JP6342337B2 - 組換え細胞、並びに、１，４−ブタンジオールの生産方法 - Google Patents

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Description

本発明は、メタノール等から１，４−ブタンジオールを生産可能な組換え細胞、及び当該組換え細胞を用いる１，４−ブタンジオールの生産方法に関する。
１，４−ブタンジオール（1,4-Butanediol）は合成ゴムのモノマーとして重要なブタジエンの原料となり得る有機化合物であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。１，４−ブタンジオールに関しても、例えば、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術が知られている（特許文献１）。
１，４−ブタンジオールの生合成経路の例を図１に示す。すなわち１，４−ブタンジオールは、例えば、コハク酸（Succinate）あるいはα−ケトグルタル酸（α-Ketoglutarate）を出発物質として生合成可能である。
コハク酸を出発物質とする経路では、コハク酸が、スクシニルＣｏＡ（Succinyl CoA）、コハク酸セミアルデヒド（Succinyl semialdehyde）、４−ヒドロキシ酪酸（4-Hydroxybutyrate）、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ（4-Hydroxybutyryl CoA）、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒド（4-Hydroxybutyraldehyde）を経て、１，４−ブタンジオールに変換される。各反応を触媒する酵素は、それぞれ、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素（Succinyl-CoA synthetase）、（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase）、（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（4-hydroxybutyrate dehydrogenase）、（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素（4-hydroxybutyryl-CoA transferase）、（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素（4-hydroxybutyryl-CoA reductase）、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）である（図１）。なお、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素は、全ての生物が有している。
また、コハク酸をコハク酸セミアルデヒドに直接変換する経路もある。その場合は、コハク酸が、コハク酸セミアルデヒド、４−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒドを経て、１，４−ブタンジオールに変換される。コハク酸をコハク酸セミアルデヒドに変換する反応を触媒する酵素は、（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（Succinate semialdehyde dehydrogenase）である（図１）。
一方、α−ケトグルタル酸を出発物質とする経路では、α−ケトグルタル酸が、コハク酸セミアルデヒド、４−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒドを経て、１，４−ブタンジオールに変換される。α−ケトグルタル酸をコハク酸セミアルデヒドに変換する反応を触媒する酵素は、（ｄ）２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素（2-oxoglutarate decarboxylase）である（図１）。
さらに、（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素（4-hydroxybutyraldehyde dehydorgenase）によって、４−ヒドロキシ酪酸から直接４−ヒドロキシブチルアルデヒドを生成させる経路もある（図１）。
ところで、Ｃ１化合物の中でも、メタノールは、天然ガス、及びバイオマスや都市ゴミ等の廃棄物を焼却することにより得られる一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素の混合ガスである合成ガス等から安価に製造される。天然ガスは化石資源の中でも多量に存在し、かつＣＯ2の発生量が比較的少ないことから次世代エネルギー源として注目され、従来の石油から天然ガスへの移行が進んでいる。メタノールは、水に可溶であること等、取り扱いや貯蔵が容易である上、微生物培養の炭素源としても適している。
メチロトローフ（Methylotroph）とは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。細菌であるメチロトローフには、メタンを資化できるものも多く、これらはしばしばメサノトローフ（Methanotroph）とも呼ばれる。
メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。図２に示されるように、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。一方、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、ＸｕＭＰ経路を保有している。
また、メチロトローフ細菌は、メタノール要求性の違いから、偏性メチロトローフ（obligate methylotroph）と、他の炭素化合物も利用できる通性メチロトローフ（facultative methylotroph）とに分類される。
国際公開第２０１０／１４１９２０号
再生可能資源からの生産プロセスについて、その従来技術のほとんどは、上記１，４−ブタンジオール生産技術を含めて、有機物、特に糖、グルセロールもしくは油成分等に依存した、微生物による生産法である。しかし、石油に由来する数多くの基幹化学品の世界的な生産量を賄うには、植物資源等に由来する現状使用可能な糖質、グリセリンや油成分の量では、微生物の炭素源として不足するのは必須である。すなわち、糖質や油成分に依存する微生物による基幹化学品の生産量は、将来に渡っても限定的である。また、このようなプロセスは、食との競合も懸念される。
上記現状に鑑み、本発明は、メタノール等から１，４−ブタンジオールを生産するための一連の技術を提供することを目的とする。
上記した課題を解決するための１つの様相は、メチロトローフである宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
図１に示すように、１，４−ブタンジオールは、コハク酸から生合成可能である。そして本様相の組換え細胞は、コハク酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、メチロトローフである宿主細胞に導入されたものであり、宿主細胞内で当該遺伝子が発現する。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。
本様相の組換え細胞によれば、メチロトローフが本来的に有する「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、コハク酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
同様の課題を解決するための他の様相は、メチロトローフである宿主細胞に、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
図１に示すように、１，４−ブタンジオールは、α−ケトグルタル酸からも生合成可能である。そして本様相の組換え細胞は、α−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、メチロトローフである宿主細胞に導入されたものであり、宿主細胞内で当該遺伝子が発現する。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。
本様相の組換え細胞によれば、メチロトローフが本来的に有する「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、α−ケトグルタル酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与又は増強される。
好ましくは、宿主細胞がメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
一般に、酵母はアルコールに対する耐性が高い。そこで本様相では宿主としてメタノール資化性酵母を採用し、組換え細胞の１，４−ブタンジオールに対する耐性を高めている。さらに、酵母では一般に、メタノールからホルムアルデヒドへの変換反応をアルコールオキシダーゼが担っている。そのため、当該変換反応には酸素が必要であり、具体的には培養時に激しく通気する必要がある。そこで本様相では「メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素」をコードする遺伝子を導入し、酸素に頼ることなくメタノールからホルムアルデヒドへの変換反応が行われるようにしている。
