WO2014112627A1 - 組換え細胞、並びに、１，４－ブタンジオールの生産方法 - Google Patents

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gene
dehydrogenase
methanol
formaldehyde
butanediol
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PCT/JP2014/050998
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古谷　昌弘
章太 上西
航一郎 岩佐
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積水化学工業株式会社
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    • C12Y402/03—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03027—Isoprene synthase (4.2.3.27)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant cell capable of producing 1,4-butanediol from methanol or the like, and a method for producing 1,4-butanediol using the recombinant cell.
  • 1,4-Butanediol is an organic compound that can be an important raw material for butadiene as a monomer of synthetic rubber, and is particularly important in the tire industry.
  • development and commercialization of technology for converting from the production process of basic chemical products that depend on petroleum to the production process from renewable resources such as plant resources has been steadily progressing.
  • 1,4-butanediol for example, a production technique using recombinant Escherichia coli using sugar as a raw material is known (Patent Document 1).
  • 1,4-butanediol can be biosynthesized using, for example, succinate or ⁇ -ketoglutarate as a starting material.
  • succinic acid is succinyl CoA (Succinyl CoA), succinic semialdehyde, 4-hydroxybutyrate, 4-hydroxybutyryl CoA (4-Hydroxybutyryl CoA).
  • succinyl CoA succinyl CoA
  • succinic semialdehyde 4-hydroxybutyrate
  • 4-hydroxybutyryl CoA (4-Hydroxybutyryl CoA).
  • 4-hydroxybutyraldehyde (4-Hydroxybutyraldehyde), it is converted to 1,4-butanediol.
  • the enzymes that catalyze each reaction are (a) succinyl-CoA synthetase, (b) CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase, (e) 4 -Hydroxybutyrate-dehydrogenase (4-hydroxybutyrate-dehydrogenase), (f) 4-hydroxybutyryl-CoA-transferase, (g) 4-hydroxybutyryl-CoA reductase And (h) alcohol dehydrogenase (FIG. 1). All organisms have (a) succinyl-CoA synthase.
  • succinic acid is converted to 1,4-butanediol via succinic semialdehyde, 4-hydroxybutyric acid, 4-hydroxybutyric acid CoA, and 4-hydroxybutyraldehyde.
  • the enzyme that catalyzes the reaction for converting succinic acid to succinic semialdehyde is (c) succinate semialdehyde dehydrogenase (FIG. 1).
  • ⁇ -ketoglutaric acid passes through succinic semialdehyde, 4-hydroxybutyric acid, 4-hydroxybutyric acid CoA, and 4-hydroxybutyraldehyde to 1,4-butane. Converted to diol.
  • the enzyme that catalyzes the reaction for converting ⁇ -ketoglutarate to succinic semialdehyde is (d) 2-oxoglutarate decarboxylase (FIG. 1).
  • methanol is inexpensively produced from natural gas and synthesis gas, which is a mixed gas of carbon monoxide, carbon dioxide, and hydrogen obtained by incineration of waste such as biomass and municipal waste. Is done. Natural gas is abundant in fossil resources, and the amount of generated CO 2 is relatively small. Therefore, natural gas is attracting attention as a next-generation energy source, and the transition from conventional oil to natural gas is progressing. Methanol is easy to handle and store, such as being soluble in water, and is also suitable as a carbon source for microbial culture.
  • Methylotroph is a carbon compound that does not have a C—C bond in the molecule, for example, methane, methanol, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, etc., as the sole carbon source and energy source, assimilating C1 compounds It is a generic name for microorganisms. Microorganisms called methanotroph, methane oxidizing bacteria, methanol-assimilating bacteria, methanol-assimilating yeast, methanol-assimilating microorganisms, etc. all belong to methylotrophs. Many bacterial methylotrophs can assimilate methane, and these are often called methanotrophs.
  • Methylotroph uses the reaction of converting formaldehyde to organic matter having a C—C bond after converting methanol to formaldehyde as the central metabolism.
  • serine pathway ribulose monophosphate pathway (RuMP pathway)
  • XuMP pathway xylulose monophosphate pathway
  • Methylotrophs classified as bacteria possess a serine cycle or RuMP pathway.
  • methylotrophic bacteria are classified into obligate methylotrophs and facultative methylotrophs that can use other carbon compounds because of differences in methanol requirements.
  • an object of the present invention is to provide a series of techniques for producing 1,4-butanediol from methanol or the like.
  • a host cell that is a methylotroph is provided with a succinic semialdehyde dehydrogenase, a succinyl CoA synthase, a CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase, 4-hydroxy Introduced gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of butyrate dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase
  • the gene is expressed in the host cell and can produce 1,4-butanediol from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide. Is a recombinant cell.
  • 1,4-butanediol can be biosynthesized from succinic acid.
  • the recombinant cell of the present invention comprises a group of enzymes acting in the biosynthetic pathway from succinic acid to 1,4-butanediol, that is, succinic semialdehyde dehydrogenase, succinyl CoA synthase, CoA-dependent succinic semi At least one selected from the group consisting of aldehyde dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase
  • a gene encoding one enzyme is introduced into a host cell that is a methylotroph, and the gene is expressed in the host cell.
  • 1,4-butanediol can be produced from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • the above-mentioned C1 is obtained via succinic acid.
  • 1,4-butanediol can be produced from the compound.
  • a host cell that is a methylotroph is allowed to have 2-oxoglutarate decarboxylase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxyl
  • a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of butyrate-CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase is introduced, and the gene is expressed in the host cell;
  • 1,4-butanediol can also be biosynthesized from ⁇ -ketoglutaric acid.
  • the recombinant cell of the present invention has a group of enzymes acting in the biosynthetic pathway from ⁇ -ketoglutarate to 1,4-butanediol, that is, 2-oxoglutarate decarboxylase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4 -A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase is a methylotrophic host cell.
  • 1,4-butanediol can be produced from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • the methylotrophic inherent “function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde” and “formaldehyde immobilization ability” are based on ⁇ -ketoglutarate via the ⁇ -ketoglutarate. 1,4-butanediol can be produced from the obtained C1 compound.
  • the formaldehyde immobilization pathway has at least one C1 carbon assimilation pathway selected from the group consisting of serine pathway, ribulose monophosphate pathway, and xylose monophosphate pathway.
  • a gene encoding 3-hexulose 6-phosphate synthase and a gene encoding 6-phospho-3-hexoisomerase are further introduced, and the gene is expressed in the host cell.
  • the host cell is a methanol-assimilating yeast, and a gene encoding an enzyme that converts methanol into formaldehyde by a dehydrogenation reaction is further introduced, and the gene is expressed in the host cell.
  • yeast is highly resistant to alcohol. Therefore, in this aspect, methanol-assimilating yeast is used as a host to increase the resistance of recombinant cells to 1,4-butanediol. Further, in yeast, alcohol oxidase is generally responsible for the conversion reaction from methanol to formaldehyde. For this reason, oxygen is required for the conversion reaction, and specifically, it is necessary to aerate vigorously during the culture. Therefore, in this aspect, a gene encoding “enzyme that converts methanol into formaldehyde by dehydrogenation” is introduced so that the conversion reaction from methanol to formaldehyde can be performed without relying on oxygen.
  • a host cell is provided with a gene that imparts a function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde, a gene that imparts formaldehyde immobilization ability, Aldehyde dehydrogenase, succinyl CoA synthase, CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde
  • a “gene that imparts a function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde” and a “gene that imparts formaldehyde immobilization ability” are introduced into a host cell.
  • Enzymes that act in the biosynthetic pathway leading to 4-butanediol namely succinic semialdehyde dehydrogenase, succinyl CoA synthase, CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4 -A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase has been introduced.
  • 1,4-butanediol can be produced from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide. That is, the recombinant cell of the present invention has the same characteristics as a methylotroph because a “gene that imparts a function of converting methanol and / or formic acid to formaldehyde” and a “gene that imparts formaldehyde immobilization ability” have been introduced. Have.
  • 1,4- Butanediol can be produced.
  • a gene that gives a host cell a function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde a gene that gives formaldehyde immobilization ability, 2-oxoglutar, At least one selected from the group consisting of acid decarboxylase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase From at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide. Recombinant capable of producing 1,4-butanediol It is a cell.
  • a “gene that imparts a function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde” and a “gene that imparts formaldehyde immobilization ability” are introduced into a host cell, and further from ⁇ -ketoglutarate.
  • a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase and alcohol dehydrogenase has been introduced. Then, 1,4-butanediol can be produced from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • the recombinant cell of the present invention has the same characteristics as a methylotroph because a “gene that imparts a function of converting methanol and / or formic acid to formaldehyde” and a “gene that imparts formaldehyde immobilization ability” have been introduced. Have. Then, based on the “function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde” and “formaldehyde immobilization ability” imparted by these foreign genes, the ⁇ -ketoglutaric acid is used as a 1, 4-Butanediol can be produced.
  • the gene imparting formaldehyde immobilization ability is a gene encoding 3-hexulose 6-phosphate synthase and a gene encoding 6-phospho-3-hexoisomerase.
  • Such a configuration provides formaldehyde immobilization ability by the ribulose monophosphate pathway.
  • the formaldehyde immobilization pathway has at least one C1 carbon assimilation pathway selected from the group consisting of a serine pathway, a ribulose monophosphate pathway, and a xylulose monophosphate pathway.
  • Another aspect of the present invention for solving the same problem is to provide a host cell having a ribulose monophosphate pathway with a gene that functions to convert methanol and / or formic acid into formaldehyde, and succinic semialdehyde dehydrogenase.
  • a host cell having a ribulose monophosphate pathway has a gene that gives a function of converting methanol and / or formic acid to formaldehyde, and 2-oxoglutarate decarboxylase.
  • Encoding at least one enzyme selected from the group consisting of 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase From the at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • a gene encoding 3-hexulose 6-phosphate synthase and a gene encoding 6-phospho-3-hexoisomerase are further introduced, and the gene is expressed in the host cell.
  • the gene imparting the function of converting methanol to formaldehyde is a gene encoding methanol dehydrogenase or alcohol oxidase
  • the gene imparting the function of converting formic acid to formaldehyde is a gene encoding formaldehyde dehydrogenase.
  • Both methanol dehydrogenase and alcohol dehydrogenase have the action of converting methanol into formaldehyde.
  • Formaldehyde dehydrogenase has a function of converting formic acid into formaldehyde.
  • These enzymes are all methane metabolizing enzymes in methylotrophs belonging to bacteria.
  • methylotrophs belonging to yeast do not have methane oxidation activity, but have an action of converting methanol into formaldehyde by the action of alcohol oxidase.
  • Yeast also has an enzymatic activity to convert formic acid into formaldehyde.
  • a gene imparting a function of converting methane to methanol is further introduced, and the gene is expressed in the host cell.
  • the gene imparting the function of converting methane to methanol is a gene encoding methane monooxygenase.
  • Methane monooxygenase has an action of converting methane to methanol. Methane monooxygenase is also one of the methane metabolizing enzymes in methylotrophs.
