JP6608936B2 - 組換え細胞、組換え細胞の製造方法、並びに、１，４−ブタンジオールの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は、組換え細胞、組換え細胞の製造方法、並びに、１，４−ブタンジオールの生産方法に関する。
１，４−ブタンジオール（1,4-Butanediol）は合成ゴムのモノマーとして重要なブタジエンの原料となり得る有機化合物であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。１，４−ブタンジオールに関しても、例えば、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術が知られている（特許文献１）。
１，４−ブタンジオールの生合成経路の例を図１に示す。すなわち１，４−ブタンジオールは、例えば、コハク酸（Succinate）あるいはα−ケトグルタル酸（α-Ketoglutarate）を出発物質として生合成可能である。
コハク酸を出発物質とする経路では、コハク酸が、スクシニルＣｏＡ（Succinyl CoA）、コハク酸セミアルデヒド（Succinyl semialdehyde）、４−ヒドロキシ酪酸（4-Hydroxybutyrate）、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ（4-Hydroxybutyryl CoA）、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒド（4-Hydroxybutyraldehyde）を経て、１，４−ブタンジオールに変換される。各反応を触媒する酵素は、それぞれ、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素（Succinyl-CoA synthetase）、（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase）、（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（4-hydroxybutyrate dehydrogenase）、（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素（4-hydroxybutyryl-CoA transferase）、（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素（4-hydroxybutyryl-CoA reductase）、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase）である（図１）。なお、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素は、全ての生物が有している。
また、コハク酸をコハク酸セミアルデヒドに直接変換する経路もある。その場合は、コハク酸が、コハク酸セミアルデヒド、４−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒドを経て、１，４−ブタンジオールに変換される。コハク酸をコハク酸セミアルデヒドに変換する反応を触媒する酵素は、（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（Succinate semialdehyde dehydrogenase）である（図１）。
一方、α−ケトグルタル酸を出発物質とする経路では、α−ケトグルタル酸が、コハク酸セミアルデヒド、４−ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ、及び４−ヒドロキシブチルアルデヒドを経て、１，４−ブタンジオールに変換される。α−ケトグルタル酸をコハク酸セミアルデヒドに変換する反応を触媒する酵素は、（ｄ）２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素（2-oxoglutarate decarboxylase）である（図１）。
さらに、（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素（4-hydroxybutyraldehyde dehydorgenase）によって、４−ヒドロキシ酪酸から直接４−ヒドロキシブチルアルデヒドを生成させる経路もある（図１）。
再生可能資源からの生産プロセスについて、その従来技術のほとんどは、上記１，４−ブタンジオール生産技術を含めて、有機物、特に糖、グリセロールもしくは油成分等に依存した、微生物による生産法である。しかし、石油に由来する数多くの基幹化学品の世界的な生産量を賄うには、植物資源等に由来する現状使用可能な糖質、グリセリンや油成分の量では、微生物の炭素源として不足するのは必須である。すなわち、糖質や油成分に依存する微生物による基幹化学品の生産量は、将来に渡っても限定的である。また、このようなプロセスは、食との競合も懸念される。
合成ガス（Synthesis gas, Syngas）は、廃棄物、天然ガス、及び石炭を燃焼させることで効率よく得られる、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を主成分とする混合ガスである。合成ガスを起点とする金属触媒によるＣ１ケミストリーの分野では、メタノール、ギ酸、ホルムアルデヒド等の液状の化学品を安価かつ大量に生産するプロセスが開発されている。
そして、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素は、廃棄物由来の合成ガスや工場排ガス、天然ガス、または石炭由来の合成ガスに含まれており、ほぼ永久的に利用可能である。しかしながら、合成ガスをはじめとするＣ１炭素源とした、微生物による化学品生産の例は、極めて少ないのが現状である。現在のところ、開発が進んでいるのは、合成ガスからのエタノール、２，３−ブタンジオール等の生産のみである。特に、組換え体による合成ガス資化性物の利用に関する報告は少ない。特許文献２には、大腸菌の組換え体によるイソプロパノールの生産技術が開示されている。この技術では、大腸菌に複数のＣＯ代謝酵素遺伝子を導入して合成ガス資化能を付与し、合成ガスからイソプロパノールを生産している。ただし、この技術は１，４−ブタンジオールを生産するものではない。また、本来合成ガス資化性微生物が保有するＣＯ代謝酵素遺伝子群を大腸菌で効率良く機能的に発現させることは難しく、さらに大腸菌のＣＯ耐性も低いこと等から、ＣＯ代謝を有する組換え大腸菌を用いる系は、目的物質の高い生産性が期待できない。
また、非食系バイオマスの中で最も豊富なものは、リグノセルロースである。リグノセルロースは物理的、化学的処理によってセルロース、ヘミセルロース、及びリグニンに分けることが可能である。これらの内とりわけセルロースは、微生物生育の有効な炭素源として期待されている。しかしながらその効率的利用には、さらに物理的、化学的、及び酵素的作用によってセルロースを事前に糖化することが必要であり、そのコストは高い。そのため、セルロースをより安価に糖化し、さらにこれをエネルギー、有用物質に変換する技術が望まれている。これまで、セルロースから１，４−ブタンジオールを効率的に生産する技術は報告されていない。
上記現状に鑑み、本発明は、石油に依存しなく、かつ食と競合しない原料であるセルロースや合成ガス等から１，４−ブタンジオールを生産することができる一連の技術を提供することを目的とする。
上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有する組換え細胞であって、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
図１に示すように、１，４−ブタンジオールは、コハク酸から生合成可能である。そして本発明の組換え細胞は、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有するものであって、コハク酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を有している。そして、当該遺伝子が発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。本発明の組換え細胞を用いることにより、例えば、セルロースや、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスから、１，４−ブタンジオールを生産することができる。
同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有する組換え細胞であって、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を有し、当該遺伝子が発現し、１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞である。
図１に示すように、１，４−ブタンジオールは、α−ケトグルタル酸からも生合成可能である。そして本発明の組換え細胞は、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有するものであって、α−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群、すなわち、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を有している。そして、当該遺伝子が発現し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。本発明の組換え細胞を用いることによっても、例えば、セルロースや、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスから、１，４−ブタンジオールを生産することができる。
好ましくは、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。
かかる構成によれば、組換え細胞が有する「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を基礎とし、コハク酸又はα−ケトグルタル酸を経由して、前記したＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有する細胞としては、図２に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）及びメタノール経路（Methanol pathway）を有する嫌気性微生物が例示される。
好ましくは、前記組換え細胞は一酸化炭素脱水素酵素を有するものである。
一酸化炭素脱水素酵素（例えば、ＥＣ １．２．９９．２／１．２．７．４）（一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、CO dehydrogenase、ＣＯＤＨ）は、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを生成させる作用、及びその逆反応である、二酸化炭素とプロトンから一酸化炭素と水を生成させる作用、を有する。一酸化炭素脱水素酵素は、アセチルＣｏＡ経路（図２）で作用する酵素の１つである。
好ましくは、前記組換え細胞は、Clostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌である。
好ましくは、前記組換え体がセルロース資化性を有し、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物又はセルロースから１，４−ブタンジオールを生産可能である。
かかる構成によれば、組換え細胞が有するセルロース資化性、具体的には、セルロースからアセチルＣｏＡを合成する機能を基礎として、コハク酸又はα−ケトグルタル酸を経由して、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産することができる。セルロースからアセチルＣｏＡを合成する経路は、エムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（Embden-Meyerhof-Parnas pathway）が中心となる。
好ましくは、前記組換え体がセルロソームを生産するものである。
好ましくは、前記組換え体がClostridium属細菌である。
好ましくは、前記組換え体がClostridium thermocellum、Clostridium cellulolyticum、又はClostridium cellulovoransである。
