener la célula en un estado metabólicamente activo y/o viable, en contraste con los medios complejos, para evitar la contaminación dispensable de los productos con productos secundarios no deseados. Por ejemplo, se puede usar medio M9 como un medio mínimo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1A-1D son gráficas con concentraciones de HLAME y DDAME después de 29 h de biotransformación. HLAME: éster metílico de ácido omega-hidroxiláurico; DDAME: éster monometílico de ácido dodecanodioico; OLAME: éster metílico de ácido omega-oxoláurico; LAME: éster metílico de ácido láurico.

EJEMPLOS

Lo precedente describe realizaciones preferidas, que, como se entenderá por los expertos en la técnica, se pueden someter a variaciones o modificaciones en el diseño, la construcción o el funcionamiento sin apartarse del alcance de las reivindicaciones. Estas variaciones, a modo de ejemplo, están destinadas a estar cubiertas por el alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Mutagénesis dirigida.

Se creía que las posiciones de aminoácidos V129, L132 y T136 de AlkB estaban implicadas en el reconocimiento del sustrato y el posicionamiento del sustrato. A fin de intercambiar aminoácidos en la enzima AlkB, los tripletes de bases correspondientes que codifican el aminoácido deseado se introdujeron en oligonucleótidos sintéticos. Con la secuencia del gen AlkB silvestre como una plantilla de PCR, los genes AlkB mutantes (que codifican los mutantes de AlkB V129T, V129A y T136A, respectivamente) se amplificaron a través de PCR mediante el uso de los oligonucleótidos sintéticos. Los productos de PCR se usaron como ADN de inserción para la construcción in vitro de los plásmidos de expresión. Se introdujeron cambios de nucleótidos a través de mutagénesis dirigida según métodos conocidos por un experto en la técnica y se muestran en la columna derecha de la Tabla 1. Estos intercambios conducían a las correspondientes variantes de AlkB mostradas en la columna izquierda de la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias nucleotídicas que se cambiaban para producir mutantes de AlkB específicos

Ejemplo 2

Construcción in vitro de plásmidos de expresión

Como vector de referencia para la construcción de plásmidos, se usó el plásmido pBT 10_alkL [para la secuencia y la construcción, véase el Ejemplo 1 del documento WO/2011/131420 (Seq ID No: 8 del documento WO/2011/131420)]. En pBT10_alkL, la secuencia de AlkB silvestre se reemplazó usando los productos de PCR que contenían los genes AlkB mutantes mediante el uso del NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit de NEB (New England Biolabs, Inc.) según las especificaciones del fabricante.

Tabla 2. Plásmidos que se usaban para la construcción de cepas de E. coli. Para la construcción del plásmido pJ294_alaDH_B.s._TA_C.v.(Ct), véase el ejemplo 1 del documento WO/2013/024114

Ejemplo 3

Construcción de cepas de E. co li

Se usó E. coli W3110 AfadE (sin b-oxidación) AbioH (sin hidrólisis del éster metílico). La cepa E. coli W3110 AbioH para inactivar la expresión de bioH se elaboró usando el método divulgado en el Ejemplo 1 del documento EP2730655. A continuación, esta cepa se usó posteriormente para inactivar la expresión de fadE usando el método divulgado en el Ejemplo 1 del documento EP2607490. La cepa resultante se denominó E.coli W3110 AfadEAbioH. Para la construcción de cepas de E. coli que expresan AlkB silvestre, genes mutantes de AlkB (variantes de AlkB) y/o transaminasa, se usó la cepa de E. coli W3110 AfadEAbioH como anfitrión para transformaciones a través de electroporación según métodos conocidos por un experto en la técnica. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que contenían kanamicina (50 pg/ml) y/o ampicilina (100 pg/ml). La lista de transformantes se proporciona en la Tabla 3.

Tabla 3. Cepas de E. coli obtenidas mediante transformación de E. coli W3110 AfadEAbioH con el plásmido 1. Se generan cepas de E. coli con ambos plásmidos (plásmido 1 y plásmido 2) a través de la transformación de ambos plásmidos.

Ejemplo 4

Actividad de mutantes de AlkB

Las cepas de la Tabla 3 se sometieron a una fermentación discontinua a fin de investigar su capacidad para producir éster metílico de ácido omega-hidroxiláurico, éster metílico de ácido omega-oxoláurico y éster monometílico de ácido dodecanodioico a partir de laurato de metilo (éster metílico de ácido láurico). Esto se llevó a cabo en un sistema de fermentación paralela de 8 veces de DASGIP ®.