  • the introduced gene is integrated into the genome of the host cell.
  • the introduced gene is more stably retained in the recombinant cell.
  • the introduced gene is incorporated into the plasmid.
  • it has resistance to at least 400 mM 1,4-butanediol.
  • 1,4-butanediol can be produced in a larger amount.
  • it has a resistance to at least 2% (v / v) methanol.
  • 1,4-butanediol can be produced in a larger amount.
  • the above recombinant cell is cultured using at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide as a carbon source,
  • 1,4-butanediol is produced by allowing a recombinant cell to produce 1,4-butanediol.
  • the present invention relates to a method for producing 1,4-butanediol.
  • the above recombinant cells are cultured using at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide as a carbon source.
  • 4-butanediol is produced.
  • 1,4-butanediol can be produced from methanol or the like.
  • the recombinant cell is contacted with at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide, and the recombinant cell is contacted with the aforementioned recombinant cell.
  • 1,4-butanediol is produced from C1 compound.
  • the above-described recombinant cell is contacted with at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide, and 1,4-butanediol is obtained from the C1 compound.
  • C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide
  • 1,4-butanediol is obtained from the C1 compound.
  • 1,4-butanediol can be produced from methanol or the like.
  • 1,4-butanediol can be produced from methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, or formamide.
  • 1,4-butanediol of the present invention is the same, and 1,4-butanediol can be produced from methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, or formamide.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram showing a metabolic pathway from succinic acid or ⁇ -ketoglutaric acid to 1,4-butanediol. It is explanatory drawing showing the carbon assimilation metabolic pathway through formaldehyde.
  • the term “gene” can be replaced by the term “nucleic acid” or “DNA”.
  • the recombinant cell of the present invention can be transferred from a succinic acid or ⁇ -ketoglutaric acid to a host cell having “a function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde” and “formaldehyde immobilization ability”.
  • a gene encoding an enzyme group that acts in the biosynthetic pathway leading to butanediol has been introduced.
  • the host cells employed in the present invention include both host cells that are methylotrophs and a wide range of host cells including non-methylotrophs.
  • a methylotroph is a carbon compound that does not have a C—C bond in the molecule, such as methane, methanol, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, etc., as a sole carbon source and energy source. It refers to a chemical microorganism.
  • methylotrophs inherently have a carbon assimilation metabolic pathway through formaldehyde, specifically, a function (route) for converting methanol and / or formic acid to formaldehyde and a formaldehyde immobilization ability (formaldehyde immobilization pathway). I have it.
  • the formaldehyde immobilization pathway includes the serine pathway, ribulose monophosphate pathway (RuMP pathway), and xylulose monophosphate pathway (XuMP pathway) shown in FIG.
  • methylotrophs possess a serine pathway, a RuMP pathway, or a XuMP pathway as a carbon assimilation metabolic pathway via formaldehyde.
  • route (FIG. 2) is demonstrated.
  • An important reaction for formaldehyde fixation by the serine pathway is a serine production reaction from glycine and 5,10-methylene-tetrahydrofolate by serine hydroxymethyltransferase.
  • 5,10-methylene-tetrahydrofolic acid is formed by the combination of formaldehyde and tetrahydrofolic acid.
  • one molecule of acetyl CoA is directly generated from one molecule of formaldehyde.
  • Ru5P ribulose 5-phosphate
  • HPS 3-hexulose-6-phosphate synthase
  • PHI 6-phospho-3-hexuloisomerase
  • F6P and the like produced by this pathway are also used for glycolysis, and then produce acetyl CoA, glyceraldehyde triphosphate (G3P), and pyruvic acid.
  • G3P glyceraldehyde triphosphate
  • F6P it is converted into two molecules of G3P per molecule, and then two molecules of acetyl CoA are generated via two molecules of pyruvic acid.
  • DHA dihydroxyacetone
  • G3P glyceraldehyde triphosphate
  • Xu5P xylulose pentaphosphate
  • Xu5P xylulose pentaphosphate
  • G3P produced by this pathway is also used for glycolysis and converted to pyruvic acid and acetyl CoA.
  • Dihydroxyacetone can also be subjected to glycolysis by phosphorylation and converted to G3P, pyruvate, and acetyl CoA.
  • the recombinant cell of the present invention is capable of producing 1,4-butanediol from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • methanol can be converted to formaldehyde.
  • methane in addition to methanol dehydrogenase or alcohol oxidase, methane can be converted to methanol, and subsequently methanol can be converted to formaldehyde.
  • formic acid can be converted to formaldehyde.
  • methylotrophs methylotrophic bacteria classified as bacteria have methane monooxygenase and methanol dehydrogenase, so that formaldehyde can be synthesized from methane or methanol.
  • methylotrophs methylotrophic yeasts classified as yeast have alcohol oxidase, so that formaldehyde can be synthesized from methanol.
  • methylotroph has formaldehyde dehydrogenase and can convert formic acid into formaldehyde.
  • the methanol dehydrogenase includes pyrroloquinoline quinone (PQQ) -dependent methanol dehydrogenase found in methylotrophs of gram-negative bacteria, NAD (P) -dependent methanol dehydrogenase and alcohol dehydrogenase found in methylotrophs of gram-positive bacteria, gram-positive DMNA (N, N′-dimethyl-4-nitrosoaniline) -dependent methanol oxidoreductase (Park H. et al., Microbiology 2010, 156, 463-471), which is found in bacterial methylotrophs, is included.
  • the conversion of methanol to formaldehyde in yeast is usually catalyzed by alcohol oxidase, which is oxygen dependent.
  • methylamine can be converted to formaldehyde.
  • These enzymes are known to be possessed by some methylotrophs and bacteria belonging to the genus Arthrobacter (Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.).
  • An enzyme that converts formamide to formaldehyde has been found in some microorganisms (Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.).
  • 1,4-butanediol can be produced via formaldehyde.
  • the type of methylotroph used as a host cell is not particularly limited, and for example, those classified into bacteria and yeasts can be employed.
  • methylotrophic bacteria examples include, for example, Methylacidphilum, Methylosinus, Methylocystis, Methylobacterium, Methylocella, Methylococcus, Methylomonas, Methylobacter, Methylobacillus, Methylophilus, Methylotenera, Methylovorus, Genus, Methyloversatilis, Mycobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Beggiatoa, Burkholderia, Granulibacter, Hyphomicrobium, Pseudomonas, Achromobactor, Paracoccus, Crenothrix, Clonothrix, Rhodohobacter, Rhodobacter Examples include bacteria belonging to the genus Thiomicrospira, Verrucomicrobia, and the like.
  • Examples of methylotrophic yeasts include yeasts belonging to the genera Pichia, Candida, Saccharomyces, Hansenula, Torulopsis, Kloeckera, and the like.
  • Examples of Pichia yeast include P. ⁇ haplophila, P. pastoris, P. trehalophila, P. lindnerii, and the like.
  • Examples of Candida yeast include C. parapsilosis, C. methanolica, C. boidinii, C. alcomigas, and the like.
  • Examples of Saccharomyces yeasts include Saccharomyces metha-nonfoams.
  • Examples of Hansenula yeast include H. Hwickerhamii, H. capsulata, H. glucozyma, H.
  • Torulopsis yeast examples include T. ⁇ methanolovescens, T. glabrata, T. nemodendra, T. pinus, T. methanofloat, T. enokii, T. menthanophiles, T. methanosorbosa, T. methanodomercqii, and the like.
  • the host cell When the host cell is a non-methylotroph, it does not necessarily have a pathway for converting methanol or the like to formaldehyde, so it is necessary to provide at least a “function for converting methanol and / or formic acid to formaldehyde”. . Furthermore, it is preferable to provide “a function of converting methane to methanol”. These functions can be imparted by introducing a gene encoding the above-described enzyme into a host cell.
  • a gene imparting a function of converting methanol into formaldehyde a gene encoding methanol dehydrogenase (for example, EC1.1.1.244, EC1.1.2.7) or a gene encoding alcohol oxidase (for example, EC1.13.13) can be used.
  • a gene encoding formaldehyde dehydrogenase (for example, EC1.2.1.46) can be used as a gene that imparts a function of converting formic acid into formaldehyde.
  • a gene encoding methane monooxygenase can be used as a gene imparting the function of converting methane to methanol.
  • a plasmid that imparts methanol assimilation is known.
  • the assimilation ability of Bacillus methanolicus depends on a plasmid encoding an enzyme group involved in methanol metabolism (Brautaset T. et al., J. Bacteriology 2004, 186 (5), 1229-1238).
  • By introducing such a plasmid into a related non-methylotroph it is possible to confer methanol assimilation ability.
  • By modifying such a plasmid it is possible to impart methanol-assimilating properties to various non-methylotrophs.
  • non-methylotrophs are treated in the same way as methylotrophs by providing them with the function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde, and further by providing the ability to immobilize formaldehyde.
  • the formaldehyde-immobilizing ability can be imparted, for example, by introducing a gene encoding an enzyme that acts in the serine pathway, RuMP pathway, or XuMP pathway described above into a non-methylotroph.
  • the host cell is methanol-assimilating yeast
  • a gene encoding an enzyme that converts methanol into formaldehyde by dehydrogenation is further introduced, and the gene is expressed in the host cell.
  • a target recombinant cell can be obtained by using a Pichia genus yeast having methanol assimilation property as a host cell and further introducing a methanol dehydrogenase gene. According to this embodiment, it is possible to obtain a recombinant cell capable of producing 1,4-butanediol, which has high alcohol resistance and can convert methanol into formaldehyde without depending on oxygen.
  • the provision of the RuMP pathway is, for example, the above-described 3-hexulose 6-phosphate synthase (HPS; eg EC4.1.2.43) gene and 6-phospho-3-hexoisomerase (PHI; eg EC5.3.1.27).
  • HPS 3-hexulose 6-phosphate synthase
  • PHI 6-phospho-3-hexoisomerase
  • This can be realized by introducing a gene. That is, ribulose 5-phosphate (Ru5P) and fructose 6-phosphate (F6P), which are substrates or products of formaldehyde immobilization reaction by HPS / PHI, are all biological organisms as metabolic intermediates of the pentose phosphate pathway and the calvin cycle. Exists universally. Therefore, by introducing HPS / PHI, it is possible to impart formaldehyde immobilization ability to all organisms including Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast and the like.
  • the HPS gene and the PHI gene may be introduced into a host cell originally having a RuMP pathway.
  • a RuMP pathway For example, an alcohol dehydrogenase such as methanol dehydrogenase (for example, EC1.1.1.244, EC1.1.2.7), 3-hexulose, or the like, which originally has a RuMP pathway or a pathway similar to this, such as Bacillus subtilis.
  • an alcohol dehydrogenase such as methanol dehydrogenase (for example, EC1.1.1.244, EC1.1.2.7), 3-hexulose, or the like, which originally has a RuMP pathway or a pathway similar to this, such as Bacillus subtilis.
  • the above-mentioned serine hydroxymethyltransferase (for example, EC2.1.2.1) gene can be used.