好ましくは、前記遺伝子の少なくとも１つは、細菌由来のものである。
好ましくは、前記遺伝子の少なくとも１つは、宿主細胞由来のものである。
好ましくは、前記遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれている。
かかる構成により、前記遺伝子がより安定的に組換え細胞内で保持される。
好ましくは、前記組換え細胞が、少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する。
かかる構成により、１，４−ブタンジオールをより大量に生産することができる。
好ましくは、組換え細胞のエタノール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されている。
好ましくは、組換え細胞の２，３−ブタンジオール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されている。
本発明の他の様相は、組換え細胞の製造方法であって、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有する宿主細胞を提供する第一工程、及び、前記宿主細胞に、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、スクシニルＣｏＡ合成酵素、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を導入する第二工程、を包含し、当該遺伝子が発現し、１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞を製造する、組換え細胞の製造方法である。
本発明の他の様相は、組換え細胞の製造方法であって、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有する宿主細胞を提供する第一工程、及び、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を導入する第二工程、を包含し、当該遺伝子が発現し、１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞を製造する、組換え細胞の製造方法である。
好ましくは、前記宿主細胞は、メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能を有し、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞を製造する。
好ましくは、前記宿主細胞は、一酸化炭素脱水素酵素を有するものである。
好ましくは、前記宿主細胞は、Clostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌である。
好ましくは、前記宿主細胞はセルロース資化性を有し、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞を製造する。
好ましくは、前記宿主細胞は、セルロソームを生産するものである。
好ましくは、前記宿主細胞は、Clostridium属細菌である。
好ましくは、前記宿主細胞は、Clostridium thermocellum、Clostridium cellulolyticum、又はClostridium cellulovoransである。
好ましくは、前記遺伝子の少なくとも１つは、細菌由来のものである。
好ましくは、前記遺伝子の少なくとも１つは、宿主細胞由来のものである。
好ましくは、第二工程で導入された遺伝子がゲノムに組み込まれている。
好ましくは、前記組換え細胞が少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する。
好ましくは、前記組換え細胞のエタノール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されている。
好ましくは、前記組換え細胞の２，３−ブタンジオール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されている。
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞、又は上記の方法により製造された組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産させる、１，４−ブタンジオールの生産方法である。
本様相は１，４−ブタンジオールの生産方法に係るものである。本様相では、上記した組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物に接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産させる。本様相によれば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスや、ギ酸、メタノールから１，４−ブタンジオールを生産することができる。
好ましくは、前記組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物から１，４−ブタンジオールを取得する。
好ましくは、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス、二酸化炭素と水素とを主成分とするガス、又は一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを主成分とするガスを、前記組換え細胞に提供する。
「組換え細胞にガスを提供する」とは、炭素源等としてガスを組換え細胞に与える、あるいは、組換え細胞にガスを接触させる、という意味である。
好ましくは、前記組換え細胞は、Clostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌である。
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞、又は上記の方法により製造された組換え細胞に、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物を接触させ、当該組換え細胞に前記リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産させる、１，４−ブタンジオールの生産方法である。
本様相では、上記した組換え細胞にリグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物を接触させ、１，４−ブタンジオールを生産させる。本様相によれば、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産することができる。
好ましくは、前記組換え細胞をリグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物を炭素源として培養し、その培養物から１，４−ブタンジオールを取得する。
好ましくは、前記組換え細胞は、Clostridium thermocellum、Clostridium cellulolyticum、又はClostridium cellulovoransである。
本発明の組換え細胞によれば、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、又はメタノールから１，４−ブタンジオールを生産することができる。例えば、一酸化炭素や二酸化炭素を含む合成ガスから１，４−ブタンジオールを生産することが可能となる。さらに、セルロールから１，４−ブタンジオールを生産することができる。
本発明の組換え細胞の製造方法によれば、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、又はメタノールから１，４−ブタンジオールを生産することができる組換え細胞を製造することができる。さらに、セルロールから１，４−ブタンジオールを生産することができる組換え細胞を製造することができる。
本発明の１，４−ブタンジオールの生産方法についても同様であり、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、又はメタノールから１，４−ブタンジオールを生産することができる。さらに、セルロールから１，４−ブタンジオールを生産することができる。
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
本発明の組換え細胞は、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有する組換え細胞であって、コハク酸あるいはα−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群をコードする遺伝子を有するものである。例えば、偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有する宿主細胞に、前記遺伝子が導入されたものである。
１つの実施形態（第一実施形態）では、組換え細胞が「メチルテトラヒドロ葉酸、一酸化炭素、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する機能」を有している。例えば、当該機能を有する宿主細胞に、前記遺伝子が導入されたものである。そして、組換え細胞が一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。メチルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨ3］−ＴＨＦ）、一酸化炭素（ＣＯ）、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、例えば、図２に示すアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）とメタノール経路（Methanol pathway）に含まれている。
図２に示すように、アセチルＣｏＡ経路では、二酸化炭素（ＣＯ2）が２つの経路で別々に、一酸化炭素（ＣＯ）とメチルカチオン源に還元される。そして、これら２つの炭素源を基質としてＣｏＡ（図２ではＨＳＣｏＡと表記）のチオール基がアセチル化され、１分子のアセチルＣｏＡが合成される。アセチルＣｏＡ経路では、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl-CoA synthase、ＡＣＳ）、メチルトランスフェラーゼ（Methyltransferase）、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（Formate dehydrogenase、ＦＤＨ）、等の酵素が作用している。なお、ホルミルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨＯ］−ＴＨＦ）から［ＣＨ3］−ＴＨＦに至る経路は、メチルブランチ（Methyl branch）と呼ばれる。
一方、メタノール経路は、メタノールをホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）、さらにギ酸（ＨＣＯＯＨ）に変換する経路と、メタノールから［ＣＨ3］−ＴＨＦを誘導する経路を含んでいる。
すなわち、メチルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨ3］−ＴＨＦ）、一酸化炭素（ＣＯ）、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路とで共通している。
一方、メタノール経路は、メタノールをホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）、さらにギ酸（ＨＣＯＯＨ）に変換する経路と、メタノールから［ＣＨ3］−ＴＨＦを誘導する経路を含んでいる。
すなわち、メチルテトラヒドロ葉酸（［ＣＨ3］−ＴＨＦ）、一酸化炭素（ＣＯ）、及びＣｏＡからアセチルＣｏＡを合成する経路は、アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路とで共通している。
本実施形態では、組換え細胞が一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）を有することが好ましい。詳細には、主に一酸化炭素代謝、すなわち一酸化炭素脱水素酵素の働きにより、一酸化炭素と水から二酸化炭素とプロトンを発生する機能によって生育する細胞が好ましい。アセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有する嫌気性微生物は、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）を有している。
