JP2023515463A - 酵母におけるエタノールおよび１つまたは複数の共生産物の生産方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、発酵性炭素源からのエタノールおよび1つまたは複数の共生産物の生産のための方法を提供する。エタノールおよび1つまたは複数の共生産物は、該1つまたは複数の共生産物をさらに生産するように改変されたエタノール生産性酵母において生産される。この方法は、発酵性炭素源を発酵培地中で改変酵母と接触させる段階、酵母が発酵性炭素源からエタノールおよび1つまたは複数の共生産物を生産するように酵母を発酵培地中で発酵させる段階、ならびにエタノールおよび1つまたは複数の共生産物を単離する段階を伴う。改変された酵母は、1つまたは複数の共生産物よりも高い濃度でエタノールを生産するエタノール生産性酵母である。さらに、本開示は、本明細書において開示される改変された酵母を提供する。TIFF2023515463000024.tif70166
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関連出願の相互参照
本出願は、2020年6月17日付で出願された米国特許仮出願第63/040,445号、および2020年2月21日付で出願された米国特許仮出願第62/979,905号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本出願は、2020年6月17日付で出願された米国特許仮出願第63/040,445号、および2020年2月21日付で出願された米国特許仮出願第62/979,905号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
背景
エタノールの工業的生産は、種々の微生物を用いた発酵法によって行われうる。より高い収率および生産性を達成するためのプロセス改良には、異なる原材料源の使用および/または副産物生産の低減が含まれる。例示的なエタノール発酵プロセスは、例えば、米国特許出願公開第2010/0196978号（特許文献1）、米国特許出願公開第2018/0030483号（特許文献2）、および中国特許出願公開第101875912 A号（特許文献3）に記載されている。ある種のクロストリジウム(Clostridium)種は、エタノール、ブタノールおよびアセトン(ABE)を生産する発酵プロセスを実行することが可能である。クロストリジウムを伴う例示的なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第2015/0093796号（特許文献4）および米国特許第9,074,173号（特許文献5）に記載されている。エタノールおよび別の生産物は、エタノールおよび他の生産物が同じ微生物による単一原材料の発酵を介して生産されない方法によって生産することもできる。米国特許出願公開第2019/0106720号（特許文献6）には、エタノールおよびキシリトールの生産が記載されており、ここでは発酵ブロスに存在するキシロースからキシリトールが生産され、デンプンからエタノールが生産されている。米国特許第5,070,016号（特許文献7）には、嫌気性エタノール発酵の二酸化炭素副産物からのメタノールの生産が記載されている。エタノール発酵の他の副産物には、動物飼料(例えば、米国特許第8,603,786号（特許文献8）参照)、酵母(例えば、欧州特許第1943346 B1号（特許文献9）参照)、マイコプロテイン(例えば、米国特許出願公開第2017/0226551号（特許文献10）参照)、およびトウモロコシ油(例えば、米国特許出願公開第2006/0019360号（特許文献11）参照)が含まれる。
エタノールの工業的生産は、種々の微生物を用いた発酵法によって行われうる。より高い収率および生産性を達成するためのプロセス改良には、異なる原材料源の使用および/または副産物生産の低減が含まれる。例示的なエタノール発酵プロセスは、例えば、米国特許出願公開第2010/0196978号（特許文献1）、米国特許出願公開第2018/0030483号（特許文献2）、および中国特許出願公開第101875912 A号（特許文献3）に記載されている。ある種のクロストリジウム(Clostridium)種は、エタノール、ブタノールおよびアセトン(ABE)を生産する発酵プロセスを実行することが可能である。クロストリジウムを伴う例示的なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第2015/0093796号（特許文献4）および米国特許第9,074,173号（特許文献5）に記載されている。エタノールおよび別の生産物は、エタノールおよび他の生産物が同じ微生物による単一原材料の発酵を介して生産されない方法によって生産することもできる。米国特許出願公開第2019/0106720号（特許文献6）には、エタノールおよびキシリトールの生産が記載されており、ここでは発酵ブロスに存在するキシロースからキシリトールが生産され、デンプンからエタノールが生産されている。米国特許第5,070,016号（特許文献7）には、嫌気性エタノール発酵の二酸化炭素副産物からのメタノールの生産が記載されている。エタノール発酵の他の副産物には、動物飼料(例えば、米国特許第8,603,786号（特許文献8）参照)、酵母(例えば、欧州特許第1943346 B1号（特許文献9）参照)、マイコプロテイン(例えば、米国特許出願公開第2017/0226551号（特許文献10）参照)、およびトウモロコシ油(例えば、米国特許出願公開第2006/0019360号（特許文献11）参照)が含まれる。
それゆえ、同じ微生物によって単一の原材料からエタノールと1つまたは複数の共生産物とを生産する改良された方法に対する必要性が当技術分野において存在している。
概要
本開示は、発酵性炭素源の一部分を用いて、エタノールを生産し続けながら生産物を生産するように改変されたエタノール生産酵母を用いた、工業的に重要な生産物の生産のための方法を提供する。本開示は、改変された酵母も提供する。
本開示は、発酵性炭素源の一部分を用いて、エタノールを生産し続けながら生産物を生産するように改変されたエタノール生産酵母を用いた、工業的に重要な生産物の生産のための方法を提供する。本開示は、改変された酵母も提供する。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノールおよび1つまたは複数の共生産物の生産のための方法は、以下の段階: (a) 発酵性炭素源を発酵培地中でエタノール生産酵母と接触させる段階; (b) 酵母を発酵培地中で発酵させる段階であって、酵母が発酵性炭素源からエタノールおよび1つまたは複数の共生産物を生産し、生産されたエタノールが、生産された共生産物よりも高いmg/mL濃度で存在する、段階; ならびに(c) エタノールおよび1つまたは複数の共生産物を単離する段階を含み、ここで、酵母は、1つまたは複数の共生産物を生産するように遺伝子改変された組換え酵母である。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、炭素源はグルコースまたはデキストロースである。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、炭素源は、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、米、またはそれらの混合物などの、デンプンに基づく原材料の糖化によって得られる再生可能な穀物源に由来する。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、炭素源は、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、またはそれらの混合物などの、再生可能な糖由来である。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノール生産酵母はサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、サッカロマイセス・セレビシエは工業用株である。適切な工業用エタノール生産菌株は、S.セレビシエPE-2、CAT-1およびRedを含むが、これらに限定されることはない。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、サッカロマイセス・セレビシエは、エタノール工業において使用される任意の一般的な菌株、典型的な実験室菌株、または菌株間の典型的な交配方法から生じる任意の菌株である。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、サッカロマイセス・セレビシエは、既存の工業用エタノールプロセスにおいて既に使用されている工業用菌株であり、ここでそのようなプロセスは、原料としてのサトウキビ、サトウダイコン、または最も好ましくは、トウモロコシに基づいている。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノール生産酵母は、PYK1および/またはPDC1 (ピルビン酸デカルボキシラーゼ1)などの、天然のエタノール生産代謝経路に関連する内因性酵素のいずれかを下方制御するように改変される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノール生産酵母は、グリセロール経路酵素および/または酢酸経路酵素などの天然のエタノール生産代謝経路に直接関連または関与しない他の内因性酵素を下方制御または欠失するように改変される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノール生産酵母は、ホスホエノールピルビン酸(PEP)のピルビン酸への変換を触媒する内因性ピルビン酸キナーゼを下方制御するように改変される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、ピルビン酸キナーゼ発現は野生型ピルビン酸キナーゼ発現のレベルと比較して、少なくとも10%、例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%だけ下方制御される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、ピルビン酸キナーゼ活性は野生型ピルビン酸キナーゼ活性のレベルと比較して、少なくとも10%、例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%だけ下方制御される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、内因性遺伝子の下方制御は、弱いプロモーター(天然もしくは合成のいずれか)、天然もしくは合成ターミネーター、天然もしくは合成転写因子、デグロンペプチド、iCRISPR、または酵母における遺伝子の下方制御のための当技術分野において公知の任意の他の技法によって実行される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、弱いプロモーターの制御下にある内因性ピルビン酸キナーゼは、野生型ピルビン酸キナーゼ発現のレベルの90%以下、例えば80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、または10%以下であるレベルで発現される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、弱いプロモーターの制御下にある内因性ピルビン酸キナーゼの活性は、野生型ピルビン酸キナーゼ活性のレベルの90%以下、例えば80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、または10%以下のレベルである。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、弱いプロモーターはpADH1、pCYC1、pSTE5、pREV1、pURA3、pRPLAl、pGAPl、pNUP57、またはpMET25である。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノール生産酵母は、ホスホエノールピルビン酸(PEP)のピルビン酸への変換を触媒する内因性ピルビン酸キナーゼを欠失するように改変される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノール生産酵母は、弱いプロモーターの制御下でホスホエノールピルビン酸(PEP)のピルビン酸への変換を触媒する外因性ピルビン酸キナーゼを発現するように改変される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、外因性遺伝子の下方制御は、弱いプロモーター(天然もしくは合成のいずれか)、天然もしくは合成ターミネーター、天然もしくは合成転写因子、デグロンペプチド、または酵母における遺伝子の下方制御のための当技術分野において公知の任意の他の技法によって実行される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、弱いプロモーターの制御下にある外因性ピルビン酸キナーゼは野生型ピルビン酸キナーゼ発現のレベルの90%以下、例えば80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、または10%以下であるレベルで発現される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、弱いプロモーターの制御下にある外因性ピルビン酸キナーゼの活性は、野生型ピルビン酸キナーゼ活性のレベルの90%以下、例えば80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、または10%以下のレベルである。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、弱いプロモーターはpADH1、pCYC1、pSTE5、pREV1、pURA3、pRPLAl、pGAPl、pNUP57、またはpMET25である。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノール生産酵母は、外因性ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)キナーゼを発現させて炭素流をPEPからオキサロ酢酸に切り替えるように改変される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、共生産物は、エタノール生産酵母にとって非毒性の濃度で生産される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、組換え酵母は、その母体である工業用エタノール生産酵母と比較して、保存されたエタノール発酵の堅牢性および性能の大部分を有し、既存の工業用エタノールプロセスでのその使用を可能にする。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、生産されたエタノールは、生産されたエタノールおよび共生産物の総重量に基づき少なくとも70重量%、例えば少なくとも75重量%、少なくとも80重量%、少なくとも85重量%、少なくとも90重量%、または少なくとも95重量%の量で存在する。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、発酵はバッチプロセス、流加回分プロセス、または連続プロセスとして実行される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、発酵は約15℃から約60℃の温度で約24時間から約96時間、嫌気条件下で実行される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、発酵は約15℃から約60℃の温度で約24時間から約96時間、微好気性条件下で実行される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、発酵は約15℃から約60℃の温度で約24時間から約96時間、好気性条件下で実行される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、発酵は工業用エタノールプラントで、好ましくは既存の工業用エタノールプラントで実行される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、1つまたは複数の共生産物は、エタノール以外のアルコール; ケトン; グリコール; エーテル; エステル; ジアミン; カルボン酸; アミノ酸; ジエン、およびアルケンからなる群より選択される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、1つまたは複数の共生産物は、1-ブタノール、2-ブタノール、イソブタノール、メタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、イソアミルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、プロピオン酸メチル、1,3-プロパンジオール、モノエチレングリコール、プロピレングリコール、クエン酸、乳酸、コハク酸、アジピン酸、酢酸、グルタミン酸、プロピオン酸、フランジカルボン酸、2,4フランジカルボン酸、2,5-フランジカルボン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、イタコン酸、グルタミン酸、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸プロピル、イソプレノール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール、ジエタノールアミン、トリプトファン、スレオニン、メチオニン、リジン、セリン、チロシン、ブタジエン、イソプレン、エタン、およびプロペンからなる群より選択される。上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、共生産物は、水への溶解度が低く、発酵ブロスタンクの底に凝集または沈降し、下流の処理中に発酵ブロスからのそれらの分離および精製を容易にしうる。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノールおよび1つまたは複数の共生産物を単離する段階は、蒸留、吸着、結晶化、吸収、電気透析、溶媒抽出、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせから選択されるプロセスを含む。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノールおよび1つまたは複数の共生産物の生産のための方法は、以下の段階: (a) 発酵性炭素源を発酵培地中でエタノール生産酵母と接触させる段階; (b) 酵母を発酵培地中で発酵させる段階であって、酵母が発酵性炭素源からエタノールおよび1つまたは複数の低沸点共生産物を生産し、生産されたエタノールが、生産された共生産物よりも高いmg/mL濃度で存在する、段階; ならびに(c) エタノールおよび1つまたは複数の低沸点共生産物を単離する段階を含み、ここで、酵母は、1つまたは複数の共生産物を生産するように遺伝子改変された組換え酵母である。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、低沸点共生産物は、100 kPa (1バール)の標準圧力で、100℃またはそれ以下、例えば99℃もしくはそれ以下、98℃もしくはそれ以下、97℃もしくはそれ以下、95℃もしくはそれ以下、90℃もしくはそれ以下、85℃もしくはそれ以下、80℃もしくはそれ以下、75℃もしくはそれ以下、70℃もしくはそれ以下、65℃もしくはそれ以下、または60℃もしくはそれ以下の沸点を有する。例示的な低沸点生産物としては、1-プロパノール(沸点: 97℃)、2-プロパノール(沸点: 82℃)、アセトン(沸点: 56℃)、メチルエチルケトン(沸点: 80℃)、酢酸エチル(沸点: 77℃)、酢酸イソプロピル(沸点: 88℃)、エタン(沸点: -90℃)、プロペン(沸点: -48℃)、およびエタノール(沸点: 78.3℃)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、1つまたは複数の低沸点共生産物は、アセトン、1-プロパノール、2-プロパノール、またはそれらの組み合わせから選択される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノールおよび1つまたは複数の低沸点共生産物を単離することは、連続蒸留ユニットによって行われる。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノールおよび1つまたは複数の共生産物の生産のための方法は、以下の段階: (a) 発酵性炭素源を発酵培地中でエタノール生産酵母と接触させる段階; (b) 酵母を発酵培地中で発酵させる段階であって、酵母が発酵性炭素源からエタノールおよび1つまたは複数の高沸点共生産物を生産し、生産されたエタノールが、生産された共生産物よりも高いmg/mL濃度で存在する、段階; ならびに(c) エタノールおよび1つまたは複数の高沸点共生産物を単離する段階を含み、ここで、酵母は、1つまたは複数の高沸点共生産物を生産するように遺伝子改変された組換え酵母である。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、高沸点共生産物は、100 kPa (1バール)の標準圧力で、100℃超、例えば105℃超、110℃超、120℃超、130℃超、140℃超、150℃超、160℃超、170℃超、180℃超、190℃超、200℃超、210℃超、220℃超、230℃超、240℃超、または250℃超の沸点を有する。例示的な高沸点共生産物としては、モノエチレングリコール(沸点: 197℃)、n-ブタノール(沸点: 118℃)、3-ヒドロキシプロピオン酸(沸点: 280℃)、アジピン酸(沸点: 338℃)、ジエタノールアミン(沸点: 268℃)、および1,3-プロパンジオール(沸点: 214℃)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、1つまたは複数の高沸点共生産物は、1-ブタノール、イソブタノール、イソアミルアルコール、またはそれらの組み合わせから選択される。
上記または下記の態様のそれぞれのまたはいずれかのいくつかの態様において、エタノールおよび1つまたは複数の高沸点共生産物を単離する段階は、蒸留と、それに続く結晶化、溶媒抽出、クロマトグラフィー分離、塩分解、沈降、酸性化、イオン交換、蒸発、またはそれらの組み合わせから選択されるプロセスによって行われる。
本開示の前述の概要ならびに以下の詳細説明は、添付した図と併せて読むと、より良好に理解されよう。本開示の実例を示す目的のために、現時点で好ましい態様を図に示している。しかしながら、本開示は、図示した厳密な配置、実施例および手段に限定されないことを理解されたい。
詳細な説明
本開示は、改変された酵母(例えば、組換え酵母)、および改変された酵母を用いて工業的に重要な生産物を生産する方法を提供する。改変された酵母は、発酵性炭素源の一部分を用いて、エタノールを生産し続けながら生産物を生産するように改変されたエタノール生産酵母である。本開示の利点は、炭素源のごく一部のみをエタノール生産から工業的関連性のある生産物の生産に転用できることであり、それにより、大量だと酵母細胞にとって有毒な標的生産物の生産が、促進される。関連する利点は、炭素源のごく一部を共生産物に転用しても、潜在的に毒性の化合物が、低濃度で、および発酵プロセスの障害となりうる毒性濃度範囲未満で、生産されるため、酵母細胞の増殖およびエタノールに対する酵母の性能に全くまたはごくわずかな影響しか与えないということである。工業生産に必要な生産条件と同様の生産条件を利用しながら、酵母のエタノール性能を少なくとも部分的に保持することのさらなる利点は、改変された酵母を、既存のエタノール生産プラントにおいて使用できることである。本開示のさらなる利点は、工業的要件に対する堅牢性および十分なエタノール生産性能を有する改変された酵母を有することができることである。
本開示は、改変された酵母(例えば、組換え酵母)、および改変された酵母を用いて工業的に重要な生産物を生産する方法を提供する。改変された酵母は、発酵性炭素源の一部分を用いて、エタノールを生産し続けながら生産物を生産するように改変されたエタノール生産酵母である。本開示の利点は、炭素源のごく一部のみをエタノール生産から工業的関連性のある生産物の生産に転用できることであり、それにより、大量だと酵母細胞にとって有毒な標的生産物の生産が、促進される。関連する利点は、炭素源のごく一部を共生産物に転用しても、潜在的に毒性の化合物が、低濃度で、および発酵プロセスの障害となりうる毒性濃度範囲未満で、生産されるため、酵母細胞の増殖およびエタノールに対する酵母の性能に全くまたはごくわずかな影響しか与えないということである。工業生産に必要な生産条件と同様の生産条件を利用しながら、酵母のエタノール性能を少なくとも部分的に保持することのさらなる利点は、改変された酵母を、既存のエタノール生産プラントにおいて使用できることである。本開示のさらなる利点は、工業的要件に対する堅牢性および十分なエタノール生産性能を有する改変された酵母を有することができることである。
本開示は、既存の工業用エタノールプロセスで用いて、糖およびエタノールにとどまらない工業関連の生産物を生産するのに適した、改変された酵母(例えば、組換え酵母)を提供する。本開示の利点は、エタノール生産者が生産物のポートフォリオを多様化することができ、糖およびエタノールの生産自体に限定されないことが可能なことである。関連する利点は、工業関連の標的生産物およびエタノールの市場価格に応じ、標的生産物およびエタノール混合物の濃度を変化させて生産できることである。さらなる利点は、収益性を高めるために、エタノールと比較して市場価格が高い工業関連の生産物を生産するようにエタノール生産から炭素源の一部を転用できることである。本開示のさらなる利点は、既存の工業用エタノール生産プラントで用いるのに適した改変された酵母を提供し、技術的リスク、工業化の時間、ならびに未開発地域のプラント建設およびスケールアッププロセスに関する投資を削減できることである。
本開示は、炭素源のごく一部をエタノール生産から工業関連の生産物の生産に転用することができる改変された酵母(例えば、組換え酵母)を提供する。本開示の利点は、改変された酵母が、工業用エタノール酵母株の工業用堅牢性およびエタノール性能の要件を損なうことなく、エタノールと比較して少量で生産物を生産できるように最小限に改変されることである。関連する利点は、大規模な代謝操作作業が不要であり、そのような低濃度で生産物を生産するために完全に最適化された代謝経路酵素は必要とされないため、研究開発プログラムへの投資を減らして、より短期間で改変された酵母を活用できることである。対照的に、大部分または全ての炭素源を、エタノールではない所望の生産物に転用することができる改変された酵母を活用するには、より時間のかかる研究開発作業および全体的なコストの増加が必要とされるであろう。
