KR20150108367A - 재조합 세포, 및 1,4-부탄디올의 생산 방법 - Google Patents

재조합 세포, 및 1,4-부탄디올의 생산 방법 Download PDF

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아끼히로 우에니시
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세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 메탄올 등으로부터 1,4-부탄디올을 생산하기 위한 일련의 기술을 제공하는 것을 과제로 한다. 메틸로트로프인 숙주 세포에, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고, 당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포가 제공된다.

Description

재조합 세포, 및 1,4-부탄디올의 생산 방법{RECOMBINANT CELL, AND METHOD FOR PRODUCING 1,4-BUTANEDIOL}
본 발명은 메탄올 등으로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포, 및 당해 재조합 세포를 사용하는 1,4-부탄디올의 생산 방법에 관한 것이다.
1,4-부탄디올(1,4-Butanediol)은 합성 고무의 단량체로서 중요한 부타디엔의 원료가 될 수 있는 유기 화합물이며, 특히 타이어 업계에 있어서 중요한 소재이다. 최근들어 석유에 의존한 기간 화학품의 생산 프로세스로부터, 식물 자원 등의 재생 가능 자원으로부터의 생산 프로세스로의 전환 기술의 개발과 실용화가 착실하게 진행되고 있다. 1,4-부탄디올에 관해서도, 예를 들어 당을 원료로 한 재조합 대장균에 의한 생산 기술이 알려져 있다(특허문헌 1).
1,4-부탄디올의 생합성 경로의 예를 도 1에 도시한다. 즉 1,4-부탄디올은, 예를 들어 숙신산(Succinate) 또는 α-케토글루타르산(α-Ketoglutarate)을 출발 물질로서 생합성 가능하다.
숙신산을 출발 물질로 하는 경로에서는, 숙신산이 숙시닐 CoA(Succinyl CoA), 숙신산세미알데히드(Succinyl semialdehyde), 4-히드록시부티르산(4-Hydroxybutyrate), 4-히드록시부티르산 CoA(4-Hydroxybutyryl CoA) 및 4-히드록시부티르알데히드(4-Hydroxybutyraldehyde)를 거쳐, 1,4-부탄디올로 변환된다. 각 반응을 촉매하는 효소는 각각 (a) 숙시닐 CoA 합성 효소(Succinyl-CoA synthetase), (b) CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase), (e) 4-히드록시부티르산 탈수소 효소(4-hydroxybutyrate dehydrogenase), (f) 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소(4-hydroxybutyryl-CoA transferase), (g) 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소(4-hydroxybutyryl-CoA reductase) 및 (h) 알코올 데히드로게나아제(Alcohol dehydrogenase)이다(도 1). 또한, (a) 숙시닐 CoA 합성 효소는 모든 생물이 갖고 있다.
또한, 숙신산을 숙신산세미알데히드로 직접 변환하는 경로도 있다. 그 경우는, 숙신산이 숙신산세미알데히드, 4-히드록시부티르산, 4-히드록시부티르산 CoA 및 4-히드록시부티르알데히드를 거쳐, 1,4-부탄디올로 변환된다. 숙신산을 숙신산세미알데히드로 변환하는 반응을 촉매하는 효소는, (c) 숙신산세미알데히드 탈수소 효소(Succinate semialdehyde dehydrogenase)이다(도 1).
한편, α-케토글루타르산을 출발 물질로 하는 경로에서는, α-케토글루타르산이, 숙신산세미알데히드, 4-히드록시부티르산, 4-히드록시부티르산 CoA 및 4-히드록시부티르알데히드를 거쳐, 1,4-부탄디올로 변환된다. α-케토글루타르산을 숙신산세미알데히드로 변환하는 반응을 촉매하는 효소는 (d) 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소(2-oxoglutarate decarboxylase)이다(도 1).
또한, (i) 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소(4-hydroxybutyraldehyde dehydorgenase)에 의해, 4-히드록시부티르산으로부터 직접 4-히드록시부티르알데히드를 생성시키는 경로도 있다(도 1).
그런데, C1 화합물 중에서도 메탄올은 천연 가스, 및 바이오매스나 도시 쓰레기 등의 폐기물을 소각함으로써 얻어지는 일산화탄소, 이산화탄소 및 수소의 혼합 가스인 합성 가스 등으로부터 저렴하게 제조된다. 천연 가스는 화석 자원 중에서도 다량으로 존재하고, 또한 CO2의 발생량이 비교적 적은 점에서 차세대 에너지원으로서 주목받아, 종래의 석유로부터 천연 가스로의 이행이 진행되고 있다. 메탄올은, 물에 가용인 것 등, 취급이나 저장이 용이한 데다가, 미생물 배양의 탄소원으로서도 적합하다.
메틸로트로프(Methylotroph)란, 분자 내에 C-C 결합을 갖지 않는 탄소 화합물, 예를 들어 메탄, 메탄올, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민 등을 유일한 탄소원, 에너지원으로서 이용하는 C1 화합물 자화성 미생물의 총칭명이다. 메타노트로프(Methanotroph), 메탄 산화 세균, 메탄올 자화성 세균, 메탄올 자화성 효모, 메탄올 자화성 미생물 등이라고 불리는 미생물은, 모두 메틸로트로프에 속하는 것이다. 세균인 메틸로트로프에는 메탄을 자화할 수 있는 것도 많아，이들은 다양한 메타노트로프(Methanotroph)라고도 불린다.
메틸로트로프는, 메탄올을 포름알데히드로 변환 후, 포름알데히드를 C-C 결합을 갖는 유기물로 변환하는 반응을 중심 대사로 한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 포름알데히드를 통한 탄소 동화 대사 경로로서, 세린 경로, 리불로스모노인산 경로(RuMP 경로) 및 크실룰로스모노인산 경로(XuMP 경로)가 알려져 있다. 세균으로 분류되는 메틸로트로프(메틸로트로프 세균)는, 세린 회로 또는 RuMP 경로를 보유하고 있다. 한편, 효모로 분류되는 메틸로트로프(메틸로트로프 효모)는 XuMP 경로를 보유하고 있다.
또한, 메틸로트로프 세균은, 메탄올 요구성의 차이로부터, 편성 메틸로트로프(obligate methylotroph)와, 다른 탄소 화합물도 이용할 수 있는 통성 메틸로트로프(facultative methylotroph)로 분류된다.
국제 공개 제2010/141920호
재생 가능 자원으로부터의 생산 프로세스에 대해, 그 종래 기술의 대부분은, 상기 1,4-부탄디올 생산 기술을 포함하여, 유기물, 특히 당, 글리세롤 또는 오일 성분 등에 의존한, 미생물에 의한 생산법이다. 그러나, 석유에서 유래하는 수많은 기간 화학품의 세계적인 생산량을 조달하기 위해서는, 식물 자원 등에서 유래하는 현재 사용 가능한 당질, 글리세린이나 오일 성분의 양으로는, 미생물의 탄소원으로서 부족한 것은 필수이다. 즉, 당질이나 오일 성분에 의존하는 미생물에 의한 기간 화학품의 생산량은 장래에 걸쳐서도 한정적이다. 또한, 이러한 프로세스는, 식(食)과의 경합도 염려된다.
상기 현 상황을 감안하여, 본 발명은 메탄올 등으로부터 1,4-부탄디올을 생산하기 위한 일련의 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양상은, 메틸로트로프인 숙주 세포에, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고, 당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포이다.
도 1에 도시한 바와 같이, 1,4-부탄디올은 숙신산으로부터 생합성 가능하다. 그리고 본 발명의 재조합 세포는, 숙신산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군, 즉 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가, 메틸로트로프인 숙주 세포에 도입된 것이며, 숙주 세포 내에서 당해 유전자가 발현된다. 그리고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능하다.
본 발명의 재조합 세포에 의하면, 메틸로트로프가 본래적으로 갖는 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능」과 「포름알데히드 고정화능」을 기초로 하고, 숙신산을 경유하여, 상기한 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
마찬가지의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 양상은, 메틸로트로프인 숙주 세포에, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고, 당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포이다.
도 1에 도시한 바와 같이, 1,4-부탄디올은 α-케토글루타르산으로부터도 생합성 가능하다. 그리고 본 발명의 재조합 세포는, α-케토글루타르산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군, 즉 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가, 메틸로트로프인 숙주 세포에 도입된 것이며, 숙주 세포 내에서 당해 유전자가 발현된다. 그리고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능하다.
본 발명의 재조합 세포에 의하면, 메틸로트로프가 본래적으로 갖는 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능」과 「포름알데히드 고정화능」을 기초로 하고, α-케토글루타르산을 경유하여, 상기한 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
바람직하게는, 포름알데히드의 고정화 경로로서, 세린 경로, 리불로스모노인산 경로 및 크실룰로스모노인산 경로로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 탄소 동화 경로를 갖는다.
바람직하게는, 3-헥술로스6인산 합성 효소를 코딩하는 유전자와, 6-포스포-3-헥술로이소머라아제를 코딩하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현된다.
이러한 구성에 의해, 리불로스모노인산 경로에 의한 포름알데히드 고정화능이 부여 또는 증강된다.
바람직하게는, 숙주 세포가 메탄올 자화성 효모이며, 메탄올을 탈수소 반응에 의해 포름알데히드로 변환하는 효소를 코딩하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현된다.