  • serine hydroxymethyltransferase eg EC2.1.2. 1
  • an enzyme group acting in a biosynthetic pathway from succinic acid or ⁇ -ketoglutarate to 1,4-butanediol (hereinafter collectively referred to as “1,4-butanediol biosynthesis-related enzymes (groups)”. ) ", Which is sometimes called”) "has been introduced.
  • the enzymes shown in (a) to (i) of FIG. 1 correspond to 1,4-butanediol biosynthesis-related enzymes.
  • the enzymes acting in the biosynthetic pathway from succinic acid to 1,4-butanediol include (c) succinic semialdehyde dehydrogenase, (a) succinyl CoA synthase, and (b) CoA dependent Type succinic semialdehyde dehydrogenase, (e) 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, (f) 4-hydroxybutyrate CoA transferase, (g) 4-hydroxybutyrate CoA reductase, (i) 4-hydroxybutyraldehyde A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of dehydrogenase and (h) alcohol dehydrogenase has been introduced into a host cell. For example, one or more enzymes may be selected from these enzyme groups and a gene encoding the enzyme may be introduced into the host cell.
  • (d) 2-oxoglutarate decarboxylase and (e) 4-hydroxybutyrate dehydrogenase are enzymes acting in the biosynthetic pathway from ⁇ -ketoglutarate to 1,4-butanediol. At least selected from the group consisting of an enzyme, (f) 4-hydroxybutyrate CoA transferase, (g) 4-hydroxybutyrate CoA reductase, (i) 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and (h) alcohol dehydrogenase
  • a gene encoding one enzyme has been introduced into the host cell.
  • one or more enzymes may be selected from these enzyme groups and a gene encoding the enzyme may be introduced into the host cell.
  • enzymes (1,4-butanediol biosynthesis-related enzymes) are not particularly limited as long as they can exhibit the enzyme activity in recombinant cells.
  • the enzyme related to 1,4-butanediol biosynthesis and its gene include those disclosed in Patent Document 1 above. For example, the following enzymes are mentioned.
  • an enzyme gene that is more excellent in substrate specificity, molecular activity, and stability, that is, having a higher Kcat / Km value or the like may be introduced.
  • the enzyme gene includes a gene encoding a modified enzyme originally possessed by the host cell. Optimization of codons of the transgene and avoidance of low frequency can be performed in each host microorganism with reference to “CodonCoUsage Database” (http://www.kazusa.or.jp/codon/).
  • C Succinate semialdehyde dehydrogenase (for example, EC 1.2.1.16, EC 1.2.1.24) Examples of genes (both indicated by UniProtKB No.): P76149 (E. coli); P25526 (E. coli); P94428 (Bacillus subtilis); Q55585 (Synechocystis sp.); P38067 (Saccharomyces cerevisiae), etc.
  • Succinyl CoA synthetase Succinyl CoA synthetase, Succinyl CoA ligase: for example, EC 6.2.1.4, EC 6.2.1.5, etc.
  • genes both expressed as UniProtKB / Swiss-Prot No.: P0AGE9 (E. coli); P0A836 (E. coli); P53598 (Saccharomyces cerevisiae); P53312 (Saccharomyces cerevisiae); P09143 (Thermus thermophilus); O82662 (Arabidopsis thaliana) etc.
  • This enzyme activity is possessed by all living organisms, but it is also effective to introduce it as a foreign gene if necessary.
  • CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase for example, EC 1.2.1.79
  • genes both indicated by UniProtKB / Swiss-Prot No.: P38947 (Clostridium kluyveri); A4YGN0 (Metallosphaera sedula), etc.
  • E 4-hydroxybutyrate dehydrogenase (eg EC 1.1.1.61)
  • genes both expressed as UniProtKB / Swiss-Prot No.: D8GUP1 (Clostridium ljungdahlii); C9YNR6 (Clostridium difficile); Q97IR6 (Clostridium acetobutylicum); Q8XYI7 (Ralstonia solanacearum); Q7phyromis
  • Alcohol dehydrogenase for example, EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2, etc.
  • genes both expressed as UniProtKB / Swiss-Prot No.: P0A4X1 (Mycobacterium bovis); P00331 (Saccharomycess cerevisiae); P00330 (Saccharomycess cerevisiae); Q9HIM3 (Thermoplasma acidophilum); B9WPR7 (Arthrobacter P4.Arthrobacter) Drosophila melanogaster) etc.
  • adhE corresponds to both (g) and (h).
  • Examples of adhE include D8GU53 (Clostridium ljungdahlii), D8GU52 (Clostridium ljungdahlii), Q9ANR5 (Clostridium acetobutylicum), P0A9Q7 (E. coli), F7TVB7 (Brevibacillus laterosporus)- display).
  • (I) 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase This enzyme is an enzyme that can reversibly catalyze the conversion of 4-hydroxybutyric acid to 4-hydroxybutyraldehyde.
  • aldehyde dehydrogenase eg EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4, EC 1.2.1.5, etc.
  • aldehyde dehydrogenase genes exhibiting 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase activity both indicated by UniProtKB / Swiss-Prot No.
  • E4R8S4 Pseudomonas putida
  • P23883 E.
  • (D) 2-oxoglutarate decarboxylase (eg EC 4.1.1.71)
  • genes (both expressed as UniProtKB / Swiss-Prot No.): A0R2B1 (Mycobacterium smegmatics); I0WZ48 (Rhodococcus imtechensis); G2EJR8 (Corynebacterium glutamicum); J1S9U2 (Streptomyces auratus); J7LQH4 (Arthrobacter sp.
  • the type (number) of genes of “1,4-butanediol biosynthesis-related enzyme” to be introduced is selected from the group consisting of “methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide”. As long as it is possible to produce 1,4-butanediol from at least one C1 compound, at least one is sufficient. However, when the activity of each enzyme is enhanced by introducing two or more genes, it is expected that the productivity of 1,4-butanediol will increase. Basically, for the 1,4-butanediol biosynthesis-related enzyme that is not possessed by the host cell, a gene encoding the enzyme is introduced from the outside. In addition, when the host cell has a low molecular activity, it is preferable to introduce a gene encoding an enzyme having a higher molecular activity.
  • the 1,4-butanediol biosynthesis-related enzyme may be a naturally-occurring enzyme or a modified enzyme of each enzyme.
  • it may be an amino acid substitution mutant of each enzyme or a polypeptide that is a partial fragment of each enzyme and has the same enzyme activity.
  • genes may be further introduced in addition to the gene encoding 1,4-butanediol biosynthesis-related enzyme.
  • the gene to be introduced include the above-mentioned methanol dehydrogenase gene, alcohol dehydrogenase gene, methane monooxidase gene, HPS / PHI gene, serine hydroxymethyltransferase gene, 5,10-methylenetetrahydrofolate synthase gene, and serine hydroxymethyltransferase Genes, etc.
  • a method for introducing a gene into a host cell is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of the host cell.
  • a vector that can be introduced into a host cell and can express an integrated gene can be used.
  • the vector when the host cell is a prokaryotic organism such as a bacterium, the vector contains a promoter at a position where it can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome, and the inserted gene can be transcribed.
  • the vector contains a promoter at a position where it can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome, and the inserted gene can be transcribed.
  • the homologous recombination method preferably targets a gene present in multiple copies on the genome, such as inverted-repeat sequence.
  • methods for introducing multiple copies into the genome include a method for loading in a transposon. Examples of gene introduction methods using a plasmid into methylotrophic bacteria include pAYC32p (Chistoserdov AY., Et al., Plasmid 1986, 16, 161-167), pRP301 (Lane M., et al. Arch. Microbiol.
  • the gene introduction method in methylotrophic yeast is established mainly by Pichia pastoris, and vectors such as pPIC3.5K, pPIC6, pGAPZ, pFLD (Invitrogen) are commercially available.
  • Bacillus subtilis includes pMTLBS72 (Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54 (3), 241-248), pHT01 (Funakoshi), pHT43 (Funakoshi).
  • Bacillus megaterium includes p3STOP1623hp (Funakoshi), pSP YocH hp (Funakoshi), and Bacillus brevis includes pNI DNA (Takara Bio).
  • each gene when a plurality of types of genes are introduced into a host cell using a vector, each gene may be incorporated into one vector or may be incorporated into separate vectors. Further, when a plurality of genes are incorporated into one vector, each gene may be expressed under a common promoter or may be expressed under different promoters.
  • introducing a plurality of types of genes when the host cell is a methylotroph, in addition to the “gene encoding 1,4-butanediol biosynthesis-related enzyme”, an embodiment in which an HPS / PHI gene is introduced. It is done.
  • regions related to transcription control, replication regions, etc. such as promoters and terminators, can be modified according to the purpose.
  • a modification method it may be changed to another natural gene sequence in each host cell or its related species, or may be changed to an artificial gene sequence.
  • the foreign gene may be incorporated into the genome of the host cell or may be incorporated into a plasmid.
  • the recombinant cells are resistant to at least 400 mM 1,4-butanediol. In another preferred embodiment, the recombinant cell has a resistance to at least 2% (v / v) methanol. With this configuration, high production of 1,4-butanediol becomes possible.
  • a recombinant cell having such characteristics can be obtained, for example, by subjecting a host cell to appropriate mutation treatment, selecting a host cell having the desired characteristics, and using the host cell.
  • the present invention includes the following (i) to (iv).
  • a host cell that is a methylotroph a host cell into which a gene that imparts a function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde and a gene that imparts formaldehyde immobilization ability, or a ribulose monophosphate pathway
  • succinic semialdehyde dehydrogenase succinyl CoA synthase
  • CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase 2-oxoglutar
  • One enzyme The gene to be loaded
  • a host cell that is a methylotroph, succinic semialdehyde dehydrogenase, succinyl CoA synthase, CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase, 2-oxoglutarate decarboxylase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase,
  • a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase is introduced, The gene is expressed in the host cell, A recombinant cell capable of producing 1,4-butanediol from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • a gene that provides a host cell with a function of converting methanol and / or formic acid into formaldehyde a gene that imparts formaldehyde immobilization ability, succinic semialdehyde dehydrogenase, succinyl-CoA synthase, CoA-dependent type Succinic semialdehyde dehydrogenase, 2-oxoglutarate decarboxylase, 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4-hydroxybutyrate CoA transferase, 4-hydroxybutyrate CoA reductase, 4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase, and A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of alcohol dehydrogenase is introduced, The gene is expressed in the host cell, A recombinant cell capable of producing 1,4-butanediol from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid,
  • a gene encoding at least one enzyme selected from the group is introduced, The gene is expressed in the host cell, A recombinant cell capable of producing 1,4-butanediol from at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and
  • the above-described recombinant cell is treated with at least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide.
  • C1 compounds used as a carbon source only one may be used and it may be used in combination of 2 or more.
  • a synthetic medium containing C1 compound as the only carbon source, but a small amount of natural medium such as yeast extract, corn steep liquor, meat extract and vitamins are added to this. This also promotes the growth of bacteria.