同様の課題を解決するための他の様相は、宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
本様相の組換え細胞は、宿主細胞に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入され、さらに、コハク酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されている。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。
すなわち本様相の組換え細胞は、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されているので、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、これらの外来遺伝子によって付与された「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、コハク酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
同様の課題を解決するための他の様相は、宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
本様相の組換え細胞は、宿主細胞に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入され、さらに、α−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されている。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。
すなわち本様相の組換え細胞は、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されているので、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、これらの外来遺伝子によって付与された「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、α−ケトグルタル酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
好ましくは、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子は、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子及び６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子である。
かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与される。
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
同様の課題を解決するための他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
同様の課題を解決するための他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
これらの様相は、例えば、リブロースモノリン酸経路を有する非メチロトローフが宿主細胞である態様に相当するものである。
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
好ましくは、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、メタノールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
メタノールデヒドロゲナーゼ（Methanol dehydrogenase）とアルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）は、いずれもメタノールをホルムアルデヒドに変換する作用を有する。また、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Formaldehyde dehydrogenase）はギ酸をホルムアルデヒドに変換する作用を有する。これらの酵素は、いずれも細菌に属するメチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。一方、酵母に属するメチロトローフはメタン酸化活性を有さず、アルコールオキシダーゼ（Alcohol oxidase）の働きによってメタノールをホルムアルデヒドへ変換する作用を有する。酵母もギ酸をホルムアルデヒドへ変換する酵素活性を有する。
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。
メタンモノオキシゲナーゼ（Methane monooxygenase）はメタンをメタノールに変換する作用を有する。メタンモノオキシゲナーゼも、メチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。
好ましくは、導入された遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている。
かかる構成により、導入された遺伝子がより安定的に組換え細胞内で保持される。
好ましくは、導入された遺伝子がプラスミドに組み込まれている。
好ましくは、少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する。
かかる構成により、１，４−ブタンジオールをより大量に生産することができる。
好ましくは、少なくとも２％（ｖ／ｖ）のメタノールに対する耐性を有する。
かかる構成により、１，４−ブタンジオールをより大量に生産することができる。
他の様相は、上記の組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に１，４−ブタンジオールを生産させる１，４−ブタンジオールの生産方法である。
本様相は１，４−ブタンジオールの生産方法に係るものである。本様相では、上記した組換え細胞をメタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として培養することにより、当該組換え細胞に１，４−ブタンジオールを生産させる。本様相によれば、メタノール等から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
他の様相は、上記の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産させる１，４−ブタンジオールの生産方法である。
本様相では、上記した組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該Ｃ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産させる。本様相によっても、メタノール等から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
本発明の１つの様相は、Pichia属、Methylobacterium属、又はMethylophilus属に属するメチロトローフの組換え細胞であって、外来遺伝子として、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、メタノールから１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
好ましくは、Pichia pastolis、Methylobacterium extorquens、又はMethylophilus methylotrophusの組換え細胞である。
好ましくは、外来遺伝子として、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とをさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する。
好ましくは、Pichia属に属するメチロトローフの組換え細胞であり、外来遺伝子として、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する。
本発明の１つの様相は、大腸菌又はBacillus属細菌の組換え細胞であって、外来遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子と、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子と、を有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、メタノールから１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
好ましくは、大腸菌又はBacillus subtilisの組換え細胞である。
好ましくは、外来遺伝子として、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する。
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。
好ましくは、前記遺伝子が組換え細胞のゲノムに組み込まれている。
好ましくは、前記遺伝子がプラスミドに組み込まれている。
好ましくは、少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する。
好ましくは、少なくとも２％（ｖ／ｖ）のメタノールに対する耐性を有する。
本発明の１つの様相は、上記の組換え細胞を、メタノールを炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に１，４−ブタンジオールを生産させる１，４−ブタンジオールの生産方法である。