本明細書において用いられる場合、用語「～に由来する」には、～に起源を有する、～から得られた、～から得られうる、～から単離された、および～から創出された、という用語が包含され得、一般的には、ある特定の物質が、別の特定の物質中にその起源を有すること、または該別の特定の物質と関連して説明できる特徴を有することを示している。
本明細書において用いられる場合、「外因性ポリヌクレオチド」は、微生物外に由来する任意のデオキシリボ核酸をいう。
本明細書において用いられる場合、用語「発現ベクター」は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは核酸配列、例えば、DNAコード配列(例えば、遺伝子配列)を含有しており、該配列が、宿主内での該コード配列の発現に影響を及ぼしうる1つまたは複数の適切な制御配列に機能的に連結されている、DNA構築体をいいうる。そのような制御配列としては、転写に影響を及ぼすためのプロモーター、そのような転写を制御するための任意選択的なオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。該ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ粒子、細菌人工染色体、または単純に潜在的ゲノム挿入体であってもよい。適切な宿主内で形質転換させると、該ベクターは、宿主のゲノムとは独立して複製して機能しうるか(例えば、独立したベクターもしくはプラスミド)、または場合によっては該ゲノム自体に組み込まれうる(例えば、組み込みベクター)。プラスミドは最も一般的に使用されている発現ベクターの形態である。しかしながら、本開示は、同等の機能を果たす当技術分野において公知の、または当技術分野において公知となるそのような他の形態の発現ベクターも包含していることを意図する。
本明細書において用いられる場合、用語「発現」は、ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードする核酸配列(例えば、遺伝子)に基づいて生成されるプロセスをいいうる。該プロセスには転写および翻訳の両方が含まれる。
本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたはタンパク質(例えば、融合タンパク質)の生成に関与しているDNAセグメントをいうことができ、コード領域の前および後の領域ならびに個々のコードセグメント(エキソン)間の介在配列(イントロン)を含む。
本明細書において用いられる場合、用語「異種」は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドに関連している場合、特定の細胞内、例えば宿主細胞内に天然に存在しない核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドをいいうる。該用語は、天然に存在する遺伝子、変異型遺伝子および/または合成遺伝子にコードされたタンパク質を包含していることを意図する。対照的に、同種という用語は、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドに関連している場合、細胞内に天然に存在する核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはペプチドをいう。
本明細書において用いられる場合、用語「宿主細胞」は、ポリペプチドまたはタンパク質(例えば、融合タンパク質)の発現のために組換え発現ベクターがトランスフェクトされうる、微生物などの細胞を含む細胞または細胞株をいいうる。宿主細胞には宿主単細胞の子孫も包含され、子孫は、天然、偶発的または意図的な変異のため必ずしも元の親細胞と(形態または全ゲノムDNAの相補体において)完全に同一でないことがありうる。宿主細胞には、発現ベクターにてインビボでトランスフェクトまたは形質転換させた細胞も含まれうる。
本明細書において用いられる場合、用語「導入される」は、細胞内への核酸配列またはポリヌクレオチド配列の挿入の状況においてトランスフェクション、形質転換または形質導入を含むものでありえ、真核生物細胞または原核生物細胞内への核酸配列またはポリヌクレオチド配列の組み込みをいい、この場合、該核酸配列またはポリヌクレオチド配列は、細胞のゲノム内に組み込まれうるか(例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアDNA)、自律性レプリコンに変換されうるか、一過的に発現されうる。
本明細書において用いられる場合、本発明の微生物体または微生物に関して使用されている場合の用語「非天然」または「改変された(modified)」は、該微生物体が、言及している種の天然に存在する株、例えば言及している種の野生型株には通常見られない少なくとも1つの遺伝子改変(genetic alteration)を有していることを意味していることを意図する。遺伝子改変としては、例えば、代謝性ポリペプチドをコードする発現可能な核酸が導入される改変(modification)、他の核酸付加、核酸欠失および/または微生物体の遺伝物質の他の機能破壊が挙げられる。そのような改変は、例えば、言及している種の異種ポリペプチド、同種ポリペプチドまたは異種ポリペプチドと同種ポリペプチドの両方のコード領域およびその機能性断片を含むものである。さらなる改変は、例えば、改変によって遺伝子またはオペロンの発現が改変される非コード調節領域を含むものである。本開示の非天然微生物体は安定な遺伝子改変を含んでいるものでありえ、これは、微生物が、該改変の喪失なく5世代より後まで培養されうることをいう。一般的に、安定な遺伝子改変としては10世代より後まで持続される改変が挙げられ、特に安定な改変は約25世代より後まで持続され、より特別には、安定な遺伝子改変は50世代より後まで(例えば、無期限に)存在する。当業者には、遺伝子改変(例えば、本明細書に例示した代謝的改変)を適切な宿主生物体およびその対応する代謝反応または所望の遺伝物質(所望の代謝経路の遺伝子など)の適切な供給源生物体に関して記載していることが理解されよう。しかしながら、多種多様な生物体の完全なゲノム配列決定およびゲノミクス分野における高レベルの技術を考慮すると、当業者は、本明細書に示した教示および手引きを本質的に全ての他の生物体に容易に適用することができよう。そのような遺伝子改変としては、例えば、一般にはホモログ種の遺伝子改変、特に、オーソログ、パラログまたは非オーソロガス遺伝子の置換が挙げられる。
本明細書において用いられる場合、用語「機能的に連結された」は、特定のエレメントの並置または配置により、該エレメントを協調して機能させ、効果をもたらすことをいいうる。例えば、プロモーターは、コード配列の転写が制御される場合、該コード配列に機能的に連結されたものでありうる。
本明細書において用いられる場合、「1-プロパノールは、一般式CH3CH2CH2OH (CAS番号71-23-8)を有するn-プロパノールを意味するように意図される。
本明細書において用いられる場合、「2-プロパノールは、一般式CH3CH3CHOH (CAS番号67-63-0)を有するイソプロピルアルコールを意味するように意図される。
本明細書において用いられる場合、用語「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの結合に関与し遺伝子の転写を開始させる調節配列をいいうる。プロモーターは誘導性プロモーターであっても構成的プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターは、環境調節条件または発生調節条件下で活性なプロモーターである。
本明細書において用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」は、任意の長さならびに任意の3次元構造および一本鎖または複数本鎖(例えば、一本鎖、二本鎖、三重らせんなど)のポリマー形態のヌクレオチドをいうことができ、これは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの類似体もしくは改変型形態、例えば、改変型のヌクレオチドもしくは塩基またはその類似体を含むものである。そのようなポリヌクレオチドまたは核酸配列は、アミノ酸(例えば、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば融合タンパク質)をコードするものでありうる。遺伝コードは縮重しているため、ある特定のアミノ酸をコードする1つより多くのコドンが使用されることがありえ、本開示には、ある特定のアミノ酸配列をコードする複数のポリヌクレオチドが包含されている。ポリヌクレオチドが使用条件下で所望の機能性を保持している限り、任意の型の改変型ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、例えば、ヌクレアーゼ耐性を増大させる改変体(例えば、デオキシ、2'-O-Me、ホスホロチオエートなど)が使用されうる。また、検出または捕捉の目的で、標識、例えば、放射性もしくは非放射性の標識またはアンカー(例えば、ビオチン)を組み込んでもよい。また、ポリヌクレオチドという用語はペプチド核酸(PNA)も包含している。ポリヌクレオチドは天然に存在するものであっても非天然であってもよい。ポリヌクレオチド、核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は本明細書において互換的に用いられる。ポリヌクレオチドは、RNA、DNAもしくは両方および/またはその改変型形態および/または類似体を含むものでありうる。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいてもよい。1つまたは複数のホスホジエステル結合を別の連結基で置き換えてもよい。このような別の連結基としては、限定されないが、ホスフェートをP(O)S (チオエート)、P(S)S (ジチオエート)、(O)NR2 (アミデート)、P(O)R、P(O)OR'、COCH2 (ホルムアセタール) (式中、各RまたはR'は、独立して、Hであるか、あるいは任意選択でエーテル(-O-)結合を含む置換もしくは非置換のアルキ(1～20 C)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル(araldyl)である)で置き換えた態様が挙げられる。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。ポリヌクレオチドは、線状であっても環状であってもよく、線状部分と環状部分の組み合わせを含むものであってもよい。
本明細書において用いられる場合、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸で構成され、かつ当業者によってタンパク質と認識される組成物をいいうる。本明細書では、アミノ酸残基をコードする慣用的な1文字または3文字を用いている。タンパク質およびポリペプチドという用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマー、例えば、連結した(例えば、融合した)ペプチド/ポリペプチド(例えば、融合タンパク質)を構成するものを含むものを示すために互換的に用いられる。該ポリマーは線状であっても分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含むものであってもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。また、該用語は、天然に、または介入; 例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって改変されたアミノ酸ポリマーも包含している。また、例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体(例えば、非天然アミノ酸など)、ならびに当技術分野において公知の他の改変を含むポリペプチドもこの定義に含まれる。
本明細書において用いられる場合、関連タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドには変種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが包含されうる。変種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、親タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと、および/または互いにアミノ酸残基の数が少数異なっている。いくつかの態様において、異なるアミノ酸残基数は約1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45、または50個のいずれかである。いくつかの態様において、変種は約1～約10個のアミノ酸が異なっている。あるいはまたさらに、変種は、例えば、配列アライメントツール、例えばBLAST、ALIGN、およびCLUSTAL (下記参照)を用いて調べたとき参照タンパク質または核酸と特定の度合いの配列同一性を有するものであってもよい。例えば、変種タンパク質または核酸は、参照配列と少なくとも約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはさらに99.5%のアミノ酸配列同一性を有するものでありうる。
本明細書において用いられる場合、用語「回収された」、「単離された」、「精製された」、および「分離された」は、天然では結合している少なくとも1種類の成分から取り外された物質(例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、ポリヌクレオチドまたは細胞)をいいうる。例えば、これらの用語は、例えば、インタクトな生物学的系などの、天然状態で見られるとき通常、付随している成分が実質的または本質的にない物質をいいうる。
本明細書において用いられる場合、用語「組換え」は、人間によって操作されたため自然界に見られる核酸、ポリペプチドおよび細胞と同じでない核酸配列またはポリヌクレオチド、ポリペプチドもしくはタンパク質およびそのベースの細胞をいいうる。また、組換えは、例えば改変ポリペプチドが生成するようにコード配列を変異させること、コード配列を別のコード配列または遺伝子のものに融合させること、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に配すること、遺伝子を異種生物体で発現させること、遺伝子をより低いまたは高いレベルで発現させること、遺伝子をその天然の発現プロフィールと異なる様式にて条件付きでまたは構成的に発現させることなどにより、配列または発現の特徴が改変されるように改変された遺伝物質(例えば、核酸配列またはポリヌクレオチド、これらにコードされたポリペプチドまたはタンパク質、ならびにそのような核酸配列またはポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞)をいうこともある。
本明細書において用いられる場合、用語「トランスフェクション」または「形質転換」は、宿主細胞内への外因性核酸またはポリヌクレオチドの挿入をいいうる。外因性核酸またはポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター(例えば、プラスミド)として維持されうるか、あるいはまた宿主細胞のゲノム内に組み込まれうる。トランスフェクトする、またはトランスフェクションという用語は、宿主細胞内に核酸またはポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる慣用的な手法を包含していることを意図する。トランスフェクション技法の例としては、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されることはない。
本明細書において用いられる場合、用語「形質転換させた」、「安定的に形質転換させた」、および「トランスジェニック」は、ゲノム内に組み込まれているか、または多世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして非天然の(例えば、異種)核酸配列またはポリヌクレオチド配列を有する細胞をいいうる。
本明細書において用いられる場合、用語「ベクター」は、核酸を1つまたは複数の細胞型に導入するためにデザインされたポリヌクレオチド配列をいいうる。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、一本鎖および二本鎖のカセットなどが挙げられる。
本明細書において用いられる場合、用語「野生型」、「天然の」または「天然に存在する」タンパク質は、自然界に見られるタンパク質をいいうる。野生型配列という用語は、自然界に見られる、または天然に存在するアミノ酸または核酸の配列をいう。いくつかの態様において、野生型配列は、タンパク質工学プロジェクト、例えば変種タンパク質産生の出発点である。
本明細書において用いられる場合、用語「非毒性濃度」は、共生産物を生産するように改変された酵母によって生産されるエタノールのレベルに対して、それ以外は類似の非改変酵母によって生産されるエタノールのレベルと比較して、影響を与えないか、または最小限の影響しか与えない共生産物の濃度をいいうる。例えば、非毒性濃度が存在する場合、改変された酵母によって生産されるエタノールのレベルは、改変されていない酵母によって生産されるエタノールのレベルと比較して、30%以下、20%以下、または最も好ましくは、10%以下だけ低減されうる。
本明細書において特に定義されていない限り、本明細書において用いられる科学技術用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York (1994)、およびHale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は当業者にとって、本開示において用いられる用語の多くの一般的辞書となろう。さらに、本明細書におけるいずれかの経路に開示した任意の基質には、択一的に該基質のアニオンまたはカチオンが含まれうることが理解されよう。
本明細書において提供される数値範囲は、該範囲を規定する数値を含む。
本開示は種々の形態で具体化されうるが、いくつかの態様の以下の記載は、本開示の例示とみなされるべきという理解を伴ってなされたものであり、本開示を、実例を示した具体的な態様に限定することを意図したものでない。見出しは、便宜上、示しているにすぎず、本開示をなんらの様式に限定するものと解釈されるべきでない。いずれかの見出しの下に実例を示した態様は、いずれかの他の見出しの下に実例を示した態様と組み合わせてもよい。
本出願において明示した種々の定量的な値における数値の使用は、そうでないことを明示していない限り、あたかも記載の範囲内の最小値と最大値の両方の前に文言「約」が記載されているかのように近似値として記載している。また、範囲の開示は、記載の最小値と最大値の間のどの値も含む連続範囲ならびにそのような値によって形成されうる任意の範囲を意図している。また、本明細書には、開示された数値を開示された任意の他の数値に分けることにより形成されうる任意のおよび全ての比率(ならびにそのような比率の任意の範囲)も開示されている。したがって、当業者には、多くのそのような比率、範囲および比率の範囲が本明細書に示された数値から明確に誘導でき、あらゆる場合においてそのような比率、範囲および比率の範囲は本開示の種々の態様を表していることが認識されよう。
酵母の改変
酵母は、1つまたは複数の生産物への発酵性炭素源の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むおよび/または発現するように、当技術分野において公知の任意の方法によって改変(例えば、遺伝子操作)されうる。
酵母は、1つまたは複数の生産物への発酵性炭素源の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むおよび/または発現するように、当技術分野において公知の任意の方法によって改変(例えば、遺伝子操作)されうる。
いくつかの態様において、酵母は、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、1-ブタノール、2-ブタノール、メチルエチルケトン、および/またはプロピオン酸メチルなどの共生産物の生産のための経路における中間体への発酵性炭素源の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むおよび/または発現するように、当技術分野において公知の任意の方法によって改変(例えば、遺伝子操作)されうる。そのような酵素は、本明細書において記載される酵素のいずれかを含みうるが、これらに限定されることはない。例えば、酵母は、スクシニル-CoAの1-プロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように改変されうる。
いくつかの態様において、酵母は、嫌気性条件下での発酵性炭素源からの、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、1-ブタノール、2-ブタノール、メチルエチルケトン、および/またはプロピオン酸メチルなどの、生産物の生産のための経路における1つまたは複数の酵素をコードする1つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドを含みうる。
1-プロパノールの生産のための経路
1-プロパノールの生産のための代謝経路は、マロン酸セミアルデヒド、3-ヒドロキシプロピオン酸、1,2-プロパンジオール、2-ケト酪酸(2-kB)、スクシニル-CoA、およびアクリリル-CoAを含むが、これらに限定されない、中間体から1-プロパノールを生産する経路を含む。図1に示されるように、2-kB、スクシニル-CoA、およびアクリリル-CoA中間体はプロピオニル-CoAに収束する。プロピオニル-CoAも1,2-プロパンジオールもともに、二機能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼによりまたはアルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせでアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)の作用によりプロピオンアルデヒドにおよび1-プロパノールに変換される。
1-プロパノールの生産のための代謝経路は、マロン酸セミアルデヒド、3-ヒドロキシプロピオン酸、1,2-プロパンジオール、2-ケト酪酸(2-kB)、スクシニル-CoA、およびアクリリル-CoAを含むが、これらに限定されない、中間体から1-プロパノールを生産する経路を含む。図1に示されるように、2-kB、スクシニル-CoA、およびアクリリル-CoA中間体はプロピオニル-CoAに収束する。プロピオニル-CoAも1,2-プロパンジオールもともに、二機能性アルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼによりまたはアルコールデヒドロゲナーゼとの組み合わせでアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)の作用によりプロピオンアルデヒドにおよび1-プロパノールに変換される。
1つの経路において、1-プロパノールはスクシニル-CoA 経路を介して生産され、それにより糖源が解糖およびクエン酸回路(TCA 回路)を介してスクシニル-CoAに変換され、続いてメチルマロニル-CoAムターゼによるメチルマロニル-CoAへのスクシニル-CoAの異性化、およびメチルマロニル-CoAデカルボキシラーゼによるプロピオニル-CoAへのメチルマロニル-CoAの脱炭酸が行われる。アルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼは、さらなる変換を触媒して、プロピオニル-CoAをプロピオンアルデヒドに、およびプロピオンアルデヒドを1-プロパノールに変換する(例えば、米国特許出願公開第2013/0280775号を参照のこと)。別の経路では、1-プロパノールは1,2-プロパンジオールを介して生産され、それにより糖源は、メチルグリオキサールシンターゼ、アルド-ケトレダクターゼまたはグリオキシル酸レダクターゼおよびアルデヒドレダクターゼによって触媒される複数の変換を受ける。ヒドロラーゼおよびデヒドロゲナーゼは、さらなる変換を触媒して、1,2-プロパンジオールをプロパノールに、およびプロパナールを1-プロパノールに変換する(例えば、米国特許第9,957,530号を参照のこと)。
別の経路において、1-プロパノールは、スレオニンおよび/またはシトラマル酸からの変換を介して2-kB中間体から生産される。例えば、2-kBは、それぞれ2-オキソブタン酸デヒドロゲナーゼまたは2-オキソブタン酸デカルボキシラーゼによってプロピオニル-CoAに変換され、または直接プロピオンアルデヒドに変換されうる(例えば、米国特許出願公開第2014/0377820号を参照のこと)。
他の経路において、1-プロパノールは、アクリリル-CoAレダクターゼによってプロピオニル-CoAに変換されるアクリリル-CoAに収束する、β-アラニン、オキサロ酢酸、乳酸、または3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)中間体から生産される(例えば、米国特許出願公開第2014/0377820号を参照のこと)。上記のように、プロピオニル-CoAは、アルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼによって1-プロパノールに変換されうる。
1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールの生産のための経路
1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールの生産のための代謝経路を図2および図3に示す。アセトンは、解糖、テルペノイド生合成、アトラジン分解およびシアノアミノ酸代謝などの、一次および二次代謝反応を含むが、これらに限定されない、いくつかの経路から生成することができる。1つの経路において、それぞれ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼによりピルビン酸および/またはマロン酸セミアルデヒドからアセチル-CoAを導出することができる。アセチル-CoAは、チオラーゼまたはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼによってアセトアセチル-CoAに変換される(例えば、米国特許出願公開第2018/0179558号を参照のこと)。あるいは、アセトアセチル-CoAは、アセトアセチル-CoAシンターゼによりマロニル-CoAを通じて形成されてもよい。アセトアセチル-CoAが形成されると、アセト酢酸へのその変換は、アセトアセチル-CoAトランスフェラーゼにより、またはHMG-CoAを通じてヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼおよびヒドロキシメチルグルタリル-CoAリアーゼにより行われうる。アセトンへのアセト酢酸の変換は、アセト酢酸デカルボキシラーゼにより行われる。