Para la fermentación, se usaron reactores de 1 I que estaban equipados con agitadores elevados y turbinas impulsoras. Para comprobar el procedimiento, se midieron pH y pO2 directamente y continuamente durante el procedimiento usando métodos conocidos en la técnica. Las medidas de OTR/CTR servían entre otra cosas para estimar la actividad metabólica y la aptitud de las células.

Las sondas de pH se calibraron por medio de una calibración de dos puntos con soluciones de medida de pH 4,0 y pH 7,0 según la referencia técnica de DASGIP. Los reactores estaban provistos según la referencia técnica con los sensores y las conexiones requeridos y el eje del agitador estaba instalado. A continuación, los reactores se rellenaron con 300 ml de agua y se trataron en autoclave durante 20 min a 121°C a fin de asegurar la esterilidad. Las sondas de pO2 se polarizaron durante la noche (al menos 6 h) después de la conexión al amplificador de medida. A continuación, el agua se retiró bajo la cabina de flujo laminar y se reemplazó por medio de alta densidad celular que consistía en 1,76 g/l de (NH4)2SO4, 19,08 g/l de K2HPO4, 12,5 g/l de KH2PO4, 6,66 g/l de extractos de levadura, 11,2 g/l de dihidrato de citrato trisódico, 17 ml/l de una solución de citrato de amonio y hierro de 1% de concentración esterilizada por filtración y 5 ml/l de una solución madre de oligoelementos esterilizada por filtración (que consistía en 36,50 g/l de HCl (37%), 1,91 g/l de MnCl2*4H2O, 1,87 g/l de ZnSO4*7H2O, 0,84 g/l de dihidrato de ácido etilendiaminotetraacético, 0,30 g/l de H3BO3, 0,25 g/l de Na2MoO4*2H2O, 4,70 g/l de CaCl2*2H2O, 17,80 g/l de FeSO4*7H2O, 0,15 g/l de CuCl2*2H2O) con 15 g/l de glucosa como fuente de carbono (añadida mediante la adición medida de 30 ml/l de una solución de alimentación estéril que consistía en 500 g/l de glucosa, 1 % (p/v) de MgSO4*7H2O y 2,2% (p/v) de NH4CI) con 50 mg/l de kanamicina.

Posteriormente, las sondas de pO2 se calibraron usando una calibración de un solo punto (agitador: 600 rpm/gasificación: 10 sl/h de aire) hasta 100% y los tramos de alimentación, agente de corrección y agente de inducción se limpiaron por medio de limpieza in situ según la referencia técnica. Para esto, los tubos se barrieron en primer lugar con etanol al 70%, a continuación con NaOH 1 M, a continuación con agua desmineralizada estéril y finalmente se cargaron con los medios respectivos.

Todas las susodichas cepas de E. coli se cultivaron en primer lugar a partir de un criocultivo en medio LB (25 ml en un matraz de agitación con resaltos de 100 ml) con 50 mg/l de kanamicina durante la noche a 37°C y 200 rpm durante aproximadamente 18 h. A continuación, se transfirieron 2 ml de este cultivo durante una segunda fase de precultivo a 25 ml de medio de alta densidad celular que consistía en 1,76 g/l de (NH4)2SO4, 19,08 g/l de K2HPO4, 12,5 g/l de KH2PO4, 6,66 g/l de extracto de levadura, 11,2 g/l de dihidrato de citrato trisódico, 17 ml/l de una solución de citrato de amonio y hierro de 1 % de concentración esterilizada por filtración y 5 ml/l de una solución madre de oligoelementos esterilizada por filtración (que consistía en 36,50 g/l de HCl (37%), 1,91 g/l de MnCl2*4H2O, 1,87 g/l de ZnSO4*7H2O, 0,84 g/l de dihidrato de ácido etilendiaminotetraacético, 0,30 g/l de H3BO3, 0,25 g/l de Na2MoO4*2H2O, 4,70 g/l de CaCl2*2H2O, 17,80 g/l de FeSO4*7H2O, 0,15 g/l de CuCl2*2H2O) con 15 g/l de glucosa como fuente de carbono (añadida mediante la adición medida de 30 ml/l de una solución de alimentación estéril que consistía en 500 g/l de glucosa, 1% (p/v) de MgSO4*7H2O y 2,2% (p/v) de NH4CI) con los antibióticos ya descritos en un matraz para agitación de 100 ml y se incubaron a 37°C/200 rpm durante 6 h más.