本発明の１つの様相は、上記の組換え細胞にメタノールを接触させ、当該組換え細胞に前記メタノールから１，４−ブタンジオールを生産させる１，４−ブタンジオールの生産方法である。
本発明の組換え細胞によれば、メタノールから１，４−ブタンジオールを生産することができる。
本発明の１，４−ブタンジオールの生産方法についても同様であり、メタノールから１，４−ブタンジオールを生産することができる。
コハク酸又はα−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る代謝経路を表す説明図である。 ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路を表す説明図である。
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
本発明の組換え細胞は、基本的に、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」とを有する宿主細胞に、コハク酸あるいはα−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群をコードする遺伝子が導入されたものである。
本発明で採用される宿主細胞としては、メチロトローフである宿主細胞と、非メチロトローフを含めた広範囲の宿主細胞の両方がある。
上述したように、メチロトローフとは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物を指す。一般にメチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路、具体的には、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能（経路）とホルムアルデヒド固定化能（ホルムアルデヒドの固定化経路）とを、本来的に保有している。
ホルムアルデヒドの固定化経路としては、図２に示すセリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、キシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が挙げられる。一般に、メチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路を保有している。
ここで、各々のホルムアルデヒド固定化経路（図２）について説明する。
セリン経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（serine hydroxymethyltransferase）による、グリシンと５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸からのセリン生成反応である。５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は、ホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸の結合によって生じる。セリン経路では、１分子のホルムアルデヒドから１分子のアセチルＣｏＡが直接生成する。
ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」と略記することがある）による、リブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのＤ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸の生成反応、並びに、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（6-phosphate-3-hexuloisomerase、以下「ＰＨＩ」と略記することがある）による、Ｄ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸からのフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）の生成反応である。
本経路で生成するＦ６Ｐ等は解糖系へも供され、その後アセチルＣｏＡや、グリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸を生成する。Ｆ６Ｐの場合、１分子あたり、２分子のＧ３Ｐに変換され、次いで２分子のピルビン酸を経て２分子のアセチルＣｏＡが生成する。
ＸｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（dihydroxyacetone synthase）による、キシルロース５リン酸（Ｘｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）及びグリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）の生成反応である。本経路で生成したＧ３Ｐは解糖系にも供され、ピルビン酸とアセチルＣｏＡに変換される。ジヒドロキシアセトンもリン酸化によって解糖系へ供され、Ｇ３Ｐ、ピルビン酸、及びアセチルＣｏＡへと変換され得る。
本発明の組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能なものである。例えば、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼを有する組換え細胞の場合には、メタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
また、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼに加えてメタンモノオキシゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、メタンをメタノールに変換し、続いてメタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
さらに、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
一般に、細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、メタンモノオキシゲナーゼとメタノールデヒドロゲナーゼを有しているので、メタン又はメタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、アルコールオキシダーゼを有しているので、メタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、メチロトローフはホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有しており、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
上記メタノールデヒドロゲナーゼには、グラム陰性細菌のメチロトローフに見出されるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ: pyrroloquinoline quinone）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＮＡＤ（Ｐ）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＤＭＮＡ（N,N'-dimethyl-4-nitrosoaniline）依存型メタノールオキシドリダクターゼ（Park H. et al., Microbiology 2010, 156, 463-471）が含まれる。酵母でのメタノールからホルムアルデヒドへの変換は、通常、酸素依存型であるアルコールオキシダーゼによって触媒される。
また、アミンオキシダーゼ（amine oxidase）やメチルアミンデヒドロゲナーゼ（methylamine dehydrogenase）を有する組換え細胞の場合には、メチルアミンをホルムアルデヒドに変換することができる。これらの酵素については、一部のメチロトローフやArthrobacter属細菌が有していることが知られている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
またホルムアミドをホルムアルデヒドに変換する酵素が、一部の微生物で見出されている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
そして、ホルムアルデヒドを経由して１，４−ブタンジオールを生産することができる。
宿主細胞として用いられるメチロトローフの種類としては、特に限定はないが、例えば細菌や酵母に分類されるものを採用することができる。
メチロトローフ細菌としては、例えば、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylophilus属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属する細菌が挙げられる。