当該嫌気性微生物として、Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenumn、Clostridium carboxidivorans、Clostridium ragsdalei（Kopke M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(15), 5467-5475）、Moorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticumと同じ) (Pierce EG. Et al., Environ. Microbiol. 2008, 10, 2550-2573)、Acetobacterium woodii（Dilling S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73(11), 3630-3636）等のClostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌が代表例として挙げられる。特に、Clostridium属細菌は、宿主−ベクター系や培養方法が確立しており、本発明における宿主細胞として好適である。
上記６種のClostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。
上記６種のClostridium属細菌、Moorella属細菌、又はAcetobacterium属細菌は、合成ガス資化性微生物の代表例として知られている。
Clostridium属細菌、Moorella属細菌、及びAcetobacterium属細菌以外では、Carboxydocella sporoducens sp. Nov. (Slepova TV. et al., Inter. J. Sys. Evol. Microbiol. 2006, 56, 797-800)、Rhodopseudomonas gelatinosa(Uffen RL, J. Bacteriol. 1983, 155(3), 956-965)、Eubacterium limosum (Roh H. et al., J. Bacteriol. 2011, 193(1), 307-308)，Butyribacterium methylotrophicum (Lynd, LH. Et al., J. Bacteriol. 1983, 153(3), 1415-1423)等の細菌を、本実施形態の組換え細胞における宿主細胞として用いることができる。
なお、上記した細菌の増殖及びＣＯＤＨ活性は全て酸素感受性であるが、酸素非感受性のＣＯＤＨも知られている。例えば、Oligotropha carboxidovorans (Schubel, U. et al., J. Bacteriol., 1995, 2197-2203)、Bradyrhizobium japonicum (Lorite MJ. Et al., Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(5), 1871-1876)を始め、その他のバクテリア種には酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する（King GM et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69 (12), 7257-7265）。好気性水素酸化細菌であるRalsotonia属菌にも酸素非感受性のＣＯＤＨが存在する (NCBI Gene ID: 4249199, 8019399)。
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明で用いる宿主細胞を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ2（ＣＯとＨ2を主成分とするガス）、もしくはＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（ＣＯとＣＯ2とＨ2を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気、微好気、もしくは好気的条件で、宿主細胞として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
このように、ＣＯＤＨを有する細菌は広く存在しており、その中から本発明で用いる宿主細胞を適宜選択することができる。例えば、ＣＯ、ＣＯ／Ｈ2（ＣＯとＨ2を主成分とするガス）、もしくはＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2（ＣＯとＣＯ2とＨ2を主成分とするガス）を唯一の炭素源かつエネルギー源とした選択培地を用い、嫌気、微好気、もしくは好気的条件で、宿主細胞として利用できるＣＯＤＨを有する細菌を分離することができる。
他の実施形態（第二実施形態）では、組換え細胞がセルロース資化性を有している。例えば、宿主細胞がセルロース資化性を有している。そして組換え細胞が、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産可能である。
偏性嫌気性、かつ酢酸生成能を有する微生物の中には、セルロースを炭素源として利用するものが存在する。中でもClostridium属に属する細菌は、極めて効率よくセルロースを分解し、資化することが可能である（Giallo J et al., Applied Environ Microbiol. 1985, 49(5), 1216）。これらの微生物は、セルロースを効率良く分解できるセルロソームと呼ばれる酵素複合体を産生することで、セルロースを資化することが可能である。セルロソームは足場タンパク質をベースに多数の高分子多糖分解酵素が結合した構造を有しており、これらの複数の酵素が共同で働くことによって構造の多様性を含むセルロースを効率良く分解することが可能である。セルロソームを産生する微生物として、Clostridium属菌に属する細菌が報告されている。具体的には、Clostridium cellulolyticum、Clostridium Cellulosolvens、Clostridium acetobutylicum、Clostridium cellulovorans、Clostridium clariflavum、Clostridium josui、Clostridium thermocellum、Clostridium papyrosolvens等が存在する。Clostridium属菌以外ではAcetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Ruminococcus albus、Ruminococcus flavefaciens等がセルロソームを産生できる。
セルロースからアセチルＣｏＡへの変換は、エムデン−マイヤーホフ−パルナス経路（Embden-Meyerhof-Parnas pathway）を中心する経路で行われる。具体的には、１）セルロースを糖、例えば２単糖であるセロビオースまでに分解する経路、２）これを細胞内に取り込みグルコースに分解した後、エムデン−マイヤーホフ−パルナス経路によってピルビン酸を合成する経路、及び、３）ピルビン酸よりアセチルＣｏＡを合成する経路、からなる。そして、アセチルＣｏＡがクエン酸回路に取り込まれることでコハク酸及びα−ケトグルタル酸が合成され、１，４−ブタンジオールの生合成へと繋がる。
本発明の組換え細胞は、コハク酸あるいはα−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群（以下、まとめて「１，４−ブタンジオール生合成関連酵素（群）」と呼ぶことがある）をコードする遺伝子を有する。例えば、宿主細胞に当該遺伝子が導入されている。図１の（ａ）〜（ｉ）で示される酵素が、１，４−ブタンジオール生合成関連酵素に相当する。
１つの様相では、組換え細胞が、コハク酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群として、（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素、（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を有する。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより、所望の組換え細胞を得ることができる。
また、他の様相では、組換え細胞が、α−ケトグルタル酸から１，４−ブタンジオールに至る生合成経路で作用する酵素群として、（ｄ）２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素、及び（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子を有する。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより、所望の組換え細胞を得ることができる。
これらの酵素（１，４−ブタンジオール生合成関連酵素）としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。これらの酵素をコードする遺伝子についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。
好ましい実施形態では、上記１，４−ブタンジオール生合成関連酵素が細菌由来のものである。より好ましい実施形態では、上記１，４−ブタンジオール生合成関連酵素が宿主細胞由来のものである。かかる構成によれば、宿主細胞が細菌である場合において、使用されるコドンの構成が宿主細胞のそれに近いため、導入された酵素遺伝子が宿主細胞内で効率よく転写・翻訳され得る。
１，４−ブタンジオール生合成関連酵素及びその遺伝子の具体例としては、上記特許文献１に開示されたものが挙げられる。例えば、以下の酵素が挙げられる。なお、宿主細胞が以下に示す酵素を元々有する場合、より基質特異性、分子活性及び安定性が優れた、すなわちＫｃａｔ／Ｋｍ値等がより高い酵素遺伝子を導入すればよい。この場合、前記酵素遺伝子には、宿主細胞が元々保有する酵素の改変体をコードする遺伝子も含まれる。
（ｃ）コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（Succinate semialdehyde dehydrogenase：例えば、EC 1.2.1.16, EC 1.2.1.24）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB No.で表示）：P76149 (E. coli); P25526 (E. coli); P94428 (Bacillus subtilis); Q55585 (Synechocystis sp.); P38067 (Saccharomyces cerevisiae)等
遺伝子の例（いずれもUniProtKB No.で表示）：P76149 (E. coli); P25526 (E. coli); P94428 (Bacillus subtilis); Q55585 (Synechocystis sp.); P38067 (Saccharomyces cerevisiae)等
（ａ）スクシニルＣｏＡ合成酵素（Succinyl CoA synthetase, Succinyl CoA ligase：例えば、EC 6.2.1.4, EC 6.2.1.5等）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0AGE9 (E. coli); P0A836 (E. coli); P53598 (Saccharomyces cerevisiae); P53312 (Saccharomyces cerevisiae); P09143 (Thermus thermophilus); O82662 (Arabidopsis thaliana)等。本酵素活性は、すべての生物が保有するが、必要に応じて外来遺伝子として導入することも有効である。
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0AGE9 (E. coli); P0A836 (E. coli); P53598 (Saccharomyces cerevisiae); P53312 (Saccharomyces cerevisiae); P09143 (Thermus thermophilus); O82662 (Arabidopsis thaliana)等。本酵素活性は、すべての生物が保有するが、必要に応じて外来遺伝子として導入することも有効である。