일반적으로, 효모는 알코올에 대한 내성이 높다. 따라서 본 양상에서는 숙주로서 메탄올 자화성 효모를 채용하여, 재조합 세포의 1,4-부탄디올에 대한 내성을 높이고 있다. 또한, 효모에서는 일반적으로, 메탄올로부터 포름알데히드로의 변환 반응을 알코올 옥시다아제가 담당하고 있다. 그로 인해, 당해 변환 반응에는 산소가 필요하며, 구체적으로는 배양 시에 격렬하게 통기할 필요가 있다. 따라서 본 양상에서는 「메탄올을 탈수소 반응에 의해 포름알데히드로 변환하는 효소」를 코딩하는 유전자를 도입하여, 산소에 의존하지 않고 메탄올로부터 포름알데히드로의 변환 반응이 행하여지도록 하고 있다.
마찬가지의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 양상은, 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자와, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고, 당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포이다.
본 발명의 재조합 세포는, 숙주 세포에 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자」와 「포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자」가 도입되고, 또한 숙신산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군, 즉 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있다. 그리고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능하다.
즉 본 발명의 재조합 세포는, 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자」와 「포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자」가 도입되어 있으므로, 메틸로트로프와 마찬가지의 특성을 갖고 있다. 그리고, 이들 외래 유전자에 의해 부여된 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능」과 「포름알데히드 고정화능」을 기초로 하고, 숙신산을 경유하여, 상기한 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
마찬가지의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 양상은, 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자와, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고, 당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포이다.
본 발명의 재조합 세포는, 숙주 세포에 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자」와 「포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자」가 도입되고, 또한 α-케토글루타르산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군, 즉 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있다. 그리고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능하다.
즉 본 발명의 재조합 세포는, 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자」와 「포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자」가 도입되어 있으므로, 메틸로트로프와 마찬가지의 특성을 갖고 있다. 그리고, 이들 외래 유전자에 의해 부여된 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능」과 「포름알데히드 고정화능」을 기초로 하고, α-케토글루타르산을 경유하여, 상기한 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
바람직하게는, 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자는, 3-헥술로스6인산 합성 효소를 코딩하는 유전자 및 6-포스포-3-헥술로이소머라아제를 코딩하는 유전자이다.
이러한 구성에 의해, 리불로스모노인산 경로에 의한 포름알데히드 고정화능이 부여된다.
바람직하게는, 포름알데히드의 고정화 경로로서, 세린 경로, 리불로스모노인산 경로 및 크실룰로스모노인산 경로로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 탄소 동화 경로를 갖는다.
마찬가지의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 양상은, 리불로스모노인산 경로를 갖는 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고, 당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포이다.
마찬가지의 과제를 해결하기 위한 본 발명의 다른 양상은, 리불로스모노인산 경로를 갖는 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고, 당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포이다.
이들 양상은, 예를 들어 리불로스모노인산 경로를 갖는 비메틸로트로프가 숙주 세포인 형태에 상당하는 것이다.
바람직하게는, 3-헥술로스6인산 합성 효소를 코딩하는 유전자와, 6-포스포-3-헥술로이소머라아제를 코딩하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현된다.
바람직하게는, 메탄올을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자는 메탄올 데히드로게나아제 또는 알코올 옥시다아제를 코딩하는 유전자이며, 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자는 포름알데히드 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자이다.
메탄올 데히드로게나아제(Methanol dehydrogenase)와 알코올 데히드로게나아제(Alcohol dehydrogenase)는, 모두 메탄올을 포름알데히드로 변환하는 작용을 갖는다. 또한, 포름알데히드 데히드로게나아제(Formaldehyde dehydrogenase)는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 작용을 갖는다. 이들 효소는, 모두 세균에 속하는 메틸로트로프에 있어서의 메탄 대사 효소 중 하나이다. 한편, 효모에 속하는 메틸로트로프는 메탄 산화 활성을 갖지 않고, 알코올 옥시다아제(Alcohol oxidase)의 작용에 의해 메탄올을 포름알데히드로 변환하는 작용을 갖는다. 효모도 포름산을 포름알데히드로 변환하는 효소 활성을 갖는다.
바람직하게는, 메탄을 메탄올로 변환하는 기능을 부여하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현된다.
바람직하게는, 메탄을 메탄올로 변환하는 기능을 부여하는 유전자는, 메탄 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자이다.
메탄 모노옥시게나아제(Methane monooxygenase)는 메탄을 메탄올로 변환하는 작용을 갖는다. 메탄 모노옥시게나아제도, 메틸로트로프에 있어서의 메탄 대사 효소 중 하나이다.
바람직하게는, 도입된 유전자가 숙주 세포의 게놈에 편입되어 있다.
이러한 구성에 의해, 도입된 유전자가 보다 안정적으로 재조합 세포 내에서 유지된다.
바람직하게는, 도입된 유전자가 플라스미드에 편입되어 있다.
바람직하게는, 적어도 400mM의 1,4-부탄디올에 대한 내성을 갖는다.
이러한 구성에 의해, 1,4-부탄디올을 보다 대량으로 생산할 수 있다.
바람직하게는, 적어도 2％(v/v)의 메탄올에 대한 내성을 갖는다.
이러한 구성에 의해, 1,4-부탄디올을 보다 대량으로 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 상기한 재조합 세포를, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 탄소원으로서 사용하여 배양하고, 당해 재조합 세포에 1,4-부탄디올을 생산시키는 1,4-부탄디올의 생산 방법이다.
본 발명은 1,4-부탄디올의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는, 상기한 재조합 세포를 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 탄소원으로서 배양함으로써, 당해 재조합 세포에 1,4-부탄디올을 생산시킨다. 본 발명에 따르면, 메탄올 등으로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 상기한 재조합 세포에, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 접촉시켜, 당해 재조합 세포에 상기 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산시키는 1,4-부탄디올의 생산 방법이다.
본 발명에서는, 상기한 재조합 세포에, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 접촉시켜, 당해 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산시킨다. 본 발명에 의해서도, 메탄올 등으로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
본 발명의 재조합 세포에 의하면, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 또는 포름아미드로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
본 발명의 1,4-부탄디올의 생산 방법에 대해서도 마찬가지이며, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 또는 포름아미드로부터 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
도 1은 숙신산 또는 α-케토글루타르산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 대사 경로를 나타내는 설명도이다.
도 2는 포름알데히드를 통한 탄소 동화 대사 경로를 나타내는 설명도이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 설명한다. 또한, 본 발명에 있어서 「유전자」라는 용어는, 모두 「핵산」 또는 「DNA」라는 용어로 치환할 수 있다.
본 발명의 재조합 세포는, 기본적으로 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능」과 「포름알데히드 고정화능」을 갖는 숙주 세포에, 숙신산또는 α-케토글루타르산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군을 코딩하는 유전자가 도입된 것이다.
본 발명에서 채용되는 숙주 세포로서는, 메틸로트로프인 숙주 세포와, 비메틸로트로프를 포함한 광범위한 숙주 세포의 양쪽이 있다.
상술한 바와 같이, 메틸로트로프란, 분자 내에 C-C 결합을 갖지 않는 탄소 화합물, 예를 들어 메탄, 메탄올, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민 등을 유일한 탄소원, 에너지원으로서 이용하는 C1 화합물 자화성 미생물을 가리킨다. 일반적으로 메틸로트로프는, 포름알데히드를 통한 탄소 동화 대사 경로, 구체적으로는 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능(경로)과 포름알데히드 고정화능(포름알데히드의 고정화 경로)을 본래적으로 보유하고 있다.
포름알데히드의 고정화 경로로서는, 도 2에 도시하는 세린 경로, 리불로스모노인산 경로(RuMP 경로), 크실룰로스모노인산 경로(XuMP 경로)를 들 수 있다. 일반적으로, 메틸로트로프는, 포름알데히드를 통한 탄소 동화 대사 경로로서, 세린 경로, RuMP 경로 또는 XuMP 경로를 보유하고 있다.
여기서, 각각의 포름알데히드 고정화 경로(도 2)에 대하여 설명한다.
세린 경로에 의한 포름알데히드 고정에 중요한 반응은, 세린 히드록시메틸트랜스페라아제(serine hydroxymethyltransferase)에 의한, 글리신과 5,10-메틸렌-테트라히드로엽산으로부터의 세린 생성 반응이다. 5,10-메틸렌-테트라히드로엽산은, 포름알데히드와 테트라히드로엽산의 결합에 의해 발생한다. 세린 경로에서는, 1분자의 포름알데히드로부터 1분자의 아세틸 CoA가 직접 생성된다.
RuMP 경로에 의한 포름알데히드 고정에 중요한 반응은, 3-헥술로스6인산 합성 효소(3-hexulose-6-phosphate synthase, 이하 「HPS」라고 약기하는 경우가 있음)에 의한 리불로스5인산(Ru5P)과 포름알데히드로부터의 D-아라비노3헥술로스6인산의 생성 반응, 및 6-포스포-3-헥술로이소머라아제(6-phosphate-3-hexuloisomerase, 이하 「PHI」라고 약기하는 경우가 있음)에 의한, D-아라비노3헥술로스6인산으로부터의 프룩토스6인산(F6P)의 생성 반응이다.
본 경로에서 생성되는 F6P 등은 해당계로도 제공되고, 그 후 아세틸 CoA나, 글리세르알데히드3인산(G3P) 및 피루브산을 생성한다. F6P의 경우, 1분자당 2분자의 G3P로 변환되고, 계속하여 2분자의 피루브산을 거쳐 2분자의 아세틸 CoA가 생성된다.