  • substances other than C1 compounds such as carbohydrates and lipids may be used as a carbon source in the cell growth stage, and if the carbon source is changed to the above C1 compound in the 1,4-butanediol production stage. Good.
  • the microorganism can be cultured under aerobic, microaerobic or anaerobic conditions depending on the purpose. Any of batch culture, fed-batch culture, and continuous culture may be used.
  • methanol when used as the carbon source, it is usually used at a concentration of 1.0% (v / v) for bacteria and at a concentration of 3.0% (v / v) or less for yeast.
  • the resistance to when it is improved, it can be cultured at higher concentrations.
  • At least one C1 compound selected from the group consisting of methane, methanol, methylamine, formic acid, formaldehyde, and formamide is added to the above-described recombinant cell.
  • 1,4-butanediol can be produced by contacting the aforementioned C1 compound with a recombinant cell.
  • the aforementioned C1 compound can be continuously supplied to immobilized recombinant cells to continuously produce 1,4-butanediol.
  • about these C1 compounds only one may be used and it may be used in combination of 2 or more.
  • the produced 1,4-butanediol is accumulated inside the cell or released outside the cell.
  • purified 1,4-butanediol can be obtained by recovering 1,4-butanediol released outside the cell and isolating and purifying it by distillation or the like.
  • 1,4-butanediol (1,4-BDO) synthase gene into methylotrophs with XuMP pathway and production of 1,4-BDO from methanol using recombinants
  • the methanol-assimilating yeast PichiaMPpastolis ⁇ GS115 strain (Invitrogen) was used as a methylotroph having the XuMP pathway.
  • SEQ ID NO: 1 is a 1,4-BDO biosynthesis-related enzyme gene cluster.
  • the gene cluster consists of sucD ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 2: CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase), 4HBd (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate dehydrogenase), abfT (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate CoA transfer).
  • Enzyme and adhE2 (SEQ ID NO: 5: aldehyde / alcohol dehydrogenase 2).
  • the artificially synthesized gene of SEQ ID NO: 1 was cloned into the SmaI / NotI cleavage site of pT7 blue-2 vector (Novagen).
  • the plasmid was prepared in large quantities and then cut with SmaI and NotI to recover the inserted gene.
  • the recovered gene fragment was introduced into the SnaBI / NotI cleavage site of pPIC3.5K (Invitrogen) to construct a vector pPBDO into which a 1,4-BDO synthetic gene was introduced.
  • This vector is under the control of alcohol oxidase I (AOXI) promoter and AOXI terminator, sucD (SEQ ID NO: 2: CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase), 4HBd (SEQ ID NO: 3: 4-hydroxybutyrate dehydrogenase) Enzymes), abfT (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate CoA transferase), and adhE2 (SEQ ID NO: 5: aldehyde / alcohol dehydrogenase 2) are expressed.
  • AOXI alcohol oxidase I
  • sucD SEQ ID NO: 2: CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase
  • 4HBd SEQ ID NO: 3: 4-hydroxybutyrate dehydrogenase
  • abfT SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate CoA transferase
  • adhE2 SEQ ID NO: 5: aldehyde / alcohol dehydrogenase
  • the GS115BDO strain and the GS11535K strain were respectively added to 20 mL of a synthetic A medium (18 g of H 3 PO 4 , 14.28 g of K 2 SO 4 , 3.9 g of KOH, 3.9 g of CaSO 4 .2H 2 O using methanol as the sole carbon source).
  • 1,4-BDO was not detected in the GS11535K strain, but 1,4-BDO was significantly detected in the GS115BDO strain.
  • the production concentration of 1,4-BDO was 13 mM. From the above, it was found that this example enables 1,4-BDO production by a eukaryotic microorganism (yeast) via the XuMP pathway, which is one of the methanol assimilation pathways.
  • Bacillus subtilis was used as a non-methylotroph.
  • SEQ ID NO: 6 which is a 1,4-BDO biosynthesis-related enzyme gene cluster
  • the gene cluster consists of mdh (SEQ ID NO: 7: methanol dehydrogenase), HPS (SEQ ID NO: 8: 3-hexulose-6-phosphate synthase), PHI (SEQ ID NO: 9: 3-hexulose-6-phosphate isomerization).
  • the artificially synthesized gene of SEQ ID NO: 6 was cloned into the SmaI / XbaI cleavage site of pUC119.
  • the plasmid was prepared in large quantities and then cut with SmaI and XbaI to recover the inserted gene.
  • the collected gene was introduced into the XbaI / SmaI cleavage site of Bacillus subtilis expression vector pHT01 (MoBiTec) to prepare pHTBDO.
  • pHTBDO is mdh (SEQ ID NO: 7: methanol dehydrogenase), HPS (SEQ ID NO: 8: 3-hexulose-6-phosphate synthase), PHI (SEQ ID NO: 9: 3-hexulose-6-phosphate isomerase).
  • SucD ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 2: CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase), 4HBd ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate dehydrogenase), abfT ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate CoA transferase), and Each gene of adhE2 (SEQ ID NO: 5: aldehyde / alcohol dehydrogenase 2) is expressed.
  • an expression vector pHTMDH (-) was constructed by removing MDH from the above seven enzyme groups encoded by pHTBDO. Furthermore, an expression vector pHTBDO ( ⁇ ) was prepared by removing SucD, 4HBd, abfT, and adhE2, which are enzyme genes related to 1,4-BDO biosynthesis, from the above seven enzyme groups encoded by pHTBDO.
  • Each expression vector was introduced into Bacillus subtilis according to the MoBiTec manual “Bacillus subtilis Expression Vectors” to prepare a recombinant (recombinant cell). Thereby, a BSBDO strain holding the expression vector pHTBDO, a BSMDH ( ⁇ ) strain holding the expression vector pHTMDH ( ⁇ ), and a BSBDO ( ⁇ ) strain holding the expression vector pHTBDO ( ⁇ ) were prepared.
  • methanol assimilation induction medium methanol 10 mL, ammonium phosphate 3 g, potassium chloride 1 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.1 g, yeast extract 0.5 g, 0.01 mM IPTG, and black
  • the solution was aerobically cultured at 37 ° C. until the OD600 of the culture became 1.5. After completion of the culture, the culture supernatant was obtained by centrifugation and analyzed by LC / MS.
  • 1,4-BDO was significantly detected in the BSBDO strain, and its concentration was 9 mM (6 mM per OD600).
  • 1,4-BDO was not detected in the BSBDO ( ⁇ ) strain.
  • the BSMDH ( ⁇ ) strain without MDH hardly grew. From the above, by introducing the MDH gene, HPS gene, and PHI gene into Bacillus subtilis, which is a non-methylotroph, it is possible to grow efficiently in a medium that uses methanol as the main carbon source, and 1,4- It was found that 1,4-BDO was efficiently produced by introducing the BDO biosynthesis-related enzyme gene cluster (SEQ ID NO: 6).
  • Methylobacterium extorquens (ATCC 55366) was used as a methylotroph having a serine pathway.
  • SEQ ID NO: 10 An artificial synthetic gene (6922 bp) of SEQ ID NO: 10, which is a 1,4-BDO biosynthesis-related enzyme gene cluster, was constructed.
  • the gene cluster consists of SucD (SEQ ID NO: 2: CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase), 4HBd (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate dehydrogenase), abfT (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate CoA transfer).
  • Enzyme and adhE2 (SEQ ID NO: 5: aldehyde / alcohol dehydrogenase 2).
  • the artificial synthetic gene of SEQ ID NO: 10 was cloned into the HindIII / XbaI cleavage site of pUC119.
  • the plasmid was prepared in large quantities and then cut with HindIII and XbaI to recover the inserted gene.
  • the recovered gene was introduced into the HindIII / XbaI site of the broad-area vector pCM80 (Marx CJ. Et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075) to prepare pC80BDO.
  • This vector comprises SucDuc (SEQ ID NO: 2: CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase), 4HBd (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate dehydrogenase), abfT (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate CoA transferase). ) And adhE2 (SEQ ID NO: 5: aldehyde / alcohol dehydrogenase 2) are expressed.
  • UUA (Leu) was converted to UUG (Leu) and AUA (Ile) was converted to AUC (Ile).
  • the expression vector pC80BDO was introduced into M. extorquens by electroporation to obtain a ME-BDO strain.
  • the expression vector pCM80 was introduced into M. extorquens by electroporation to obtain the ME-CM80 strain.
  • the ME-BDO strain or ME-CM80 strain was synthesized from a synthetic B medium containing methanol as a sole carbon source (18 g of H 3 PO 4 , 14.28 g of K 2 SO 4 , 3.9 g of KOH, CaSO 4 .2H 2 O per liter).
  • 1,4-BDO was detected in the ME-BDO strain, and its concentration was 11 mM (6.2 mM per OD600). On the other hand, 1,4-BDO was not detected in the ME-CM80 strain. From the above, it is possible to efficiently produce 1,4-BDO from methanol by introducing a 1,4-BDO biosynthesis-related enzyme gene cluster (SEQ ID NO: 10) into a methylotroph having a serine pathway. It was shown that there is.
  • SEQ ID NO: 10 1,4-BDO biosynthesis-related enzyme gene cluster
  • Methylophilus methylotrophus (ATCC 53528) was used as a methylotroph having a RuMP pathway.
  • the pC80BDO prepared in Example 3 was introduced into M. methylotrophus by electroporation to obtain the MM-BDO strain.
  • pCM80 was introduced into M. methylotrophus by electroporation to obtain MM-CM80 strain.
  • MM-BDO strain or MM-CM80 strain was aerobic in 100 mL of synthetic B medium (methanol concentration was 1% (v / v)) using methanol as the sole carbon source used in Example 3.
  • the cells were cultured at 37 ° C.
  • the culture supernatant was collected by centrifugation.
  • the culture supernatant was analyzed by LC / MS.
  • 1,4-BDO was detected in the MM-BDO strain, but not in the MM-80 strain.
  • the accumulated concentration of 1,4-BDO produced by the MM-BDO strain was 15 mM (8.3 mM per OD600).
  • MDH methanol dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 11 is a 1,4-BDO biosynthesis-related enzyme gene cluster
  • the gene cluster consists of mdh (SEQ ID NO: 7: methanol dehydrogenase), HPS (SEQ ID NO: 8: 3-hexulose-6-phosphate synthase), PHI (SEQ ID NO: 9: 3-hexulose-6-phosphate isomerization).
  • pTrcMeBDO consists of mdh (SEQ ID NO: 7: methanol dehydrogenase), HPS (SEQ ID NO: 8: 3-hexulose-6-phosphate synthase), PHI (SEQ ID NO: 9: 3-hexulose-6-phosphate isomerase).
  • SucD ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 2: CoA-dependent succinic semialdehyde dehydrogenase), 4HBd ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate dehydrogenase), abfT ⁇ ⁇ (SEQ ID NO: 4: 4-hydroxybutyrate CoA transferase), and Each gene of adhE2 (SEQ ID NO: 5: aldehyde / alcohol dehydrogenase 2) is expressed.