（ｂ）ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase：例えば、EC 1.2.1.79）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P38947 (Clostridium kluyveri); A4YGN0 (Metallosphaera sedula)等。
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P38947 (Clostridium kluyveri); A4YGN0 (Metallosphaera sedula)等。
（ｅ）４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（4-hydroxybutyrate dehydrogenase:例えばEC 1.1.1.61）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：D8GUP1 (Clostridium ljungdahlii); C9YNR6 (Clostridium difficile); Q97IR6 (Clostridium acetobutylicum);Q8XYI7 (Ralstonia solanacearum); Q7MWD4 (Porphyromonas gingivalis)等。
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：D8GUP1 (Clostridium ljungdahlii); C9YNR6 (Clostridium difficile); Q97IR6 (Clostridium acetobutylicum);Q8XYI7 (Ralstonia solanacearum); Q7MWD4 (Porphyromonas gingivalis)等。
（ｆ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素（4-hydroxybutyryl-CoA transferase: 例えばEC2.8.3.a）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：Q9RM86 (Clostridium aminobutyricum); P38942 (Clostridium kluyveri); Q185L2 (Clostridium difficile); Q3ACH6 (Carboxydothermus hydrogenoformas); C4Z8H6 (Eubacterium rectale); I8UF15 (Porphyromonas gingivalis)等。
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：Q9RM86 (Clostridium aminobutyricum); P38942 (Clostridium kluyveri); Q185L2 (Clostridium difficile); Q3ACH6 (Carboxydothermus hydrogenoformas); C4Z8H6 (Eubacterium rectale); I8UF15 (Porphyromonas gingivalis)等。
（ｇ）４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素（4-hydroxybutyryl-CoA reductase: 例えばEC1.2.1.10等、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素活性は、CoA-acylating aldehyde dehydrogenaseの逆反応の触媒活性を示す）
遺伝子の例：Q716S8 (Clostridium beijerinckii); Q7X4B7 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum); A5HYN9 (Clostridium botulinum); P0A9Q7 (E. coli) （以上、UniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）; GenBank CAQ57983 (Clostridium saccharobutylicum); NCBI ZP_03705305 (Clostridium methylpentosum); NCBI ZP_08533507 (Caldalkalibacillus thermarum)等。
遺伝子の例：Q716S8 (Clostridium beijerinckii); Q7X4B7 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum); A5HYN9 (Clostridium botulinum); P0A9Q7 (E. coli) （以上、UniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）; GenBank CAQ57983 (Clostridium saccharobutylicum); NCBI ZP_03705305 (Clostridium methylpentosum); NCBI ZP_08533507 (Caldalkalibacillus thermarum)等。
（ｈ）アルコールデヒドロゲナーゼ（Alcohol dehydrogenase：例えばEC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2等）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0A4X1 (Mycobacterium bovis); P00331（Saccharomycess cerevisiae）; P00330（Saccharomycess cerevisiae）; Q9HIM3 (Thermoplasma acidophilum); B9WPR7 (Arthrobacter sp.); P00334 (Drosophila melanogaster)等。
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：P0A4X1 (Mycobacterium bovis); P00331（Saccharomycess cerevisiae）; P00330（Saccharomycess cerevisiae）; Q9HIM3 (Thermoplasma acidophilum); B9WPR7 (Arthrobacter sp.); P00334 (Drosophila melanogaster)等。
なお、上記（ｇ）及び（ｈ）の２段階の酵素反応ステップは、アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼ（aldehyde/alochohol dehydrogenase）(adhE: EC1.1.1.1, 1.1.1.10等）の作用によっても触媒され得る。すなわちadhEは、上記（ｇ）と（ｈ）の両方に該当する。adhEの例としては、D8GU53 (Clostridium ljungdahlii)、D8GU52 (Clostridium ljungdahlii)、Q9ANR5 (Clostridium acetobutylicum)、P0A9Q7 (E. coli)、F7TVB7 (Brevibacillus laterosporus)等がある（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）。
（ｉ）４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素（4-hydroxybutyraldehyde dehydrogenase）
本酵素は４−ヒドロキシ酪酸から４−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換を可逆的に触媒できる酵素であり、酵素分類上、アルデヒドデヒドロゲナーゼ (例えばEC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4, EC 1.2.1.5等)に属する。
４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素活性を示すアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：E4R8S4 (Pseudomonas putida); P23883 (E. coli); P12693 (Pseudomonas putida); P40047 (Saccharomyces cerevisiae); P25553 (E. coli); P0C6D7 (Vibrio sp.); P47771 (Saccharomyces cerevisiae); G3XYI2 (Aspergillus niger)等。
本酵素は４−ヒドロキシ酪酸から４−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換を可逆的に触媒できる酵素であり、酵素分類上、アルデヒドデヒドロゲナーゼ (例えばEC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4, EC 1.2.1.5等)に属する。
４−ヒドロキシブチルアルデヒド脱水素酵素活性を示すアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：E4R8S4 (Pseudomonas putida); P23883 (E. coli); P12693 (Pseudomonas putida); P40047 (Saccharomyces cerevisiae); P25553 (E. coli); P0C6D7 (Vibrio sp.); P47771 (Saccharomyces cerevisiae); G3XYI2 (Aspergillus niger)等。
（ｄ）２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素（2-oxoglutarate decarboxylase：例えばEC 4.1.1.71）
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：A0R2B1 (Mycobacterium smegmatics); I0WZ48 (Rhodococcus imtechensis); G2EJR8 (Corynebacterium glutamicum); J1S9U2 (Streptomyces auratus); J7LQH4 (Arthrobacter sp.)等。
遺伝子の例（いずれもUniProtKB/Swiss-Prot No.で表示）：A0R2B1 (Mycobacterium smegmatics); I0WZ48 (Rhodococcus imtechensis); G2EJR8 (Corynebacterium glutamicum); J1S9U2 (Streptomyces auratus); J7LQH4 (Arthrobacter sp.)等。
なお、導入される「１，４−ブタンジオール生合成関連酵素」の遺伝子の種類（数）は、組換え細胞が「一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産可能」である限り、少なくとも１つでよい。ただし、２種以上の遺伝子を導入することにより各酵素の活性が増強される場合は、１，４−ブタンジオールの生産性が高まることが期待される。
基本的に、宿主細胞が保有していない１，４−ブタンジオール生合成関連酵素については、当該酵素をコードする遺伝子を外部から導入する。また、宿主細胞が保有しているが分子活性が低い場合には、より分子活性の高い酵素をコードする遺伝子を導入することが好ましい。
基本的に、宿主細胞が保有していない１，４−ブタンジオール生合成関連酵素については、当該酵素をコードする遺伝子を外部から導入する。また、宿主細胞が保有しているが分子活性が低い場合には、より分子活性の高い酵素をコードする遺伝子を導入することが好ましい。
１，４−ブタンジオール生合成関連酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