XuMP 경로에 의한 포름알데히드 고정에 중요한 반응은, 디히드록시아세톤 신타아제(dihydroxyacetone synthase)에 의한 크실룰로스5인산(Xu5P)과 포름알데히드로부터의 디히드록시아세톤(DHA) 및 글리세르알데히드3인산(G3P)의 생성 반응이다. 본 경로에서 생성된 G3P는 해당계로도 제공되어, 피루브산과 아세틸 CoA로 변환된다. 디히드록시아세톤도 인산화에 의해 해당계로 제공되어, G3P, 피루브산 및 아세틸 CoA로 변환될 수 있다.
본 발명의 재조합 세포는, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 것이다. 예를 들어, 메탄올 데히드로게나아제나 알코올 옥시다아제를 갖는 재조합 세포의 경우에는, 메탄올을 포름알데히드로 변환할 수 있다.
또한, 메탄올 데히드로게나아제나 알코올 옥시다아제 외에 메탄 모노옥시게나아제를 갖는 재조합 세포의 경우에는 메탄을 메탄올로 변환하고, 계속하여 메탄올을 포름알데히드로 변환할 수 있다.
또한, 포름알데히드 데히드로게나아제를 갖는 재조합 세포의 경우에는 포름산을 포름알데히드로 변환할 수 있다.
일반적으로, 세균으로 분류되는 메틸로트로프(메틸로트로프 세균)는, 메탄 모노옥시게나아제와 메탄올 데히드로게나아제를 갖고 있으므로, 메탄 또는 메탄올로부터 포름알데히드를 합성할 수 있다. 또한, 효모로 분류되는 메틸로트로프(메틸로트로프 효모)는, 알코올 옥시다아제를 갖고 있으므로, 메탄올로부터 포름알데히드를 합성할 수 있다. 또한, 메틸로트로프는 포름알데히드 데히드로게나아제를 갖고 있으며, 포름산을 포름알데히드로 변환할 수 있다.
상기 메탄올 데히드로게나아제에는, 그램 음성 세균의 메틸로트로프에서 발견되는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ: pyrroloquinoline quinone) 의존형 메탄올 데히드로게나아제, 그램 양성 세균의 메틸로트로프에서 발견되는 NAD(P) 의존형 메탄올 데히드로게나아제 및 알코올 데히드로게나아제, 그램 양성 세균의 메틸로트로프에서 발견되는 DMNA(N,N'-디메틸-4-니트로소아닐린) 의존형 메탄올옥시드리덕타아제(Park H. et al., Microbiology 2010, 156, 463-471)가 포함된다. 효모에서의 메탄올로부터 포름알데히드로의 변환은, 통상 산소 의존형인 알코올 옥시다아제에 의해 촉매된다.
또한, 아민 옥시다아제(amine oxidase)나 메틸아민 데히드로게나아제(methylamine dehydrogenase)를 갖는 재조합 세포의 경우에는 메틸아민을 포름알데히드로 변환할 수 있다. 이들 효소에 대해서는, 일부의 메틸로트로프나 아트로박터(Arthrobacter)속 세균이 갖고 있는 것이 알려져 있다(Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc).
또한 포름아미드를 포름알데히드로 변환하는 효소가, 일부의 미생물에서 발견되고 있다(Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc).
그리고, 포름알데히드를 경유하여 1,4-부탄디올을 생산할 수 있다.
숙주 세포로서 사용되는 메틸로트로프의 종류로서는, 특별히 한정은 없지만, 예를 들어 세균이나 효모로 분류되는 것을 채용할 수 있다.
메틸로트로프 세균으로서는, 예를 들어 메틸락시드필룸(Methylacidphilum)속, 메틸로시누스(Methylosinus)속, 메틸로시스티스(Methylocystis)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 메틸로셀라(Methylocella)속, 메틸로코쿠스(Methylococcus)속, 메틸로모나스(Methylomonas)속, 메틸로박터(Methylobacter)속, 메틸로바실루스(Methylobacillus)속, 메틸로필루스(Methylophilus)속, 메틸로테네라(Methylotenera)속, 메틸로보루스(Methylovorus)속, 메틸로미크로븀(Methylomicrobium)속, 메틸로파가(Methylophaga)속, 메틸로필라세아에(Methylophilaceae)속, 메틸로베르사틸리스(Methyloversatilis)속, 미코박테리움(Mycobacterium)속, 아트로박터속, 바실루스(Bacillus)속, 베기아토아(Beggiatoa)속, 부르크홀데리아(Burkholderia)속, 그라눌리박터(Granulibacter)속, 히포미크로븀(Hyphomicrobium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 아크로모박터(Achromobactor)속, 파라코쿠스(Paracoccus)속, 크레노트릭스(Crenothrix)속, 클로노트릭스(Clonothrix)속, 로도박터(Rhodobacter)속, 로도시클라세아에(Rhodocyclaceae)속, 실리시박터(Silicibacter)속, 티오미크로스피라(Thiomicrospira)속, 베르루코미크로비아(Verrucomicrobia)속 등에 속하는 세균을 들 수 있다.
메틸로트로프 효모로서는, 예를 들어 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 한세눌라(Hansenula)속, 토룰롭시스(Torulopsis)속, 클로에케라(Kloeckera)속 등에 속하는 효모를 들 수 있다. 피키아속 효모의 예로서는, 피. 하플로필라(P. haplophila), 피. 파스토리스(P. pastoris), 피. 트레할로필라(P. trehalophila), 피. 린드네리이(P. lindnerii) 등을 들 수 있다. 칸디다속 효모의 예로서는, 씨. 파라프실로시스(C. parapsilosis), 씨. 메타놀리카(C. methanolica), 씨. 보이디니이(C. boidinii), 씨. 알코미가스(C. alcomigas) 등을 들 수 있다. 사카로미세스속 효모의 예로서는, 사카로미세스 메타-논포암스(Saccharomyces metha-nonfoams) 등을 들 수 있다. 한세눌라속 효모의 예로서는, 에이치. 위커하미이(H. wickerhamii), 에이치. 캅슐라타(H. capsulata), 에이치. 글루코지마(H. glucozyma), 에이치. 헨리씨이(H. henricii), 에이치. 미누타(H. minuta), 에이치. 논페르멘탄스(H. nonfermentans), 에이치. 필로덴드라(H. philodendra), 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha) 등을 들 수 있다. 토룰롭시스속 효모의 예로서는, 티. 메타놀로베센스(T. methanolovescens), 티. 글라브라타(T. glabrata), 티. 네모덴드라(T. nemodendra), 티. 피누스(T. pinus), 티. 메타노플로트(T. methanofloat), 티. 에노키이(T. enokii), 티. 멘타노필레스(T. menthanophiles), 티. 메타노소르보사(T. methanosorbosa), 티. 메타노도메르퀴이(T. methanodomercqii) 등을 들 수 있다.
숙주 세포가 비메틸로트로프인 경우에는, 메탄올 등을 포름알데히드로 변환하는 경로를 갖고 있다고만은 할 수 없으므로, 적어도 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능」을 부여할 필요가 있다. 또한, 「메탄을 메탄올로 변환하는 기능」을 부여하는 것이 바람직하다. 이들 기능 부여는, 상기한 효소를 코딩하는 유전자를 숙주 세포에 도입함으로써 실현할 수 있다.
예를 들어, 메탄올을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자로서, 메탄올 데히드로게나아제(예를 들어, EC 1.1.1.244, EC 1.1.2.7)를 코딩하는 유전자나 알코올 옥시다아제(예를 들어 EC 1.13.13)를 코딩하는 유전자를 사용할 수 있다. 또한, 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자로서, 포름알데히드 데히드로게나아제(예를 들어 EC 1.2.1.46)를 코딩하는 유전자를 사용할 수 있다. 또한, 메탄을 메탄올로 변환하는 기능을 부여하는 유전자로서, 메탄 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자를 사용할 수 있다.
또한, 메탄올 자화성을 부여하는 플라스미드가 알려져 있다. 예를 들어, 바실루스 메타놀리쿠스(Bacillus methanolicus)의 메탄올 자화성은, 메탄올 대사에 관한 효소군을 코딩하는 플라스미드에 의존하고 있다(Brautaset T. et al., J. Bacteriology 2004, 186(5), 1229-1238). 이러한 플라스미드를 근연의 비메틸로트로프에 도입함으로써, 메탄올 자화능을 부여하는 것이 가능하다. 나아가, 이러한 플라스미드를 개변함으로써, 다양한 비메틸로트로프에 메탄올 자화성을 부여하는 것도 가능하다.
상기한 바와 같이 하여 비메틸로트로프에 대하여 「메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능」을 부여하고, 추가로 「포름알데히드의 고정화능」을 부여함으로써, 비메틸로트로프를 메틸로트로프와 마찬가지로 취급하는 것이 가능해진다. 포름알데히드 고정화능의 부여는, 예를 들어 상기한 세린 경로, RuMP 경로 또는 XuMP 경로에서 작용하는 효소를 코딩하는 유전자를 비메틸로트로프에 도입함으로써, 실현할 수 있다.
하나의 바람직한 실시 형태에서는, 숙주 세포가 메탄올 자화성 효모이며, 메탄올을 탈수소 반응에 의해 포름알데히드로 변환하는 효소를 코딩하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현된다. 예를 들어, 메탄올 자화성을 구비한 피키아속 효모를 숙주 세포로서 사용하고, 또한 메탄올 데히드로게나아제 유전자를 도입함으로써, 원하는 재조합 세포를 취득할 수 있다. 본 실시 형태에 따르면, 고알코올 내성이고, 또한 산소에 의존하지 않고 메탄올을 포름알데히드로 변환할 수 있는, 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포를 얻을 수 있다.