メチロトローフ酵母としては、例えば、Pichia属、Candida属、Saccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、Kloeckera属、などに属する酵母が挙げられる。Pichia属酵母の例としては、P. haplophila、P. pastoris、P. trehalophila、P. lindnerii、などが挙げられる。Candida属酵母の例としては、C. parapsilosis、C. methanolica、C. boidinii、C. alcomigas、などが挙げられる。Saccharomyces属酵母の例としては、Saccharomyces metha-nonfoams、などが挙げられる。Hansenula属酵母の例としては、H. wickerhamii、H. capsulata、H. glucozyma、H. henricii、H. minuta、H. nonfermentans、H. philodendra、H. polymorpha、などが挙げられる。Torulopsis属酵母の例としては、T. methanolovescens、T. glabrata、T. nemodendra、T. pinus、T. methanofloat、T. enokii、T. menthanophiles、T. methanosorbosa、T. methanodomercqii、などが挙げられる。
宿主細胞が非メチロトローフである場合には、メタノール等をホルムアルデヒドに変換する経路を有しているとは限らないので、少なくとも「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与する必要がある。さらに、「メタンをメタノールに変換する機能」を付与することが好ましい。これらの機能付与は、上記した酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより、実現することができる。
例えば、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼ(例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）をコードする遺伝子やアルコールオキシダーゼ（例えばEC1.13.13）をコードする遺伝子を用いることができる。また、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えばEC1.2.1.46）をコードする遺伝子を用いることができる。さらに、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子として、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を用いることができる。
また、メタノール資化性を付与するプラスミドが知られている。例えば、Bacillus methanolicusのメタノール資化性は、メタノール代謝に関わる酵素群をコードするプラスミドに依存している（Brautaset T. et al., J. Bacteriology 2004, 186(5), 1229-1238）。このようなプラスミドを近縁の非メチロトローフに導入することで、メタノール資化能を付与することが可能である。さらには、このようなプラスミドを改変することで、様々な非メチロトローフにメタノール資化性を付与することも可能である。
上記のようにして非メチロトローフに対して「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与し、さらに「ホルムアルデヒドの固定化能」を付与することにより、非メチロトローフをメチロトローフと同様に取り扱うことが可能となる。ホルムアルデヒド固定化能の付与は、例えば、上記したセリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路で作用する酵素をコードする遺伝子を非メチロトローフに導入することにより、実現することができる。
１つの好ましい実施形態では、宿主細胞がメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。例えば、メタノール資化性を備えたPichia属酵母を宿主細胞として用い、さらにメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、目的の組換え細胞を取得することができる。本実施形態によれば、高アルコール耐性であり、かつ酸素に頼らずにメタノールをホルムアルデヒドに変換できる、１，４−ブタンジオールを生産可能な組換え細胞を得ることができる。
ＲｕＭＰ経路を付与する場合を例として、さらに説明する。ＲｕＭＰ経路の付与は、例えば、上記した３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）遺伝子を導入することにより、実現することができる。すなわち、ＨＰＳ／ＰＨＩによるホルムアルデヒド固定化反応の基質又は生成物である、リブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）は、ペントースリン酸経路、及びカルビン回路の代謝中間体として全ての生物に普遍的に存在する。したがって、ＨＰＳ／ＰＨＩの導入により、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、及び酵母等をはじめとする全ての生物にホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能である。
元々ＲｕＭＰ経路を有している宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。これにより、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。例えば、枯草菌のように、元々ＲｕＭＰ経路もしくはこれと同質の経路を有する微生物に、例えばメタノールデヒドロゲナーゼ (例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）等のアルコール脱水素酵素、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）、等の酵素をコードする遺伝子を導入することで、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能（すなわちメタノール資化性）を付与すると共に、ホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。
なお、メチロトローフである宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。すなわち、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、あるいはＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへＨＰＳ／ＰＨＩを導入することで、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。その結果、組換え細胞のホルムアルデヒド耐性を高めることができ、結果的にメタノールやギ酸に対する耐性及び資化能を高めることが可能となる。これにより、組換え細胞の培養効率や１，４−ブタンジオールの生産効率を向上させることが可能となる。
一方、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与する場合には、上記したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（例えばEC2.1.2.1）遺伝子を用いることができる。例えば、非メチロトローフに、メタノールデヒドロゲナーゼ等のアルコール脱水素酵素遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸（5,10-methylenetetrahydrofolate）(CH2=H4F) 合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (例えばEC2.1.2.1）遺伝子等を導入することで、メタノール資化性と、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能となる。
本発明の組換え細胞では、コハク酸あるいはα−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群（以下、まとめて「１，４−ブタンジオール生合成関連酵素（群）」と呼ぶことがある）をコードする遺伝子が導入されている。図１の（ａ）〜（ｉ）で示される酵素が、１，４−ブタンジオール生合成関連酵素に相当する。
１つの様相では、コハク酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群として、（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素、（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、宿主細胞に導入されている。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入すればよい。
また、他の様相では、α−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群として、（ｄ）２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、宿主細胞に導入されている。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入すればよい。
これらの酵素（１，４−ブタンジオール生合成関連酵素）としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。これらの酵素をコードする遺伝子についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。宿主細胞由来のものでもよいし、他の由来のものでもよい。