A fin de inocular los reactores con una densidad óptica de 0,1, se midió la OD⁶⁰⁰de la segunda fase de precultivo y se calculó la cantidad de cultivo requerida para la inoculación. La cantidad de cultivo requerida se añadió con la ayuda de una jeringa de 5 ml a través de un tabique hacia el reactor termotratado y aireado.

El programa estándar usado se muestra en la Tabla 4:

Tabla 4. El programa estándar para determinar la actividad de mutantes de AlkB

El pH se reguló hasta pH 6,8 en una cara con solución de amoníaco de 12,5% de concentración. Durante el cultivo y la biotransformación, el oxígeno disuelto (pO2 u OD) en el cultivo se reguló hasta al menos 30% por medio de la velocidad de alimentación al agitador y de gasificación. Después de la inoculación, el OD caía de 100% hasta este 30%, donde se mantenía estable durante el resto de la fermentación.

La fermentación se llevó a cabo de forma discontinua, donde el comienzo de la alimentación se activó como aporte a la fase de alimentación con 5 g/l*h de alimentación de glucosa, que consistía en 500 g/l de glucosa, 1% (p/v) de MgSO4*7H2O y 2,2% (p/v) de NH4CI, a través del máximo de OD que inducía el final de la fase discontinua. Con el comienzo de la alimentación, la temperatura de 37°C se reducía hasta 30°C. 10 h después del comienzo de la alimentación, la expresión de los genes de oxidación se indujo con 0,025% (v/v) de DCPK. El comienzo de la producción de hidroxilaurato de metilo (= comienzo de la biotransformación) se llevaba a cabo 14 h después del comienzo de la alimentación. Con este propósito, se añadieron 150 ml de una mezcla de laurato de metilo y ácido oleico (calidad técnica 90%) como lote al caldo de fermentación. Los resultados se muestran en las Figuras 1A-1D. Todos los mutantes muestran una producción de HLAME más rápida en comparación con el control (2-3 veces), una oxidación global más rápida en comparación con el control (1,5-2 veces) y una quimioselectividad (relación HLAME/DDAME) mejorada en todos los mutantes en comparación con el control (1,20 - 1,75 frente a 0,84). La producción de OLAME es baja en todas las cepas (1 g/l en el mutante V129A, en todas las otras cepas < 0,6 g/l).

Ejemplo 5

Cuantificación de productos basada en LC-ESI/MS2

Para cuantificar LAME y HLA en muestras de fermentación, se tomaron muestras 1/2/4/20/22 h después del comienzo de la biotransformación. Estas muestras se prepararon para el análisis. La cuantificación de eductos, productos intermedios y productos en muestras se fermentación se llevó a cabo por medio de LC-ESI/MS2 mediante referencia a una calibración externa para todos los analitos (0,1 — 50 mg/l) y usando el patrón interno ácido aminoundecanoico (AUD para HLAME) y d3-LAME (para LAME).

Se usaron los siguientes instrumentos:

• Sistema de HPLC 1260 (Agilent; Boblingen) con automuestreador (G1367E), bomba binaria (G1312B) y horno de columna (G1316A)

• Espectrómetro de masas TripelQuad 6410 (Agilent; Boblingen) con fuente de ESI

• Columna de HPLC: Kinetex C18, 100 x 2,1 mm, tamaño de partícula: 2,6 pm, tamaño de poro 100 Á (Phenomenex; Aschaffenburg)

• Precolumna: KrudKatcher Ultra HPLC In-Line Filter; altura del filtro 0,5 pm y 0,004 mm de diámetro interno (Phenomenex; Aschaffenburg)

Las muestras se prepararon al pipetear 1900 pl de disolvente (80% (v/v) de acetonitrilo, 20% de H2O doblemente destilada (v/v), 0,1% de ácido fórmico) y 100 pl de muestra en un recipiente de reacción de 2 ml. La mezcla se sometió a turbulencia durante aproximadamente 10 segundos y a continuación se centrifugó a aproximadamente 13.000 rpm durante 5 min. El sobrenadante transparente se retiró usando una pipeta y, después de una dilución apropiada, se analizó con diluyentes (80% (v/v) de ACN, 20% de H2O doblemente destilada (v/v), 0,1% de ácido fórmico). Se pipetearon 100 pl de ISTD en cada muestra de 900 pl (10 pl para un volumen de muestra de 90 pl).