RuMP 경로를 부여하는 경우를 예로 하여 재차 설명한다. RuMP 경로의 부여는, 예를 들어 상기한 3-헥술로스6인산 합성 효소(HPS; 예를 들어 EC 4.1.2.43) 유전자와, 6-포스포-3-헥술로이소머라아제(PHI; 예를 들어 EC 5.3.1.27) 유전자를 도입함으로써 실현할 수 있다. 즉, HPS/PHI에 의한 포름알데히드 고정화 반응의 기질 또는 생성물인, 리불로스5인산(Ru5P)과 프룩토스6인산(F6P)은, 펜토스인산 경로 및 캘빈 회로의 대사 중간체로서 모든 생물에 보편적으로 존재한다. 따라서, HPS/PHI의 도입에 의해, 대장균(에스케리치아 콜리(Escherichia coli)), 고초균(바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)) 및 효모 등을 비롯한 모든 생물에 포름알데히드 고정화능을 부여하는 것이 가능하다.
원래 RuMP 경로를 갖고 있는 숙주 세포에, HPS 유전자와 PHI 유전자를 도입할 수도 있다. 이에 의해, RuMP 경로에 의한 포름알데히드 고정화능을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 고초균과 같이, 원래 RuMP 경로 또는 이것과 동질의 경로를 갖는 미생물에, 예를 들어 메탄올 데히드로게나아제(예를 들어, EC 1.1.1.244, EC 1.1.2.7) 등의 알코올 탈수소 효소, 3-헥술로스6인산 합성 효소(HPS; 예를 들어 EC 4.1.2.43), 6-포스포-3-헥술로이소머라아제(PHI; 예를 들어 EC 5.3.1.27) 등의 효소를 코딩하는 유전자를 도입함으로써, 메탄올을 포름알데히드로 변환하는 기능(즉 메탄올 자화성)을 부여함과 함께, 포름알데히드 고정화능을 증강시킬 수 있다.
또한, 메틸로트로프인 숙주 세포에, HPS 유전자와 PHI 유전자를 도입할 수도 있다. 즉, 세린 경로, RuMP 경로 또는 XuMP 경로를 갖는 메틸로트로프에 HPS/PHI를 도입함으로써, RuMP 경로에 의한 포름알데히드 고정화능을 증강시킬 수 있다. 그 결과, 재조합 세포의 포름알데히드 내성을 높일 수 있어, 결과적으로 메탄올이나 포름산에 대한 내성 및 자화능을 높이는 것이 가능해진다. 이에 의해, 재조합 세포의 배양 효율이나 1,4-부탄디올의 생산 효율을 향상시키는 것이 가능해진다.
한편, 세린 경로에 의한 포름알데히드 고정화능을 부여하는 경우에는, 상기한 세린 히드록시메틸트랜스페라아제(예를 들어 EC 2.1.2.1) 유전자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 비메틸로트로프에, 메탄올 데히드로게나아제 등의 알코올 탈수소 효소 유전자, 5,10-메틸렌테트라히드로엽산(5,10-methylenetetrahydrofolate)(CH2=H4F) 합성 효소 유전자 및 세린 히드록시메틸트랜스페라아제(예를 들어 EC 2.1.2.1) 유전자 등을 도입함으로써, 메탄올 자화성과, 세린 경로에 의한 포름알데히드 고정화능을 부여하는 것이 가능해진다.
본 발명의 재조합 세포에서는, 숙신산 또는 α-케토글루타르산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군(이하, 통합하여 「1,4-부탄디올 생합성 관련 효소(군)」이라고 칭하는 경우가 있음)을 코딩하는 유전자가 도입되어 있다. 도 1의 (a) 내지 (i)로 표시되는 효소가 1,4-부탄디올 생합성 관련 효소에 상당한다.
하나의 양상에서는, 숙신산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군으로서, (c) 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, (a) 숙시닐 CoA 합성 효소, (b) CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, (e) 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, (f) 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, (g) 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, (i) 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 (h) 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주 세포에 도입되어 있다. 예를 들어, 이들 효소군으로부터 1 또는 2 이상의 효소를 선택하여, 당해 효소를 코딩하는 유전자를 숙주 세포에 도입하면 된다.
또한, 다른 양상에서는, α-케토글루타르산으로부터 1,4-부탄디올에 이르는 생합성 경로에서 작용하는 효소군으로서, (d) 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, (e) 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, (f) 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, (g) 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, (i) 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 (h) 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주 세포에 도입되어 있다. 예를 들어, 이들 효소군으로부터 1 또는 2 이상의 효소를 선택하여, 당해 효소를 코딩하는 유전자를 숙주 세포에 도입하면 된다.
이들 효소(1,4-부탄디올 생합성 관련 효소)로서는, 재조합 세포 내에서 그 효소 활성을 발휘할 수 있는 것이면 특별히 한정은 없다. 이들 효소를 코딩하는 유전자에 대해서도 마찬가지이며, 재조합 세포 내에서 정상적으로 전사·번역되는 것이면 특별히 한정은 없다. 숙주 세포 유래의 것일 수도 있고, 다른 유래의 것일 수도 있다.
1,4-부탄디올 생합성 관련 효소 및 그의 유전자의 구체예로서는, 상기 특허문헌 1에 개시된 것을 들 수 있다. 예를 들어, 이하의 효소를 들 수 있다. 또한, 숙주 세포가 이하에 나타내는 효소를 원래 갖는 경우, 보다 기질 특이성, 분자 활성 및 안정성이 우수한, 즉 Kcat/Km값 등이 보다 높은 효소 유전자를 도입하면 된다. 이 경우, 상기 효소 유전자에는, 숙주 세포가 원래 보유하는 효소의 개변체를 코딩하는 유전자도 포함된다. 도입 유전자의 코돈(codon)의 최적화나 저빈도의 회피는, 「코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database)」(http://www.kazusa.or.jp/codon/)을 참조하여, 각 숙주 미생물에 있어서 행할 수 있다.
(c) 숙신산 세미알데히드 탈수소 효소(Succinate semialdehyde dehydrogenase: 예를 들어, EC 1.2.1.16, EC 1.2.1.24)
유전자의 예(모두 UniProtKB No.로 표시): P76149(이. 콜리(E. coli)); P25526(이. 콜리); P94428(바실루스 서브틸리스); Q55585(시네코시스티스속(Synechocystis sp .)); P 38067(사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)) 등
(a) 숙시닐 CoA 합성 효소(Succinyl CoA synthetase, Succinyl CoA ligase: 예를 들어, EC 6.2.1.4, EC 6.2.1.5 등)
유전자의 예(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시): P0AGE9(이. 콜리); P0A836(이. 콜리); P53598(사카로미세스 세레비시아에); P53312(사카로미세스 세레비시아에); P09143(터무스 터모필루스(Thermus thermophilus)); O82662(아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)) 등. 본 효소 활성은, 모든 생물이 보유하지만, 필요에 따라 외래 유전자로서 도입하는 것도 유효하다.
(b) CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase: 예를 들어, EC 1.2.1.79)
유전자의 예(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시): P38947(클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri)); A4YGN0(메탈로스파에라 세둘라 (Metallosphaera sedula)) 등.
(e) 4-히드록시부티르산 탈수소 효소(4-hydroxybutyrate dehydrogenase: 예를 들어 EC 1.1.1.61)
유전자의 예(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시): D8GUP1(클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii)); C9YNR6(클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile)); Q97IR6(클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)); Q8XYI7(랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)); Q7MWD4(포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)) 등.
(f) 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소(4-hydroxybutyryl-CoA transferase: 예를 들어 EC 2.8.3.a)
유전자의 예(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시): Q9RM86(클로스트리듐 아미노부티리쿰(Clostridium aminobutyricum)); P38942(클로스트리듐 클루이베리); Q185L2(클로스트리듐 디피실레); Q3ACH6(카르복시도테르무스 히드로게노포르마스(Carboxydothermus hydrogenoformas)); C4Z8H6(에우박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale)); I8UF15(포르피로모나스 진지발리스) 등.
(g) 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소(4-hydroxybutyryl-CoA reductase: 예를 들어 EC 1.2.1.10 등, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소 활성은, CoA-아실화 알데히드 환원 효소(CoA-acylating aldehyde dehydrogenase)의 역반응의 촉매 활성을 나타냄)
유전자의 예: Q716S8(클로스트리듐 베이저링키이(Clostridium beijerinckii)); Q7X4B7(클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)); A5HYN9(클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)); P0A9Q7(이. 콜리)(이상, UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시); 젠뱅크 CAQ57983(클로스트리듐 사카로부틸이쿰(Clostridium saccharobutylicum)); NCBI ZP_ 03705305(클로스트리듐 메틸펜토숨(Clostridium methylpentosum)); NCBI ZP_08533507(칼달칼리바실루스 터마룸(Caldalkalibacillus thermarum)) 등.
(h) 알코올 데히드로게나아제(Alcohol dehydrogenase: 예를 들어 EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2 등)
유전자의 예(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시): P0A4X1(미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)); P00331(사카로미세스 세레비시아에); P00330(사카로미세스 세레비시아에); Q9HIM3(터모플라즈마 애시도필룸(Thermoplasma acidophilum)); B9WPR7(아트로박터속); P00334(드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)) 등.