  • an expression vector pTrcMDH ( ⁇ ) was constructed by removing MDH from the above seven enzyme groups encoded by pTrcMeBDO. Furthermore, an expression vector pTrcBDO ( ⁇ ) was prepared by removing SucD, 4HBd, abfT and adhE2 which are 1,4-BDO biosynthesis related enzyme genes from the above seven enzyme groups encoded by pTrcMeBDO.
  • Expression vectors pTrcMeBDO, pTrcMDH ( ⁇ ) or pTrcBDO ( ⁇ ) were introduced into Escherichia coli K12 strain to obtain EKMeBDO strain, EKMDH ( ⁇ ) strain, and EKBDO ( ⁇ ) strain, respectively.
  • Each recombinant Escherichia coli was mixed with methanol-utilized synthetic C medium containing IPTG at a concentration of 0.05 mM (18 g of H 3 PO 4 , 14.28 g of K 2 SO 4 , 3.9 g of KOH, CaSO 4 .2H 2 O per liter).

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Abstract

　メタノール等から１，４－ブタンジオールを生産するための一連の技術を提供することを課題とする。　メチロトローフである宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。

Description

組換え細胞、並びに、１，４－ブタンジオールの生産方法
　本発明は、メタノール等から１，４－ブタンジオールを生産可能な組換え細胞、及び当該組換え細胞を用いる１，４－ブタンジオールの生産方法に関する。
　１，４－ブタンジオール（1,4-Butanediol）は合成ゴムのモノマーとして重要なブタジエンの原料となり得る有機化合物であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。１，４－ブタンジオールに関しても、例えば、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術が知られている（特許文献１）。
　１，４－ブタンジオールの生合成経路の例を図１に示す。すなわち１，４－ブタンジオールは、例えば、コハク酸（Succinate）あるいはα－ケトグルタル酸（α-Ketoglutarate）を出発物質として生合成可能である。
　コハク酸を出発物質とする経路では、コハク酸が、スクシニルＣｏＡ（Succinyl CoA）、コハク酸セミアルデヒド（Succinyl semialdehyde）、４－ヒドロキシ酪酸（4-Hydroxybutyrate）、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ（4-Hydroxybutyryl CoA）、及び４－ヒドロキシブチルアルデヒド（4-Hydroxybutyraldehyde）を経て、１，４－ブタンジオールに変換される。各反応を触媒する酵素は、それぞれ、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素（Succinyl-CoA synthetase）、（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase）、（ｅ）４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（4-hydroxybutyrate dehydrogenase）、（ｆ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素（4-hydroxybutyryl-CoA transferase）、（ｇ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素（4-hydroxybutyryl-CoA reductase）、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）である（図１）。なお、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素は、全ての生物が有している。
　また、コハク酸をコハク酸セミアルデヒドに直接変換する経路もある。その場合は、コハク酸が、コハク酸セミアルデヒド、４－ヒドロキシ酪酸、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ、及び４－ヒドロキシブチルアルデヒドを経て、１，４－ブタンジオールに変換される。コハク酸をコハク酸セミアルデヒドに変換する反応を触媒する酵素は、（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（Succinate semialdehyde dehydrogenase）である（図１）。
　一方、α－ケトグルタル酸を出発物質とする経路では、α－ケトグルタル酸が、コハク酸セミアルデヒド、４－ヒドロキシ酪酸、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ、及び４－ヒドロキシブチルアルデヒドを経て、１，４－ブタンジオールに変換される。α－ケトグルタル酸をコハク酸セミアルデヒドに変換する反応を触媒する酵素は、（ｄ）２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素（2-oxoglutarate decarboxylase）である（図１）。
　さらに、（ｉ）４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素（4-hydroxybutyraldehyde dehydorgenase）によって、４－ヒドロキシ酪酸から直接４－ヒドロキシブチルアルデヒドを生成させる経路もある（図１）。
　ところで、Ｃ１化合物の中でも、メタノールは、天然ガス、及びバイオマスや都市ゴミ等の廃棄物を焼却することにより得られる一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素の混合ガスである合成ガス等から安価に製造される。天然ガスは化石資源の中でも多量に存在し、かつＣＯ2の発生量が比較的少ないことから次世代エネルギー源として注目され、従来の石油から天然ガスへの移行が進んでいる。メタノールは、水に可溶であること等、取り扱いや貯蔵が容易である上、微生物培養の炭素源としても適している。
　メチロトローフ（Methylotroph）とは、分子内にＣ－Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。細菌であるメチロトローフには、メタンを資化できるものも多く、これらはしばしばメサノトローフ（Methanotroph）とも呼ばれる。
　メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ－Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。図２に示されるように、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。一方、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、ＸｕＭＰ経路を保有している。
　また、メチロトローフ細菌は、メタノール要求性の違いから、偏性メチロトローフ（obligate methylotroph）と、他の炭素化合物も利用できる通性メチロトローフ（facultative methylotroph）とに分類される。
国際公開第２０１０／１４１９２０号
　再生可能資源からの生産プロセスについて、その従来技術のほとんどは、上記１，４－ブタンジオール生産技術を含めて、有機物、特に糖、グルセロールもしくは油成分等に依存した、微生物による生産法である。しかし、石油に由来する数多くの基幹化学品の世界的な生産量を賄うには、植物資源等に由来する現状使用可能な糖質、グリセリンや油成分の量では、微生物の炭素源として不足するのは必須である。すなわち、糖質や油成分に依存する微生物による基幹化学品の生産量は、将来に渡っても限定的である。また、このようなプロセスは、食との競合も懸念される。
　上記現状に鑑み、本発明は、メタノール等から１，４－ブタンジオールを生産するための一連の技術を提供することを目的とする。
　上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、メチロトローフである宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
　図１に示すように、１，４－ブタンジオールは、コハク酸から生合成可能である。そして本発明の組換え細胞は、コハク酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、メチロトローフである宿主細胞に導入されたものであり、宿主細胞内で当該遺伝子が発現する。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である。
　本発明の組換え細胞によれば、メチロトローフが本来的に有する「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、コハク酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、メチロトローフである宿主細胞に、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
　図１に示すように、１，４－ブタンジオールは、α－ケトグルタル酸からも生合成可能である。そして本発明の組換え細胞は、α－ケトグルタル酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、メチロトローフである宿主細胞に導入されたものであり、宿主細胞内で当該遺伝子が発現する。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である。
　本発明の組換え細胞によれば、メチロトローフが本来的に有する「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、α－ケトグルタル酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
　好ましくは、３－ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
　かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与又は増強される。
　好ましくは、宿主細胞がメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
　一般に、酵母はアルコールに対する耐性が高い。そこで本様相では宿主としてメタノール資化性酵母を採用し、組換え細胞の１，４－ブタンジオールに対する耐性を高めている。さらに、酵母では一般に、メタノールからホルムアルデヒドへの変換反応をアルコールオキシダーゼが担っている。そのため、当該変換反応には酸素が必要であり、具体的には培養時に激しく通気する必要がある。そこで本様相では「メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素」をコードする遺伝子を導入し、酸素に頼ることなくメタノールからホルムアルデヒドへの変換反応が行われるようにしている。
　同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
　本発明の組換え細胞は、宿主細胞に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入され、さらに、コハク酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されている。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である。
　すなわち本発明の組換え細胞は、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されているので、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、これらの外来遺伝子によって付与された「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、コハク酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
　本発明の組換え細胞は、宿主細胞に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入され、さらに、α－ケトグルタル酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されている。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である。
　すなわち本発明の組換え細胞は、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されているので、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、これらの外来遺伝子によって付与された「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」を基礎とし、α－ケトグルタル酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　好ましくは、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子は、３－ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子及び６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子である。
　かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与される。
　好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
　同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
　同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
　これらの様相は、例えば、リブロースモノリン酸経路を有する非メチロトローフが宿主細胞である態様に相当するものである。
　好ましくは、３－ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
　好ましくは、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、メタノールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
　メタノールデヒドロゲナーゼ（Methanol dehydrogenase）とアルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）は、いずれもメタノールをホルムアルデヒドに変換する作用を有する。また、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Formaldehyde dehydrogenase）はギ酸をホルムアルデヒドに変換する作用を有する。これらの酵素は、いずれも細菌に属するメチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。一方、酵母に属するメチロトローフはメタン酸化活性を有さず、アルコールオキシダーゼ（Alcohol oxidase）の働きによってメタノールをホルムアルデヒドへ変換する作用を有する。酵母もギ酸をホルムアルデヒドへ変換する酵素活性を有する。
　好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
　好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。
　メタンモノオキシゲナーゼ（Methane monooxygenase）はメタンをメタノールに変換する作用を有する。メタンモノオキシゲナーゼも、メチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。
　好ましくは、導入された遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている。
　かかる構成により、導入された遺伝子がより安定的に組換え細胞内で保持される。
　好ましくは、導入された遺伝子がプラスミドに組み込まれている。
　好ましくは、少なくとも４００ｍＭの１，４－ブタンジオールに対する耐性を有する。
　かかる構成により、１，４－ブタンジオールをより大量に生産することができる。
　好ましくは、少なくとも２％（ｖ／ｖ）のメタノールに対する耐性を有する。
　かかる構成により、１，４－ブタンジオールをより大量に生産することができる。
　本発明の他の様相は、上記の組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に１，４－ブタンジオールを生産させる１，４－ブタンジオールの生産方法である。
　本発明は１，４－ブタンジオールの生産方法に係るものである。本発明では、上記した組換え細胞をメタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として培養することにより、当該組換え細胞に１，４－ブタンジオールを生産させる。本発明によれば、メタノール等から１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　本発明の他の様相は、上記の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産させる１，４－ブタンジオールの生産方法である。
　本発明では、上記した組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該Ｃ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産させる。本発明によっても、メタノール等から１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　本発明の組換え細胞によれば、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、又はホルムアミドから１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　本発明の１，４－ブタンジオールの生産方法についても同様であり、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、又はホルムアミドから１，４－ブタンジオールを生産することができる。
コハク酸又はα－ケトグルタル酸から１，４－ブタンジオールに至る代謝経路を表す説明図である。 ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路を表す説明図である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