本発明の組換え細胞においては、エタノール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されていることが好ましい。また、本発明の組換え細胞においては、２，３−ブタンジオール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されていることが好ましい。すなわち、上記した宿主細胞の多くは、エタノール、２，３−ブタンジオール等のアルコール類を産生する性質がある。そこで、これらの合成系遺伝子の発現を下方制御することによって、本発明の目的である１，４−ブタンジオールの産生量を増大させることが可能となる。下方制御とは、遺伝子の欠損、プロモーター変異、酵素遺伝子変異等による活性低下を意味する。
本発明の組換え細胞においては、１，４−ブタンジオール生合成関連酵素をコードする遺伝子等に加えて、他の遺伝子がさらに導入されていてもよい。導入する遺伝子としては、第一実施形態の場合には、アセチルＣｏＡ経路やメタノール経路で作用する酵素、例えば、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl-CoA synthase、ＡＣＳ）、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase、ＦＤＨ）、等をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子を導入することにより、アセチルＣｏＡ合成の増強が期待できる。
第二実施形態の場合には、セルロソーム構成タンパク質群をコードする遺伝子が挙げられる。
これらの遺伝子の発現を上方制御することによっても、同様の効果が得られる。上方制御とは、目的遺伝子の多コピー化、プロモーター変異、酵素遺伝子変異等による活性向上を意味する。
第二実施形態の場合には、セルロソーム構成タンパク質群をコードする遺伝子が挙げられる。
これらの遺伝子の発現を上方制御することによっても、同様の効果が得られる。上方制御とは、目的遺伝子の多コピー化、プロモーター変異、酵素遺伝子変異等による活性向上を意味する。
宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
宿主細胞がClostridium属細菌（Moorella属細菌のような近縁種を含む）の場合について説明すると、Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターpIMP1（Mermelstein LD et al., Bio/technology 1992, 10, 190-195）を用いることができる。本シャトルベクターは、pUC9 (ATCC 37252)とBacillus subtilisから分離されたpIM13 (Projan SJ et al., J. Bacteriol. 1987, 169 (11), 5131-5139)との融合ベクターであり、Clostridium属細菌内でも安定的に保持される。Clostridium属細菌と大腸菌とのシャトルベクターの他の例としては、pSOS95（GenBank: AY187686.1）が挙げられる。
なお、Clostridium属細菌への遺伝子導入には、通常、エレクトロポレーション法が使用されるが、遺伝子導入直後の導入された外来プラスミドは制限酵素Cac824I等による分解を受けやすく極めて不安定である。そのため、Bacillus subtilis ファージΦ3T1由来メチルトランスフェラーゼ遺伝子が保持されたpAN1 (Mermelstein LD et al., Apply. Environ. Microbiol. 1993, 59(4), 1077-1081)を保有する大腸菌、例えばER2275株等で、pIMP1に由来するベクターを一旦増幅し、メチル化処理を行ってから、これを大腸菌から回収しエレクトロポレーションによる形質転換に使用することが好ましい。なお最近では、Cac824I遺伝子が欠損したClostridium acetobuthylicumが開発されており、メチル化処理されていないベクターも安定的に可能である(Dong H. et al., PLoS ONE 2010, 5 (2), e9038)。また、大腸菌ＢＬ２１株の改良株であるNEB expressを用いてベクターを増幅して、メチル化されていないベクターを効率よく導入する手法が知られている（Leang C. et al.,Appl Environ Microbiol. 2013 79(4), 1102-9）。
Clostridium属細菌における異種遺伝子発現のプロモーターとしては、例えばthl (thiolase)プロモーター(Perret S et al., J. Bacteriol. 2004, 186(1), 253-257)、Dha (glycerol dehydratase)プロモーター(Raynaud C. et al., PNAS 2003, 100(9), 5010-5015)、ptb (phosphotransbutyrylase)プロモーター (Desai RP et al., Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65(3), 936-945)、adc (acetoacetate decarboxylase)プロモーター(Lee J et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (5), 1416-1423)等がある。ただし、本発明ではこれらに限定されることなく、宿主細胞等に見出される様々な代謝系のオペロンに使用されているプロモーター領域の配列が使用可能である。
またベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の遺伝子を導入する例としては、「１，４−ブタンジオール生合成関連酵素をコードする遺伝子」に加えて、上記したアセチルＣｏＡ経路やメタノール経路で作用する酵素をコードする遺伝子を導入する態様が挙げられる。
以上のように、本発明で使用できる既知のベクターを示したが、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変することができる。改変方法としては各宿主細胞、もしくはその近縁種における天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、また人工の遺伝子配列に変更してもよい。
また、以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることで、宿主細胞での導入遺伝子の発現量、宿主細胞の１，４−ブタンジオール排出機能、１，４−ブタンジオール耐性、等を向上させることにより、１，４−ブタンジオールの生産性をさらに向上させることが可能となる。
すなわち、本発明においては、外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んでもよいし、プラスミドに組み込んでもよい。
１つの好ましい実施形態では、組換え細胞が、少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する。かかる構成により、１，４−ブタンジオールの高生産が可能となる。このような特性を有する組換え細胞は、例えば、適宜の変異処理を宿主細胞に施して目的の特性を有する宿主細胞を選抜し、その宿主細胞を用いることにより得ることができる。
本発明の１，４−ブタンジオールの生産方法の１つの様相では、上記した組換え細胞に、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物から１，４−ブタンジオールを生産させる。
好ましくは、前記組換え細胞を、一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、その培養物から１，４−ブタンジオールを得る。炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。
また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に提供することが好ましい。
また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に提供することが好ましい。
本発明の組換え細胞を培養する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等に応じて適宜行うことができる。組換え細胞がClostridium属細菌（偏性嫌気性、絶対嫌気性）の場合には、例えば、生育に必要な無機塩類及び、合成ガスからなる栄養条件で培養する。好ましくは０．２〜０．３ＭＰａ（絶対圧）程度の加圧状態で培養する。さらには、初期増殖及び到達細胞密度を良好にするためには、ビタミン、酵母エキス、コーンスティープリカー、バクトトリプトン等の有機物を少量加えてよい。
なお、組換え細胞が好気性や通性嫌気性の場合には、例えば、液体培地を用いた通気・撹拌培養を行うことができる。
培養を行わずに１，４−ブタンジオールの生産を行うこともできる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物を接触させて、１，４−ブタンジオールを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、１，４−ブタンジオールを連続的に生産させることができる。本態様においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、エネルギー源として水素（Ｈ2）を同時に接触させることが好ましい。
好ましい実施形態では、一酸化炭素と水素とを主成分とするガス（ＣＯ／Ｈ2）、二酸化炭素と水素とを主成分とするガス（ＣＯ2／Ｈ2）、又は一酸化炭素と二酸化炭素と水素とを主成分とするガス（ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2）を、前記組換え細胞に提供する。すなわち、これらのガスを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、あるいは、これらのガスを組換え細胞に接触させて、ガス中の一酸化炭素又は二酸化炭素から１，４−ブタンジオールを生産させる。この場合も、水素はエネルギー源として使用される。
別の好ましい実施形態では、メタノールと一酸化炭素、メタノールと二酸化炭素、又はメタノールと二酸化炭素と水素を、前記組換え細胞に提供する。すなわち、メタノールとこれらのガスを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、あるいは、メタノールとこれらのガスを組換え細胞に接触させる。これにより、メタノール、一酸化炭素、又は二酸化炭素から１，４−ブタンジオールを生産させる。提供の態様としては、例えば、組み換え細胞に対して、メタノールとこれらのガスを同時に提供することが挙げられる。
さらに、ギ酸及び／又はメタノールを組換え細胞に提供し、ギ酸及び／又はメタノールからも１，４−ブタンジオールを生産することもできる。すなわち、一酸化炭素や二酸化炭素に加えて、もしくは単独で、ギ酸やメタノールを炭素源として用いて組換え細胞を培養したり、ギ酸やメタノールを組換え細胞に接触させることにより、ギ酸やメタノールからも１，４−ブタンジオールを生産することができる。
本発明の１，４−ブタンジオールの生産方法は、上記の組換え細胞に、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物を接触させて、当該組換え細胞に前記リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産させる方法を包含する。好ましくは、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物を炭素源として前記組換え細胞を培養し、その培養物から１，４−ブタンジオールを得る。
培養に用いるセルロース基質としては、例えば、セルロース系バイオマスを用いることができる。例えば、稲わら、野菜くず、バガス、木材パルプ、木材チップ、おが屑、古紙、レーヨン、綿、麻、糸、段ボール、結晶性セルロース等が挙げられる。これらのセルロース基質は、そのまま組換え細胞に作用させてもよいが、より効率的に資化させるには、物理的、化学的、あるいは酵素的な処理を単独もしくは組わせて、事前に、もしくは培養と同時に行うことが好ましい。物理的処理法としてはボールミル、振動ミル、加圧熱水、蒸煮爆砕等の処理が挙げられる。化学的処理としては、酸、アルカリによる処理が挙げられる。酵素処理としては、ヘミセルラーゼや、セルラーゼ、あるいはこれら含有する液体及び培養液を作用させる方法が挙げられる。