또한, 상기 (g) 및 (h)의 2단계의 효소 반응 스텝은, 알데히드/알코올 데히드로게나아제(aldehyde/alochohol dehydrogenase)(adhE: EC 1.1.1.1, 1.1.1.10 등)의 작용에 의해서도 촉매될 수 있다. 즉 adhE는, 상기 (g)와 (h)의 양쪽에 해당한다. adhE의 예로서는, D8GU53(클로스트리듐 륭달리이), D8GU52(클로스트리듐 륭달리이), Q9ANR5(클로스트리듐 아세토부틸이쿰), P0A9Q7(이. 콜리), F7TVB7(브레비바실루스 라테로스포루스(Brevibacillus laterosporus)) 등이 있다(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시).
(i) 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소(4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase)
본 효소는 4-히드록시부티르산으로부터 4-히드록시부티르알데히드로의 변환을 가역적으로 촉매할 수 있는 효소이며, 효소 분류상, 알데히드데히드로게나아제(예를 들어 EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4, EC 1.2.1.5 등)에 속한다.
4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 활성을 나타내는 알데히드 데히드로게나아제 유전자의 예(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시): E4R8S4(슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)); P23883(이. 콜리); P12693(슈도모나스 푸티다); P40047(사카로미세스 세레비시아에); P25553(이. 콜리); P0C6D7(비브리오속(Vibrio sp .)); P47771(사카로미세스 세레비시아에); G3XYI2(아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger)) 등.
(d) 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소(2-oxoglutarate decarboxylase: 예를 들어 EC 4.1.1.71)
유전자의 예(모두 UniProtKB/Swiss-Prot No.로 표시): A0R2B1(미코박테리움 스메그마틱스(Mycobacterium smegmatics)); I0WZ48(로도코쿠스 임테켄시스(Rhodococcus imtechensis)); G2EJR8(코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)); J1S9U2(스트렙토미세스 아우라투스(Streptomyces auratus)); J7LQH4(아트로박터속) 등.
또한, 도입되는 「1,4-부탄디올 생합성 관련 효소」의 유전자의 종류(수)는, 재조합 세포가 「메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능」한 한, 적어도 하나이면 된다. 단, 2종 이상의 유전자를 도입함으로써 각 효소의 활성이 증강되는 경우에는 1,4-부탄디올의 생산성이 높아지는 것이 기대된다. 기본적으로, 숙주 세포가 보유하고 있지 않은 1,4-부탄디올 생합성 관련 효소에 대해서는, 당해 효소를 코딩하는 유전자를 외부로부터 도입한다. 또한, 숙주 세포가 보유하고 있지만 분자 활성이 낮은 경우에는, 보다 분자 활성 등의 높은 효소를 코딩하는 유전자를 도입하는 것이 바람직하다.
1,4-부탄디올 생합성 관련 효소에 대해서는, 천연에 존재하는 것 외에, 각 효소의 개변체일 수도 있다. 예를 들어, 각 효소의 아미노산 치환 변이체나, 각 효소의 부분 단편이며 마찬가지의 효소 활성을 갖는 폴리펩티드일 수도 있다.
본 발명의 재조합 세포에 있어서는, 1,4-부탄디올 생합성 관련 효소를 코딩하는 유전자 등 외에, 다른 유전자가 더 도입되어 있을 수도 있다. 도입하는 유전자로서는, 예를 들어 상기한 메탄올 데히드로게나아제 유전자, 알코올 데히드로게나아제 유전자, 메탄모노옥시다아제 유전자, HPS/PHI 유전자, 세린 히드록시메틸트랜스페라아제 유전자, 5,10-메틸렌테트라히드로엽산 합성 효소 유전자 및 세린 히드록시메틸트랜스페라아제 유전자 등을 들 수 있다.
숙주 세포에 유전자를 도입하는 방법으로서는 특별히 한정은 없고, 숙주 세포의 종류 등에 의해 적절히 선택하면 된다. 예를 들어, 숙주 세포에 도입 가능하고 또한 편입된 유전자를 발현 가능한 벡터를 사용할 수 있다.
예를 들어, 숙주 세포가 세균 등의 원핵 생물인 경우에는, 당해 벡터로서, 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 편입이 가능하며, 삽입된 상기 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 당해 벡터를 사용하여, 프로모터, 리보솜 결합 서열, 상기 유전자 및 전사 종결 서열을 포함하는 일련의 구성을 숙주 세포 내에서 구축하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 메틸로트로프 세균의 염색체로의 편입 방법으로서는, 리불로스모노인산 경로를 갖는 메틸로바실루스 플라겔라투스(Methylobacillus flagellatus)나, 세린 경로를 갖는 메틸로박테리움 익스토르퀸스(Methylobacterium extorquencs)로, 목적 유전자의 파괴 조작에 의해 예가 기재되어 있다(Chistoserdova L. et al., Microbiology 2000, 146, 233-238; Chistoserdov AY., et al., J. Bacteriol 1994, 176, 4052-4065). 이들은 환상 DNA를 사용한 게놈으로의 유전자 도입법이지만, 메틸로필루스(Methylophilus)속 세균 등에서는, 직쇄상 DNA를 사용한 게놈으로의 유전자 도입법도 개발되고 있다(일본 특허 공개 제2004-229662호 공보). 일반적으로, 숙주 세포에 의한 분해를 받기 어려운 경우에는, 직쇄상 DNA에 의한 게놈 재조합이 환상 DNA에 의한 것보다도 더 효율적이다. 또한 통상 상동 재조합법은, 역반복 서열(inverted-repeat sequence) 등과 같이, 게놈 위에 멀티카피 존재하는 유전자를 표적하는 것이 바람직하다. 또한, 게놈에 멀티카피 도입하는 방법으로서는, 상동 재조합 이외에, 트랜스포존에 탑재하는 방법도 있다. 메틸로트로프 세균으로의 플라스미드에 의한 유전자 도입법으로서는, 예를 들어 광숙주역 벡터인 pAYC32(Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167), pRP301(Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34), pBBR1, pBHR1(Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799), pCM80(Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075) 등이 있다.
메틸로트로프 효모에 있어서의 유전자 도입 방법으로서는, 주로 피키아 파스토리스(Pachia pastoris)로 확립되어 있고, pPIC3.5K, pPIC6, pGAPZ, pFLD(인비트로젠사) 등의 벡터가 시판되고 있다.
바실루스속 세균으로의 유전자 도입에 생기는 사용 플라스미드로서는, 바실루스 서브틸리스에는, pMTLBS72(Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54(3), 241-248), pHT01(후나코시사), pHT43(후나코시사) 등이, 바실루스 메가테륨(Bacillus megaterium)에는, p3STOP1623hp(후나코시사), pSPYocHhp(후나코시사) 등이, 바실루스 브레비스(Bacillus brevis)에는 pNI DNA(다카라 바이오사) 등이 있다.
또한 벡터를 사용하여 복수종의 유전자를 숙주 세포에 도입하는 경우, 각 유전자를 1개의 벡터에 편입할 수도 있고, 별도의 벡터에 편입할 수도 있다. 또한 1개의 벡터에 복수의 유전자를 조합하는 경우에는, 각 유전자를 공통된 프로모터 하에서 발현시킬 수도 있고, 별도의 프로모터 하에서 발현시킬 수도 있다. 복수종의 유전자를 도입하는 예로서는, 숙주 세포가 메틸로트로프인 경우에 「1,4-부탄디올 생합성 관련 효소를 코딩하는 유전자」 외에, HPS/PHI 유전자를 도입하는 형태를 들 수 있다.
이상과 같이 메틸로트로프 등에서 사용할 수 있는 기지의 벡터를 나타냈지만, 프로모터, 터미네이터 등의 전사 제어, 복제 영역 등에 관한 영역을 목적에 따라 개변할 수 있다. 개변 방법으로서는 각 숙주 세포, 또는 그의 근연종에 있어서의 천연의 다른 유전자 서열로 변경할 수도 있고, 또한 인공의 유전자 서열로 변경할 수도 있다.
또한, 이상의 유전자 도입에 의한 개변 외에, 돌연변이, 게놈 셔플링 등의 변이 방법도 조합함으로써, 숙주 세포에서의 도입 유전자의 발현량, 숙주 세포의 1,4-부탄디올 배출 기능, 1,4-부탄디올 내성 등을 향상시킴으로써, 1,4-부탄디올의 생산성을 더욱 향상시키는 것이 가능해진다.
즉, 본 발명에 있어서는, 외래 유전자를 숙주 세포의 게놈에 편입할 수도 있고, 플라스미드에 편입할 수도 있다.
하나의 바람직한 실시 형태에서는, 재조합 세포가 적어도 400mM의 1,4-부탄디올에 대한 내성을 갖는다. 다른 바람직한 실시 형태에서는, 재조합 세포가 적어도 2％(v/v)의 메탄올에 대한 내성을 갖는다. 이러한 구성에 의해, 1,4-부탄디올의 고생산이 가능해진다. 이러한 특성을 갖는 재조합 세포는, 예를 들어 적절한 변이 처리를 숙주 세포에 실시하여 원하는 특성을 갖는 숙주 세포를 선발하여, 그 숙주 세포를 사용함으로써 얻을 수 있다.
본 발명은, 하기 (i) 내지 (iv)를 포함한다.