１，４−ブタンジオール生合成関連酵素及びその遺伝子の具体例としては、上記特許文献１に開示されたものが挙げられる。例えば、以下の酵素が挙げられる。なお、宿主細胞が以下に示す酵素を元々有する場合、より基質特異性、分子活性及び安定性が優れた、すなわちＫｃａｔ／Ｋｍ値等がより高い酵素遺伝子を導入すればよい。この場合、前記酵素遺伝子には、宿主細胞が元々保有する酵素の改変体をコードする遺伝子も含まれる。導入遺伝子のコドンの最適化や低頻度の回避は、「Codon Usage Database」（http://www.kazusa.or.jp/codon/）を参照し、各宿主微生物において行うことができる。
（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（Succinate semialdehyde dehydrogenase：例えば、EC 1.2.1.16, EC 1.2.1.24）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB No.で表示）：P76149 (E. coli); P25526 (E. coli); P94428 (Bacillus subtilis); Q55585 (Synechocystis sp.); P38067 (Saccharomyces cerevisiae)等
（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素（Succinyl CoA synthetase, Succinyl CoA ligase：例えば、EC 6.2.1.4, EC 6.2.1.5等）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0AGE9 (E. coli); P0A836 (E. coli); P53598 (Saccharomyces cerevisiae); P53312 (Saccharomyces cerevisiae); P09143 (Thermus thermophilus); O82662 (Arabidopsis thaliana)等。本酵素活性は、すべての生物が保有するが、必要に応じて外来遺伝子として導入することも有効である。
（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase：例えば、EC 1.2.1.79）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P38947 (Clostridium kluyveri); A4YGN0 (Metallosphaera sedula)等。
（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（4-hydroxybutyrate dehydrogenase:例えばEC 1.1.1.61）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：D8GUP1 (Clostridium ljungdahlii); C9YNR6 (Clostridium difficile); Q97IR6 (Clostridium acetobutylicum);Q8XYI7 (Ralstonia solanacearum) ; Q7MWD4 (Porphyromonas gingivalis)等。
（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素（4-hydroxybutyryl-CoA transferase: 例えばEC2.8.3.a）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：Q9RM86 (Clostridium aminobutyricum); P38942 (Clostridium kluyveri); Q185L2 (Clostridium difficile); Q3ACH6 (Carboxydothermus hydrogenoformas); C4Z8H6 (Eubacterium rectale) ; I8UF15 (Porphyromonas gingivalis)等。
（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素（4-hydroxybutyryl-CoA reductase: 例えばEC1.2.1.10等、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素活性は、CoA-acylating aldehyde dehydrogenaseの逆反応の触媒活性を示す）
遺伝子の例：Q716S8 (Clostridium beijerinckii); Q7X4B7 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum); A5HYN9 (Clostridium botulinum); P0A9Q7 (E. coli) （以上、UniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）; GenBank CAQ57983 (Clostridium saccharobutylicum); NCBI ZP_03705305 (Clostridium methylpentosum); NCBI ZP_08533507 (Caldalkalibacillus thermarum)等。
（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase：例えばEC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2等）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0A4X1 (Mycobacterium bovis); P00331（Saccharomycess cerevisiae）; P00330（Saccharomycess cerevisiae）; Q9HIM3 (Thermoplasma acidophilum); B9WPR7 (Arthrobacter sp.); P00334 (Drosophila melanogaster)等。
なお、上記（ｇ）及び（ｈ）の２段階の酵素反応ステップは、アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ（aldehyde/alochohol dehydrogenase）(adhE: EC1.1.1.1, 1.1.1.10等）の作用によっても触媒され得る。すなわちadhEは、上記（ｇ）と（ｈ）の両方に該当する。adhEの例としては、D8GU53(Clostridium ljungdahlii)、D8GU52(Clostridium ljungdahlii)、Q9ANR5 (Clostridium acetobutylicum)、P0A9Q7 (E. coli)、F7TVB7 (Brevibacillus laterosporus)等がある（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）。
（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素（4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase）
本酵素は４−ヒドロキシ酪酸から４−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換を可逆的に触媒できる酵素であり、酵素分類上、アルデヒドデヒドロゲナーゼ (例えばEC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4, EC 1.2.1.5等)に属する。
４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素活性を示すアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：E4R8S4 (Pseudomonas putida); P23883 (E. coli); P12693 (Pseudomonas putida); P40047 (Saccharomyces cerevisiae); P25553 (E. coli); P0C6D7 (Vibrio sp.); P47771 (Saccharomyces cerevisiae); G3XYI2 (Aspergillus niger)等。
（ｄ）２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素（2-oxoglutarate decarboxylase：例えばEC 4.1.1.71）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：A0R2B1 (Mycobacterium smegmatics); I0WZ48 (Rhodococcus imtechensis); G2EJR8 (Corynebacterium glutamicum); J1S9U2 (Streptomyces auratus); J7LQH4 (Arthrobacter sp.)等。
なお、導入される「１，４−ブタンジオール生合成関連酵素」の遺伝子の種類（数）は、組換え細胞が「メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能」である限り、少なくとも１つでよい。ただし、２種以上の遺伝子を導入することにより各酵素の活性が増強される場合は、１，４−ブタンジオールの生産性が高まることが期待される。基本的に、宿主細胞が保有していない１，４−ブタンジオール生合成関連酵素については、当該酵素をコードする遺伝子を外部から導入する。また、宿主細胞が保有しているが分子活性が低い場合には、より分子活性等、の高い酵素をコードする遺伝子を導入することが好ましい。