1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールの生産のための代謝経路を図2および図3に示す。アセトンは、解糖、テルペノイド生合成、アトラジン分解およびシアノアミノ酸代謝などの、一次および二次代謝反応を含むが、これらに限定されない、いくつかの経路から生成することができる。1つの経路において、それぞれ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼによりピルビン酸および/またはマロン酸セミアルデヒドからアセチル-CoAを導出することができる。アセチル-CoAは、チオラーゼまたはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼによってアセトアセチル-CoAに変換される(例えば、米国特許出願公開第2018/0179558号を参照のこと)。あるいは、アセトアセチル-CoAは、アセトアセチル-CoAシンターゼによりマロニル-CoAを通じて形成されてもよい。アセトアセチル-CoAが形成されると、アセト酢酸へのその変換は、アセトアセチル-CoAトランスフェラーゼにより、またはHMG-CoAを通じてヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼおよびヒドロキシメチルグルタリル-CoAリアーゼにより行われうる。アセトンへのアセト酢酸の変換は、アセト酢酸デカルボキシラーゼにより行われる。
別の経路において、2-プロパノールは、前駆物質としてプロパンおよび/またはアセトンから生産される。上記のように、アセトンは、複数の反応によってアセチル-CoAから生成され、イソプロパノールデヒドロゲナーゼによってイソプロパノールに変換される(例えば、米国特許出願公開第2018/0179558号を参照のこと)。別の経路において、酪酸中間体からプロパンが生産され、プロパン2-モノオキシゲナーゼによってイソプロパノールが生成される。大腸菌(Escherichia coli)における酪酸を中間体として有するグルコースからのプロパンの生合成は、Kallio et al. (2014) Nat Commun, 5 (4731)に記載されている。
別の経路において、アルケン(例えば、エテンおよびプロペン)は、米国特許出願公開第2019/0323016号に記載されているように、リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼによりアルコール中間体(例えば、それぞれエタノールおよびプロパノール)から生産される。
別の経路において、酪酸およびブチリル-CoAを前駆物質として有するブタノールデヒドロゲナーゼにより、ブタナールから1-ブタノールが生産される。ブチリル-ACPは脂肪酸生合成(FASII)経路を介して生成され、続けてチオエステラーゼによる酪酸の放出およびマチュラーゼホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの補助を受けたカルボン酸レダクターゼによるブタナールへのその変換が、例えば、Kallio et al. (2014) Nat Commun, 5 (4731)に記載されているように行われる。ブチリル-CoAは、ブチリル-CoAデヒドロゲナーゼの反応によってクロトニル-CoAから生産され、ここでクロトニル-CoAは、例えば、Ferreira et al. (2019) Biotechnol Biofuels 12:230および米国特許第9,567,613号に記載されているように、アセチル-CoAを介してアミノ酸代謝および/または解糖によって生成される。
メチルエチルケトン(ブタノン)および/または2-ブタノールの生産のための経路
別の経路において、図4に示されるように、マロン酸セミアルデヒド(MSA)からメチルエチルケトン(ブタノンとしても公知である)および/または2-ブタノールが生産される。ブタノンおよび/または2-ブタノールの生産のための代謝経路は、マロン酸セミアルデヒド、3-ヒドロキシプロピオン酸(3HP)、3-ヒドロキシプロピオニル-コエンザイムA (3HP-CoA)、アクリリル-CoA、プロピオニル-CoA、アセチル-CoA、3-ケトバレリル-CoA、および3-ケト吉草酸を含むがこれらに限定されない中間体から、ブタノンおよび/または2-ブタノールを生産する経路を含む。
別の経路において、図4に示されるように、マロン酸セミアルデヒド(MSA)からメチルエチルケトン(ブタノンとしても公知である)および/または2-ブタノールが生産される。ブタノンおよび/または2-ブタノールの生産のための代謝経路は、マロン酸セミアルデヒド、3-ヒドロキシプロピオン酸(3HP)、3-ヒドロキシプロピオニル-コエンザイムA (3HP-CoA)、アクリリル-CoA、プロピオニル-CoA、アセチル-CoA、3-ケトバレリル-CoA、および3-ケト吉草酸を含むがこれらに限定されない中間体から、ブタノンおよび/または2-ブタノールを生産する経路を含む。
いくつかの局面において、改変された酵母は、以下を含む: (a) マロン酸セミアルデヒドからのアセチル-CoAの生産を触媒する1つまたは複数のポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子; (b) マロン酸セミアルデヒドからの3-ヒドロキシプロピオン酸の生産を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子; (c) 3-ヒドロキシプロピオン酸からのプロピオニル-CoAの生産を触媒する1つまたは複数のポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子; ならびに(d) プロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAからの2-ブタノンの生産を触媒する1つまたは複数のポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子。
いくつかの局面において、マロン酸セミアルデヒドは、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼによりアセチル-CoAに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表1に記載されているものなどの、EC番号1.2.1.18またはEC番号1.2.1.27を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1または複数のマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの局面において、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(bauC)は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来である。いくつかの局面において、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(Ald6)は、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)由来である。いくつかの局面において、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(iolA)は、リステリア・モノサイトゲネス(Lysteria monocytogenes)由来である。いくつかの局面において、マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(dddC)は、ハロモナス種(Halomonas sp.) HTNK1由来である。
（表１）アセチル-CoAへのマロン酸セミアルデヒドの変換の候補
いくつかの局面において、マロン酸セミアルデヒドは、(i) マロニル-CoAレダクターゼおよび/または2-ケト酸デカルボキシラーゼ、ならびに(ii) マロニル-CoAデカルボキシラーゼの連続反応によりアセチル-CoAに変換することができる。いくつかの局面において、マロニル-CoAレダクターゼおよび/または2-ケト酸デカルボキシラーゼは、マロン酸セミアルデヒドのマロニル-CoAへの変換を触媒する。いくつかの局面において、マロニル-CoAデカルボキシラーゼは、マロニル-CoAからのアセチル-CoAの生産を触媒する。いくつかの局面において、改変された酵母は、表2に記載されているものなどの、EC番号1.1.1.298を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のマロニル-CoAレダクターゼおよび/または2-ケト酸デカルボキシラーゼを含む。いくつかの局面において、改変された酵母は、表2に記載されているものなどの、EC番号4.1.1.9を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のマロニル-CoAデカルボキシラーゼを含む。いくつかの局面において、マロニル-CoAレダクターゼ(mcr)は、クロロフレクサス・アウランティアクス(Chloroflexus aurantiacus)由来である。いくつかの局面において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ(kivD)は、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)由来である。いくつかの局面において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ(kdcA)は、ラクトコッカス・ラクティス由来である。いくつかの局面において、2-ケト酸デカルボキシラーゼ(ARO10)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、マロニル-CoAデカルボキシラーゼ(MatA)は、リゾビウム・トリフォリィ(Rhizobium trifolii)由来である。いくつかの局面において、マロニル-CoAデカルボキシラーゼ(MLYCD)は、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)由来である。
（表２）マロニル-CoA中間体を介したアセチル-CoAへのマロン酸セミアルデヒドの変換の候補
いくつかの局面において、マロン酸セミアルデヒドは、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼにより3HPに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表3に記載されているものなどの、EC番号1.1.1.298またはEC番号1.1.1.381を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼを含む。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ(ydfg)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ(mcr-1)は、クロロフレクサス・アウランティアクス由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ(Ydf1)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ(Hpd1)は、カンジダ・アルビカンス由来である。
（表３）3-ヒドロキシプロピオン酸へのマロン酸セミアルデヒドの変換の候補
いくつかの局面において、3HPは、(i) 3-ヒドロキシプロピオニル-CoAトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAリガーゼ、または3-ヒドロキシプロピオニル-CoAシンターゼ; (ii) 3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ; および(iii) アクリリル-CoAレダクターゼの連続反応によりプロピオニル-CoAに変換することができる。
いくつかの局面において、改変された酵母は、表4に記載されているものなどの、EC番号2.8.3.1、EC番号6.2.1.17、またはEC番号6.2.1.36を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の3-ヒドロキシプロピオニル-CoAトランスフェラーゼ、3-ヒドロキシプロピオニル-CoA リガーゼ、および/または3-ヒドロキシプロピオニル-CoAシンターゼを含む。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAトランスフェラーゼ(pct)は、カプリアビダス・ネカトール(Cupriavidus necator)、クロストリジウム・プロピオニクム(Clostridium propionicum)、またはメガスフェラ・エルスデニイ(Megasphaera elsdenii)由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAリガーゼ(prpE)は、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)または大腸菌由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAリガーゼ(Nmar_1309)は、ニトロソプミルス・マリティムス(Nitrosopumilus maritimus)由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAシンターゼ(Msed_1456)は、メタロスパエラ・セデュラ(Metallosphaera sedula)由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAシンターゼ(Stk_07830)は、スルホロブス・トコダイイ(Sulfolobus tokodaii)由来である。
いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAトランスフェラーゼは、アセチル-CoAから3-ヒドロキシプロピオン酸にコエンザイム-Aを転移させ、酢酸を生成させる。このコエンザイムは、酢酸が酢酸キナーゼにより酢酸-Pに変換され、酢酸-Pがリン酸アセチルトランスフェラーゼによりアセチル-CoAに変換される2つの連続した反応によって再利用される。酢酸キナーゼおよびリン酸アセチルトランスフェラーゼは、それぞれEC番号2.7.2.1およびEC番号2.3.1.8を有する酵素を含むが、これらに限定されることはない。いくつかの局面において、酢酸キナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)または大腸菌由来である。いくつかの局面において、酢酸キナーゼは、大腸菌(ackA)由来である。いくつかの局面において、リン酸アセチルトランスフェラーゼは、大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミカム由来である。いくつかの局面において、リン酸アセチルトランスフェラーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム(pta)由来である。いくつかの局面において、リン酸アセチルトランスフェラーゼはコリネバクテリウム・グルタミカム由来であり、酢酸キナーゼは大腸菌由来である。
いくつかの局面において、改変された酵母は、表4に記載されているものなどの、EC番号4.2.1.116、EC番号4.2.1.55、EC番号4.2.1.150、またはEC番号4.2.1.17を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼを含む。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(hpcd)は、メタロスパエラ・セデュラ、バチルス種(Bacillus sp.)、またはスポラナエロバクター・アセチゲネス(Sporanaerobacter acetigenes)由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼは、ルエゲリア・ポメロイ(Ruegeria pomeroyi)由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(St1516)は、スルホロブス・トコダイイ由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(Nmar_1308)は、ニトロソプミルス・マリティムス由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(Hpcd)は、クロロフレクサス・アウランティアクス由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(Crt)は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)またはクロストリジウム・パステウラナム(Clostridium pasteuranum)由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼは、クロストリジウム・パステウラヌム(Clostridium pasteuranum)由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(Mels_1449)は、メガスフェラ・エルスデニイ由来である。いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(Aflv_0566)は、アノキシバチルス・フラビサーマス(Anoxybacillus flavithermus)由来である。
いくつかの局面において、改変された酵母は、表4に記載されているものなどの、EC番号1.3.1.84またはEC番号1.3.1.95を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のアクリリル-CoAレダクターゼを含む。いくつかの局面において、アクリリル-CoAレダクターゼ(acuI)は、ルエゲリア・ポメロイ、大腸菌、またはロドバクタ―・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)由来である。いくつかの局面において、アクリリル-CoAレダクターゼ(pcdh)は、クロストリジウム・プロピオニクム由来である。いくつかの局面において、アクリリル-CoAレダクターゼ(acuI)は、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)由来である。いくつかの局面において、アクリリル-CoAレダクターゼ(Acr)は、スルホロブス・トコダイイ由来である。いくつかの局面において、アクリリル-CoAレダクターゼ(acuI)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アクリリル-CoAレダクターゼ(Acr)は、メタロスパエラ・セドゥラ(Metallosphaera sedula)由来である。いくつかの局面において、アクリリル-CoAレダクターゼ(Nmar_1565)は、ニトロソプミルス・マリティムス由来である。
いくつかの局面において、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAトランスフェラーゼ(pct)は、クロストリジウム・プロピオニクム由来であり、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ(hpcd)は、スポラナエロバクター・アセチゲネスおよび/またはメタロスパエラ・セデュラ由来であり、アクリリル-CoAリダクターゼ(acr)は、ルエゲリア・ポメロイ由来である。
（表４）プロピオニル-CoAへの3-ヒドロキシプロピオン酸の変換の候補
いくつかの局面において、3HPは、三機能性プロピオニル-CoAシンターゼ(PCS)によってプロピオニル-CoAに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表5に記載されているものなどの、EC番号6.2.1.17を有する酵素を含むが、これに限定されない、1つまたは複数のプロピオニル-CoAシンターゼを含む。いくつかの局面において、プロピオニル-CoAシンターゼ(pcs)は、クロロフレクサス・アウランティアクス、クロロフレクサス・アグレガンス(Chloroflexus aggregans)、ロゼイフレクサス・キャステンホルツィイ(Roseiflexus castenholzii)、ナトロノコッカス・オキュルタゥス(Natronococcus occultus)、ハリオグロブス・ジャポニクス(Halioglobus japonicus)、またはエリスロバクター種(Erythrobacter sp.) NAP1由来である。
（表５）プロピオニル-CoAへの3-ヒドロキシプロピオン酸の変換の候補
いくつかの局面において、改変された酵母は、以下を含む: (i) プロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAからの3-ケトバレリル-CoAの生産を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子; (ii) 3-ケトバレリル-CoAからの3-オキソ吉草酸の生産を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子; ならびに(iii) 3-オキソ吉草酸からの2-ブタノンの生産を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子。
いくつかの局面において、プロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAを一緒に、β-ケトチオラーゼまたはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼによって3-ケトバレリル-CoAに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表6に記載されているものなどの、EC番号2.3.1.16またはEC番号2.3.1.9を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のβ-ケトチオラーゼまたはアセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼを含む。いくつかの局面において、β-ケトチオラーゼ(phaA)は、アシネトバクター種(Acinetobacter sp.) RA384由来である。いくつかの局面において、β-ケトチオラーゼ(BktB)は、カプリビアダス・ネカトール(Cupriviadus necator)由来である。いくつかの局面において、β-ケトチオラーゼ(BktC)は、カプリビアダス・ネカトール由来である。いくつかの局面において、β-ケトチオラーゼ(BktB)は、カプリアビダス・タイワネンシス(Cupriavidus taiwanensis)由来である。いくつかの局面において、β-ケトチオラーゼ(POT1)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(phaA)は、カプリアビダス・ネカトール由来である。いくつかの局面において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(thlA)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(thlB)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(phaA)は、ズーグロエア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)由来である。いくつかの局面において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(atoB)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(ERG10)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。
（表６）3-ケトバレリル-CoAへのプロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAの変換の候補
いくつかの局面において、3-ケトバレリル-CoAは、3-ケトバレリル-CoAトランスフェラーゼまたは3-ケトバレリル-CoAヒドロラーゼにより3-ケト吉草酸(3-オキソ吉草酸としても公知である)に変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表7に記載されているものなどの、EC番号2.8.3.5、EC番号2.8.3.8、またはEC番号2.8.3.9を有する酵素を含むが、これらに限定されない、スクシニル-CoA:3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ、酢酸-CoAトランスフェラーゼ、酪酸-アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ、およびアセトアセチル-CoA:アセチル-CoAトランスフェラーゼから選択される1つまたは複数の3-ケトバレリル-CoAトランスフェラーゼまたは3-ケトバレリル-CoAヒドロラーゼを含む。いくつかの局面において、スクシニル-CoA:3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ(ScoA)は、枯草菌(Bacillus subtilis)由来である。いくつかの局面において、スクシニル-CoA:3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ(ScoB)は、枯草菌由来である。いくつかの局面において、酢酸-CoAトランスフェラーゼ(atoA)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、酢酸-CoAトランスフェラーゼ(atoD)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、酪酸-アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ(ctfA)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、酪酸-アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ(ctfB)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、酪酸-アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ(ctfA)は、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)由来である。いくつかの局面において、酪酸-アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ(ctfB)は、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム由来である。いくつかの局面において、アセトアセチル-CoA:アセチル-CoAトランスフェラーゼ(ctfA)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アセトアセチル-CoA:アセチル-CoAトランスフェラーゼ(ctfB)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、酢酸CoA-トランスフェラーゼ(ydiF)は、大腸菌由来である。