　本発明の組換え細胞は、基本的に、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」と「ホルムアルデヒド固定化能」とを有する宿主細胞に、コハク酸あるいはα－ケトグルタル酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群をコードする遺伝子が導入されたものである。
　本発明で採用される宿主細胞としては、メチロトローフである宿主細胞と、非メチロトローフを含めた広範囲の宿主細胞の両方がある。
　上述したように、メチロトローフとは、分子内にＣ－Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物を指す。一般にメチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路、具体的には、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能（経路）とホルムアルデヒド固定化能（ホルムアルデヒドの固定化経路）とを、本来的に保有している。
　ホルムアルデヒドの固定化経路としては、図２に示すセリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、キシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が挙げられる。一般に、メチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路を保有している。
　ここで、各々のホルムアルデヒド固定化経路（図２）について説明する。
　セリン経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（serine hydroxymethyltransferase）による、グリシンと５，１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸からのセリン生成反応である。５，１０－メチレン－テトラヒドロ葉酸は、ホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸の結合によって生じる。セリン経路では、１分子のホルムアルデヒドから１分子のアセチルＣｏＡが直接生成する。
　ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、３－ヘキスロース６リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」と略記することがある）による、リブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのＤ－アラビノ３ヘキスロース６リン酸の生成反応、並びに、６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼ（6-phosphate-3-hexuloisomerase、以下「ＰＨＩ」と略記することがある）による、Ｄ－アラビノ３ヘキスロース６リン酸からのフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）の生成反応である。
　本経路で生成するＦ６Ｐ等は解糖系へも供され、その後アセチルＣｏＡや、グリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸を生成する。Ｆ６Ｐの場合、１分子あたり、２分子のＧ３Ｐに変換され、次いで２分子のピルビン酸を経て２分子のアセチルＣｏＡが生成する。
　ＸｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（dihydroxyacetone synthase）による、キシルロース５リン酸（Ｘｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）及びグリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）の生成反応である。本経路で生成したＧ３Ｐは解糖系にも供され、ピルビン酸とアセチルＣｏＡに変換される。ジヒドロキシアセトンもリン酸化によって解糖系へ供され、Ｇ３Ｐ、ピルビン酸、及びアセチルＣｏＡへと変換され得る。
　本発明の組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能なものである。例えば、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼを有する組換え細胞の場合には、メタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
　また、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼに加えてメタンモノオキシゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、メタンをメタノールに変換し、続いてメタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
　さらに、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
　一般に、細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、メタンモノオキシゲナーゼとメタノールデヒドロゲナーゼを有しているので、メタン又はメタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、アルコールオキシダーゼを有しているので、メタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、メチロトローフはホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有しており、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
　上記メタノールデヒドロゲナーゼには、グラム陰性細菌のメチロトローフに見出されるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ: pyrroloquinoline quinone）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＮＡＤ（Ｐ）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＤＭＮＡ（N,N’-dimethyl-4-nitrosoaniline）依存型メタノールオキシドリダクターゼ（Park H. et al., Microbiology 2010, 156, 463-471）が含まれる。酵母でのメタノールからホルムアルデヒドへの変換は、通常、酸素依存型であるアルコールオキシダーゼによって触媒される。
　また、アミンオキシダーゼ（amine oxidase）やメチルアミンデヒドロゲナーゼ（methylamine dehydrogenase）を有する組換え細胞の場合には、メチルアミンをホルムアルデヒドに変換することができる。これらの酵素については、一部のメチロトローフやArthrobacter属細菌が有していることが知られている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
　またホルムアミドをホルムアルデヒドに変換する酵素が、一部の微生物で見出されている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
　そして、ホルムアルデヒドを経由して１，４－ブタンジオールを生産することができる。
　宿主細胞として用いられるメチロトローフの種類としては、特に限定はないが、例えば細菌や酵母に分類されるものを採用することができる。
　メチロトローフ細菌としては、例えば、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属する細菌が挙げられる。
　メチロトローフ酵母としては、例えば、Pichia属、Candida属、Saccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、Kloeckera属、などに属する酵母が挙げられる。Pichia属酵母の例としては、P. haplophila、P. pastoris、P. trehalophila、P. lindnerii、などが挙げられる。Candida属酵母の例としては、C. parapsilosis、C. methanolica、C. boidinii、C. alcomigas、などが挙げられる。Saccharomyces属酵母の例としては、Saccharomyces metha-nonfoams、などが挙げられる。Hansenula属酵母の例としては、H. wickerhamii、H. capsulata、H. glucozyma、H. henricii、H. minuta、H. nonfermentans、H. philodendra、H. polymorpha、などが挙げられる。Torulopsis属酵母の例としては、T. methanolovescens、T. glabrata、T. nemodendra、T. pinus、T. methanofloat、T. enokii、T. menthanophiles、T. methanosorbosa、T. methanodomercqii、などが挙げられる。
　宿主細胞が非メチロトローフである場合には、メタノール等をホルムアルデヒドに変換する経路を有しているとは限らないので、少なくとも「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与する必要がある。さらに、「メタンをメタノールに変換する機能」を付与することが好ましい。これらの機能付与は、上記した酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより、実現することができる。
　例えば、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼ(例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）をコードする遺伝子やアルコールオキシダーゼ（例えばEC1.13.13）をコードする遺伝子を用いることができる。また、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えばEC1.2.1.46）をコードする遺伝子を用いることができる。さらに、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子として、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を用いることができる。
　また、メタノール資化性を付与するプラスミドが知られている。例えば、Bacillus methanolicusのメタノール資化性は、メタノール代謝に関わる酵素群をコードするプラスミドに依存している（Brautaset T. et al., J. Bacteriology 2004, 186(5), 1229-1238）。このようなプラスミドを近縁の非メチロトローフに導入することで、メタノール資化能を付与することが可能である。さらには、このようなプラスミドを改変することで、様々な非メチロトローフにメタノール資化性を付与することも可能である。
　上記のようにして非メチロトローフに対して「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与し、さらに「ホルムアルデヒドの固定化能」を付与することにより、非メチロトローフをメチロトローフと同様に取り扱うことが可能となる。ホルムアルデヒド固定化能の付与は、例えば、上記したセリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路で作用する酵素をコードする遺伝子を非メチロトローフに導入することにより、実現することができる。
　１つの好ましい実施形態では、宿主細胞がメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。例えば、メタノール資化性を備えたPichia属酵母を宿主細胞として用い、さらにメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより、目的の組換え細胞を取得することができる。本実施形態によれば、高アルコール耐性であり、かつ酸素に頼らずにメタノールをホルムアルデヒドに変換できる、１，４－ブタンジオールを生産可能な組換え細胞を得ることができる。
　ＲｕＭＰ経路を付与する場合を例として、さらに説明する。ＲｕＭＰ経路の付与は、例えば、上記した３－ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）遺伝子と、６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）遺伝子を導入することにより、実現することができる。すなわち、ＨＰＳ／ＰＨＩによるホルムアルデヒド固定化反応の基質又は生成物である、リブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）は、ペントースリン酸経路、及びカルビン回路の代謝中間体として全ての生物に普遍的に存在する。したがって、ＨＰＳ／ＰＨＩの導入により、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、及び酵母等をはじめとする全ての生物にホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能である。
　元々ＲｕＭＰ経路を有している宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。これにより、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。例えば、枯草菌のように、元々ＲｕＭＰ経路もしくはこれと同質の経路を有する微生物に、例えばメタノールデヒドロゲナーゼ (例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）等のアルコール脱水素酵素、３－ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）、６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）、等の酵素をコードする遺伝子を導入することで、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能（すなわちメタノール資化性）を付与すると共に、ホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。
　なお、メチロトローフである宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。すなわち、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、あるいはＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへＨＰＳ／ＰＨＩを導入することで、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。その結果、組換え細胞のホルムアルデヒド耐性を高めることができ、結果的にメタノールやギ酸に対する耐性及び資化能を高めることが可能となる。これにより、組換え細胞の培養効率や１，４－ブタンジオールの生産効率を向上させることが可能となる。
　一方、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与する場合には、上記したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（例えばEC2.1.2.1）遺伝子を用いることができる。例えば、非メチロトローフに、メタノールデヒドロゲナーゼ等のアルコール脱水素酵素遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸（5,10-methylenetetrahydrofolate）(CH2=H4F) 合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (例えばEC2.1.2.1）遺伝子等を導入することで、メタノール資化性と、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能となる。
　本発明の組換え細胞では、コハク酸あるいはα－ケトグルタル酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群（以下、まとめて「１，４－ブタンジオール生合成関連酵素（群）」と呼ぶことがある）をコードする遺伝子が導入されている。図１の（ａ）～（ｉ）で示される酵素が、１，４－ブタンジオール生合成関連酵素に相当する。
　１つの様相では、コハク酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群として、（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素、（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、（ｅ）４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、（ｆ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、（ｇ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、（ｉ）４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、宿主細胞に導入されている。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入すればよい。
　また、他の様相では、α－ケトグルタル酸から１，４－ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群として、（ｄ）２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、（ｅ）４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、（ｆ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、（ｇ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、（ｉ）４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が、宿主細胞に導入されている。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入すればよい。
　これらの酵素（１，４－ブタンジオール生合成関連酵素）としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。これらの酵素をコードする遺伝子についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。宿主細胞由来のものでもよいし、他の由来のものでもよい。
　１，４－ブタンジオール生合成関連酵素及びその遺伝子の具体例としては、上記特許文献１に開示されたものが挙げられる。例えば、以下の酵素が挙げられる。なお、宿主細胞が以下に示す酵素を元々有する場合、より基質特異性、分子活性及び安定性が優れた、すなわちＫｃａｔ／Ｋｍ値等がより高い酵素遺伝子を導入すればよい。この場合、前記酵素遺伝子には、宿主細胞が元々保有する酵素の改変体をコードする遺伝子も含まれる。導入遺伝子のコドンの最適化や低頻度の回避は、「Codon Usage Database」（http://www.kazusa.or.jp/codon/）を参照し、各宿主微生物において行うことができる。
（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（Succinate semialdehyde dehydrogenase：例えば、EC 1.2.1.16, EC 1.2.1.24）