(i) 메틸로트로프인 숙주 세포, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자가 도입된 숙주 세포, 또는 리불로스모노인산 경로를 갖고 또한 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자가 도입된 숙주 세포에, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
(ii) 메틸로트로프인 숙주 세포에, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
(iii) 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자와, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
(iv) 리불로스모노인산 경로를 갖는 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
본 발명의 1,4-부탄디올의 생산 방법의 하나의 양상에서는, 상기한 재조합 세포를, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 탄소원으로서 사용하여 배양하고, 당해 재조합 세포에 1,4-부탄디올을 생산시킨다. 탄소원으로서 사용하는 이들 C1 화합물에 대해서는, 하나만을 사용할 수도 있고, 2개 이상을 조합하여 사용할 수도 있다. 또한, 이들의 C1 화합물은, 주된 탄소원으로서 사용하는 것이 바람직하고, 유일한 탄소원인 것이 보다 바람직하다.
또한, 편성 메틸로트로프의 경우에는, C1 화합물을 유일한 탄소원으로 하는 합성 배양지를 사용하는 것이 기본이지만, 이것에 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 육엑기스 등의 천연 배지나 비타민류를 소량 첨가함으로써도 균의 증식은 촉진된다. 통성 메틸로트로프인 경우에는, 균체 증식 스테이지에서는 당질, 지질 등의 C1 화합물 이외의 물질을 탄소원으로 할 수도 있고, 1,4-부탄디올 생산 스테이지에서 탄소원을 상기 C1 화합물로 변경하면 된다. 미생물의 배양법으로서는, 목적에 따라 호기, 미호기, 또는 혐기 조건에서 배양 가능하다. 또한 배치 배양, 유가 배양, 연속 배양의 어느 한 방법일 수도 있다.
탄소원으로서 예를 들어 메탄올을 사용하는 경우는, 통상 세균의 경우에는 1.0％(v/v) 농도, 효모의 경우에는 3.0％(v/v) 농도 이하에서 사용하지만, 인위적으로 이들에 대한 내성을 개량한 경우에는, 그 이상의 농도에서도 배양 가능하다.
본 발명의 1,4-부탄디올의 생산 방법의 다른 양상에서는, 상기한 재조합 세포에, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 접촉시켜, 당해 재조합 세포에 상기 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산시킨다. 즉, 세포 분열(세포 증식)을 수반하는지의 여부와 관계없이 재조합 세포에 상기한 C1 화합물을 접촉시켜, 1,4-부탄디올을 생산시킬 수 있다. 예를 들어, 고정화된 재조합 세포에 상기한 C1 화합물을 연속적으로 공급하여, 1,4-부탄디올을 연속적으로 생산시킬 수 있다.
본 양상에 있어서도, 이들 C1 화합물에 대해서는, 하나만을 사용할 수도 있고, 2개 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
생산된 1,4-부탄디올은 세포 내에 축적되거나 세포 밖으로 방출된다. 예를 들어, 세포 밖으로 방출된 1,4-부탄디올을 회수하여, 증류 등에 의해 단리 정제함으로써, 순화된 1,4-부탄디올을 취득할 수 있다.
이하, 실시예를 갖고 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
XuMP 경로를 갖는 메틸로트로프로의 1,4-부탄디올(1,4-BDO) 합성 효소 유전자의 도입과, 재조합체를 사용한 메탄올로부터의 1,4-BDO의 생산
본 실시예에서는, XuMP 경로를 갖는 메틸로트로프로서, 메탄올 자화성 효모피키아 파스토리스(Pichia pastolis) GS115주(인비트로젠사)를 사용하였다.
1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터인 서열 번호 1의 인공 합성 유전자(7773 bp)를 구축하였다. 해당 유전자 클러스터는, sucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3: 4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4: 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 포함한다.
서열 번호 1의 인공 합성 유전자를, pT7 blue-2 벡터(노바겐(Novagen)사)의 SmaI/NotI 절단 부위에 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 대량 제조한 후, SmaI 및 NotI로 절단하여, 삽입 유전자를 회수하였다. 회수된 유전자 단편을 pPIC 3.5K(인비트로젠사)의 SnaBI/NotI 절단 부위에 도입하여, 1,4-BDO 합성 유전자가 도입된 벡터 pPBDO를 구축하였다. 본 벡터는, 알코올 옥시다아제 I(AOXI) 프로모터 및 AOXI 터미네이터의 컨트롤 하에서, sucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3: 4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4: 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 발현시킨다. 본 벡터의 도입에 의해, 효모에 있어서 숙시닐 CoA로부터 1,4-BDO의 합성이 가능해진다.
피키아 파스토리스 GS115주로의 pPBDO에 의한 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 발현 유닛의 도입은, 인비트로젠사 매뉴얼 「Version D 032002/25-0156」에 따라 행하였다. 멀티 카피의 유전자 도입체를 얻기 위하여, 1.5㎎/mL 농도의 제네티신(Geneticin)(인비트로젠사) 내성주를 취득하였다. 이에 의해, 외래의 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자를 복수 카피 유지하는 메탄올 자화성 효모 GS115BDO주를 구축하였다. 또한 컨트롤주로서 1.5㎎/mL 농도의 제네티신에 내성이 있는, pPIC3.5K만이 도입된 GS11535K 주도 얻었다.
GS115BDO주 및 GS11535K 주를 각각 메탄올을 유일한 탄소원으로 하는 20mL의 합성 A 배지(1L당 H3PO4 18g, K2SO4 14.28g, KOH 3.9g, CaSO4·2H2O 0.9g, MgSO4·7H2O 11.7g, CuSO4·5H2O 8.4㎎, KI 1.1㎎, MnSO4H2O 4.2㎎, NaMoO4·2H2O 0.3㎎, H3BO3 0.03㎎, CoCl2·6H2O 0.7㎎, ZnSO4·7H2O 28㎎, FeSO4·7H2O 91㎎, 비오틴 0.28㎎, 메탄올 20mL을 포함함)에서 호기적으로 30℃로 64시간 배양하였다. 균체를 회수한 후, 회수 균체를 45mL의 합성 A 배지에서 재차 30℃로 16시간 진탕 배양하였다. 배양 종료 후, 배양으로부터 원심 분리에 의해 배양 상청을 얻었다. 배양 상청을 LC/MS에 의해 분석하였다.
그 결과, GS11535K 주에서는 1,4-BDO는 검출되지 않았지만, GS115BDO 주에서는 1,4-BDO가 유의하게 검출되었다. 이 때의 1,4-BDO의 생성 농도는 13mM이었다.
이상으로부터, 본 실시예에 의해, 메탄올 자화 경로의 일종인 XuMP 경로를 통한, 진핵 미생물(효모)에 의한 1,4-BDO 생산이 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 2
비메틸로트로프로의 메탄올 데히드로게나아제, HPS 유전자, PSI 유전자 및 이소프렌 합성 효소 유전자의 도입과, 재조합체에 의한 메탄올로부터의 1,4-BDO 생산
본 실시예에서는, 비메틸로트로프로서 바실루스 서브틸리스를 사용하였다.
1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터인 서열 번호 6의 인공 합성 유전자(10600 bp)를 구축하였다. 해당 유전자 클러스터는, mdh(서열 번호 7: 메탄올 탈수소 효소), HPS(서열 번호 8: 3-헥술로스-6인산 합성 효소), PHI(서열 번호 9: 3-헥술로스-6-인산 이성화 효소), SucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3: 4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4: 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 포함한다.
서열 번호 6의 인공 합성 유전자를, pUC119의 SmaI/XbaI 절단 부위에 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 대량 제조한 후, SmaI 및 XbaI로 절단하여, 삽입 유전자를 회수하였다. 회수한 유전자를 바실루스 서브틸리스용 발현 벡터 pHT01(MoBiTec사)의 XbaI/SmaI 절단 부위에 도입하여, pHTBDO를 제작하였다. pHTBDO는, mdh(서열 번호 7: 메탄올 탈수소 효소), HPS(서열 번호 8: 3-헥술로스-6인산 합성 효소), PHI(서열 번호 9: 3-헥술로스-6-인산 이성화 효소), SucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3:4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4: 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 발현시킨다.
컨트롤 벡터로서, pHTBDO가 코딩하는 상기 7개의 효소군으로부터 MDH를 제외한 발현 벡터 pHTMDH(-)를 구축하였다. 또한, pHTBDO가 코딩하는 상기 7개의 효소군으로부터 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자인 SucD, 4HBd, abfT 및 adhE2를 제외한 발현 벡터 pHTBDO(-)를 제작하였다.
MoBiTec사 매뉴얼 「바실루스 서브틸리스 발현 벡터(Bacillus subtilis Expression Vectors)」에 따라, 각 발현 벡터를 바실루스 서브틸리스에 도입하여, 재조합체(재조합 세포)를 제작하였다. 이에 의해, 발현 벡터 pHTBDO를 유지하는 BSBDO주, 발현 벡터 pHTMDH(-)를 유지하는 BSMDH(-)주 및 발현 벡터 pHTBDO(-)를 유지하는 BSBDO(-)주를, 각각 제작하였다.
각 재조합체를, 100mL의 메탄올 자화 유도 배지(메탄올 10mL, 인산암모늄 3g, 염화칼륨 1g, 황산마그네슘·7수화물 0.1g, 효모 엑기스 0.5g, 0.01mM IPTG 및 클로람페니콜 5㎎을, 1L의 수돗물 중에 포함함)에서, 호기적으로 37℃로 배양액의 OD600이 1.5로 될 때까지 배양하였다. 배양 종료 후, 배양 상청을 원심 분리에 의해 얻고, LC/MS에 의해 분석하였다.