いくつかの局面において、トランスフェラーゼは3-ケトバレリル-CoAから酢酸にコエンザイム-Aを転移させ、アセチル-CoAを生成させる。酢酸は、アセチル-CoAがリン酸アセチルトランスフェラーゼによりアセチル-Pに変換され、アセチル-Pが酢酸キナーゼにより酢酸に変換される2つの連続した反応によって再利用される。酢酸キナーゼおよびリン酸アセチルトランスフェラーゼは、それぞれEC番号2.7.2.1およびEC番号2.3.1.8を有する酵素を含むが、これらに限定されることはない。いくつかの局面において、酢酸キナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカムまたは大腸菌由来である。いくつかの局面において、酢酸キナーゼは、大腸菌(ackA)由来である。いくつかの局面において、リン酸アセチルトランスフェラーゼは、大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミカム由来である。いくつかの局面において、リン酸アセチルトランスフェラーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム(pta)由来である。いくつかの局面において、リン酸アセチルトランスフェラーゼはコリネバクテリウム・グルタミカム由来であり、酢酸キナーゼは大腸菌由来である。
（表７）3-ケト吉草酸(3-オキソ吉草酸)への3-ケトバレリル-CoAの変換の候補
いくつかの局面において、アセト酢酸と構造的に類似している3-ケト吉草酸(3-オキソ吉草酸としても公知である)は、アセト酢酸デカルボキシラーゼによりブタノンに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表8に記載されているものなどの、EC番号4.1.1.4を有する酵素を含むが、これに限定されない、1つまたは複数のアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を含む。いくつかの局面において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(adc)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(adc)は、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム由来である。いくつかの局面において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(adc)は、クロストリジウム・ベイジェリンキィ(Clostridium beijerinkii)由来である。いくつかの局面において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(adc)は、クロストリジウム・パステウラナム由来である。いくつかの局面において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(adc)は、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来である。
（表８）ブタノンへの3-ケト吉草酸(3-オキソ吉草酸)の変換の候補
いくつかの局面において、プロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAをブタノンに変換するために用いられる酵素は、(i) カプリアビダス・ネカトール由来のβ-ケトチオラーゼ(BktB)および/またはアシネトバクター種由来のβ-ケトチオラーゼ(phaA)、(ii) 大腸菌由来のCoAトランスフェラーゼ(atoAD)および/またはクロストリジウム・アセトブチリカム由来のCoAトランスフェラーゼ(ctfAB)、ならびに(iii) クロストリジウム・アセトブチリカムまたはシュードモナス・プチダ由来の酢酸デカルボキシラーゼ(adc)である。好都合には、いくつかの局面において、酵素は、アセトンなどの望ましくない副産物の有意なレベルの形成なしにプロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAをブタノンに変換し、それによって収率の望ましくない減少を回避する。
いくつかの局面において、改変された酵母は、以下を含む: (i) プロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAからの2-メチルアセトアセチル-CoAの生産を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子; (ii) 2-メチルアセトアセチル-CoAからの2-メチルアセト酢酸の生産を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子; および(iii) 2-メチルアセト酢酸からの2-ブタノンの生産を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸分子。
いくつかの局面において、プロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAを一緒に、2-メチルアセトアセチル-CoAチオラーゼによって2-メチルアセトアセチル-CoAに変換することができる。いくつかの局面において、2-メチルアセトアセチル-CoAは、CoAヒドロラーゼまたはCoA-トランスフェラーゼによって2-メチルアセト酢酸に変換することができる。いくつかの局面において、CoAヒドロラーゼは、アセチル-CoAヒドロラーゼである。いくつかの局面において、CoA-トランスフェラーゼは、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼまたはスクシニル-CoA:3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼである。いくつかの局面において、改変された酵母は、表9に記載されているものなどの、EC番号2.3.1.9、EC番号2.8.3.5、またはEC番号3.1.2.1を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のCoAヒドロラーゼまたはCoA-トランスフェラーゼを含む。いくつかの局面において、アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(Act1)は、ホモ・サピエンス由来である。いくつかの局面において、スクシニル-CoA:3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ(ScoA)は、枯草菌由来である。いくつかの局面において、スクシニル-CoA:3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ(ScoB)は、枯草菌由来である。いくつかの局面において、アセチル-CoAヒドロラーゼ(Ach1)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。
いくつかの局面において、2-メチルアセト酢酸は、2-メチルアセト酢酸デカルボキシラーゼによってブタノンに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表9に記載されているものなどの、EC番号4.1.1.5を有する酵素を含むが、これに限定されない、1つまたは複数の2-メチルアセト酢酸デカルボキシラーゼを含む。いくつかの局面において、2-メチルアセト酢酸デカルボキシラーゼは、A-アセト乳酸デカルボキシラーゼである。いくつかの局面において、A-アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALDC)は、アセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)由来である。いくつかの局面において、A-アセト乳酸デカルボキシラーゼ(Aldc)は、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)由来である。いくつかの局面において、A-アセト乳酸デカルボキシラーゼ(budA)は、ラオウルテラ・テリゲナ(Rauoltella terrigena)由来である。
（表９）ブタノンへのプロピオニル-CoAおよびアセチル-CoAの変換の候補
いくつかの局面において、ブタノンは、アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ)またはMEKレダクターゼによって2-ブタノールに変換することができる。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼは、NAD依存性である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼは、NADP依存性である。
いくつかの局面において、改変された酵母は、表10に記載されているものなどの、EC番号1.1.1.1、EC番号1.1.1.2、EC番号1.1.1.80、またはEC番号1.1.1.-を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のアルコールデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの局面において、NAD依存性酵素は、EC番号1.1.1.1として公知である。いくつかの局面において、NADP依存性酵素は、EC番号1.1.1.2として公知である。いくつかの局面において、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ(sadh)は、ロドコッカス・ルバー(Rhodococcus ruber)由来である。いくつかの局面において、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ(adhA)は、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furious)由来である。いくつかの局面において、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ(adh)は、クロストリジウム・ベイジェリンキィ(Clostridium beijerinckii)由来である。いくつかの局面において、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ(adh)は、サーモアナエロバクター・ブロッキィ(Thermoanaerobacter brockii)由来である。いくつかの局面において、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ(yqhD)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、2-ブタノールデヒドロゲナーゼ(chnA)は、アシネトバクター種由来である。
（表１０）2-ブタノールへのブタノンの変換の候補
プロピオン酸メチルの生産のための経路
別の経路において、プロピオン酸メチルは、EC番号1.14.13.-を有する酵素を含むが、これに限定されない、ベイヤー・ビリガー(Baeyer-Villiger)モノオキシゲナーゼによってブタノンから生産される。1つの態様において、ベイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼは、アシネトバクター・カルコアセティクス(Acinetobacter calcoaceticus)、ロドコッカス・ジョスティ(Rhodococcus jostii)、および/またはザントバクター・フラバス(Xanthobacter flavus)由来である。
別の経路において、プロピオン酸メチルは、EC番号1.14.13.-を有する酵素を含むが、これに限定されない、ベイヤー・ビリガー(Baeyer-Villiger)モノオキシゲナーゼによってブタノンから生産される。1つの態様において、ベイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼは、アシネトバクター・カルコアセティクス(Acinetobacter calcoaceticus)、ロドコッカス・ジョスティ(Rhodococcus jostii)、および/またはザントバクター・フラバス(Xanthobacter flavus)由来である。
1-プロパノールおよびブタノンの同時生産のための経路
別の経路において、1-プロパノールおよびブタノンは、図5に示されるように、マロン酸セミアルデヒド(MSA)から同時生産される。1-プロパノールとブタノンとの同時生産のための代謝経路は、マロン酸セミアルデヒド、3-ヒドロキシプロピオン酸(3HP)、3-ヒドロキシプロピオニル-コエンザイムA (3HP-CoA)、アクリリル-CoA、プロピオニル-CoA、アセチル-CoA、3-ケトバレリル-CoA、および3-ケト吉草酸を含むが、これらに限定されない、中間体から1-プロパノールおよびブタノンを生産する経路を含む。本明細書において論じられるブタノンの生産のための経路において、生産されたプロピオニル-CoAの一部分はブタノンを生産するために用いられ、一部分は1-プロパノールを生産するために用いられる。
別の経路において、1-プロパノールおよびブタノンは、図5に示されるように、マロン酸セミアルデヒド(MSA)から同時生産される。1-プロパノールとブタノンとの同時生産のための代謝経路は、マロン酸セミアルデヒド、3-ヒドロキシプロピオン酸(3HP)、3-ヒドロキシプロピオニル-コエンザイムA (3HP-CoA)、アクリリル-CoA、プロピオニル-CoA、アセチル-CoA、3-ケトバレリル-CoA、および3-ケト吉草酸を含むが、これらに限定されない、中間体から1-プロパノールおよびブタノンを生産する経路を含む。本明細書において論じられるブタノンの生産のための経路において、生産されたプロピオニル-CoAの一部分はブタノンを生産するために用いられ、一部分は1-プロパノールを生産するために用いられる。
いくつかの局面において、プロピオニル-CoAは、二機能性アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼによって1-プロパノールに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表11に記載されているものなどの、EC番号1.1.1.1、EC番号1.2.1.4、またはEC番号1.2.1.5を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の二機能性アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhe)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhe)は、クロストリジウム・ベイジェリンキィ由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhe)は、クロストリジウム・チフィムリウム(Clostridium typhimurium)由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhe)は、クロストリジウム・アルブスティ(Clostridium arbusti)由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhE)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhP)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(bdhB)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(Adh2)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhE)は、クロストリジウム・ロゼウム(Clostridium roseum)由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(adhA)は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(Ald6)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、アルコール/アルデヒドデヒドロゲナーゼ(Aldh3A1)は、ホモ・サピエンス由来である。
（表１１）1-プロパノールへのプロピオニル-CoAの直接変換の候補
いくつかの局面において、プロピオニル-CoAは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)およびアルコールデヒドロゲナーゼの連続反応により1-プロパノールに変換することができる。いくつかの局面において、改変された酵母は、表12に記載されているものなどの、EC番号1.2.1.10を有する酵素を含むが、これに限定されない、1つまたは複数のアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)を含む。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (mhpf)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (Mhpf)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (Mhpf)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (mhpf)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (Pdup)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (pdup)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (Pdup)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (aldH)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (ald)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、改変された酵母は、表12に記載されているものなどの、EC番号1.1.1.2またはEC番号1.2.1.87を有する酵素を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のアルコールデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(alrA)は、アシネトバクター種由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(bdhI)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(bdhII)は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(adhA)は、クロストリジウム・グルタミカム(Clostridium glutamicum)由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(yqhD)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(adhP)は、大腸菌由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(PduQ)は、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシィ(Propionibacterium freudenreichii)由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH1)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH2)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH4)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH6)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(PduQ)は、サルモネラ・エンテリカ由来である。いくつかの局面において、アルコールデヒドロゲナーゼ(Adh)は、スルホロブス・トコダイイ由来である。いくつかの局面において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化) (PduP)は、サルモネラ・エンテリカ由来であり、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH1)は、サッカロマイセス・セレビシエ由来である。
（表１２）プロピオンアルデヒドへのプロピオニル-CoAの変換の候補および1-プロパノールへのプロピオンアルデヒドの変換の候補
好都合には、ブタノンおよび1-プロパノールの同時生産経路は酸化還元中性かつATPプラスであり、その結果、所望の化合物のより効率的かつ高収率の生産をもたらす。さらに、バランスのとれた経路は、嫌気性条件下で実施される可能性があり、これは好気性プロセスと比較した場合に同じ収率でいくつかの発酵プロセスの利点を提供する: 嫌気性発酵槽は好気性発酵と比較してコストを低減し、空気圧縮機は高価でコスト上昇を意味し、嫌気性プロセスでは大型発酵槽が可能であるため、同じ生産物生産能力で好気性プロセスと比較して必要な発酵槽数が少なくなる。
いくつかの局面において、ブタノンの生産において改変された酵母によって生産される過剰なNAD(P)Hの少なくとも一部分は、1-プロパノールの生産においてNAD(P)Hを供給するために利用される。理論によって束縛されることを望むわけではないが、ブタノンおよび1-プロパノールの酸化還元バランスのとれた同時生産は、望ましくない副産物を有意なレベルで形成することなく、嫌気性条件下での発酵を容易にし、それによって所望の生産物の収量減少を回避するものと考えられている。
いくつかの局面において、ブタノンおよび1-プロパノールの同時生産は、工業用エタノール生産酵母株において実行される。いくつかの局面において、工業用エタノール生産酵母株は、エタノールを生産し続けながら炭素源の一部分をブタノンおよび1-プロパノールの生産に転用して嫌気性発酵条件下でブタノンおよび1-プロパノールを同時生産するように操作される。いくつかの局面において、工業用エタノール生産酵母株は、工業用エタノール酵母としての性能と頑健性を実質的に全て保持しているため、既存の工業用エタノール生産活動へのその使用および成功裏の導入を可能にする。
改変された酵母
本明細書において提供される改変された酵母は、以下を含みうる:
- 発酵性炭素源のスクシニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の1,2-プロパンジオールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の乳酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のβ-アラニンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のスレオニンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のシトラマル酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- スクシニル-CoAのメチルマロニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- スレオニンの2-ケト酪酸(2-kB)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- シトラマル酸の2-ケト酪酸(2-kB)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- β-アラニンのマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- マロン酸セミアルデヒドの3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 乳酸のアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- β-アラニンのアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 3-HPのアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- メチルマロニル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 2-kBのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アクリリル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- プロピオニル-CoAのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 1,2-プロパンジオールのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、および/または
- プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド。
本明細書において提供される改変された酵母は、以下を含みうる:
- 発酵性炭素源のスクシニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の1,2-プロパンジオールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の乳酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のβ-アラニンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のスレオニンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のシトラマル酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- スクシニル-CoAのメチルマロニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- スレオニンの2-ケト酪酸(2-kB)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- シトラマル酸の2-ケト酪酸(2-kB)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- β-アラニンのマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- マロン酸セミアルデヒドの3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 乳酸のアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- β-アラニンのアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 3-HPのアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- メチルマロニル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 2-kBのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アクリリル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- プロピオニル-CoAのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 1,2-プロパンジオールのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、および/または
- プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド。
本明細書において提供される改変された微生物は、以下を含みうる:
- 発酵性炭素源のピルビン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のマロン酸セミアルデヒド(MSA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- ピルビン酸のアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- MSAのアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド;
- アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセチル-CoAのマロニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- マロニル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセトアセチル-CoAのヒドロキシメチルグルタリル-CoA (HMG-CoA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- HMG-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセトンの2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の酪酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 酪酸のプロパンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- プロパンの2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 2-プロパノールのプロペンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のブチリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 酪酸のブタナールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- ブチリル-CoAのブタナールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、および/または
- ブタナールの1-ブタノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド。
- 発酵性炭素源のピルビン酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のマロン酸セミアルデヒド(MSA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- ピルビン酸のアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- MSAのアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド;
- アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセチル-CoAのマロニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- マロニル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセトアセチル-CoAのヒドロキシメチルグルタリル-CoA (HMG-CoA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- HMG-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- アセトンの2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の酪酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 酪酸のプロパンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- プロパンの2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源の2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 2-プロパノールのプロペンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 発酵性炭素源のブチリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- 酪酸のブタナールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、
- ブチリル-CoAのブタナールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド、および/または
- ブタナールの1-ブタノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド。
いくつかの態様において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)である。
いくつかの態様において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエであり、工業用エタノール生産株酵母、すなわち、既存の工業用エタノール発酵プロセスおよびアセットにおいて既に使用されている酵母株であり、そのような工業用酵母は、エタノールの生産に対して適切かつ際立った堅牢性および発酵性能を有する。
いくつかの態様において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエであり、既存の工業用エタノール発酵プロセスおよびアセットにおいて既に使用されている工業用エタノール生産株酵母であり、そのようなプロセスおよびアセットは、原材料としてサトウキビ、サトウダイコンまたはトウモロコシに基づく。
いくつかの態様において、酵母はサッカロマイセス・セレビシエであり、既存のトウモロコシに基づくエタノール発酵プロセスおよびアセットに由来するか、または既存のトウモロコシに基づくエタノール発酵プロセスおよびアセットにおいて工業的に使用されている工業用エタノール生産株酵母である。
いくつかの態様において、酵母は、例えば、生産された分子(例えば、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、1-ブタノール、2-ブタノール、メチルエチルケトン、および/もしくはプロピオン酸メチル)、ならびに/または有機溶媒への耐性を含む1つまたは複数の耐性機構を含むようにさらに改変される。そのような耐性機構を含むように改変された酵母は、発酵の力価を増加させる手段を提供することが可能であり、および/または工業規模のプロセスにおいて混入を制御することが可能である。
宿主細胞は、本明細書において開示される1つもしくは複数の酵素の産生のための上記の発現ベクターもしくはクローニングベクターで、または本明細書において開示される1つもしくは複数の酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養される。
開示された酵素をコードする所望の核酸配列を含む宿主細胞は、種々の培地中で培養されうる。Ham's F10 (Sigma)、最少必須培地((MEM), Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM), Sigma)などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58: 44, (1979); Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980); 米国特許第4,767,704号; 同第4,657,866号; 同第4,927,762号; 同第4,560,655号; もしくは同第5,122,469号; WO 90/103430; WO 87/00195; または米国再発行特許第30,985号に記載されている培地のいずれかを宿主細胞の培地として使用してもよい。これらの培地のいずれかに必要に応じて、ホルモンおよび/または他の成長因子(インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子などの)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩などの)、緩衝液(HEPESなどの)、ヌクレオチド(アデノシンおよびチミジンなどの)、抗生物質(ゲンタマイシン(GENTAMYCIN)(商標)薬などの)、微量元素(通常マイクロモル範囲の終濃度で存在する無機化合物と定義される)、ならびにグルコースまたは等価のエネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要な補充物を、当業者に公知であると考えられる適切な濃度で含めてもよい。温度、pHなどのような、培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
エタノールおよび共生産物の同時生産のための方法
エタノールおよび1つまたは複数の共生産物は、本明細書において提供される遺伝子改変された酵母のいずれかを発酵性炭素源と接触させることによって生産されうる。そのような方法は、好ましくは、発酵性炭素源を、共生産物の生産における中間体のいずれかへの発酵性炭素源の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドおよび発酵培地中での共生産物への1つまたは複数の中間体の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む酵母と接触させる段階; ならびに共生産物の生産における1つまたは複数の中間体への発酵性炭素源の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドおよび共生産物への1つまたは複数の中間体の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現させる段階を含みうる。
エタノールおよび1つまたは複数の共生産物は、本明細書において提供される遺伝子改変された酵母のいずれかを発酵性炭素源と接触させることによって生産されうる。そのような方法は、好ましくは、発酵性炭素源を、共生産物の生産における中間体のいずれかへの発酵性炭素源の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドおよび発酵培地中での共生産物への1つまたは複数の中間体の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む酵母と接触させる段階; ならびに共生産物の生産における1つまたは複数の中間体への発酵性炭素源の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドおよび共生産物への1つまたは複数の中間体の変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現させる段階を含みうる。
本開示の発酵生産物は、工業用サトウキビ、サトウダイコン、またはより好ましくは、トウモロコシエタノール生産のための従来のプロセスによって調製されうる。そのようなプロセスにおいて、グルコースおよびデキストロースまたは別の適切な炭素源は、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、米、およびそれらの混合物などの穀物を含むデンプンに基づく原材料の糖化を通じて再生可能な穀物源から導出することができる。適切な炭素源は、グルコース、フルクトース、およびスクロース、またはこれらとキシロースおよび/もしくはアラビノースなどのC5糖との混合物も含むが、これらに限定されることはない。炭素源は、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、およびそれらの混合物などの再生可能な糖源から導出されてもよい。
発酵培地は、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝液、ならびに培養物の増殖および維持に適した他の成分をさらに含有してもよい。
トウモロコシエタノール生産などの発酵プロセスは、通常、酵母の増殖段階および発酵段階の2段階で実施される。酵母の増殖段階には、酵母の質量が発酵段階に適した量に増加する。通常、増殖段階は連続シードタンクにおいて実施される。塩、栄養素および炭素源(例えば、加水分解コーンマッシュ、サトウキビ糖蜜または任意の他の低コスト炭素源)を含有する適切な培地を、活性乾燥酵母(ADY)、酵母スラリーまたは圧搾酵母と接触させる。好ましくは、酵母の増殖は好気性条件下で行われるが、しかし嫌気性条件下でも行うことができる。適切な酵母濃度に達したら、材料を発酵タンクに移して発酵段階を開始する。発酵段階では、炭素源は、エタノールなどの主産物および酵母本来の代謝に由来する他の副産物に変換される。トウモロコシエタノール生産の発酵段階では、乾式粉砕プロセスまたは湿式粉砕プロセスで粉砕されたトウモロコシから調製されたマッシュが使用される。湿式粉砕プロセスでは、トウモロコシをさまざまな成分に分画することを伴い、デンプン画分のみが発酵プロセスに投入される。乾式粉砕プロセスでは、トウモロコシ穀粒を粉砕してミールにし、ミールを水および酵素と混合することを伴う。一般に、異なる2種類の乾式粉砕プロセスが使用される。一般的に使用されるプロセス(「従来のプロセス」)では、デンプン含有材料を粉砕し、その後、通常は細菌α-アミラーゼを使用して、高温で糊化デンプンを液化し、その後に同時糖化発酵(SSF)を行うことを伴う。「生デンプン加水分解」プロセス(RSHプロセス)といわれることが多い、別の周知のプロセスには、デンプン含有材料を粉砕し、その後、通常は酸菌α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下、初期糊化温度未満で粒状デンプンを同時に糖化および発酵させることが含まれる(例えば、米国特許第8,962,286号を参照のこと)。
さまざまな態様において、発酵は約15℃から約60℃の範囲、好ましくは28℃から約35℃の範囲の温度で行われる。さまざまな態様において、発酵のpH範囲は、pH 2.0からpH 9.0である。場合によっては、初期pH条件はpH 6.0からpH 8.0である。発酵は、好気性または嫌気性条件下で実施することができる。トウモロコシエタノール発酵は、通常、嫌気性または微好気性条件下で行われる。いくつかの態様において、発酵中に空気を供給することができる。
適切な発酵実行時間は、約36時間から約72時間などの、約24時間から約96時間の範囲である。発酵実行時間は、増殖段階から移される酵母の量ならびにマッシュ調製中およびSSFプロセスまたはRSHプロセス中のデンプン酵素の量に基づいて異なるであろう。炭素源が使い果たされたら、発酵したマッシュを下流プロセス(DPS)に移して、生産されたエタノールおよび他の付加費用の副産物(例えば、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣(DDGS))を精製する。
本開示の方法および組成物は、従来の発酵バイオリアクタ(例えば、バッチ、流加回分、細胞リサイクル、および連続発酵)に適合させることができる。
いくつかの態様において、本明細書で提供される酵母(例えば、遺伝子改変された酵母)は、発酵産物の発酵培地への排出をもたらす液体発酵培地(すなわち、液内培養)で培養される。1つの態様において、発酵最終産物は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を用いて発酵培地から単離することができる。
いくつかの態様において、発酵産物の形成は、酵母の初期の急速な増殖期間中に行われる。1つの態様において、発酵産物の形成は、培養物が、増殖の遅い状態または非増殖状態に維持される第2の期間中に行われる。1つの態様において、発酵産物の形成は、酵母の2つ以上の増殖期間中に行われる。そのような態様において、単位時間当たりに形成される発酵産物の量は、一般に、酵母の代謝活性、生理学的培養条件(例えば、pH、温度、培地組成)、および発酵プロセスに存在する酵母の量の関数である。
エタノールおよび関心対象の共生産物は、多くの分離および精製の方法が当技術分野において公知であり、以下の開示が限定するものであると意図されないことを考慮に入れて、以下の段落に記載されているアプローチにより分離および精製されうる。
エタノールおよび低沸点分子を含む発酵ブロスの一般的な処理については、さまざまな方法を実践して、バイオマスを除去し、ならびに/または培養ブロスおよびその成分からエタノールおよび低沸点分子を分離することが可能である。糖に基づく原材料ストリームは、本明細書において開示されるように、発酵槽内でエタノールおよび関心対象の他の共生産物に変換される。本開示の1つの態様において、エタノールおよび1つまたは複数の低沸点共生産物が生産され、これらの生産物は気相(オフガス)および液相(ブロス)の両方で得られる。オフガス中の生産物は吸収カラムまたは他の洗浄装置中に回収されて、エタノールおよび低沸点揮発性共生産物の損失を最小限に抑える。オフガスから回収された生産物およびブロスを含むこのストリームは、さらなる処理のために混合することができる。あるいは、遠心分離、デカンティング、ろ過、またはそれらの組み合わせを含む、固形物除去段階を実施してもよく、ブロス中に存在する固形粒子のサイズに応じて操作ユニットシステムを実施してもよい。任意で、フラッシュユニット、もしくは蒸留ユニットもしくは吸収ユニット、またはそれらの組み合わせを含む、不凝縮ガス除去を適合させてもよい。続いて、混合物は、1 つまたは複数の蒸留塔を含む蒸留塔システムに直接進むことができるが、低沸点分子の性質に応じて、システムは、抽出蒸留、共沸蒸留、フラッシュ、吸着および吸収またはそれらの組み合わせを含む1つまたは複数の追加操作ユニットをさらに含むことができる。これらの段階の最後に、特定の用途に必要な仕様でエタノールおよび揮発性生産物が得られる。
エタノールおよび高沸点分子を含む発酵ブロスの一般的な処理に関して、さまざまな方法を実践して、バイオマスを除去し、ならびに/または培養ブロスおよびその成分からエタノールおよび高沸点分子を分離することが可能である。1つまたは複数の高沸点共生産物からエタノールを単離するプロセスは、揮発性物質(特にエタノール)を除去するための蒸留により行われ、その後に結晶化、溶媒抽出、クロマトグラフィー分離、吸着、ろ過、塩分解(salt splitting)、沈降、酸性化、イオン交換、蒸発、またはそれらの組み合わせから選択されるプロセスを行って、精製された高沸点分子をもたらす。
発酵生産物を遠心分離ユニットに供して、細胞および不溶性内容物を沈降させる。液体の上清相には、水、エタノールおよび可溶性共生産物が含有されている。続いて、蒸留を適用して揮発性生産物(特にエタノール)を蒸気として分離し、一方で高沸点の共生産物および塩が液体の水相に残る。液相を含有するストリームは、結晶化、クロマトグラフ分離、溶媒抽出、吸着、塩分解、沈降、ろ過(限外ろ過、ナノろ過および/もしくは精密ろ過)、酸性化、イオン交換、または他のプロセスならびにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、可能なプロセスの1つまたは複数を伴うプロセスにおける塩の分離に至る。溶液中で高沸点生産物を含有するストリームは、他の共生産物または水に関連する相対揮発性に応じて、単蒸留塔でまたは1段階蒸発によってもしくは多段階蒸発段階によって濃縮されうる。例えば、高沸点生産物を水に分散させると、生産物は塔下部に集まり、水は塔上部で除去される。高沸点共生産物が水と共沸混合物を形成する場合、一連の抽出ユニットまたは分子ふるいが必要とされうる。回収された生産物は、乾燥機で仕上げて湿度を下げ、さらなる保管のための安定性を高めることが可能である。
別の態様において、炭素源からのバイオマス(例えば未発酵穀物残渣)も発酵ブロスの一部である。発酵生産物を蒸留プロセスに供して、揮発性生産物(特にエタノール)を蒸気として分離し、一方で高沸点共生産物、細胞残屑、炭素源からの醸造穀粒および塩は液相に残る。液相中の生産物を遠心分離ユニットに供して、細胞残屑、醸造穀粒の不溶性部分および他の不溶性成分を沈降させる。遠心分離プロセスの上清相は、結晶化、クロマトグラフ分離、溶媒抽出、吸着、塩分解、沈降、ろ過(限外ろ過、ナノろ過および/もしくは精密ろ過)、酸性化、イオン交換、または他のプロセスならびにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、可能なプロセスの1つまたは複数を伴うプロセスにおける塩および醸造穀粒の可能性部分の、高沸点分子からの分離に至る。醸造穀粒の可溶性部分と不溶性部分の両方を含有するストリームを組み合わせ、蒸発器ユニットおよび/または乾燥機に供して、湿度を下げ、可溶性部分を有する乾燥醸造穀粒(DDGS)を構成させることが可能である。溶液中で高沸点生産物を含有するストリームは、他の共生産物または水に関連する相対揮発性に応じて、単蒸留塔でまたは1段階蒸発によってもしくは多段階蒸発段階によって濃縮されうる。
実施例1: 1-プロパノールの生産のための、エタノール生産酵母の改変
酵母は、例えばグルコースを含む発酵性炭素源から1-プロパノールを生産するように遺伝子改変される。
酵母は、例えばグルコースを含む発酵性炭素源から1-プロパノールを生産するように遺伝子改変される。
例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のスクシニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) スクシニル-CoAのメチルマロニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) メチルマロニル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) プロピオニル-CoAのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(v) プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源の1,2-プロパンジオールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) 1,2-プロパンジオールのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(iii) プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のスレオニンまたはシトラマル酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) スレオニンまたはシトラマル酸の2-ケト酪酸(2-kB)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) 2-kBのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) プロピオニル-CoAのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(v) プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源の乳酸またはβ-アラニンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) 乳酸またはβ-アラニンのアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) アクリリル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) プロピオニル-CoAのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(v) プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のβ-アラニンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) β-アラニンのマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) マロン酸セミアルデヒドの3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) 3-HPのアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (v) アクリリル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (vi) プロピオニル-CoAのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(vii) プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のオキサロ酢酸マロン酸セミアルデヒド(oxaloacetate malonate semialdehyde)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) オキサロ酢酸のマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) マロン酸セミアルデヒドの3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) 3-HPのアクリリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (v) アクリリル-CoAのプロピオニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (vi) プロピオニル-CoAのプロピオンアルデヒドへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(vii) プロピオンアルデヒドの1-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