生産された１，４−ブタンジオールは、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、上述したClostridium属細菌又はMoorella属細菌を宿主細胞とした組換え細胞を用い、細胞外に放出された１，４−ブタンジオールを回収し、蒸留等によって単離精製することにより、純化された１，４−ブタンジオールを取得することができる。
ここで、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路（図２）を有している場合において、組換え細胞に提供され得る一酸化炭素、二酸化炭素、ギ酸、及びメタノールの組み合わせについて説明する。
アセチルＣｏＡ経路によるアセチルＣｏＡ合成では、メチルトランスフェラーゼ（Methyltransferase）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質（Corrinoid iron-sulfur protein、ＣｏＦｅＳ−Ｐ)、アセチルＣｏＡシンターゼ（Acetyl-CoA synthase、ＡＣＳ）、及びＣＯＤＨの作用による、ＣｏＡ、メチルテトラヒドロ葉酸（methyltetrahydrofolate、［ＣＨ3］−ＴＨＦ)、及びＣＯからのアセチルＣｏＡの合成過程が必須である（Ragsdale SW et al., B.B.R.C. 2008, 1784(12), 1873-1898）。
一方、Butyribacterium methylotrophicumの培養において、炭素源としてＣＯやＣＯ2以外にギ酸やメタノールを添加することは、ＣＯ代謝すなわち、アセチルＣｏＡ経路のメチルブランチ（Methyl branch）におけるテトラヒドロ葉酸（tetrahydrofolate、ＴＨＦ）含量、及び、ＣＯ代謝で必要とされるＣＯＤＨ、ギ酸デヒドロゲナーゼ（formate dehydrogenase、ＦＤＨ）及びヒドロゲナーゼ（hydrogenase）の活性を増大させることが知られている（Kerby R. et al., J. Bacteriol. 1987, 169(12), 5605-5609）。Eubacterium limosum等においても、嫌気条件下ＣＯ2及びメタノールを炭素源とした場合でも、高い増殖を得ることが示されている（Genthner BRS. et al., Appl. Environ. Microbiol., 1987, 53(3), 471-476）。
これらのメタノールの合成ガス資化性微生物へ影響、及びMoorella thermoacetica（Clostridium thermoaceticum）及びClostridium ljungdahlii等のゲノム解析(Pierce E. et al., Environ. Microbiol. 2008, 10(10), 2550-2573; Durre P. et al., PNAS 2010, 107(29), 13087-13092)の結果から、これらの微生物種では、図２に示されるようなメタノール経路（methanol pathway）がアセチルＣｏＡ経路（Wood-Ljungdahl pathway）にメチル基のドナーとして関与することが説明できる。
また実際に、いくつかのClostridium属菌ではギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）(ＥＣ １．２．１．２／１．２．１．４３：Formate＋ＮＡＤ（Ｐ）+ ⇔ ＣＯ2＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）の正方向の活性（FormateからのＣＯ2形成）が確認されている（Liu CL et al., J. Bacteriol. 1984, 159(1), 375-380; Keamy JJ et al., J. Bacteriol. 1972, 109(1), 152-161)。このことから、これらの株ではＣＯ2やＣＯが欠乏状態にある場合、部分的にメタノール（ＣＨ3ＯＨ）やギ酸（ＨＣＯＯＨ）からＣＯ2の生成方向の反応が働くことができる（図２）。このことは、前述したＣＨ3ＯＨを加えることによる、ギ酸ヒドロゲナーゼ（formatede hydrogenase）活性、及びＣＯＤＨの活性増大の現象 (Kerby R et al., J. Bateriol. 1987, 169(12), 5605-5609)からも説明できる。すなわち、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）もしくはメタノール（ＣＨ3ＯＨ）を唯一の炭素源としても増殖可能である。
宿主細胞が、元々、ギ酸デヒドロゲナーゼの正方向の活性を有しない株であっても、変異導入、外来遺伝子導入、もしくはゲノムシャッフリングのような遺伝子改変によって、正方向の活性を付与させればよい。
以上のことから、宿主細胞がアセチルＣｏＡ経路とメタノール経路を有している場合には、以下のガスや液体を用いて、１，４−ブタンジオールを生産することができる。
・ＣＯ
・ＣＯ2
・ＣＯ／Ｈ2
・ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ2
・ＣＨ3ＯＨ
・ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ
・ＣＯ2
・ＣＯ／Ｈ2
・ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2
・ＣＯ／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＨＣＯＯＨ
・ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2／ＣＨ3ＯＨ
・ＣＨ3ＯＨ／Ｈ2
・ＨＣＯＯＨ／Ｈ2
・ＣＨ3ＯＨ
・ＨＣＯＯＨ
なお、本発明の組換え細胞について、１，４−ブタンジオール生産を目的とせず、専ら細胞を増やす目的で培養する場合には、一酸化炭素や二酸化炭素を炭素源として用いる必要はない。例えば糖類やグリセリンといった本発明の組換え細胞が資化しやすい他の炭素源を用いて、組換え細胞を培養すればよい。
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本説明はこれらの実施例に限定されるものではない。
合成ガス資化菌C. ljungdahliiによる１，４−ブタンジオールの生産（コハク酸経路）
Clostridium/E. coliシャトルベクターpGn15_SUC(op)（配列番号１、図３）をエレクトロポレーション法（BioRad Micropulser (BioRad, Hercules, CA, USA), 0.63 kV)により、C. ljungdahliiに導入した。得られた形質転換体をＹＴＦ寒天培地（１Ｌあたり、トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム４ｇ、Ｌ−システイン２ｍＭ、キシロース１％、寒天１．５％）から回収した。
エレクトロポレーション法には、以下の手法を用いた。遠心分離と冷凍保存を除くすべての操作は、Whitley Anaerobic Workstation A55 (Don Whitley Scientific Limited, United Kingdom)中で、ガス条件は１０％ＣＯ2、５％Ｈ2、８５％Ｎ2の偏性嫌気性条件で行った。Clostridium ljungdahliiの菌株（ＤＳＭ Ｎｏ．１３５２８）は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）から、凍結乾燥状態で得た。ＤＳＭＺが推奨する偏性嫌気性微生物の取り扱い方法、菌株に特異的な培養方法に従った。菌株を５０ｍＬの遠心管中で、ＹＴＦ培地（１Ｌあたり、トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム４ｇ、Ｌ−システイン２ｍＭ、キシロース１％）２０ｍＬに懸濁した。培養液のＯＤ６００が約２.０の時点で、菌体を回収し、そのうちの１％を新しい培地２０ｍＬに植菌した。この操作を３回繰り返し、その後、コンピテントセルの調製のため、同様の手法で２００ｍＬのフラスコ中で、１００ｍＬの新しい培地に菌を植菌した。細胞壁を不安定化させるため、４０ｍＬのＤＬ−トレオニンを加えた。培養液のＯＤ６００が０．３付近になった時点で、菌体を回収し、氷中で冷却した洗浄用バッファー（スクロース２７０ｍＭ、塩化マグネシウム１ｍＭ、ＢｉｓＴｒｉｓ２０ｍＭ、ｐＨ５．９）１００ｍＬで３回洗浄した。サンプルは５０ｍＬの遠心管中で４℃、４０００×ｇ、５分の条件で遠心し細胞を沈殿させ、上清を捨てた。最後に、洗浄した細胞の沈殿を２ｍＬの洗浄バッファーに懸濁し、ＤＭＳＯを最終濃度１０％になるように加えた。この細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブに２５μＬずつ分注した。このコンピテント細胞は、最長３か月間−８０℃で保存した。
一般に、ＤＮＡのメチル化はClostridium属の形質転換に大きく影響する。Clostridium ljungdahliiには、プラスミドの調製に、Ｅ．ｃｏｌｉのＢ株によるＤｃｍ−、Ｄａｍ＋のメチル化がより効果的であるとされている（Leang et al. 2013）。特に、恒常的に発現するプロモーターを用いる際には、プラスミドの安定性がより高いと考えられるため、１，４−ＢＤＯ遺伝子クラスターをもつプラスミドＤＮＡは、Ｋ株ＮＥＢ１０Ｂ（New England Biolabs, Frankfurt am Main, Germany）から単離した。このプラスミドを用いたClostridium ljungdahliiへの遺伝子導入が成功したことから、Clostridium ljungdahliiへのＤＮＡの導入には、特異的なメチル化のステップは必要でないことが示唆された。ＤＮＡを導入するため、細胞は、氷上で溶かし、３μｇのプラスミドと混ぜた。
ＤＮＡと細胞の混合溶液を、冷却した０．１ｍｍギャップのキュベットに移し、BioRad Micropulser (BioRad, Hercules, CA, USA)を用いて、０．６３ｋＶでエレクトロポレーションを行った。続いて、細胞を２０ｍＬのＹＴＦ培地に移し、少なくとも１２時間以上回復培養をおこなった。その後、抗生物質クラリスロマイシンを培地に加え（７０％エタノールに溶解、最終濃度５μｇ／ｍＬ）、さらに６時間培養した。細胞の濃度を変えＹＴＦ寒天培地に混ぜ、培養した。３７℃のＹＴＦ寒天培地（クラリスロマイシン５μｇ／ｍＬを含む）約３０ｍＬに、１μＬ、１０μＬ、１００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬの細胞懸濁液を加え、そのうち２０ｍＬをシャーレ（直径９ｃｍ）にまき、少なくとも５日、３７℃で培養した。コロニーをプレート上からピックアップし、Clostridium ljungdahliiの形態をしていた時のみ、１−１００μＬの培地に加えた。さらに、１５ｍＬの遠心管で培養を行った。クラリスロマイシンは常に最終濃度５μｇ／ｍＬで添加した。
ベクターpGn15_SUC(op)は、Escherichia coli由来sucCD、Clostridium kluyveri由来sucD、Porphyromonas gingivalis由来4hbd、Porphyromonas gingivalis由来cat2、及びClostridium acetobutylicum由来adhE2をコードする、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスター（図３）を含む。得られた形質転換体を、CLJU_pGn15_SUC(op)と命名した。
CLJU_pGn15_SUC(op)および、上述の野生型株を、ＹＴＦ培地（１Ｌあたり、トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム４ｇ、Ｌ−システイン２ｍＭ、キシロースまたはフルクトース１％）で嫌気的に培養した。培養液５０ｍＬをブチルゴム栓によって封をされた２００ｍＬ容量のバイアル瓶中にて３７℃で振とう培養した。培養液のＯＤ６００が２．０の時点で、培養液を遠心し、上清を回収した。０．２２μｍフィルターでろ過した培養上清をＧＣＭＳ（QP2010S GC-MS system（Shimadzu）、InterCap FFAP (GL Sciences)、移動相；１００％メタノール、キャリアーガス；ヘリウム、スプリット比；１：１０、インジェクション温度２２０℃）で解析した。
操作カラムのためのＧＣＭＳ解析パラメーター
カラム： InterCap FFAP (GL Sciences)
ディメンション： ３０ｍ×０．２５ｍｍ，０．２５μｍ
移動相： １００％メタノール