１，４−ブタンジオール生合成関連酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
本発明の組換え細胞においては、１，４−ブタンジオール生合成関連酵素をコードする遺伝子等に加えて、他の遺伝子がさらに導入されていてもよい。導入する遺伝子としては、例えば、上記したメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、メタンモノオキシダーゼ遺伝子、ＨＰＳ／ＰＨＩ遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子、等が挙げられる。
宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
例えば、メチロトローフ細菌の染色体への組み込み方法としては、リブロースモノリン酸経路を有するMethylobacillus flagellatusや、セリン経路を有するMethylobacterium extorquencsで、目的遺伝子の破壊操作によって例が示されている（Chistoserdova L. et al., Microbiology 2000, 146, 233-238; Chistoserdov AY., et al., J. Bacteriol 1994, 176, 4052-4065）。これらは環状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法であるが、Methylophilus属細菌等では、直鎖状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法も開発されている（特開２００４−２２９６６２号公報）。一般に、宿主細胞による分解を受けにくい場合は、直鎖状ＤＮＡによるゲノム組換えの方が、環状ＤＮＡによるよりも効率的である。また通常、相同組換え法は、inverted-repeat sequence等のように、ゲノム上に多コピー存在する遺伝子を標的することが好ましい。また、ゲノムに多コピー導入する手法としては、相同組換え以外に、トランスポゾンに搭載する方法もある。メチロトローフ細菌へのプラスミドによる遺伝子導入法としては、例えば、広宿主域ベクターであるpAYC32 (Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167)、pRP301 (Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34)、pBBR1、pBHR1 (Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799)、pCM80 (Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等がある。
メチロトローフ酵母における遺伝子導入方法としては、主にPichia pastorisで確立されており、pPIC3.5K、pPIC6、pGAPZ、pFLD（インビトロジェン社）等のベクターが市販されている。
Bacillus属細菌への遺伝子導入にできる使用プラスミドとしては、Bacillus subtilisには、pMTLBS72 (Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54(3), 241-248)、pHT01（フナコシ社）、pHT43（フナコシ社）等が、Bacillus megateriumには、p3STOP1623hp （フナコシ社）、pSPYocHhp（フナコシ社）等が、Bacillus brevisには、pNI DNA（タカラバイオ社）等がある。
またベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の遺伝子を導入する例としては、宿主細胞がメチロトローフである場合に、「１，４−ブタンジオール生合成関連酵素をコードする遺伝子」に加えて、ＨＰＳ／ＰＨＩ遺伝子を導入する態様が挙げられる。
以上のようにメチロトローフ等で使用できる既知のベクターを示したが、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変することができる。改変方法としては各宿主細胞、もしくはその近縁種における天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、また人工の遺伝子配列に変更してもよい。
また、以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることで、宿主細胞での導入遺伝子の発現量、宿主細胞の１，４−ブタンジオール排出機能、１，４−ブタンジオール耐性、等を向上させることにより、１，４−ブタンジオールの生産性をさらに向上させることが可能となる。
すなわち、本発明においては、外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでもよいし、プラスミドに組み込んでもよい。
１つの好ましい実施形態では、組換え細胞が、少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する。別の好ましい実施形態では、組換え細胞が、少なくとも２％（ｖ／ｖ）のメタノールに対する耐性を有する。かかる構成により、１，４−ブタンジオールの高生産が可能となる。このような特性を有する組換え細胞は、例えば、適宜の変異処理を宿主細胞に施して目的の特性を有する宿主細胞を選抜し、その宿主細胞を用いることにより得ることができる。
本発明は、下記(i)〜(iv)を包含する。
(i) メチロトローフである宿主細胞、メタノール及び／若しくはギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子とホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入された宿主細胞、又はリブロースモノリン酸経路を有しかつメタノール及び／若しくはギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入された宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
(ii) メチロトローフである宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
(iii) 宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
(iv) リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
本発明の１，４−ブタンジオールの生産方法の１つの様相では、上記した組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に１，４−ブタンジオールを生産させる。炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。
なお、偏性メチロトローフの場合は、Ｃ１化合物を唯一の炭素源とする合成培地を用いることが基本であるが、これに酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の天然培地やビタミン類を少量加えることによっても菌の増殖は促進される。通性メチロトローフである場合は、菌体増殖ステージでは糖質、脂質等のＣ１化合物以外の物質を炭素源としてもよく、１，４−ブタンジオール生産ステージで炭素源を上記Ｃ１化合物に変更すればよい。微生物の培養法としては、目的に応じて好気、微好気、もしくは嫌気条件で培養可能である。またバッチ培養、流加培養、連続培養のいずれの方法でもよい。
炭素源として例えばメタノールを用いる場合は、通常、細菌の場合は１．０％(ｖ/ｖ)濃度、酵母の場合は３．０％（v/v）濃度以下で用いるが、人為的にこれらに対する耐性を改良した場合は、それ以上の濃度でも培養可能である。
本発明の１，４−ブタンジオールの生産方法の別の様相では、上記した組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産させる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物を接触させて、１，４−ブタンジオールを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、１，４−ブタンジオールを連続的に生産させることができる。
本様相においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
生産された１，４−ブタンジオールは、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、細胞外に放出された１，４−ブタンジオールを回収し、蒸留等によって単離精製することにより、純化された１，４−ブタンジオールを取得することができる。
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへの１，４−ブタンジオール（１，４−ＢＤＯ）合成酵素遺伝子の導入と、組換え体を用いたメタノールからの１，４−ＢＤＯの生産
本実施例では、ＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフとして、メタノール資化性酵母Pichia pastolis GS115株（インビトロジェン社）を使用した。