あるいは、発酵性炭素源の1-プロパノールへの変換のための1つまたは複数の酵素(例えば、触媒的に活性である1つまたは複数の機能酵素)を欠く酵母は、発酵性炭素源の1-プロパノールへの変換を触媒することを欠く経路における酵素(例えば、本明細書において開示される任意の酵素を含む機能酵素)をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変される。
実施例2: アセトン、2-プロパノール、プロペンおよび/または1-ブタノールの生産のための、エタノール生産酵母の改変
例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のピルビン酸またはマロン酸セミアルデヒド(MSA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) ピルビン酸またはMSAのアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) アセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(v) アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のピルビン酸またはマロン酸セミアルデヒド(MSA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) ピルビン酸またはMSAのアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) アセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(v) アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のピルビン酸またはマロン酸セミアルデヒド(MSA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) ピルビン酸またはMSAのアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) アセチル-CoAのマロニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) マロニル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (v) アセトアセチル-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(vi) アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のピルビン酸またはマロン酸セミアルデヒド(MSA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) ピルビン酸またはMSAのアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) アセチル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) アセトアセチル-CoAのヒドロキシメチルグルタリル-CoA (HMG-CoA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (v) HMG-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(vi) アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のピルビン酸またはマロン酸セミアルデヒド(MSA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) ピルビン酸またはMSAのアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iii) アセチル-CoAのマロニル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (iv) マロニル-CoAのアセトアセチル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (v) アセトアセチル-CoAのヒドロキシメチルグルタリル-CoA (HMG-CoA)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (vi) HMG-CoAのアセト酢酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(vii) アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源のアセトンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(ii) アセトンのイソプロパノール(2-プロパノール)への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源の酪酸への変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) 酪酸のプロパンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(iii) プロパンの2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源の2-プロパノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(ii) 2-プロパノールのプロペンへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
別の例示的な方法において、酵母は、以下を含むように当技術分野において公知の任意の方法によって遺伝子操作される: (i) 発酵性炭素源の酪酸またはブチリル-CoAへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; (ii) 酪酸またはブチリル-CoAのブタナールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド; および(iii) ブタナールの1-ブタノールへの変換を触媒する経路における酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド。
あるいは、発酵性炭素源のアセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールへの変換のための1つまたは複数の酵素(例えば、触媒的に活性である1つまたは複数の機能酵素)を欠く酵母は、発酵性炭素源のアセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールへの変換を触媒することを欠く経路における酵素(例えば、本明細書において開示される任意の酵素を含む機能酵素)をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変される。
実施例3: 1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールを生産するための、遺伝子改変されたエタノール生産酵母によるグルコースの発酵
上記実施例1または実施例2において生産された遺伝子改変酵母を用いて炭素源を発酵させ、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールを生産する。
上記実施例1または実施例2において生産された遺伝子改変酵母を用いて炭素源を発酵させ、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノール、プロペン、および/または1-ブタノールを生産する。
例示的な方法において、発酵性炭素源(例えば、9 g/Lグルコース、1 g/L KH2PO4、2 g/L (NH4)2HPO4、5 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MgSO4・7H2O、2.5 mg/L MnSO4・H2O、10 mg/L CaCl2・6H2O、10 mg/L CoCl2・6H2O、および10 g/L酵母抽出物)を含む事前に滅菌した培養液をバイオリアクタ内に充填する。
発酵中、嫌気性条件は、例えば、培養液を通して窒素をスパージングすることによって維持される。発酵に適した温度(例えば、約30℃)は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて維持される。ほぼ生理学的なpH (例えば、約6.5)は、例えば、水酸化ナトリウムの自動添加によって維持される。バイオリアクタを、例えば、約50 rpmで撹拌する。完了するまで発酵させる。
実施例4: エタノールおよび低沸点共生産物を生産するための、遺伝子改変されたエタノール生産酵母によるグルコースの発酵
上記実施例1または実施例2において生産された遺伝子改変酵母を用いて炭素源を発酵させ、エタノールならびに1-プロパノール、2-プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、エタン、およびプロペンなどの1つまたは複数の低沸点共生産物を生産する。
上記実施例1または実施例2において生産された遺伝子改変酵母を用いて炭素源を発酵させ、エタノールならびに1-プロパノール、2-プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、エタン、およびプロペンなどの1つまたは複数の低沸点共生産物を生産する。
例示的な方法において、発酵性炭素源(例えば、9 g/Lグルコース、1 g/L KH2PO4、2 g/L (NH4)2HPO4、5 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MgSO4・7H2O、2.5 mg/L MnSO4・H2O、10 mg/L CaCl2・6H2O、10 mg/L CoCl2・6H2O、および10 g/L酵母抽出物)を含む事前に滅菌した培養液をバイオリアクタ内に充填する。
発酵中、使用される場合、嫌気性条件は、例えば、培養液を通して窒素をスパージングすることによって維持される。発酵に適した温度(例えば、約30℃)は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて維持される。ほぼ生理学的なpH (例えば、約6.5)は、例えば、水酸化ナトリウムの自動添加によって維持される。バイオリアクタを、例えば、約50 rpmで撹拌する。完了するまで発酵させる。
実施例5: エタノールおよび高沸点共生産物を生産するための、遺伝子改変されたエタノール生産酵母によるグルコースの発酵
上記実施例1または実施例2において生産された遺伝子改変酵母を用いて炭素源を発酵させ、エタノールならびにモノエチレングリコール、n-ブタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、アジピン酸、ジエタノールアミン、および1,3-プロパンジオールなどの1つまたは複数の高沸点共生産物を生産する。
上記実施例1または実施例2において生産された遺伝子改変酵母を用いて炭素源を発酵させ、エタノールならびにモノエチレングリコール、n-ブタノール、3-ヒドロキシプロピオン酸、アジピン酸、ジエタノールアミン、および1,3-プロパンジオールなどの1つまたは複数の高沸点共生産物を生産する。
例示的な方法において、発酵性炭素源(例えば、9 g/Lグルコース、1 g/L KH2PO4、2 g/L (NH4)2HPO4、5 mg/L FeSO4・7H2O、10 mg/L MgSO4・7H2O、2.5 mg/L MnSO4・H2O、10 mg/L CaCl2・6H2O、10 mg/L CoCl2・6H2O、および10 g/L酵母抽出物)を含む事前に滅菌した培養液をバイオリアクタ内に充填する。
発酵中、使用される場合、嫌気性条件は、例えば、培養液を通して窒素をスパージングすることによって維持される。発酵に適した温度(例えば、約30℃)は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて維持される。ほぼ生理学的なpH (例えば、約6.5)は、例えば、水酸化ナトリウムの自動添加によって維持される。バイオリアクタを、例えば、約50 rpmで撹拌する。完了するまで発酵させる。
実施例6: 酵母に及ぼす高濃度C3およびC4アルコールの影響
サッカロマイセス・セレビシエにおいて、エタノールと比較してn-プロパノール(すなわち、1-プロパノール)、2-プロパノール、および2-ブタノールの負の影響を理解するために、アルコール耐性実験を行った。糖-エタノール発酵中で生産される天然生産物(またはネイティブ生産物)であるエタノールは一般に、S.セレビシエなどの酵母によって良好な耐容性が示される。しかしながら、遺伝子改変された酵母を用いることにより非天然化学物質、例えばC3、C4、もしくはC5アルコール、ケトン、有機酸、または他の非天然生産物(例えば、エタノール以外のアルコール)を生産する既存のアプローチは、通常、エタノールと比較して、酵母の細胞増殖および/または性能に対してそのような非天然化学物質またはアルコール(例えば、n-プロパノールおよび2-プロパノール)の高い毒性によって負の影響を受ける。
サッカロマイセス・セレビシエにおいて、エタノールと比較してn-プロパノール(すなわち、1-プロパノール)、2-プロパノール、および2-ブタノールの負の影響を理解するために、アルコール耐性実験を行った。糖-エタノール発酵中で生産される天然生産物(またはネイティブ生産物)であるエタノールは一般に、S.セレビシエなどの酵母によって良好な耐容性が示される。しかしながら、遺伝子改変された酵母を用いることにより非天然化学物質、例えばC3、C4、もしくはC5アルコール、ケトン、有機酸、または他の非天然生産物(例えば、エタノール以外のアルコール)を生産する既存のアプローチは、通常、エタノールと比較して、酵母の細胞増殖および/または性能に対してそのような非天然化学物質またはアルコール(例えば、n-プロパノールおよび2-プロパノール)の高い毒性によって負の影響を受ける。
いくつかの濃度のn-プロパノール、2-プロパノール、2-ブタノールおよびエタノールを酵母培養物において試験した。実験は、工業用エタノール生産酵母株PE-2を用い、40g/Lグルコースを有するYNB培地50 mLを含む250 mL振とうフラスコ中32℃で行った。培養を初期OD600nm=12 (OD = 光学密度)で8～9時間行った。適切な間隔でサンプルを採取し、HPLCにより分析して、グルコース、エタノール、n-プロパノール、2-プロパノールおよび2-ブタノールを測定した。実験は、表13のパラメータに従い二つ組で実施した。糖の消費が見られない条件は致死濃度とみなし、分析から除外した。
（表１３）実験デザイン - C2、C3およびC4アルコールに対する酵母耐性
さまざまな濃度のアルコールについて、グルコース消費阻害の割合を評価した。植菌2時間後にサンプルを試験した。この時点で、グルコースは完全に消費されていなかった。線形回帰曲線を図6に示し、結果を表14に提供する。
（表１４）アルコール濃度に対する糖消費阻害依存性
図6に見られるように、S.セレビシエにおいて非天然であるn-プロパノール、2-プロパノールおよび2-ブタノールは、S.セレビシエに負の影響を与え、その影響は高濃度でいっそう高い。表14に示されるように、2-ブタノールはエタノールよりも2.94倍大きい阻害を示した。一方、2-プロパノールはエタノールよりも1.45倍大きい阻害を示した。N-プロパノールは2-プロパノールと2-ブタノールの中間の効果を示し、エタノールよりも2.16倍大きい阻害を有していた。これらの結果は、n-プロパノール、2-プロパノールおよび2-ブタノールのような非天然生産物がいかにサッカロマイセス・セレビシエなどの酵母に及ぼす負の影響を促進し、糖消費プロファイル、およびそれゆえ生産性などのエタノール発酵性能の局面を損ないうるかを実証している。
実施例7: エタノールを主成分とし、1-プロパノールおよび 2-プロパノールが非毒性濃度で同時生産される、工業用エタノール酵母発酵性能のシミュレーション
共生産物、または酵母において非天然の生産物がエタノールとともに生産される、酵母糖-エタノール発酵に及ぼす影響を研究するために実験室でのシミュレーションを行った。2つの条件を試験した: i) 条件1、ここでは工業用エタノール生産酵母が、培養液中に添加した糖からエタノールを生産し、同時に期待される最終エタノール力価に達するようにエタノールを外因的に追加添加した; およびii) 条件2、ここでは同じ工業用エタノール生産酵母が、培養液中に添加した糖からエタノールを生産し、条件1と同じ生産物の最終力価濃度に達するようにn-プロパノールおよび2-プロパノールの濃縮溶液(50/50重量%)を培養液に外因的に添加した。実験は、最終容量として0.7 Lを有する1 Lバイオリアクタを用いて実施した。NaOH 25% w/wの添加、温度32℃および300 rpmの撹拌によりpHを4.5に制御した。使用した工業用エタノール生産酵母株はPE-2であり、初期ピッチは0.7 g/L DWCとし、培養液は、アミノ酸を含まないYNBであった。最終糖濃度は224 g/Lグルコースであった。実験は無菌条件下で実施した。
共生産物、または酵母において非天然の生産物がエタノールとともに生産される、酵母糖-エタノール発酵に及ぼす影響を研究するために実験室でのシミュレーションを行った。2つの条件を試験した: i) 条件1、ここでは工業用エタノール生産酵母が、培養液中に添加した糖からエタノールを生産し、同時に期待される最終エタノール力価に達するようにエタノールを外因的に追加添加した; およびii) 条件2、ここでは同じ工業用エタノール生産酵母が、培養液中に添加した糖からエタノールを生産し、条件1と同じ生産物の最終力価濃度に達するようにn-プロパノールおよび2-プロパノールの濃縮溶液(50/50重量%)を培養液に外因的に添加した。実験は、最終容量として0.7 Lを有する1 Lバイオリアクタを用いて実施した。NaOH 25% w/wの添加、温度32℃および300 rpmの撹拌によりpHを4.5に制御した。使用した工業用エタノール生産酵母株はPE-2であり、初期ピッチは0.7 g/L DWCとし、培養液は、アミノ酸を含まないYNBであった。最終糖濃度は224 g/Lグルコースであった。実験は無菌条件下で実施した。
バイオリアクタを最初に 650 ml の YNB 培地と糖で満たし、pH と温度を安定させた後、酵母を植菌した50 mLの懸濁液をバイオリアクタの中に添加した。次に、条件1の場合には160 g/Lの濃縮エタノール溶液130 mLを添加し、条件2の場合には177 g/Lの濃縮n-プロパノールおよび2-プロパノール溶液130 mLを添加した。各溶液は次のプロファイルに従った: 植菌から10時間は、0.2 mL/分; 11時間から15時間は、0.4 mL/分; 16時間から40時間は、0.6 mL/分; および41時間から46時間は、0.2 mL/分。このプロファイルは、PE-2 酵母のエタノール生産プロファイルをシミュレートするために追加された。発酵は、70時間の発酵運転で終了した。エタノール、1-プロパノール、2-プロパノールおよびグルコースを測定するために、適切な間隔でサンプルを採取した。結果を表15および図7に提示する。
（表１５）アルコールを添加したエタノール-酵母発酵
表15に示されるように、エタノール収量および容量生産性の酵母発酵パラメータは、試験した両方の条件で同様であった。換言すれば、エタノールのみに曝露された酵母培養物の酵母エタノール発酵プロファイル(条件1)は、n-プロパノールおよび2-プロパノールの混合物に曝露されたもの(条件2)と同様であった。条件1と比較して、条件2 (ここでは発酵中の最終アルコール総量の16.5%がC3アルコール、つまりn-プロパノールおよび2-プロパノールの組み合わせであった)の下では、エタノール収量および容量生産性に及ぼす影響が最小限または全くないことが観察された。さらに、図7に示されるように、糖消費およびエタノール生産は、両方の試験条件で同様である。これらの結果は、試験濃度のn-プロパノールおよび2-プロパノールがエタノール発酵中、エタノール発酵収量および容量生産性によって評価される通り、酵母発酵性能を損なうことを回避することを実証している。
実施例8: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに3-ヒドロキシプロピオン酸を同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに3-ヒドロキシプロピオン酸を同時生産するように遺伝子改変された。サッカロマイセス・セレビシエは本来、グルコースから3-ヒドロキシプロピオン酸を生産することができない。それゆえ、3-ヒドロキシプロピオン酸生産性の代謝経路および標的酵素が、サッカロマイセス・セレビシエ酵母(W303株)中で異種発現された。さらに、酵母株は、野生型ピルビン酸キナーゼ(PYK1)の欠失と、より弱いプロモーター(pNUP57およびpMET25ΔF)を用いて下方制御されたPYK1酵素の発現によってPYK1酵素の半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御することによりピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように改変された。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに3-ヒドロキシプロピオン酸を同時生産するように遺伝子改変された。サッカロマイセス・セレビシエは本来、グルコースから3-ヒドロキシプロピオン酸を生産することができない。それゆえ、3-ヒドロキシプロピオン酸生産性の代謝経路および標的酵素が、サッカロマイセス・セレビシエ酵母(W303株)中で異種発現された。さらに、酵母株は、野生型ピルビン酸キナーゼ(PYK1)の欠失と、より弱いプロモーター(pNUP57およびpMET25ΔF)を用いて下方制御されたPYK1酵素の発現によってPYK1酵素の半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御することによりピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように改変された。
表16に示されるように、組換え酵母株YS_001およびYS_002には、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム(T. castaneum)由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ(L. kluyveri)由来PYD4 (PYD4.Lk)、および大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)を含めて、3-ヒドロキシプロピオン酸経路生産性遺伝子がゲノムに組み込まれていた。さらに、これらの菌株は、炭素流をPEPからオキサロ酢酸(OAA)に切り替えるために過剰発現された大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を有する。全ての3-ヒドロキシプロピオン酸生合成経路遺伝子は、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化された。
エタノール発酵試験は、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施された。撹拌は振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmであった。3-ヒドロキシプロピオン酸、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な分析方法および機器を使用して48時間の発酵後に測定したが、その結果を表16に示す。
（表１６）グルコースからの嫌気性エタノール発酵中の、主成分としてのエタノールとの3-ヒドロキシプロピオン酸の同時生産
組換え酵母株YS_001は、PYK1発現のためにやや強いプロモーター(pMET25ΔF)を使用し、主成分としてのエタノールまたは副産物としての3-ヒドロキシプロピオン酸のいずれかへのグルコースからの糖の比率を非毒性量で適切に制御することを可能にし、所望の糖-エタノール発酵プロファイルをもたらした。YS_001は、グルコースからエタノールまたは3-ヒドロキシプロピオン酸のいずれかへ炭素流を切り替え、そして、エタノールと非天然3-ヒドロキシプロピオン酸との生産のために異種遺伝子を導入する遺伝子改変にもかかわらず、供給した全てのグルコースを消費することが可能であって、61の最終OD600に達する非常に良好な細胞増殖を示した。YS_001組換え酵母株は、29 g/Lの高濃度でのエタノールと4.7 g/Lの3-ヒドロキシプロピオン酸とを同時生産することが可能であった。まとめると、表16中の結果は、3-ヒドロキシプロピオン酸を低いかつ非毒性の濃度で生産しながらエタノール性能を保持するように生成物の比率が制御された糖-エタノール発酵の間に、3-ヒドロキシプロピオン酸が主成分としてのエタノールと同時生産されたことを示す。