キャリアガス： ヘリウム
スプリット比： １：１０
トータルフロー： １４．４ｍＬ／分
インジェクション温度： ２２０℃
カラム： InterCap FFAP (GL Sciences)
ディメンション： ３０ｍ×０．２５ｍｍ，０．２５μｍ
移動相： １００％メタノール
キャリアガス： ヘリウム
スプリット比： １：１０
トータルフロー： １４．４ｍＬ／分
インジェクション温度： ２２０℃
InterCap FFAPカラムを用いた１，４−ＢＤＯ検出のためのＧＣ−ＭＳ解析方法
速度（℃／分） 最終温度（℃） 保持時間（分）
− ６０ １．００
５．０ ７０ ０．００
３５．０ ２２０ ２．００
速度（℃／分） 最終温度（℃） 保持時間（分）
− ６０ １．００
５．０ ７０ ０．００
３５．０ ２２０ ２．００
その結果、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスターを導入したCLJU_pGn15_SUC(op)は、２０〜４０μＭの１，４−ＢＤＯを生産していたが、野生型株では１，４−ＢＤＯが検出されなかった。以上のことから、合成ガス資化性菌C. ljungdahliiは、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子を導入することで、１，４−ＢＤＯの生産が可能であることが示された。
合成ガスからのClostridium ljungadhliiによる１，４-ブタンジオールの生産（α―ケトグルタル酸経路）
Clostridium/E. coliシャトルベクターpGn15 AKG(op)（配列番号２、図４）をエレクトロポレーション法（BioRad Micropulser (BioRad, Hercules, CA, USA), 0.63 kV)によってC. ljungdahliiに導入した。得られた形質転換体をＹＴＦ寒天培地（１Ｌあたり、トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、塩化ナトリウム４ｇ、Ｌ−システイン２ｍＭ、キシロース１％、寒天１．５％）から回収した。pGn15 AKG(op)ベクターは、α-ketoglutarate decarboxylase (Mycobacterium bovis由来sucA), 4-hydroxybutyrate dehydrogenase (Porphyromonas gingivalis由来4hbd), 4-hydroxybutyryl CoA transferase (Porphyromonas gingivalis由来cat2)、及びbifunctional 4-hydroxybutyryl CoA reductase and alcohol dehydrogenase (Clostridium acetobutylicum由来adhE2）をコードする、１,４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスター（図４）を含む。得られた組換え体をCLJU_pGn15_AKG(op)と命名した。
前述のCLJU_pGn15_AKG(op)とC. ljungdahliiの野生株を、嫌気条件のATCC培地(1 g/L Yeast extract, 2 mM cysteine, pH 6.0, adapted from Koepke Dissertation, Ulm 2009)で培養した。培養は２００ｍＬの密閉されたボトル中に前述の培地５０ｍＬを封入し、３７℃で振盪して行った。ボトルのヘッドスペースにはＣＯ/ＣＯ2/Ｈ2=(１：１：１）のガスを１ＭＰａで満たした。培養ボトルをブチルゴム栓とアルミキャップでシールした。
培養液のＯＤ６００が２．０になった時点で、遠心分離し、上清を採取した。フィルター濾過（0.22μm）した後にＧＣＭＳ(QP2010S GC-MS system (Shimadzu))によって分析した（InterCap FFAP (GL Sciences), Mobile phase was 100% Methanol, carrier gas was helium, split ration 1:10, injection temperature 220 degree C）。
培養液のＯＤ６００が２．０になった時点で、遠心分離し、上清を採取した。フィルター濾過（0.22μm）した後にＧＣＭＳ(QP2010S GC-MS system (Shimadzu))によって分析した（InterCap FFAP (GL Sciences), Mobile phase was 100% Methanol, carrier gas was helium, split ration 1:10, injection temperature 220 degree C）。
組換え体は合成ガス発酵で前培養を行った。前培養はフラスコに５０ｍＬのＡＴＣＣ培地 (pH 6.0)で行い。合成ガス(1/1/1; 1 bar overpressure)もしくは合成ガス(1/1/1; 1 bar overpressure)+ １％フルクトースを炭素源として用いた。セレクションにはChlarithromycin (10 μg/mL)を用いた。前培養はリアクター培養を行う前に３７℃で少なくとも４８時間培養した。合成ガスでの前培養ではリアクター培養の前に７２時間以上の培養を要する。リアクター培養はＡＴＣＣ培地２Ｌに５０ｍＬの 0.8 M BIS-TRIS （pH 6.0）と １．５ｍＬの消泡剤 (Struktol J673)を添加したものを用いた。リアクターはオートクレーブ処理後の５００ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨを塩基として用い、培地のオートクレーブ処理前に２００μＬのresazurin (20 mg/mL)を添加した。オートクレーブ後、trace elements, vitamin-solution, L-Cystein、抗生物質を添加し、ｐＨ制御（ｐＨ６．０）を開始した。脱酸素のために断続的に窒素ガスを流した(０．８Ｌ／分; １０-１５分)。その後、１５分間培地を撹拌しながら合成ガス(1/1/1; 0.25 L/min)を流した。サンプルはGC/MS (6 mL)による気相分析のために１日に２回、また、LC/MS-MS (50_100 mL、OD600に依存)によるターゲットプロテオミクス分析のために毎時間サンプリングを行った。５、６日後、リアクター培養液から溶媒抽出法によって１，４−ＢＤＯを抽出した。ジクロロメタンと塩による抽出法を用いた。この方法は２Ｌのリアクター培養液を１００ｍＬ以下に少なく濃縮することができる。これを５００μＬ取り、ＧＣＭＳ分析チューブに移し、1μＬをインジェクトした。
その結果、野生株は１，４−ＢＤＯを生産していなかったが、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスターを導入したCLJU_pGn15_AKG(op)からは４０〜１７０μＭの１，４−ＢＤＯが得られた。以上よりC. ljungdahliiに１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスターを導入することで、合成ガスから１，４−ＢＤＯを生産できることが示された。
セルロース資化性菌Clostridium cellulolyticumによる１，４−ブタンジオールの生産（コハク酸経路）
Clostridium/E. coliシャトルベクターpM9_SUC(op)（配列番号３、図５）をエレクトロポレーション法(1.6kV)によってC. cellulolyticumに導入した。ＣＭ３（1.3 g L-1 (NH4)2 SO4, 1.5 g L-1 KH2PO4, 2.9 g L-1 K2HPO4 x 3 H2O, 0.2 g L-1 MgCl2 x 6 H2O, 75.0 mg L-1 CaCl2 x 2 H2O, 1.25 mg L-1 FeSO4 x 7 H2O, 1.0 mL L-1 trace element solution SL-10, 1.0 mg L-1 Resazurin, 2.0 g L-1 yeast extract, 2.5 g L-1 Na2CO3, 0.5 g L-1 L-cysteine-HCL x H2O, 6.0 g L-1 D-cellobiose and 15.0 g L-1 agar）寒天プレートより形質転換体を得た。pM9_SUC(op)ベクターはスクシニルCoA合成酵素（Escherichia coli由来sucCD）、CoA依存スクシネイトセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ (Clostridium kluyveri由来sucD)、Porphyromonas gingivalis由来4hbd、Porphyromonas gingivalis由来cat2、及びClostridium acetobutylicum由来adhE2をコードする、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスター（図５）を含む。得られた組み換え体をCCE_pM9_SUC(op)と命名した。
前記CCE_pM9_SUC(op)とCCE野生型株を嫌気性条件においてＣＭ３培地（前述の寒天無しのもの）を用いて培養した。培養は２００ｍＬの密閉されたボトル中に前述の培地５０ｍＬを封入し、３４℃で培養した。培養ボトルはブチルゴム栓とアルミキャップでシールした。
培養液のＯＤ６００が２．０になった時点で、遠心分離し、上清を採取した。フィルター濾過（0.22μm）した後にGCMS (QP2010S GC-MS system (Shimadzu))によって分析した（InterCap FFAP (GL Sciences), Mobile phase was 100% Methanol, carrier gas was helium, split ration 1:10, injection temperature 220 degree C）。
培養液のＯＤ６００が２．０になった時点で、遠心分離し、上清を採取した。フィルター濾過（0.22μm）した後にGCMS (QP2010S GC-MS system (Shimadzu))によって分析した（InterCap FFAP (GL Sciences), Mobile phase was 100% Methanol, carrier gas was helium, split ration 1:10, injection temperature 220 degree C）。
その結果、野生株は１，４−ＢＤＯを生産していなかったが、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスターを導入したpM9_SUC(op)からは６０〜１２０μＭの１，４−ＢＤＯが得られた。以上より、セルロース資化性細菌C. cellulolyticumに１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスターを導入することで１，４−ＢＤＯを生産できることが示された。
セルロース資化生菌Clostridium cellulolyticumによる１，４−ブタンジオールの生産（α―ケトグルタル酸経路）
Clostridium/E. coliシャトルベクターpM9_AKG（配列番号４、図６）をエレクトロポレーション法(1.6kV)によってC. cellulolyticumに導入した。ＣＭ３（1.3 g L-1 (NH4)2 SO4, 1.5 g L-1 KH2PO4, 2.9 g L-1 K2HPO4 x 3 H2O, 0.2 g L-1 MgCl2 x 6 H2O, 75.0 mg L-1 CaCl2 x 2 H2O, 1.25 mg L-1 FeSO4 x 7 H2O, 1.0 mL L-1 trace element solution SL-10, 1.0 mg L-1 Resazurin, 2.0 g L-1 yeast extract, 2.5 g L-1 Na2CO3, 0.5 g L-1 L-cysteine-HCL x H2O, 6.0 g L-1 D-cellobiose and 15.0 g L-1 agar）寒天プレートより形質転換体を得た。pM9_AKGベクターはsucA (Mycobacterium bovis由来)、4hbd (Porphyromonas gingivalis由来)、cat2 (Porphyromonas gingivalis由来)、及びadhE2 (Clostridium acetobutylicum由来)をコードする、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスター(図６)を含む。得られた組み換え体をCCE_pM9_AKGと命名した。