１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号１の人工合成遺伝子(7773 bp)を構築した。該遺伝子クラスターは、sucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
配列番号１の人工合成遺伝子を、pT7 blue-2 vector (Novagen社)のSmaI/NotI切断部位へクローニングした。該プラスミドを大量調製した後、SmaI及びNotIで切断し、挿入遺伝子を回収した。回収した遺伝子断片をｐＰＩＣ３．５Ｋ（インビトロジェン社）のSnaBI/NotI切断部位へ導入し、1,4-BDO合成遺伝子が導入されたベクターｐＰＢＤＯを構築した。本ベクターは、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ）プロモーター、及びＡＯＸＩターミネーターのコントロール下で、sucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。本ベクターの導入によって、酵母においてスクシニルＣｏＡから１，４−ＢＤＯの合成が可能となる。
Pichia pastoris GS115株へのｐＰＢＤＯによる１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子発現ユニットの導入は、インビトロジェン社マニュアル「Version D 032002/25-0156」に従って行った。マルチコピーの遺伝子導入体を得るために、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（インビトロジェン社）耐性株を取得した。これによって、外来の１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子を複数コピー保持するメタノール資化性酵母GS115BDO株を構築した。またコントロール株として１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticinに耐性のある、ｐＰＩＣ３．５Ｋのみが導入されたGS11535K株も得た。
GS115BDO株及びGS11535K株を、それぞれ、メタノールを唯一の炭素源とする２０ｍＬの合成Ａ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール２０ｍＬを含む。）にて、好気的に、３０℃で６４時間培養した。菌体を回収した後、回収菌体を４５ｍＬの合成Ａ培地で、さらに３０℃で１６時間振とう培養した。培養終了後、培養から遠心分離によって培養上清を得た。培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析した。
その結果、GS11535K株では１，４−ＢＤＯは検出されなかったが、GS115BDO株では１，４−ＢＤＯが有意に検出された。この際の１，４−ＢＤＯの生成濃度は１３ｍＭであった。
以上のことから、本実施例によって、メタノール資化経路の１種であるＸｕＭＰ経路を介した、真核微生物（酵母）による１，４−ＢＤＯ生産が可能であることがわかった。
非メチロトローフへのメタノールデヒドロゲナーゼ、ＨＰＳ遺伝子、ＰＳＩ遺伝子、及びイソプレン合成酵素遺伝子の導入と、組換え体によるメタノールからの１，４−ＢＤＯ生産
本実施例では、非メチロトローフとしてBacillus subtilisを使用した。
１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号６の人工合成遺伝子(10600 bp)を構築した。該遺伝子クラスターは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３−ヘキスロース−６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３−ヘキスロース−６−リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
配列番号６の人工合成遺伝子を、pUC119のSmaI/XbaI切断部位へクローニングした。該プラスミドを大量調製した後、SmaI及びXbaIで切断し、挿入遺伝子を回収した。回収した遺伝子をBacillus subtilis用発現ベクターpHT01(MoBiTec社）のXbaI/SmaI切断部位へ導入し、pHTBDOを作製した。pHTBDOは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３−ヘキスロース−６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３−ヘキスロース−６−リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。
コントロールベクターとして、pHTBDOがコードする上記７つの酵素群からMDHを除いた発現ベクターpHTMDH(-)を構築した。さらに、pHTBDOがコードする上記７つの酵素群から１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子であるSucD、4HBd、abfT、及びadhE2を除いた発現ベクターpHTBDO(-)を作製した。
MoBiTec社マニュアル「Bacillus subtilis Expression Vectors」に従って、各発現ベクターをBacillus subtilisに導入し、組換え体（組換え細胞）を作製した。これにより、発現ベクターｐＨＴＢＤＯを保持するＢＳＢＤＯ株、発現ベクターｐＨＴＭＤＨ（−）を保持するＢＳＭＤＨ（−）株、及び、発現ベクターｐＨＴＢＤＯ（−）を保持するＢＳＢＤＯ（−）株を、それぞれ作製した。
各組換え体を、１００ｍＬのメタノール資化誘導培地（メタノール１０ｍＬ、リン酸アンモニウム３ｇ、塩化カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、０．０１ｍＭ ＩＰＴＧ、及びクロラムフェニコール５ｍｇを、１Ｌの水道水中に含む。）にて、好気的に３７℃で培養液のＯＤ６００が１．５になるまで培養した。培養終了後、培養上清を遠心分離によって得、ＬＣ／ＭＳによって分析した。
その結果、ＢＳＢＤＯ株では、１，４−ＢＤＯが有意に検出され、その濃度は９ｍＭ
(１ＯＤ６００当たり６ｍＭ)であった。一方、ＢＳＢＤＯ（−）株では１，４−ＢＤＯは検出されなかった。なお、ＭＤＨを有しないＢＳＭＤＨ（−）株は、ほとんど生育しなかった。
以上のことから、非メチロトローフであるBacillus subtilisにＭＤＨ遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、及びＰＨＩ遺伝子を導入することで、メタノールを主要炭素源する培地で効率良く生育させることが可能であり、かつ１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号６）を導入することで、効率的に１，４−ＢＤＯが生成することがわかった。
１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子が導入された、セリン経路を有するメチロトローフの作製と、組換え体によるメタノールからの１，４−ＢＤＯの生産
本実施例では、セリン経路を有するメチロトローフとして、Methylobacterium extorquens (ATCC 55366)を使用した。
１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号１０の人工合成遺伝子（6922 bp）を構築した。該遺伝子クラスターは、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
配列番号１０の人工合成遺伝子をpUC119のHindIII/XbaI切断部位へクローニングした。該プラスミドを大量調製した後、HindIII及びXbaIで切断し、挿入遺伝子を回収した。回収した本遺伝子を広域ベクターpＣＭ８０(Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトへ導入し、ｐＣ８０ＢＤＯを作製した。本ベクターは、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。また、各酵素遺伝子のコドン改変として、UUA(Leu)はUUG(Leu)に、AUA(Ile)はAUC(Ile)に変換された。発現ベクターｐＣ８０ＢＤＯをエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ−ＢＤＯ株を得た。コントロールとして、発現ベクターｐＣＭ８０をエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ−ＣＭ８０株を得た。
ＭＥ−ＢＤＯ株又はＭＥ−ＣＭ８０株を、メタノールを唯一の炭素源とする合成Ｂ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、及びテトラサイクリン１０ｍｇを含む。）１００ｍＬにて、好気的に３０℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．８になるまで培養し、遠心分離によって培養上清を回収した。回収した培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析した。
その結果、ＭＥ−ＢＤＯ株で１，４−ＢＤＯが検出され、その濃度は１１ｍＭ（１ＯＤ６００当たり６．２ｍＭ）であった。一方、ＭＥ−ＣＭ８０株では１，４−ＢＤＯは検出されなかった。
以上のことから、セリン経路を有するメチロトローフへ、１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号１０）を導入することによって、メタノールからの効率的な１，４−ＢＤＯの生産が可能であることが示された。
ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフへの１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子の導入と、組換え体を用いるメタノールからの１，４−ＢＤＯの生産
本実施例では、ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフとして、Methylophilus methylotrophus (ATCC 53528)を使用した。
実施例３にて作製したｐＣ８０ＢＤＯをエレクトロポレーションによってM. methylotrophusへ導入し、ＭＭ−ＢＤＯ株を得た。コントロールとして、ｐＣＭ８０をエレクトロポレーションによってM. methylotrophusへ導入し、ＭＭ−ＣＭ８０株を得た。
ＭＭ−ＢＤＯ株又はＭＭ−ＣＭ８０株を、実施例３で使用したメタノールを唯一の炭素源とする合成Ｂ培地（但し、メタノール濃度は１%(v/v)とした）１００ｍＬにて、好気的に３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．８−２．０の時点で、遠心分離によって培養上清を回収した。培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析した。その結果、ＭＭ−ＢＤＯ株では、１，４−ＢＤＯが検出されたが、ＭＭ−８０株では検出されなかった。ＭＭ−ＢＤＯ株によって産生された１，４−ＢＤＯの蓄積濃度は１５ｍＭ（１ＯＤ６００当たり８．３ｍＭ）であった。
以上のことから、ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフへ、１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号１０）を導入することによって、メタノールからの効率的な１，４−ＢＤＯの生産が可能であることが示された。
大腸菌へのメタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、及び１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子の導入と、組換え体によるメタノールから１，４−ＢＤＯの生産
１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号１１の人工合成遺伝子(9123 bp)を構築した。該遺伝子クラスターは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３−ヘキスロース−６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３−ヘキスロース−６−リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
配列番号１１の人工合成遺伝子を、ｐＴｒｃ９９ＡベクターのNcoI/HindIII切断部位へクローニングし、ｐＴｒｃＭｅＢＤＯを作製した。ｐＴｒｃＭｅＢＤＯは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３−ヘキスロース−６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３−ヘキスロース−６−リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。
コントロールベクターとして、ｐＴｒｃＭｅＢＤＯがコードする上記７つの酵素群からMDHを除いた発現ベクターｐＴｒｃＭＤＨ（−）を構築した。さらに、ｐＴｒｃＭｅＢＤＯがコードする上記７つの酵素群から１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子であるSucD、4HBd、abfT、及びadhE2を除いた発現ベクターｐＴｒｃＢＤＯ（−）を作製した。
発現ベクターｐＴｒｃＭｅＢＤＯ、ｐＴｒｃＭＤＨ（−）もしくはｐＴｒｃＢＤＯ（−）を大腸菌Ｋ１２株へ導入し、それぞれＥＫＭｅＢＤＯ株、ＥＫＭＤＨ（−）株、及びＥＫＢＤＯ（−）株を得た。
各々の組換え大腸菌を、０．０５ｍＭ濃度のＩＰＴＧを含有するメタノール資化合成Ｃ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、クロラムフェニコール３４ｍｇ、及びアンピシリン１００ｍｇを含む。）１００ｍＬにて、好気的に３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０−１．６の時点で、遠心部分離によって培養上清を回収した。
回収した培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析したところ、ＥＫＭｅＢＤＯ株では１，４−ＢＤＯが１１ｍＭ（１ＯＤ６００当たり６．９ｍＭ）生成していたが、ＥＫＢＤＯ（−）株ではほとんど検出されなかった。なお、ＥＫＭＤＨ（−）株は全く生育しなかった。
以上のことから、非メチロトローフである大腸菌にＭＤＨ遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、及びＰＨＩ遺伝子を導入することで、メタノールを主要炭素源する培地で効率良く生育させることが可能であり、かつ１，４−ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号１１）を導入することで、効率的に１，４−ＢＤＯが生成することがわかった。

Claims (14)

  1. Pichia属、Methylobacterium属、又はMethylophilus属に属するメチロトローフの組換え細胞であって、
    外来遺伝子として、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子を有し、
    当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
    メタノールから１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  2. Pichia pastolis、Methylobacterium extorquens、又はMethylophilus methylotrophusの組換え細胞である請求項１に記載の組換え細胞。
  3. 外来遺伝子として、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とをさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する請求項１又は２に記載の組換え細胞。
  4. Pichia属に属するメチロトローフの組換え細胞であり、外来遺伝子として、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する請求項１〜３のいずれかに記載の組換え細胞。
  5. 大腸菌又はBacillus属細菌の組換え細胞であって、
    外来遺伝子として、
    メタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子と、
    ３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、
    ６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子と、
    ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子と、を有し、
    当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
    メタノールから１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  6. 大腸菌又はBacillus subtilisの組換え細胞である請求項５に記載の組換え細胞。
  7. 外来遺伝子として、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する請求項５又は６に記載の組換え細胞。
  8. メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である請求項７に記載の組換え細胞。
  9. 前記遺伝子が組換え細胞のゲノムに組み込まれている請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
  10. 前記遺伝子がプラスミドに組み込まれている請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
  11. 少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え細胞。
  12. 少なくとも２％（ｖ／ｖ）のメタノールに対する耐性を有する請求項１〜１１のいずれかに記載の組換え細胞。
  13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞を、メタノールを炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に１，４−ブタンジオールを生産させる１，４−ブタンジオールの生産方法。
  14. 請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え細胞にメタノールを接触させ、当該組換え細胞に前記メタノールから１，４−ブタンジオールを生産させる１，４−ブタンジオールの生産方法。
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