本明細書において提示された結果は、組換え酵母株W303を用いて実証されたものであるが、工業用サトウキビ-エタノール発酵プロセスおよびトウモロコシ-エタノール発酵プロセスにおいて広く用いられているPE-2、CAT-1、BG-1、およびEthanol Red酵母株などの工業用酵母を含む他のサッカロマイセス・セレビシエ酵母株も使用することができる。
実施例9: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに1-プロパノールを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに1-プロパノールを同時生産するように遺伝子改変された。サッカロマイセス・セレビシエは本来、分岐鎖アミノ酸代謝に関わるエールリッヒ経路を介して残存量の1-プロパノールしか生産することができない。1-プロパノール生産性の生合成代謝経路および標的酵素がW303酵母株において異種発現された。さらに、酵母株は、野生型ピルビン酸キナーゼ(PYK1)の欠失と、pNUP57などの弱いプロモーターを用いて下方制御されたPYK1酵素の発現によってPYK1酵素の半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御することによりピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように改変された。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに1-プロパノールを同時生産するように遺伝子改変された。サッカロマイセス・セレビシエは本来、分岐鎖アミノ酸代謝に関わるエールリッヒ経路を介して残存量の1-プロパノールしか生産することができない。1-プロパノール生産性の生合成代謝経路および標的酵素がW303酵母株において異種発現された。さらに、酵母株は、野生型ピルビン酸キナーゼ(PYK1)の欠失と、pNUP57などの弱いプロモーターを用いて下方制御されたPYK1酵素の発現によってPYK1酵素の半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御することによりピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように改変された。
表17に示されるように、組換え酵母株YS_003およびYS_004には、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)、C.アルビカンス由来HPD1 (HPD1.Ca)、C.プロピオニクム由来PCT (PCT.Cp)、R.ポメロイ由来HPCDおよびACR (HPCD.RpおよびACR.Rp)、ならびにS.エンテリカ由来PDUP (PDUP.Sen)を含めて、1-プロパノール経路生産性遺伝子がさまざまなコピーでゲノムに組み込まれていた。全ての1-プロパノール生合成経路遺伝子は、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化されており、構築された組換え酵母株は、PEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替えるために大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)が過剰発現されていた。YS_003およびYS_004は、MSAの3-ヒドロキシプロピオン酸への変換に関与する異なる3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ候補(3HPDH)を有していた。YS_003はNADPH依存性3HPDH酵素(YDFG.Ec)が、その一方でYS_004はNADH依存性3HPDH酵素(HPD1.Cal)が過剰発現されていた。
エタノール発酵試験は、フィルタ付き1 mLピペットチップ2本を突き刺したシリコンキャップで塞いだ125 mL発酵フラスコ内で40 g/Lのグルコースを含む25 mLのリッチ培地の存在下で実施された。さらに40 g/Lのグルコースを増殖24時間後に添加した。撹拌は振とう直径50 mmのインキュベータにて180 rpmであった。1-プロパノール、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な分析方法および機器(GC/MS-MS)を使用して48時間の発酵後に測定したが、その結果を表17に示す。
（表１７）グルコースからのエタノール発酵中の、主成分としてのエタノールとの1-プロパノールの同時生産
YS_003およびYS_004組換え酵母株は、1-プロパノールを生産し、グルコースからの炭素流を切り替える遺伝子改変にもかかわらず、供給した全てのグルコースを消費することが可能であって、それぞれ43および59の最終OD600に達する比較的良好な細胞増殖を示した。YS_003およびYS_004組換え酵母株は、エタノール発酵中に、グルコース供給量80 g/Lに応じて28～30 g/Lの高い力価で主成分としてエタノールを生産しながら、それぞれ0.71 g/Lおよび1.13 g/Lの1-プロパノールを生産することができた。理論によって束縛されることを望むわけではないが、YS_004の1-プロパノール生産の増加は、アスパラギン酸デカルボキシラーゼのいっそう高いコピー数およびNADH依存性3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ酵素の過剰発現によるものと考えられる。
本明細書において提示された結果は、組換え酵母株W303を用いて実証されたものであるが、工業用サトウキビ-エタノール発酵プロセスおよびトウモロコシ-エタノール発酵プロセスにおいて広く用いられているPE-2、CAT-1、BG-1、およびEthanol Red酵母株などの工業用酵母を含む他のサッカロマイセス・セレビシエ酵母株も使用することができる。
実施例10: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともにアセトンを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにアセトンを同時生産するように遺伝子改変された。アセトン生産性の代謝経路および標的酵素が、W303酵母株中で異種発現された。表18に示されるように、組換え酵母株YS_006およびYS_007は、YS_005に由来し、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、緑膿菌由来およびC.アルビカンス由来MSD (MSD.PAまたはMSD.Cal)、S.セレビシエ由来ERG10 (ERG10.Sc)、大腸菌由来ATOAD (ATOA.ECおよびATOD.Ec)、C.アセトブチリカム由来ADC (ADC.Ca)、C.グルタミカム由来PTA (PTA.Cg)、ならびに大腸菌由来ACK (ACK.Ec)を含めて、アセトン経路生産性遺伝子がゲノムに組み込まれていた。全てのアセトン生合成経路遺伝子は、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化されており、構築された組換え酵母株は、PEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替えるために大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)が過剰発現されていた。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにアセトンを同時生産するように遺伝子改変された。アセトン生産性の代謝経路および標的酵素が、W303酵母株中で異種発現された。表18に示されるように、組換え酵母株YS_006およびYS_007は、YS_005に由来し、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、緑膿菌由来およびC.アルビカンス由来MSD (MSD.PAまたはMSD.Cal)、S.セレビシエ由来ERG10 (ERG10.Sc)、大腸菌由来ATOAD (ATOA.ECおよびATOD.Ec)、C.アセトブチリカム由来ADC (ADC.Ca)、C.グルタミカム由来PTA (PTA.Cg)、ならびに大腸菌由来ACK (ACK.Ec)を含めて、アセトン経路生産性遺伝子がゲノムに組み込まれていた。全てのアセトン生合成経路遺伝子は、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化されており、構築された組換え酵母株は、PEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替えるために大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)が過剰発現されていた。
エタノール発酵試験は、フィルタ付きピペットチップ2本を挿入したシリコンキャップを有する125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのリッチ培地の存在下で実施された。撹拌は振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで維持した。アセトン、エタノールおよびグルコースを、標準的な分析方法および機器(GC/MS-MSヘッドスペース)を使用して48時間の発酵後に測定した。親株YS_005はアセトンの生合成に関わる異種遺伝子および関連酵素を欠くため、発酵アッセイではYS_005株を陰性対照として使用した。
（表１８）グルコースからのエタノール発酵中の、主成分としてのエタノールとのアセトンの同時生産
YS_006およびYS_007組換え酵母株は、炭素流をグルコースからエタノールへ切り替え、また、エタノールとのアセトンの生産のために異種遺伝子を導入する遺伝子改変にもかかわらず、供給した全てのグルコースを消費することが可能であって、65超の最終OD600に達する良好な細胞増殖を示した。YS_006およびYS_007組換え酵母株は、アセトンを生合成できないYS_005株によって生産される量に極めて近い、約35 g/Lのエタノールという高い力価に達することによりエタノール性能を維持しながらも、それぞれ、0.7 g/Lおよび1.0 g/Lのアセトンを生産することができた。この結果からまた、理論によって束縛されることを望むわけではないが、MSAへのβ-アラニンの変換および主要なアセトン前駆物質であるアセチル-CoAへのMSAの変換を促進すると考えられる、PAND.TcaおよびMSD.Paの追加コピーを含むYS_007株において予想されたアセトン生産の増大が実証された。
本明細書において提示された結果は、組換え酵母株W303を用いて実証されたものであるが、工業用サトウキビ-エタノール発酵プロセスおよびトウモロコシ-エタノール発酵プロセスにおいて広く用いられているPE-2、CAT-1、BG-1、およびEthanol Red酵母株などの工業用酵母を含む他のサッカロマイセス・セレビシエ酵母株も使用することができる。
実施例11: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに2-プロパノールを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに2-プロパノールを同時生産するように遺伝子改変された。2-プロパノール生産性の代謝経路および標的酵素が、W303酵母株中で異種発現された。表19に示されるように、組換え酵母株YS_008は、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、緑膿菌由来およびC.アルビカンス由来MSD (MSD.PAまたはMSD.Cal)、S.セレビシエ由来ERG10 (ERG10.Sc)、大腸菌由来ATOAD (ATOA.ECおよびATOD.Ec)、P.ポリミキサ(P. polymyxa)由来ADC (ADC.Pp)、C.グルタミカム由来PTA (PTA.Cg)、大腸菌由来ACK (ACK.Ec)、ならびにC.ベイジェリンキィ由来IPDH1 (IPDH1.Cbe)を含めて、2-プロパノール経路生産性遺伝子がゲノムに組み込まれていた。全ての2-プロパノール生合成経路遺伝子は、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化されており、構築された組換え酵母株は、PEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を同様に切り替えるために大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)が過剰発現されていた。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに2-プロパノールを同時生産するように遺伝子改変された。2-プロパノール生産性の代謝経路および標的酵素が、W303酵母株中で異種発現された。表19に示されるように、組換え酵母株YS_008は、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、緑膿菌由来およびC.アルビカンス由来MSD (MSD.PAまたはMSD.Cal)、S.セレビシエ由来ERG10 (ERG10.Sc)、大腸菌由来ATOAD (ATOA.ECおよびATOD.Ec)、P.ポリミキサ(P. polymyxa)由来ADC (ADC.Pp)、C.グルタミカム由来PTA (PTA.Cg)、大腸菌由来ACK (ACK.Ec)、ならびにC.ベイジェリンキィ由来IPDH1 (IPDH1.Cbe)を含めて、2-プロパノール経路生産性遺伝子がゲノムに組み込まれていた。全ての2-プロパノール生合成経路遺伝子は、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化されており、構築された組換え酵母株は、PEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を同様に切り替えるために大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)が過剰発現されていた。
エタノール発酵試験は、フィルタ付きピペットチップ2本を挿入したシリコンキャップを有する125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのリッチ培地の存在下で実施された。撹拌は振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで維持した。2-プロパノール、エタノールおよびグルコースを、標準的な分析方法および機器(GC/MS-MS)を使用して48時間の発酵後に測定した。
（表１９）グルコースからのエタノール発酵中の、主成分としてのエタノールとの2-プロパノールの同時生産
YS_008組換え酵母は、炭素流をグルコースからエタノールへ切り替え、そして、エタノールと2-プロパノールとの生産のために異種遺伝子を導入する遺伝子改変にもかかわらず、100の最終OD600に達することができた。YS_008組換え酵母は、1.42 g/Lの2-プロパノールおよび39 g/Lのエタノールを生産し、供給したグルコースg/Lに基づいて良好なエタノール性能を維持することができた。
本明細書において提示された結果は、組換え酵母株W303を用いて実証されたものであるが、工業用サトウキビ-エタノール発酵プロセスおよびトウモロコシ-エタノール発酵プロセスにおいて広く用いられているPE-2、CAT-1、BG-1、およびEthanol Red酵母株などの工業用酵母を含む他のサッカロマイセス・セレビシエ酵母株も使用することができる。
実施例12: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに1-プロパノールおよび2-プロパノールの両方を同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに1-プロパノールおよび2-プロパノールを同時生産するように遺伝子改変された。1-プロパノールおよび2-プロパノール生産性の代謝経路および標的酵素が、W303酵母株中で異種発現された。さらに、酵母株は、野生型ピルビン酸キナーゼ(PYK1)の欠失と、pNUP57などの弱いプロモーターを用いて下方制御されたPYK1酵素の発現によってPYK1酵素の半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御することによりピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように改変された。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株は、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに1-プロパノールおよび2-プロパノールを同時生産するように遺伝子改変された。1-プロパノールおよび2-プロパノール生産性の代謝経路および標的酵素が、W303酵母株中で異種発現された。さらに、酵母株は、野生型ピルビン酸キナーゼ(PYK1)の欠失と、pNUP57などの弱いプロモーターを用いて下方制御されたPYK1酵素の発現によってPYK1酵素の半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御することによりピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように改変された。
表20に示されるように、組換え酵母株YS_009は、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)、S.セレビシエ由来YDF1 (YDF1.Sc)、C.プロピオニクム由来PCT (PCT.Cp)、R.ポメロイ由来HPCDおよびACR (HPCD.RpおよびACR.Rp)、S.エンテリカ由来PDUP (PDUP.Sen)、緑膿菌由来およびC.アルビカンス由来MSD (MSD.PaまたはMSS.Ca)、S.セレビシエ由来ERG10 (ERG10.Sc)、大腸菌由来ATOAD (ATOA.EcおよびATOD.Ec)、P.ポリミキサ由来ADC (ADC.Pp)、C.グルタミカム由来PTA (PTA.Cg)、大腸菌由来ACK (ACK.Ec)ならびにC.ベイジェリンキィ由来IPDH1 (IPDH1.Cbe)を含めて、1-プロパノール経路および2-プロパノール経路生産性遺伝子がゲノムに組み込まれていた。さらに、YS_009は、PEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替えるために大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)が過剰発現されていた。全ての1-プロパノールおよび2-プロパノール生合成経路遺伝子は、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化された。
（表２０）グルコースからのエタノール発酵中の、主成分としてのエタノールとの1-プロパノールおよび2-プロパノールの同時生産
約250 g/Lのグルコースを供給した0.2 L YPD培地の存在下において0.7 Lバイオリアクタ内でYS_009組換え酵母株をアッセイした。発酵のごく冒頭に、0.125 vvmの通気で撹拌を500 rpmに維持した。GC-MS/FIDを用いてエタノール、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノールおよびグルコースを測定し、その結果を表21に示す。
（表２１）グルコースからのエタノール発酵中の主成分としてのエタノールとの1-プロパノールおよび2-プロパノールの同時生産。
YS_009組換え酵母は、供給したグルコースのほとんどを消費することができ、発酵40時間の時点で150のOD600に達し高い細胞密度を示した。YS_009組換え酵母は、56時間の発酵時間で101 g/Lの高力価のエタノールとともに1.5 g/Lの1-プロパノールおよび2-プロパノールを生産することができた。さらに、グルコースからの炭素源の大部分はエタノールに転換され、炭素源のごく一部は無毒な終濃度で1-プロパノールおよび2-プロパノールに変換された。グリセロールは、56時間の発酵時間で最終力価1.4 g/Lで測定された。
本明細書において提示された結果は、組換え酵母株W303を用いて実証されたものであるが、工業用サトウキビ-エタノール発酵プロセスおよびトウモロコシ-エタノール発酵プロセスにおいて広く用いられているPE-2、CAT-1、BG-1、およびEthanol Red酵母株などの工業用酵母を含む他のサッカロマイセス・セレビシエ酵母株も使用することができる。
実施例13: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともにアクリル酸を同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにアクリル酸を同時生産するように遺伝子改変する。3-ヒドロキシプロピオン酸を経由するアクリル酸生合成代謝経路および標的酵素を実験用酵母株W303中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにアクリル酸を同時生産するように遺伝子改変する。3-ヒドロキシプロピオン酸を経由するアクリル酸生合成代謝経路および標的酵素を実験用酵母株W303中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
組換え酵母株には、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)、C.アルビカンス由来HPD1 (HPD1.Ca)、C.プロピオニクム由来PCT (PCT.Cp)、R.ポメロイ由来HPCD (HPCD.Rp)、および大腸菌由来アシル-CoAヒドロラーゼYciA (YciA.Ec)を含めて、アクリル酸生産経路遺伝子をゲノムに組み込む。全てのアクリル酸生合成経路遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。
これらの組換え酵母株はまた、大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を過剰発現させてPEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替え、任意で、さまざまな強度のプロモーター、好ましくは弱いプロモーターを用い、PYK1酵素を下方制御させて、PYK1酵素半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御してもよい。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。アクリル酸、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。アクリル酸は、エタノールを主成分としてg/Lの範囲で同時生産される。
実施例14: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともにプロピオン酸を同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにプロピオン酸を同時生産するように遺伝子改変する。3-ヒドロキシプロピオン酸を経由するプロピオン酸生合成代謝経路および標的酵素をW303酵母株中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株PE-2およびEthanol Red中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにプロピオン酸を同時生産するように遺伝子改変する。3-ヒドロキシプロピオン酸を経由するプロピオン酸生合成代謝経路および標的酵素をW303酵母株中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株PE-2およびEthanol Red中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
組換え酵母株には、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)、C.アルビカンス由来HPD1 (HPD1.Ca)、C.プロピオニクム由来PCT (PCT.Cp)、R.ポメロイ由来HPCD (HPCD.Rp)、およびR.ポメロイ由来ACR (ACR.Rp)を含めて、プロピオン酸生産経路遺伝子をゲノムに組み込み、ここでPCT.Cpは3-ヒドロキシプロピオン酸のCoA活性化と、プロピオニル-CoAからプロピオン酸を放出する他の分子へのCoA転移に関与している。全てのプロピオン酸生合成経路遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。
これらの組換え酵母株は、大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を過剰発現させてPEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替え、任意で、また弱いプロモーターを用いPYK1酵素を下方制御させて、PYK1酵素半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御してもよい。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。プロピオン酸、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。エタノールを主成分として5 g/L、10 g/L、15 g/Lまたはそれ以上のプロピオン酸が生産される。
実施例15: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともにブタノンを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにブタノンを同時生産するように遺伝子改変する。ブタノンはプロピオニル-CoAおよびアセチル-CoA縮合を経て生産することができ、ここで両中間体はマロン酸セミアルデヒドから誘導される。この生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、広く用いられている工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにブタノンを同時生産するように遺伝子改変する。ブタノンはプロピオニル-CoAおよびアセチル-CoA縮合を経て生産することができ、ここで両中間体はマロン酸セミアルデヒドから誘導される。この生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、広く用いられている工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