La separación por HPLC se llevó a cabo con la columna y la precolumna susodichas. El volumen de inyección era 0,7 pl, la temperatura de la columna 50°C, el caudal 0,6 ml/min. La fase móvil consistía en el Eluyente A (0,1% de concentración de ácido fórmico acuoso (v/v)) y el Eluyente B (acetonitrilo con 0,1% (v/v) de ácido fórmico). Se usó el perfil del gradiente que se muestra en la Tabla 5:

Tabla 5. Perfil del gradiente usado en la separación por HPLC

Tiempo [min] Eluyente A [%] Eluyente B [%]

0 77 23

0,3 77 23

0,4 40 60

2,5 40 60

2,6 2 98

5,5 2 98

5,6 77 23

9 77 23

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula microbiana que expresa una enzima AlkB muíante, comprendiendo la enzima AlkB muíante al menos una mutación puntual en la secuencia silvestre de AlkB, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido V129 y/o T136 de la enzima AlkB silvestre,

en donde la mutación puntual en el aminoácido V129 se selecciona del grupo que consiste en V129T y V129A, en donde la AlkB silvestre comprende un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 60% con un polipéptido SEQ ID NO: 1.

2. La célula según la reivindicación 1, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido T136.

3. La célula según la reivindicación 1 o 2, en donde la mutación puntual en la posición del aminoácido T136 es T136A.

4. La célula según la reivindicación 1, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido V129 y se selecciona del grupo que consiste en V129T y V129A.

5. La célula según la reivindicación 1, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácidos V129 y T136.

6. La célula según la reivindicación 5, en donde la mutación puntual en la posición del aminoácido V129 se selecciona del grupo que consiste en V129T y V129A y la mutación puntual en la posición del aminoácido T136 es T136A.

7. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia silvestre de AlkB es SEQ ID NO:1.

8. La célula según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la célula está genéticamente modificada adicionalmente para comprender una expresión incrementada con relación a una célula silvestre de - una enzima E¹, una w-transaminasa capaz de catalizar la conversión de los ácidos omega-oxocarboxílicos y/o sus ésteres en los correspondientes ácidos omega-aminocarboxílicos y/o sus ésteres.

9. Un método para producir al menos un ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres a partir de al menos un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres como sustrato, comprendiendo el método

en donde el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato es un ácido carboxílico C⁶-C¹⁴y/o uno de sus ésteres; y

la enzima AlkB mutante comprende al menos una mutación puntual en la secuencia silvestre de AlkB, en donde la mutación puntual está en la posición del aminoácido seleccionada del grupo que consiste en V129, L132 y T136 de la enzima AlkB silvestre,

en donde la AlkB silvestre comprende un polipéptido con una identidad de secuencia de al menos 60% con un polipéptido SEQ ID NO: 1.

10. El método según la reivindicación 9, en donde la mutación puntual se selecciona del grupo que consiste en V129T, T136A, V129A y L132V.

11. El método según la reivindicación 9 o 10, en donde la secuencia silvestre de AlkB es SEQ ID NO:1.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato es ácido láurico y/o éster metílico de ácido láurico (LAME) y el correspondiente ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres es ácido omega-hidroxiláurico y/o éster metílico de ácido omega-hidroxiláurico (HLAME).

13. Un método para producir al menos un ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres a partir de al menos un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres como sustrato, comprendiendo el método

- poner en contacto al menos una célula genéticamente modificada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 con el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato.

14. Un método para producir al menos un ácido omega-aminocarboxílico y/o uno de sus ésteres a partir de al menos un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres como sustrato, comprendiendo el método

- poner en contacto la célula según la reivindicación 8 con el ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres usados como sustrato.

15. Uso de la célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para catalizar la conversión de un ácido carboxílico y/o uno de sus ésteres en un ácido carboxílico hidroxilado en omega y/o uno de sus ésteres y/o ácido omega-aminocarboxílico y/o uno de sus ésteres correspondientes.