그 결과, BSBDO주에서는, 1,4-BDO가 유의하게 검출되고, 그 농도는 9mM(1OD600당 6mM)이었다. 한편, BSBDO(-)주에서는 1,4-BDO는 검출되지 않았다. 또한, MDH를 갖지 않는 BSMDH(-)주는 거의 생육되지 않았다.
이상으로부터, 비메틸로트로프인 바실루스 서브틸리스에 MDH 유전자, HPS 유전자 및 PHI 유전자를 도입함으로써, 메탄올을 주요 탄소원하는 배지에서 효율적으로 생육시키는 것이 가능하고, 또한 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터(서열 번호 6)를 도입함으로써, 효율적으로 1,4-BDO가 생성되는 것을 알 수 있다.
실시예 3
1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자가 도입된, 세린 경로를 갖는 메틸로트로프의 제작과, 재조합체에 의한 메탄올로부터의 1,4-BDO의 생산
본 실시예에서는, 세린 경로를 갖는 메틸로트로프로서, 메틸로박테리움 익스토르퀸스(ATCC 55366)를 사용하였다.
1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터인 서열 번호 10의 인공 합성 유전자(6922 bp)를 구축하였다. 해당 유전자 클러스터는, SucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3: 4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4: 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 포함한다.
서열 번호 10의 인공 합성 유전자를 pUC119의 HindIII/XbaI 절단 부위에 클로닝하였다. 해당 플라스미드를 대량 제조한 후, HindIII 및 XbaI로 절단하고, 삽입 유전자를 회수하였다. 회수한 본 유전자를 광역 벡터 pCM80(Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075)의 HindIII/XbaI 사이트에 도입하여, pC80BDO를 제작하였다. 본 벡터는, SucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3:4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4:4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 발현시킨다. 또한, 각 효소 유전자의 코돈 개변으로서, UUA(Leu)는 UUG(Leu)로, AUA(Ile)는 AUC(Ile)로 변환되었다. 발현 벡터 pC80BDO를 일렉트로포레이션에 의해 엠. 익스토르퀸스(M.extorquens)에 도입하여, ME-BDO주를 얻었다. 컨트롤로서, 발현 벡터 pCM80을 일렉트로포레이션에 의해 엠. 익스토르퀸스에 도입하여, ME-CM80주를 얻었다.
ME-BDO주 또는 ME-CM80주를, 메탄올을 유일한 탄소원으로 하는 합성 B 배지(1L당 H3PO4 18g, K2SO4 14.28g, KOH 3.9g, CaSO4·2H2O 0.9g, MgSO4·7H2O 11.7g, CuSO4·5H2O 8.4㎎, KI 1.1㎎, MnSO4H2O 4.2㎎, NaMoO4·2H2O 0.3㎎, H3BO3 0.03㎎, CoCl2·6H2O 0.7㎎, ZnSO4·7H2O 28㎎, FeSO4·7H2O 91㎎, 비오틴 0.28㎎, 메탄올 5mL 및 테트라사이클린 10㎎을 포함함) 100mL에서, 호기적으로 30℃로 배양하였다. 배양액의 OD600이 1.8로 될 때까지 배양하고, 원심 분리에 의해 배양 상청을 회수하였다. 회수한 배양 상청을 LC/MS에 의해 분석하였다.
그 결과, ME-BDO주에서 1,4-BDO가 검출되고, 그 농도는 11mM(1OD600당 6.2mM)이었다. 한편, ME-CM80주에서는 1,4-BDO는 검출되지 않았다.
이상으로부터, 세린 경로를 갖는 메틸로트로프에, 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터(서열 번호 10)를 도입함으로써, 메탄올로부터의 효율적인 1,4-BDO의 생산이 가능한 것이 나타났다.
실시예 4
RuMP 경로를 갖는 메틸로트로프로의 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자의 도입과, 재조합체를 사용하는 메탄올로부터의 1,4-BDO의 생산
본 실시예에서는, RuMP 경로를 갖는 메틸로트로프로서, 메틸로필루스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus)(ATCC 53528)를 사용하였다.
실시예 3에서 제작한 pC80BDO를 일렉트로포레이션에 의해 엠.메틸로트로푸스(M.methylotrophus)에 도입하여, MM-BDO주를 얻었다. 컨트롤로서, pCM80을 일렉트로포레이션에 의해 엠.메틸로트로푸스에 도입하여, MM-CM80주를 얻었다.
MM-BDO주 또는 MM-CM80주를, 실시예 3에서 사용한 메탄올을 유일한 탄소원으로 하는 합성 B 배지(단, 메탄올 농도는 1％(v/v)로 함) 100mL에서, 호기적으로 37℃로 배양하였다. 배양액의 OD600이 1.8-2.0인 시점에서, 원심 분리에 의해 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청을 LC/MS에 의해 분석하였다. 그 결과, MM-BDO주에서는, 1,4-BDO가 검출되었지만, MM-80주에서는 검출되지 않았다. MM-BDO주에 의해 산생된 1,4-BDO의 축적 농도는 15mM(1OD600당 8.3mM)이었다.
이상으로부터, RuMP 경로를 갖는 메틸로트로프에, 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터(서열 번호 10)를 도입함으로써, 메탄올로부터의 효율적인 1,4-BDO의 생산이 가능한 것이 나타났다.
실시예 5
대장균으로의 메탄올 데히드로게나아제(MDH) 유전자, HPS 유전자, PHI 유전자 및 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자의 도입과, 재조합체에 의한 메탄올로부터 1,4-BDO의 생산
1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터인 서열 번호 11의 인공 합성 유전자(9123 bp)를 구축하였다. 해당 유전자 클러스터는, mdh(서열 번호 7: 메탄올 탈수소 효소), HPS(서열 번호 8: 3-헥술로스-6인산 합성 효소), PHI(서열 번호 9: 3-헥술로스-6-인산 이성화 효소), SucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3: 4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4: 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 포함한다.
서열 번호 11의 인공 합성 유전자를, pTrc99A 벡터의 NcoI/HindIII 절단 부위에 클로닝하여, pTrcMeBDO를 제작하였다. pTrcMeBDO는, mdh(서열 번호 7: 메탄올 탈수소 효소), HPS(서열 번호 8: 3-헥술로스-6인산 합성 효소), PHI(서열 번호 9: 3-헥술로스-6-인산 이성화 효소), SucD(서열 번호 2: CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소), 4HBd(서열 번호 3: 4-히드록시부티르산 탈수소 효소), abfT(서열 번호 4: 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소) 및 adhE2(서열 번호 5: 알데히드/알코올 탈수소 효소 2)의 각 유전자를 발현시킨다.
컨트롤 벡터로서, pTrcMeBDO가 코딩하는 상기 7개의 효소군으로부터 MDH를 제외한 발현 벡터 pTrcMDH(-)를 구축하였다. 또한, pTrcMeBDO가 코딩하는 상기 7개의 효소군으로부터 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자인 SucD, 4HBd, abfT 및 adhE2를 제외한 발현 벡터 pTrcBDO(-)를 제작하였다.
발현 벡터 pTrcMeBDO, pTrcMDH(-) 또는 pTrcBDO(-)를 대장균 K12주에 도입하여, 각각 EKMeBDO주, EKMDH(-)주 및 EKBDO(-)주를 얻었다.
각각의 재조합 대장균을, 0.05mM 농도의 IPTG를 함유하는 메탄올 자화 합성 C 배지(1L당 H3PO4 18g, K2SO4 14.28g, KOH 3.9g, CaSO4·2H2O 0.9g, MgSO4·7H2O 11.7g, CuSO4·5H2O 8.4㎎, KI 1.1㎎, MnSO4H2O 4.2㎎, NaMoO4·2H2O 0.3㎎, H3BO3 0.03㎎, CoCl2·6H2O 0.7㎎, ZnSO4·7H2O 28㎎, FeSO4·7H2O 91㎎, 비오틴 0.28㎎, 메탄올 5mL, 클로람페니콜 34㎎ 및 암피실린 100㎎을 포함함) 100mL에서, 호기적으로 37℃로 배양하였다. 배양액의 OD600이 1.0-1.6인 시점에서, 원심부 분리에 의해 배양 상청을 회수하였다.
회수된 배양 상청을 LC/MS에 의해 분석한 바, EKMeBDO주에서는 1,4-BDO가 11mM(1OD600당 6.9mM) 생성하고 있었지만, EKBDO(-)주에서는 거의 검출되지 않았다. 또한, EKMDH(-)주는 전혀 생육되지 않았다.