　遺伝子の例（いずれもUniProtKB No.で表示）：P76149 (E. coli); P25526 (E. coli); P94428 (Bacillus subtilis); Q55585 (Synechocystis sp.); P38067 (Saccharomyces cerevisiae)等
（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素（Succinyl CoA synthetase, Succinyl CoA ligase：例えば、EC 6.2.1.4, EC 6.2.1.5等）
　遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0AGE9 (E. coli); P0A836 (E. coli); P53598 (Saccharomyces cerevisiae); P53312 (Saccharomyces cerevisiae); P09143 (Thermus thermophilus); O82662 (Arabidopsis thaliana)等。本酵素活性は、すべての生物が保有するが、必要に応じて外来遺伝子として導入することも有効である。
（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase：例えば、EC 1.2.1.79）
　遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P38947 (Clostridium kluyveri); A4YGN0 (Metallosphaera sedula)等。 
（ｅ）４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（4-hydroxybutyrate dehydrogenase:例えばEC 1.1.1.61）
　遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：D8GUP1 (Clostridium ljungdahlii); C9YNR6 (Clostridium difficile); Q97IR6 (Clostridium acetobutylicum);Q8XYI7 (Ralstonia solanacearum) ; Q7MWD4 (Porphyromonas gingivalis)等。
（ｆ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素（4-hydroxybutyryl-CoA transferase: 例えばEC2.8.3.a）
　遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：Q9RM86 (Clostridium aminobutyricum); P38942 (Clostridium kluyveri); Q185L2 (Clostridium difficile); Q3ACH6 (Carboxydothermus hydrogenoformas); C4Z8H6 (Eubacterium rectale) ; I8UF15 (Porphyromonas gingivalis)等。
（ｇ）４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素（4-hydroxybutyryl-CoA reductase: 例えばEC1.2.1.10等、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素活性は、CoA-acylating aldehyde dehydrogenaseの逆反応の触媒活性を示す）
　遺伝子の例：Q716S8 (Clostridium beijerinckii); Q7X4B7 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum); A5HYN9 (Clostridium botulinum); P0A9Q7 (E. coli) （以上、UniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）; GenBank CAQ57983 (Clostridium saccharobutylicum); NCBI ZP_03705305 (Clostridium methylpentosum); NCBI ZP_08533507 (Caldalkalibacillus thermarum)等。
（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase：例えばEC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2等）
　遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0A4X1 (Mycobacterium bovis); P00331（Saccharomycess cerevisiae）; P00330（Saccharomycess cerevisiae）; Q9HIM3 (Thermoplasma acidophilum); B9WPR7 (Arthrobacter sp.); P00334 (Drosophila melanogaster)等。
　なお、上記（ｇ）及び（ｈ）の２段階の酵素反応ステップは、アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ（aldehyde/alochohol dehydrogenase）(adhE: EC1.1.1.1, 1.1.1.10等）の作用によっても触媒され得る。すなわちadhEは、上記（ｇ）と（ｈ）の両方に該当する。adhEの例としては、D8GU53(Clostridium ljungdahlii)、D8GU52(Clostridium ljungdahlii)、Q9ANR5 (Clostridium acetobutylicum)、P0A9Q7 (E. coli)、F7TVB7 (Brevibacillus laterosporus)等がある（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）。
（ｉ）４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素（4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase）
　本酵素は４－ヒドロキシ酪酸から４－ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換を可逆的に触媒できる酵素であり、酵素分類上、アルデヒドデヒドロゲナーゼ (例えばEC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4, EC 1.2.1.5等)に属する。
　４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素活性を示すアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：E4R8S4 (Pseudomonas putida); P23883 (E. coli); P12693 (Pseudomonas putida); P40047 (Saccharomyces cerevisiae); P25553 (E. coli); P0C6D7 (Vibrio sp.); P47771 (Saccharomyces cerevisiae); G3XYI2 (Aspergillus niger)等。
（ｄ）２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素（2-oxoglutarate decarboxylase：例えばEC 4.1.1.71）
　遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：A0R2B1 (Mycobacterium smegmatics); I0WZ48 (Rhodococcus imtechensis); G2EJR8 (Corynebacterium glutamicum); J1S9U2 (Streptomyces auratus); J7LQH4 (Arthrobacter sp.)等。
　なお、導入される「１，４－ブタンジオール生合成関連酵素」の遺伝子の種類（数）は、組換え細胞が「メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能」である限り、少なくとも１つでよい。ただし、２種以上の遺伝子を導入することにより各酵素の活性が増強される場合は、１，４－ブタンジオールの生産性が高まることが期待される。基本的に、宿主細胞が保有していない１，４－ブタンジオール生合成関連酵素については、当該酵素をコードする遺伝子を外部から導入する。また、宿主細胞が保有しているが分子活性が低い場合には、より分子活性等、の高い酵素をコードする遺伝子を導入することが好ましい。
　１，４－ブタンジオール生合成関連酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
　本発明の組換え細胞においては、１，４－ブタンジオール生合成関連酵素をコードする遺伝子等に加えて、他の遺伝子がさらに導入されていてもよい。導入する遺伝子としては、例えば、上記したメタノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、メタンモノオキシダーゼ遺伝子、ＨＰＳ／ＰＨＩ遺伝子、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子、等が挙げられる。
　宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
　例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
　例えば、メチロトローフ細菌の染色体への組み込み方法としては、リブロースモノリン酸経路を有するMethylobacillus flagellatusや、セリン経路を有するMethylobacterium extorquencsで、目的遺伝子の破壊操作によって例が示されている（Chistoserdova L. et al., Microbiology 2000, 146, 233-238; Chistoserdov AY., et al., J. Bacteriol 1994, 176, 4052-4065）。これらは環状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法であるが、Methylophilus属細菌等では、直鎖状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法も開発されている（特開２００４－２２９６６２号公報）。一般に、宿主細胞による分解を受けにくい場合は、直鎖状ＤＮＡによるゲノム組換えの方が、環状ＤＮＡによるよりも効率的である。また通常、相同組換え法は、inverted-repeat sequence等のように、ゲノム上に多コピー存在する遺伝子を標的することが好ましい。また、ゲノムに多コピー導入する手法としては、相同組換え以外に、トランスポゾンに搭載する方法もある。メチロトローフ細菌へのプラスミドによる遺伝子導入法としては、例えば、広宿主域ベクターであるpAYC32 (Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167)、pRP301 (Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34)、pBBR1、pBHR1 (Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799)、pCM80 (Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等がある。
　メチロトローフ酵母における遺伝子導入方法としては、主にPichia pastorisで確立されており、pPIC3.5K、pPIC6、pGAPZ、pFLD（インビトロジェン社）等のベクターが市販されている。
　Bacillus属細菌への遺伝子導入にできる使用プラスミドとしては、Bacillus subtilisには、pMTLBS72 (Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54(3), 241-248)、pHT01（フナコシ社）、pHT43（フナコシ社）等が、Bacillus megateriumには、p3STOP1623hp （フナコシ社）、pSPYocHhp（フナコシ社）等が、Bacillus brevisには、pNI DNA（タカラバイオ社）等がある。
　またベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の遺伝子を導入する例としては、宿主細胞がメチロトローフである場合に、「１，４－ブタンジオール生合成関連酵素をコードする遺伝子」に加えて、ＨＰＳ／ＰＨＩ遺伝子を導入する態様が挙げられる。
　以上のようにメチロトローフ等で使用できる既知のベクターを示したが、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変することができる。改変方法としては各宿主細胞、もしくはその近縁種における天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、また人工の遺伝子配列に変更してもよい。
　また、以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることで、宿主細胞での導入遺伝子の発現量、宿主細胞の１，４－ブタンジオール排出機能、１，４－ブタンジオール耐性、等を向上させることにより、１，４－ブタンジオールの生産性をさらに向上させることが可能となる。
　すなわち、本発明においては、外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでもよいし、プラスミドに組み込んでもよい。
　１つの好ましい実施形態では、組換え細胞が、少なくとも４００ｍＭの１，４－ブタンジオールに対する耐性を有する。別の好ましい実施形態では、組換え細胞が、少なくとも２％（ｖ／ｖ）のメタノールに対する耐性を有する。かかる構成により、１，４－ブタンジオールの高生産が可能となる。このような特性を有する組換え細胞は、例えば、適宜の変異処理を宿主細胞に施して目的の特性を有する宿主細胞を選抜し、その宿主細胞を用いることにより得ることができる。
　本発明は、下記(i)～(iv)を包含する。
(i)　メチロトローフである宿主細胞、メタノール及び／若しくはギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子とホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入された宿主細胞、又はリブロースモノリン酸経路を有しかつメタノール及び／若しくはギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子が導入された宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
(ii)　メチロトローフである宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
(iii)　宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
(iv)　リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
　本発明の１，４－ブタンジオールの生産方法の１つの様相では、上記した組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に１，４－ブタンジオールを生産させる。炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。
　なお、偏性メチロトローフの場合は、Ｃ１化合物を唯一の炭素源とする合成培地を用いることが基本であるが、これに酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の天然培地やビタミン類を少量加えることによっても菌の増殖は促進される。通性メチロトローフである場合は、菌体増殖ステージでは糖質、脂質等のＣ１化合物以外の物質を炭素源としてもよく、１，４－ブタンジオール生産ステージで炭素源を上記Ｃ１化合物に変更すればよい。微生物の培養法としては、目的に応じて好気、微好気、もしくは嫌気条件で培養可能である。またバッチ培養、流加培養、連続培養のいずれの方法でもよい。
　炭素源として例えばメタノールを用いる場合は、通常、細菌の場合は１．０％(ｖ/ｖ)濃度、酵母の場合は３．０％（v/v）濃度以下で用いるが、人為的にこれらに対する耐性を改良した場合は、それ以上の濃度でも培養可能である。
　本発明の１，４－ブタンジオールの生産方法の別の様相では、上記した組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産させる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物を接触させて、１，４－ブタンジオールを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、１，４－ブタンジオールを連続的に生産させることができる。
　本様相においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
　生産された１，４－ブタンジオールは、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、細胞外に放出された１，４－ブタンジオールを回収し、蒸留等によって単離精製することにより、純化された１，４－ブタンジオールを取得することができる。
　以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　ＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへの１，４－ブタンジオール（１，４－ＢＤＯ）合成酵素遺伝子の導入と、組換え体を用いたメタノールからの１，４－ＢＤＯの生産
　本実施例では、ＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフとして、メタノール資化性酵母Pichia pastolis GS115株（インビトロジェン社）を使用した。
　１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号１の人工合成遺伝子(7773 bp)を構築した。該遺伝子クラスターは、sucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
　配列番号１の人工合成遺伝子を、pT7 blue-2 vector (Novagen社)のSmaI/NotI切断部位へクローニングした。該プラスミドを大量調製した後、SmaI及びNotIで切断し、挿入遺伝子を回収した。回収した遺伝子断片をｐＰＩＣ３．５Ｋ（インビトロジェン社）のSnaBI/NotI切断部位へ導入し、1,4-BDO合成遺伝子が導入されたベクターｐＰＢＤＯを構築した。本ベクターは、アルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ）プロモーター、及びＡＯＸＩターミネーターのコントロール下で、sucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。本ベクターの導入によって、酵母においてスクシニルＣｏＡから１，４－ＢＤＯの合成が可能となる。