前記CCE_pM9_AKGとCCE野生型株を嫌気性条件においてＣＭ３培地（前述の寒天無しのもの）を用いて培養した。培養は２００ｍＬの密閉されたボトル中に前述の培地５０ｍＬを封入し、３４度で培養した。培養ボトルをブチルゴム栓とアルミキャップでシールした。
培養液のＯＤ６００が２．０になった時点で、遠心分離し、上清を採取した。フィルター濾過（0.22μm）した後にGCMS (QP2010S GC-MS system (Shimadzu))によって分析した（InterCap FFAP (GL Sciences), Mobile phase was 100% Methanol, carrier gas was helium, split ration 1:10, injection temperature 220 degree C）。
培養液のＯＤ６００が２．０になった時点で、遠心分離し、上清を採取した。フィルター濾過（0.22μm）した後にGCMS (QP2010S GC-MS system (Shimadzu))によって分析した（InterCap FFAP (GL Sciences), Mobile phase was 100% Methanol, carrier gas was helium, split ration 1:10, injection temperature 220 degree C）。
野生株は1,4-BDO は生産していなかったが、１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスターを導入したpM9_AKGからは、６０μＭの１，４−ＢＤＯが得られた。以上よりセルロース資化性細菌C. cellulolyticumに１，４−ＢＤＯ合成遺伝子クラスターを導入することで１，４−ＢＤＯを生産できることが示された。
合成ガスからのClostridium ljungdahliiによる１，４−ブタンジオールの生産（コハク酸経路）
（１）１，４−ブタンジオール合成関連酵素発現ベクターの構築
１，４−ブタンジオール生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号５の人工合成遺伝子（６７７４ｂｐ）を構築した。該遺伝子クラスターは、sucD（ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、Gene ID: 5394466）、4Hb（４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、Gene ID: 2552693）、abfT（４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、EMBL_CAB60036.2）、adhE2（アルコールデヒドロゲナーゼ、EMBL_AAK09379.1）の各遺伝子とＴ７ターミネーターを含み、さらに、両末端にそれぞれBglIIとXhoIの認識配列を含む。
１，４−ブタンジオール生合成関連酵素遺伝子クラスターである配列番号５の人工合成遺伝子（６７７４ｂｐ）を構築した。該遺伝子クラスターは、sucD（ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、Gene ID: 5394466）、4Hb（４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、Gene ID: 2552693）、abfT（４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、EMBL_CAB60036.2）、adhE2（アルコールデヒドロゲナーゼ、EMBL_AAK09379.1）の各遺伝子とＴ７ターミネーターを含み、さらに、両末端にそれぞれBglIIとXhoIの認識配列を含む。
Clostridium/E. coliシャトルベクターpSOS95（GenBank: AY187686.1）のBamHI/EheIサイトに配列番号６の人工合成ＤＮＡ（１２０ｂｐ）をクローニングし、pSOS-MSとした。さらに、pSOS-MSのBamHI/XhoIサイトに、配列番号５の人工合成遺伝子をBglII/XhoIで制限酵素処理した遺伝子断片をクローニングし、pSOS-BDOとした。これらのクローニングの際にはNEB express を用いた。pSOS-BDOもpSOS95と同様にシャトルベクターとして機能する。
（２）１，４−ブタンジオール生産能を有する組換え体の作製
上記（１）で作製したpSOS-BDOを、エレクトロポレーションにてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体を取得した。コントロールとして、pSOS-MSを同様にしてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体を取得した。エレクトロポレーションは、Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4):1102-9で推奨されている方法によって行った。
上記（１）で作製したpSOS-BDOを、エレクトロポレーションにてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体を取得した。コントロールとして、pSOS-MSを同様にしてClostridium ljungdahlii（DSM13528/ATCC55383）に導入し、組換え体を取得した。エレクトロポレーションは、Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(4):1102-9で推奨されている方法によって行った。
（３）組換え体による１，４−ブタンジオール生産
上記（２）で取得した２種の組換え体を、３７℃、嫌気条件下で培養した。培地として、４μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含有するATCC medium 1754 PETC培地（ただし、フルクトース非含有）を用いた。１２５ｍＬ容の密閉可能なガラス容器に４５ｍＬの培地を仕込み、ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2＝３３／３３／３４％（体積比）の混合ガスを０．２５ＭＰａ（絶対圧）のガス圧で充填し、アルミキャップで密封した後、振とう培養した。ＯＤ６００が０．９に到達した時点で培養を終了し、培養液を遠心した後、上清を用いてＬＣＭＳによって分析した。
上記（２）で取得した２種の組換え体を、３７℃、嫌気条件下で培養した。培地として、４μｇ／ｍＬクラリスロマイシンを含有するATCC medium 1754 PETC培地（ただし、フルクトース非含有）を用いた。１２５ｍＬ容の密閉可能なガラス容器に４５ｍＬの培地を仕込み、ＣＯ／ＣＯ2／Ｈ2＝３３／３３／３４％（体積比）の混合ガスを０．２５ＭＰａ（絶対圧）のガス圧で充填し、アルミキャップで密封した後、振とう培養した。ＯＤ６００が０．９に到達した時点で培養を終了し、培養液を遠心した後、上清を用いてＬＣＭＳによって分析した。
その結果、pSOS-MSを導入した組換え体においては１，４−ブタンジオールは検出されなかったが、pSOS-BDOを導入した組換え体においては１，４−ブタンジオールが検出された。以上のことから、１，４−ブタンジオール生合成関連酵素遺伝子クラスターが導入されたClostridium ljungdahliiの組換え体を培養することで、合成ガスから１，４−ブタンジオールを生産することができることが示された。
Claims (15)
- 偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有するClostridium属細菌の組換え細胞であって、
セルロース資化性を有し、
セルロソームを生産するものであり、
外来遺伝子として、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子を有し、
当該遺伝子が発現し、
リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。 - 偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有するClostridium属細菌の組換え細胞であって、
セルロース資化性を有し、
セルロソームを生産するものであり、
外来遺伝子として、２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子を有し、
当該遺伝子が発現し、
リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞。 - Clostridium thermocellum、Clostridium cellulolyticum、又はClostridium cellulovoransである、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
- Clostridium cellulolyticumである、請求項１又は２に記載の組換え細胞。
- 前記酵素群を構成する酵素の少なくとも１つは、細菌由来のものである、請求項１〜４のいずれかに記載の組換え細胞。
- 前記酵素群を構成する酵素の少なくとも１つは、宿主細胞由来のものである、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え細胞。
- 前記遺伝子がゲノムに組み込まれている、請求項１〜６のいずれかに記載の組換え細胞。
- 少なくとも４００ｍＭの１，４−ブタンジオールに対する耐性を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
- エタノール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されている、請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
- ２，３−ブタンジオール合成能が、宿主細胞のそれと比較して下方制御されている、請求項１〜９のいずれかに記載の組換え細胞。
- 組換え細胞の製造方法であって、
偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有し、セルロース資化性を有し、かつセルロソームを生産するClostridium属細菌の宿主細胞を提供する第一工程、及び、
前記宿主細胞に、ＣｏＡ依存型コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子を導入する第二工程、を包含し、
当該遺伝子が発現し、
リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞を製造する、組換え細胞の製造方法。 - 組換え細胞の製造方法であって、
偏性嫌気性かつ酢酸生成能を有し、セルロース資化性を有し、かつセルロソームを生産するClostridium属細菌の宿主細胞を提供する第一工程、及び、
２−オキソグルタル酸脱炭酸酵素、４−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ転移酵素、４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ還元酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼを含む酵素群をコードする遺伝子を導入する第二工程、を包含し、
当該遺伝子が発現し、
リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産可能である組換え細胞を製造する、組換え細胞の製造方法。 - 請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え細胞、又は請求項１１若しくは１２に記載の方法により製造された組換え細胞に、リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物を接触させ、当該組換え細胞に前記リグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物から１，４−ブタンジオールを生産させる、１，４−ブタンジオールの生産方法。
- 前記組換え細胞をリグノセルロース、セルロース、又は可溶性炭水化物を炭素源として培養し、その培養物から１，４−ブタンジオールを取得する、請求項１３に記載の方法。
- 前記組換え細胞は、Clostridium cellulolyticumである、請求項１３又は１４に記載の方法。
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