이상으로부터, 비메틸로트로프인 대장균에 MDH 유전자, HPS 유전자 및 PHI 유전자를 도입함으로써, 메탄올을 주요 탄소원하는 배지에서 효율적으로 생육시키는 것이 가능하고, 또한 1,4-BDO 생합성 관련 효소 유전자 클러스터(서열 번호 11)를 도입함으로써, 효율적으로 1,4-BDO가 생성되는 것을 알 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Sekisui Chemical Co., Ltd. <120> ?????????????????????????? <130> 14P00042 <150> JP2013-008810 <151> 2013-01-21 <160> 11 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 7773 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic gene cluster for 1,4-BDO synthesis in Pichia pastolis <400> 1 cccgggacca tgggtaatga agtatctata aaagaattaa ttgaaaaggc aaaggtggca 60 caaaaaaaat tggaagccta tagtcaagaa caagttgatg tactagtaaa agcactagga 120 aaagtggttt atgataatgc agaaatgttt gcaaaagaag cagttgaaga aacagaaatg 180 ggtgtttatg aagataaagt agctaaatgt catttgaaat caggagctat ttggaatcat 240 ataaaagaca agaaaactgt aggcataata aaagaagaac ctgaaagggc acttgtttat 300 gttgctaagc caaagggagt tgtggcagct actacgccta taactaatcc agtggtaact 360 cctatgtgta atgcaatggc tgctataaag ggcagaaata caataatagt agcaccacat 420 cctaaagcaa agaaagtttc agctcatact gtagaactta tgaatgctga gcttaaaaaa 480 ttgggagcac cagaaaatat catacagata gtagaagcac catcaagaga agctgctaag 540 gaacttatgg aaagtgctga tgtagttatt gctacaggcg gtgctggaag agttaaagct 600 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540 gagtaa 546 <210> 10 <211> 6922 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic gene cluster for 1,4-BDO synthesis in Methylobacterium extorquens <400> 10 aagcttatga gtaatgaagt atctatcaaa gaattgattg aaaaggcaaa ggtggcacaa 60 aaaaaattgg aagcctatag tcaagaacaa gttgatgtac tagtaaaagc actaggaaaa 120 gtggtttatg ataatgcaga aatgtttgca aaagaagcag ttgaagaaac agaaatgggt 180 gtttatgaag ataaagtagc taaatgtcat ttgaaatcag gagctatttg gaatcatatc 240 aaagacaaga aaactgtagg catcatcaaa gaagaacctg aaagggcact tgtttatgtt 300 gctaagccaa agggagttgt ggcagctact acgcctatca ctaatccagt ggtaactcct 360 atgtgtaatg caatggctgc tatcaagggc agaaatacaa tcattgtagc accacatcct 420 aaagcaaaga aagtttcagc tcatactgta gaacttatga atgctgagct taaaaaattg 480 ggagcaccag aaaatatcat ccagatcgta gaagcaccat caagagaagc tgctaaggaa 540 cttatggaaa gtgctgatgt agttattgct acaggcggtg ctggaagagt taaagctgct 600 tactccagtg gaagaccagc ttatggcgtt ggacctggaa attcacaggt aatcgttgat 660 aagggatacg attataacaa agctgcacag gatatcatca caggaagaaa atatgacaat 720 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ctggtagtga aacaacatct cttgcagtta ttacagactc tgcacgtaaa gtaaaaatgc 480 ctgttattga tgagaaaatt actccaactg tagcaattgt tgacccagaa ttaatggtga 540 aaaaaccagc tggattaaca atcgcaactg gtatggacgc attatcacac gcaattgaag 600 catatgttgc aaaaggtgct acaccagtta ctgatgcatt tgcaattcaa gcaatgaaac 660 tcatcaatga atacttacca aaagcggtgg caaacggaga agacatcgaa gcacgtgaag 720 caatggctta tgcacaatac atggcaggag tggcatttaa caacggtggt ttaggattag 780 tacactctat ttctcaccaa gtaggtggag tttacaaatt acaacacgga atctgtaact 840 cagttaatat gccacacgtt tgcgcattca acctaattgc taaaactgag cgcttcgcac 900 acattgctga gcttttaggc gagaatgttt ctggcttaag cactgcagca gctgctgaga 960 gagcaattgt agcgcttgaa cgctataaca aaaacttcgg tatcccatct ggctatgcag 1020 aaatgggcgt gaaagaagag gatatcgaat tattagcgaa aaacgcattc gaagacgtat 1080 gtactcaaag caacccacgt gttgctacag ttcaagacat tgcacaaatc atcaaaaacg 1140 ctctgtaata attcttaaat aaacaatact taaaacattt gaggaggtct tgtaaacatg 1200 gcattgacac aaatggcatt agattcactg gatttcgacg caactgttgc gctggctgaa 1260 aaggtagctc 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cttttcattg tgatctctgg ctctggcagc acagaaaccc tgatgccttt 2160 ggttaagaag gcaaagagcc aaggtgccaa gattatcgtg atttccatga aggctcagtc 2220 cccaatggct gaattggctg atctggttgt gccagttggt ggcaacgatg ccaatgcatt 2280 tgacaagact catggtatgc ctatgggtac tattttcgag ttgtccaccc tgtggttcct 2340 cgaagcgact attgccaagc tggtagatca aaaaggtctg acagaagaag gtatgcgcgc 2400 gattcatgct aacctcgagt aataatagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 2460 aggggttttt tgtgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg 2520 gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagtaatgaa gtatctataa aagaattaat 2580 tgaaaaggca aaggtggcac aaaaaaaatt ggaagcctat agtcaagaac aagttgatgt 2640 actagtaaaa gcactaggaa aagtggttta tgataatgca gaaatgtttg caaaagaagc 2700 agttgaagaa acagaaatgg gtgtttatga agataaagta gctaaatgtc atttgaaatc 2760 aggagctatt tggaatcata taaaagacaa gaaaactgta ggcataataa aagaagaacc 2820 tgaaagggca cttgtttatg ttgctaagcc aaagggagtt gtggcagcta ctacgcctat 2880 aactaatcca gtggtaactc ctatgtgtaa tgcaatggct gctataaagg gcagaaatac 2940 aataatagta 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gttgcaaaga agaaggatgg aagtatgatt tcgaagatcg ttccattcat 8880 cgatcacggt gcagctgtaa ctacatccag aaacgatgcg gactatgtcg taacggaata 8940 tggtattgct gaaatgaagg gtaagtcttt acaggacaga gcaagagcgt taatcaatat 9000 tgcacaccct gatttcaaag atgaattaaa ggctgaattt gaaaagagat tcaacgcggc 9060 attctaataa tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgaag 9120 ctt 9123

Claims (21)

  1. 메틸로트로프(Methylotroph)인 숙주 세포에, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
    당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
    메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
  2. 메틸로트로프인 숙주 세포에, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
    당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
    메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포름알데히드의 고정화 경로로서, 세린 경로, 리불로스모노인산 경로 및 크실룰로스모노인산 경로로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 탄소 동화 경로를 갖는 재조합 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 3-헥술로스6인산 합성 효소를 코딩하는 유전자와, 6-포스포-3-헥술로이소머라아제를 코딩하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현되는 재조합 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 메탄올 자화성 효모이며, 메탄올을 탈수소 반응에 의해 포름알데히드로 변환하는 효소를 코딩하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현되는 재조합 세포.
  6. 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자와, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
    당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
    메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
  7. 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자와, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
    당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
    메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 포름알데히드 고정화능을 부여하는 유전자는, 3-헥술로스6인산 합성 효소를 코딩하는 유전자 및 6-포스포-3-헥술로이소머라아제를 코딩하는 유전자인 재조합 세포.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 포름알데히드의 고정화 경로로서, 세린 경로, 리불로스모노인산 경로 및 크실룰로스모노인산 경로로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 탄소 동화 경로를 갖는 재조합 세포.
  10. 리불로스모노인산 경로를 갖는 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 숙시닐 CoA 합성 효소, CoA 의존형 숙신산세미알데히드 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
    당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
    메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
  11. 리불로스모노인산 경로를 갖는 숙주 세포에, 메탄올 및/또는 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자와, 2-옥소글루타르산 탈탄산 효소, 4-히드록시부티르산 탈수소 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 전이 효소, 4-히드록시부티르산 CoA 환원 효소, 4-히드록시부티르알데히드 탈수소 효소 및 알코올 데히드로게나아제로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 이루어지고,
    당해 유전자가 상기 숙주 세포 내에서 발현되고,
    메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산 가능한 재조합 세포.
  12. 제6항, 제7항, 제9항, 제10항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 3-헥술로스6인산 합성 효소를 코딩하는 유전자와, 6-포스포-3-헥술로이소머라아제를 코딩하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현되는 재조합 세포.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄올을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자는 메탄올 데히드로게나아제 또는 알코올 옥시다아제를 코딩하는 유전자이고, 포름산을 포름알데히드로 변환하는 기능을 부여하는 유전자는 포름알데히드 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자인 재조합 세포.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 메탄을 메탄올로 변환하는 기능을 부여하는 유전자가 더 도입되어, 당해 유전자가 숙주 세포 내에서 발현되는 재조합 세포.
  15. 제14항에 있어서, 메탄을 메탄올로 변환하는 기능을 부여하는 유전자는 메탄 모노옥시게나아제를 코딩하는 유전자인 재조합 세포.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 도입된 유전자가 숙주 세포의 게놈에 편입되어 있는 재조합 세포.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 도입된 유전자가 플라스미드에 편입되어 있는 재조합 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 400mM의 1,4-부탄디올에 대한 내성을 갖는 재조합 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2％(v/v)의 메탄올에 대한 내성을 갖는 재조합 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 세포를, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 탄소원으로서 사용하여 배양하고, 당해 재조합 세포에 1,4-부탄디올을 생산시키는 1,4-부탄디올의 생산 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 세포에, 메탄, 메탄올, 메틸아민, 포름산, 포름알데히드 및 포름아미드로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 C1 화합물을 접촉시켜, 당해 재조합 세포에 상기 C1 화합물로부터 1,4-부탄디올을 생산시키는 1,4-부탄디올의 생산 방법.
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