　Pichia pastoris GS115株へのｐＰＢＤＯによる１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子発現ユニットの導入は、インビトロジェン社マニュアル「Version D 032002/25-0156」に従って行った。マルチコピーの遺伝子導入体を得るために、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（インビトロジェン社）耐性株を取得した。これによって、外来の１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子を複数コピー保持するメタノール資化性酵母GS115BDO株を構築した。またコントロール株として１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticinに耐性のある、ｐＰＩＣ３．５Ｋのみが導入されたGS11535K株も得た。
　GS115BDO株及びGS11535K株を、それぞれ、メタノールを唯一の炭素源とする２０ｍＬの合成Ａ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール２０ｍＬを含む。）にて、好気的に、３０℃で６４時間培養した。菌体を回収した後、回収菌体を４５ｍＬの合成Ａ培地で、さらに３０℃で１６時間振とう培養した。培養終了後、培養から遠心分離によって培養上清を得た。培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析した。
　その結果、GS11535K株では１，４－ＢＤＯは検出されなかったが、GS115BDO株では１，４－ＢＤＯが有意に検出された。この際の１，４－ＢＤＯの生成濃度は１３ｍＭであった。
　以上のことから、本実施例によって、メタノール資化経路の１種であるＸｕＭＰ経路を介した、真核微生物（酵母）による１，４－ＢＤＯ生産が可能であることがわかった。
　非メチロトローフへのメタノールデヒドロゲナーゼ、ＨＰＳ遺伝子、ＰＳＩ遺伝子、及びイソプレン合成酵素遺伝子の導入と、組換え体によるメタノールからの１，４－ＢＤＯ生産
　本実施例では、非メチロトローフとしてBacillus subtilisを使用した。
　１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号６の人工合成遺伝子(10600 bp)を構築した。該遺伝子クラスターは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３－ヘキスロース－６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３－ヘキスロース－６－リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
　配列番号６の人工合成遺伝子を、pUC119のSmaI/XbaI切断部位へクローニングした。該プラスミドを大量調製した後、SmaI及びXbaIで切断し、挿入遺伝子を回収した。回収した遺伝子をBacillus subtilis用発現ベクターpHT01(MoBiTec社）のXbaI/SmaI切断部位へ導入し、pHTBDOを作製した。pHTBDOは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３－ヘキスロース－６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３－ヘキスロース－６－リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。
　コントロールベクターとして、pHTBDOがコードする上記７つの酵素群からMDHを除いた発現ベクターpHTMDH(-)を構築した。さらに、pHTBDOがコードする上記７つの酵素群から１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子であるSucD、4HBd、abfT、及びadhE2を除いた発現ベクターpHTBDO(-)を作製した。
　MoBiTec社マニュアル「Bacillus subtilis Expression Vectors」に従って、各発現ベクターをBacillus subtilisに導入し、組換え体（組換え細胞）を作製した。これにより、発現ベクターｐＨＴＢＤＯを保持するＢＳＢＤＯ株、発現ベクターｐＨＴＭＤＨ（－）を保持するＢＳＭＤＨ（－）株、及び、発現ベクターｐＨＴＢＤＯ（－）を保持するＢＳＢＤＯ（－）株を、それぞれ作製した。
　各組換え体を、１００ｍＬのメタノール資化誘導培地（メタノール１０ｍＬ、リン酸アンモニウム３ｇ、塩化カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、０．０１ｍＭ ＩＰＴＧ、及びクロラムフェニコール５ｍｇを、１Ｌの水道水中に含む。）にて、好気的に３７℃で培養液のＯＤ６００が１．５になるまで培養した。培養終了後、培養上清を遠心分離によって得、ＬＣ／ＭＳによって分析した。
　その結果、ＢＳＢＤＯ株では、１，４－ＢＤＯが有意に検出され、その濃度は９ｍＭ(１ＯＤ６００当たり６ｍＭ)であった。一方、ＢＳＢＤＯ（－）株では１，４－ＢＤＯは検出されなかった。なお、ＭＤＨを有しないＢＳＭＤＨ（－）株は、ほとんど生育しなかった。
　以上のことから、非メチロトローフであるBacillus subtilisにＭＤＨ遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、及びＰＨＩ遺伝子を導入することで、メタノールを主要炭素源する培地で効率良く生育させることが可能であり、かつ１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号６）を導入することで、効率的に１，４－ＢＤＯが生成することがわかった。
　１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子が導入された、セリン経路を有するメチロトローフの作製と、組換え体によるメタノールからの１，４－ＢＤＯの生産
　本実施例では、セリン経路を有するメチロトローフとして、Methylobacterium extorquens (ATCC 55366)を使用した。
　１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号１０の人工合成遺伝子（6922 bp）を構築した。該遺伝子クラスターは、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
　配列番号１０の人工合成遺伝子をpUC119のHindIII/XbaI切断部位へクローニングした。該プラスミドを大量調製した後、HindIII及びXbaIで切断し、挿入遺伝子を回収した。回収した本遺伝子を広域ベクターpＣＭ８０(Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩサイトへ導入し、ｐＣ８０ＢＤＯを作製した。本ベクターは、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。また、各酵素遺伝子のコドン改変として、UUA(Leu)はUUG(Leu)に、AUA(Ile)はAUC(Ile)に変換された。発現ベクターｐＣ８０ＢＤＯをエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ－ＢＤＯ株を得た。コントロールとして、発現ベクターｐＣＭ８０をエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ－ＣＭ８０株を得た。
　ＭＥ－ＢＤＯ株又はＭＥ－ＣＭ８０株を、メタノールを唯一の炭素源とする合成Ｂ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、及びテトラサイクリン１０ｍｇを含む。）１００ｍＬにて、好気的に３０℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．８になるまで培養し、遠心分離によって培養上清を回収した。回収した培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析した。
　その結果、ＭＥ－ＢＤＯ株で１，４－ＢＤＯが検出され、その濃度は１１ｍＭ（１ＯＤ６００当たり６．２ｍＭ）であった。一方、ＭＥ－ＣＭ８０株では１，４－ＢＤＯは検出されなかった。
　以上のことから、セリン経路を有するメチロトローフへ、１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号１０）を導入することによって、メタノールからの効率的な１，４－ＢＤＯの生産が可能であることが示された。
　ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフへの１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子の導入と、組換え体を用いるメタノールからの１，４－ＢＤＯの生産
　本実施例では、ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフとして、Methylophilus methylotrophus (ATCC 53528)を使用した。
　実施例３にて作製したｐＣ８０ＢＤＯをエレクトロポレーションによってM. methylotrophusへ導入し、ＭＭ－ＢＤＯ株を得た。コントロールとして、ｐＣＭ８０をエレクトロポレーションによってM. methylotrophusへ導入し、ＭＭ－ＣＭ８０株を得た。
　ＭＭ－ＢＤＯ株又はＭＭ－ＣＭ８０株を、実施例３で使用したメタノールを唯一の炭素源とする合成Ｂ培地（但し、メタノール濃度は１%(v/v)とした）１００ｍＬにて、好気的に３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．８－２．０の時点で、遠心分離によって培養上清を回収した。培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析した。その結果、ＭＭ－ＢＤＯ株では、１，４－ＢＤＯが検出されたが、ＭＭ－８０株では検出されなかった。ＭＭ－ＢＤＯ株によって産生された１，４－ＢＤＯの蓄積濃度は１５ｍＭ（１ＯＤ６００当たり８．３ｍＭ）であった。
　以上のことから、ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフへ、１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号１０）を導入することによって、メタノールからの効率的な１，４－ＢＤＯの生産が可能であることが示された。
　大腸菌へのメタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、及び１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子の導入と、組換え体によるメタノールから１，４－ＢＤＯの生産
　１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号１１の人工合成遺伝子(9123 bp)を構築した。該遺伝子クラスターは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３－ヘキスロース－６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３－ヘキスロース－６－リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を含む。
　配列番号１１の人工合成遺伝子を、ｐＴｒｃ９９ＡベクターのNcoI/HindIII切断部位へクローニングし、ｐＴｒｃＭｅＢＤＯを作製した。ｐＴｒｃＭｅＢＤＯは、mdh (配列番号７：メタノール脱水素酵素)、HPS(配列番号８：３－ヘキスロース－６リン酸合成酵素)、PHI(配列番号９：３－ヘキスロース－６－リン酸異性化酵素)、SucD (配列番号２：CoA依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素)、4HBd (配列番号３：４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素)、abfT (配列番号４：４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素)、及びadhE2 (配列番号５：アルデヒド/アルコール脱水素酵素２)の各遺伝子を発現させる。
　コントロールベクターとして、ｐＴｒｃＭｅＢＤＯがコードする上記７つの酵素群からMDHを除いた発現ベクターｐＴｒｃＭＤＨ（－）を構築した。さらに、ｐＴｒｃＭｅＢＤＯがコードする上記７つの酵素群から１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子であるSucD、4HBd、abfT、及びadhE2を除いた発現ベクターｐＴｒｃＢＤＯ（－）を作製した。
　発現ベクターｐＴｒｃＭｅＢＤＯ、ｐＴｒｃＭＤＨ（－）もしくはｐＴｒｃＢＤＯ（－）を大腸菌Ｋ１２株へ導入し、それぞれＥＫＭｅＢＤＯ株、ＥＫＭＤＨ（－）株、及びＥＫＢＤＯ（－）株を得た。
　各々の組換え大腸菌を、０．０５ｍＭ濃度のＩＰＴＧを含有するメタノール資化合成Ｃ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、クロラムフェニコール３４ｍｇ、及びアンピシリン１００ｍｇを含む。）１００ｍＬにて、好気的に３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０－１．６の時点で、遠心部分離によって培養上清を回収した。
　回収した培養上清をＬＣ／ＭＳによって分析したところ、ＥＫＭｅＢＤＯ株では１，４－ＢＤＯが１１ｍＭ（１ＯＤ６００当たり６．９ｍＭ）生成していたが、ＥＫＢＤＯ（－）株ではほとんど検出されなかった。なお、ＥＫＭＤＨ（－）株は全く生育しなかった。
　以上のことから、非メチロトローフである大腸菌にＭＤＨ遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、及びＰＨＩ遺伝子を導入することで、メタノールを主要炭素源する培地で効率良く生育させることが可能であり、かつ１，４－ＢＤＯ生合成関連酵素遺伝子クラスター（配列番号１１）を導入することで、効率的に１，４－ＢＤＯが生成することがわかった。

Claims (21)

  1. 　メチロトローフである宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
    　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
    　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  2. 　メチロトローフである宿主細胞に、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、
    　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
    　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  3. 　ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項１又は２に記載の組換え細胞。
  4. 　３－ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する請求項１～３のいずれかに記載の組換え細胞。
  5. 　宿主細胞がメタノール資化性酵母であり、メタノールを脱水素反応によってホルムアルデヒドに変換する酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する請求項１～４のいずれかに記載の組換え細胞。
  6. 　宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
    　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
    　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  7. 　宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
    　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
    　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  8. 　ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子は、３－ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子及び６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子である請求項６又は７に記載の組換え細胞。
  9. 　ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項６又は７に記載の組換え細胞。
  10. 　リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
    　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
    　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  11. 　リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、２－オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４－ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４－ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、
    　当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、
    　メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。
  12. 　３－ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する請求項６、７、９、１０又は１１に記載の組換え細胞。
  13. 　メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、メタノールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である請求項６～１２のいずれかに記載の組換え細胞。
  14. 　メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する請求項６～１３のいずれかに記載の組換え細胞。
  15. 　メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である請求項１４に記載の組換え細胞。
  16. 　導入された遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている請求項１～１５のいずれかに記載の組換え細胞。
  17. 　導入された遺伝子がプラスミドに組み込まれている請求項１～１５のいずれかに記載の組換え細胞。
  18. 　少なくとも４００ｍＭの１，４－ブタンジオールに対する耐性を有する請求項１～１７のいずれかに記載の組換え細胞。
  19. 　少なくとも２％（ｖ／ｖ）のメタノールに対する耐性を有する請求項１～１８のいずれかに記載の組換え細胞。
  20. 　請求項１～１９のいずれかに記載の組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞に１，４－ブタンジオールを生産させる１，４－ブタンジオールの生産方法。
  21. 　請求項１～１９のいずれかに記載の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４－ブタンジオールを生産させる１，４－ブタンジオールの生産方法。
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