これらの組換え酵母株には、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)、C.アルビカンス由来HPD1 (HPD1.Ca)、C.プロピオニクム由来PCT (PCT.Cp)、R.ポメロイ由来HPCDおよびACR (HPCD.RpおよびACR.Rp)、C.アルビカンスまたは緑膿菌由来MSD (MSD.PaまたはMSD.Ca)、C.ネカトール由来b-ケトチオラーゼBktB (BtkB.Cn)、大腸菌由来ATOAD (ATOA.EcおよびATOD.Ec)、ならびにC.アセトブチリカムまたはP.ポリミキサ由来ADC (ADC.CaまたはADC.Pp)を含めて、ブタノン生産経路遺伝子をゲノムに組み込む。全てのブタノン生合成経路遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。
これらの組換え酵母株は、大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を過剰発現させてPEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替え、任意で、また弱いプロモーターを用いPYK1酵素を下方制御させて、その半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御してもよい。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。ブタノン、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。エタノールを主成分として5 g/L、10 g/L、15 g/Lまたはそれ以上のg/Lのブタノンが同時生産される。
実施例16: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに2-ブタノールを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに2-ブタノールを同時生産するように遺伝子改変する。2-ブタノールは、先の実施例で記載したように、MSA由来のブタノンから生産することができる。2-ブタノール生合成代謝経路および標的酵素をW303酵母株中で異種発現させ、また、広く用いられている工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびEthanol Red株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに2-ブタノールを同時生産するように遺伝子改変する。2-ブタノールは、先の実施例で記載したように、MSA由来のブタノンから生産することができる。2-ブタノール生合成代謝経路および標的酵素をW303酵母株中で異種発現させ、また、広く用いられている工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびEthanol Red株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
これらの組換え酵母株には、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)、C.アルビカンス由来HPD1 (HPD1.Ca)、C.プロピオニクム由来PCT (PCT.Cp)、R.ポメロイ由来HPCDおよびACR (HPCD.RpおよびACR.Rp)、C.アルビカンスまたは緑膿菌由来MSD (MSD.PaまたはMSD.Ca)、C.ネカトール由来b-ケトチオラーゼBktB (BtkB.Cn)、大腸菌由来ATOAD (ATOA.EcおよびATOD.Ec)、C.アセトブチリカムまたはP.ポリミキサ由来ADC (ADC.CaまたはADC.Pp)、ならびにL.ブレビス(L. brevis)由来二級アルコールデヒドロゲナーゼADH (ADH.Lb)を含めて、2-ブタノール生産経路遺伝子をゲノムに組み込む。全ての2-ブタノール生合成経路遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。
これらの組換え酵母株はまた、大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を過剰発現させてPEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替え、任意で、また弱いプロモーターを用いPYK1酵素を下方制御させて、その半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御してもよい。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。2-ブタノール、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。エタノールを主成分として5 g/L、10 g/L、15 g/Lまたはそれ以上のg/Lの2-ブタノールが同時生産される。
実施例17: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに酢酸プロピルを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに酢酸プロピルを同時生産するように遺伝子改変する。酢酸プロピルは、1-プロパノールおよびアセチル-CoAのエステル化によって生産することができる。酢酸プロピル生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびEthanol Red株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに酢酸プロピルを同時生産するように遺伝子改変する。酢酸プロピルは、1-プロパノールおよびアセチル-CoAのエステル化によって生産することができる。酢酸プロピル生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびEthanol Red株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
これらの組換え酵母株には、S.セレビシエ由来AAT2 (AAT2.Sc)、T.カスタニューム由来PAND (PAND.Tca)、L.クルイベリ由来PYD4 (PYD4.Lk)、大腸菌由来YDFG (YDFG.Ec)、C.アルビカンス由来HPD1 (HPD1.Ca)、C.プロピオニクム由来PCT (PCT.Cp)、R.ポメロイ由来HPCDおよびACR (HPCD.RpおよびACR.Rp)、C.アルビカンスまたは緑膿菌由来MSD (MSD.PaまたはMSD.Ca)、S.エンテリカ由来PDUP (PDUP.Sen)、S.セレビシエ由来ADH1 (ADH1.Sc)、C.アルビカンスまたは緑膿菌由来MSD (MSD.CaまたはMSD.Pa)、ならびにS.セレビシエ由来アルコールO-アセチルトランスフェラーゼ1 ATF1 (ATF1.Sc)を含めて、酢酸プロピル生産経路遺伝子をゲノムに組み込む。全ての酢酸プロピル生合成経路遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。
これらの組換え酵母株は、大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を過剰発現させてPEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替え、任意で、またpMET25DFまたはpNUP57などの弱いプロモーターを用いることにより、PYK1酵素を下方制御させて、その半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御してもよい。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。酢酸プロピル、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。酢酸プロピルは、エタノールを主成分としてg/Lの範囲で同時生産される。
実施例18: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに2,3-ブタンジオールを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに2,3-ブタンジオールを同時生産するように遺伝子改変する。2,3-ブタンジオール生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに2,3-ブタンジオールを同時生産するように遺伝子改変する。2,3-ブタンジオール生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。
これらの組換え酵母株には、P.ポリミキサ由来アセト乳酸シンターゼALS (ALS.Pp)、枯草菌由来アセト乳酸デカルボキシラーゼ(ALD.Bs)およびC.オートエタノゲナム(C. autoethanogenum)由来2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ(BDH.Ca)を含めて、2,3-ブタンジオール生産経路遺伝子をゲノムに組み込む。全ての2,3-ブタンジオール生合成経路遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。同じ基質であるピルビン酸について競合する酵素の発現を超えて、弱いプロモーターの使用および/または1つもしくは複数のアイソザイムの欠失のような、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)の活性を低減する遺伝子操作によって、エタノールから2,3-ブタンジオールへ炭素流をさらに転ずることができる。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。2,3-ブタンジオール、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。エタノールを主成分として5 g/L、10 g/L、15 g/Lまたはそれ以上のg/Lの2,3-ブタンジオールが同時生産される。
実施例19: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともにコハク酸を同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにコハク酸を同時生産するように遺伝子改変する。コハク酸生合成代謝経路および標的酵素を実験用酵母株W303中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともにコハク酸を同時生産するように遺伝子改変する。コハク酸生合成代謝経路および標的酵素を実験用酵母株W303中で異種発現させ、また、工業用エタノール生産酵母株であるPE-2株およびRed株中で異種発現させる。さらに、ピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を下方制御するように酵母株を改変する。
これらの組換え酵母株には、R.デレマー(R. delemar)由来リンゴ酸デヒドロゲナーゼMdh (MDH.Rd)、大腸菌由来フマラーゼFumCおよびフマル酸レダクターゼFumABCD (FUMC.EcおよびFUMABCD.Ec)を含めて、コハク酸生産経路遺伝子をゲノムに組み込む。全ての異種遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。
これらの組換え酵母株はまた、大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を過剰発現させてPEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替え、任意で、またpMET25DFなどの弱いプロモーターを用いることによりPYK1酵素を下方制御させて、その半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御してもよい。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。コハク酸、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。コハク酸は、エタノールを主成分としてg/Lの範囲で同時生産される。
実施例20: グルコースからのエタノール発酵中に、主成分としてのエタノールとともに1,4-ブタンジオールを同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに1,4-ブタンジオールを同時生産するように遺伝子改変する。1,4-ブタンジオール生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、PE-2、BG-1、CAT-1およびRed株のような工業用エタノール生産酵母株中で異種発現させ、実証されているようにピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を引き続き下方制御させる。
エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのグルコースからの炭素流の切り替えを通じ主成分としてのエタノールとともに1,4-ブタンジオールを同時生産するように遺伝子改変する。1,4-ブタンジオール生合成代謝経路および標的酵素をW303株中で異種発現させ、また、PE-2、BG-1、CAT-1およびRed株のような工業用エタノール生産酵母株中で異種発現させ、実証されているようにピルビン酸分岐点での天然のエタノール生産性代謝経路を引き続き下方制御させる。
これらの組換え酵母株には、R.デレマー(R. delemar)由来リンゴ酸デヒドロゲナーゼMdh (MDH.Rd)、大腸菌由来フマラーゼFumC、フマル酸レダクターゼFumABCDおよびスクシニル-CoAシンテターゼSucCD (FUMC.Ec、FUMABCD.EcおよびSUCCD.Ec)、P.ジンジバリス(P. gingivalis)由来CoA依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼSucD、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ4bdhおよびCoA-アシルトランスフェラーゼCat2 (SUCD.Pg、4HBDH.PgおよびCAT2.Pg)、C.アセトブチリカム由来CoA依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼALDおよびアルコールデヒドロゲナーゼADH (ALD.CaおよびADH.Ca)を含めて、1,4-ブタンジオール生産経路遺伝子をゲノムに組み込む。全ての1,4-ブタンジオール生合成経路遺伝子を、さまざまな強度のプロモーターの制御下で、また、さまざまな遺伝子コピー数の制御下で、酵母において最適に発現されるようにコドン最適化する。
これらの組換え酵母株は、大腸菌由来PEP.CK (PEPCK.Ec)を過剰発現させてPEPからオキサロ酢酸(OAA)へ炭素流を切り替え、任意で、またpMET25DFなどの弱いプロモーターを用いることによりPYK1酵素を下方制御させて、その半減期を低下させ、それによってPEPからピルビン酸への炭素流を低減し、自然に生産されるエタノールの量をより良好に制御してもよい。
発酵試験を、125 mL発酵フラスコ内で80 g/Lのグルコースを含む25 mLのYPD培地の存在下で実施する。30～35℃で、振とう直径50 mmのインキュベータにて135 rpmで、撹拌を維持する。1,4-ブタンジオール、エタノール、グリセロールおよびグルコースを、標準的な機器および分析方法を使用して48時間の発酵後に測定する。1,4-ブタンジオールは、g/Lの範囲でエタノールと同時生産される。
実施例21: 工業用サトウキビ原料に基づく工業用エタノール発酵条件中に、1つまたは複数の共生産物を同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
工業用エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのサトウキビ原料からの工業用エタノール発酵プロセス中に1つまたは複数の共生産物とともにエタノールを生産するように遺伝子改変する。これは、好ましくは、PE-2、BG-1、CAT-1株を含めてサトウキビ-エタノール発酵プロセスで工業的に既に使用されている工業用エタノール生産性S.セレビシエ株である。
工業用エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのサトウキビ原料からの工業用エタノール発酵プロセス中に1つまたは複数の共生産物とともにエタノールを生産するように遺伝子改変する。これは、好ましくは、PE-2、BG-1、CAT-1株を含めてサトウキビ-エタノール発酵プロセスで工業的に既に使用されている工業用エタノール生産性S.セレビシエ株である。
この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、非毒性濃度で1つまたは複数の共生産物とともにエタノールを生産することができるように、先の実施例において記載されているように得られる。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノールまたはそれらの組み合わせとともにエタノールを生産することができる。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、工業用エタノール生産性酵母株PE-2、BG-1およびCAT-1株にとって非毒性濃度で1-プロパノール、アセトン、2-プロパノールまたはそれらの組み合わせとともにエタノールを生産することができる。
この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、工業用サトウキビ-エタノール発酵条件を模倣した小規模発酵試験を通じて、工業用サトウキビ材料から1-プロパノール、アセトン、2-プロパノールまたはそれらの組み合わせとともにエタノールを同時生産することができる。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株を、TRS (全還元糖) 170 g/Lのサトウキビ糖蜜液200 mLを用い500 mLにて試験する。糖蜜液140 mLに、約100 g/L (DWC)を含有する酵母懸濁液(植菌液)70 mLを混合する。フラスコにエアロックタイプSで栓をする(嫌気性条件を促進するため)。その後、培養を、32℃、150 rpmで8時間実行する。培養の終了時に、発酵液(beer)を遠心分離し、清澄化した発酵液から酵母ペレットを分離する。酵母ペレットを、74 mLの清澄化した発酵液で再懸濁する。清澄化した発酵液からおよび再懸濁した酵母からサンプルを採取する。その後、140 mLの糖蜜液(170g/L TRS)と70 mLの再懸濁した酵母(4 mlをサンプルとして使用)を混合することにより、新たなサイクルを開始する。20サイクルの間、この手順を繰り返す。各発酵終了時のサンプルを、HPLC、GC-MS/FIDおよび当業者によって知られている標準的な分析方法のために採取する。グルコース、スクロース、エタノール、グリセロール、1-プロパノール、アセトンおよび2-プロパノールを測定する。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、その母体である工業用エタノール生産性酵母株PE-2、BG-1およびCAT-1に期待される、極めて類似した工業用エタノール発酵の頑健性および性能(エタノール収量および力価など)を示す。アルコール収量は、糖1グラム当たり約0.43～0.46グラムの総アルコールが生産され、一方、総エタノール力価は約60～80 g/Lである。エタノールは、生産されたアルコールの総重量に基づいて約80～85重量%の量で存在する。一方で、得られるアルコール(n-プロパノール、2-プロパノールおよびアセトン)の総濃度は、約15重量%～20重量%である。この結果は、工業生産用途に適した母体酵母の頑健性および発酵性能を損なうことなく、非毒性濃度で1-プロパノール、アセトンおよび/または2-プロパノールとともに主成分としてのエタノールの生産に向けた使用を可能にするように遺伝子改変された、工業用エタノール生産性酵母を生産するプロセスを実証している。
実施例22: 工業用トウモロコシ原料に基づく工業用エタノール発酵条件中に、1つまたは複数の共生産物を同時生産する、組換えエタノール生産性酵母
工業用エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのトウモロコシ原料からの工業用エタノール発酵プロセス中に1つまたは複数の共生産物とともにエタノールを生産するように遺伝子改変する。これは、好ましくは、Ethanol Red(登録商標) (Leaf-Lesaffre)株のようなトウモロコシ-エタノール発酵プロセスで工業的に既に使用されている工業用エタノール生産性S.セレビシエ株である。
工業用エタノール生産性S.セレビシエ酵母株を、炭素源としてのトウモロコシ原料からの工業用エタノール発酵プロセス中に1つまたは複数の共生産物とともにエタノールを生産するように遺伝子改変する。これは、好ましくは、Ethanol Red(登録商標) (Leaf-Lesaffre)株のようなトウモロコシ-エタノール発酵プロセスで工業的に既に使用されている工業用エタノール生産性S.セレビシエ株である。
この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、非毒性濃度で1つまたは複数の共生産物とともにエタノールを生産することができるように、先の実施例において記載されているように得られる。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノールまたはそれらの組み合わせとともにエタノールを生産することができる。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、Ethanol Red(登録商標) (Leaf-Lesaffre)株などの工業用エタノール生産性酵母株にとって非毒性の濃度で、1-プロパノール、アセトン、2-プロパノールまたはそれらの組み合わせとともにエタノールを生産することができる。
この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は、工業用トウモロコシ-エタノール発酵条件を模倣した小規模発酵試験を通じて、工業用トウモロコシ材料から1-プロパノール、アセトン、2-プロパノールまたはそれらの組み合わせとともにエタノールを同時生産することができる。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株を、部分的に加水分解されたコーンマッシュ1 Lを用いて3.5 Lバイオリアクタ内で試験する。適量のグルコアミラーゼ酵素を添加し、0.5 g/Lの新鮮酵母を植菌する。初期pHを4.5に調整するが、発酵中の制御はない。300 rpmで撹拌しながら温度を35℃に設定する。培養は72時間実行し、適切な間隔でサンプルを採取する。実験は三つ組で実施する。
HPLC、GC-MS/FIDおよび他の標準的な分析方法を用いて、糖、グルコース、エタノール、グリセロール、1-プロパノール、アセトンおよび2-プロパノールを測定する。この遺伝子改変されたS.セレビシエ酵母株は工業用エタノール生産性酵母株と比較して、極めて類似した工業用エタノール発酵の頑健性および性能(エタノール収量および力価などの)を示す。アルコール収量は、糖1グラム当たり約0.43～0.46グラムの総アルコールが生産され、一方、総エタノール力価は約120～150 g/Lである。エタノールは、生産されたアルコールの総重量に基づいて約80～85重量%の量で存在する。一方で、アルコール(n-プロパノール、2-プロパノールおよびアセトン)の総濃度は、約15重量%～20重量%で得られる。この結果は、工業生産用途に適した母体酵母の頑健性および発酵性能を損なうことなく、非毒性濃度で1-プロパノール、アセトンおよび/または2-プロパノールとともに主成分としてのエタノールの生産に向けた使用を可能にするように遺伝子改変された、工業用エタノール生産性酵母を生産するプロセスを実証している。
特に記載のない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いた成分の量、特性、例えば、分子量、反応条件などを示す数字は全て、全ての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されたい。したがって、そうでないことを記載していない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示した数値パラメータは、本開示によって得ようとしている所望の特性に応じて異なりうる近似値である。最低限でも、また、均等論の適用を特許請求の範囲の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告した有効桁の数字に鑑みて、および通常の丸め手法を適用することにより解釈されたい。
本開示の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるとは述べたものの、具体的な実施例に示した数値は可能な限り厳密に報告している。しかしながら、いずれの数値にも、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差によって必然的に生じる一定の誤差が固有に含まれている。
本開示の説明の文中で(特に以下の特許請求の範囲の文中で)用いられている用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、「その(the)」および同様の指示対象は、本明細書において特に記載のない限り、または文脈と明確に矛盾していない限り、単数と複数の両方を包含していると解釈されたい。本明細書における値の範囲の記載は、該範囲に含まれる個別の各値を個々に示すことの簡便な方法の役目を果たすことを意図したものにすぎない。本明細書において特に記載のない限り、個々の各値が本明細書に、あたかも該値が本明細書に個々に記載されているかのように組み込まれている。本明細書に記載の方法は全て、本明細書において特に記載のない限り、あるいは文脈と明確に矛盾していない限り、任意の適切な順序で行われうる。本明細書において示したありとあらゆる例または例示の文言(例えば、「などの」)の使用は、本開示をよりよく明らかにすることを意図したものにすぎず、請求項に記載以外の本開示の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書に文言がないことは、請求項に記載されていないが本開示の実施に必須である任意の要素を示していると解釈されたい。
本明細書に開示した本開示の別の要素または態様の群分けは、限定と解釈されるべきでない。各群の構成員は、個々に、または本明細書に見られる群の他の構成員もしくは他の要素との任意の組み合わせで言及され、請求項に記載されている場合がありうる。群の1つまたは複数の構成員が、便宜上および/または特許性の理由で群に包含されるか、群から削除されることが予測される。そのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、修正された群を含んでおり、したがって、添付の特許請求の範囲で使用した全てのマーカッシュ群の記載要件を満たすとみなす。
本明細書では、本開示を実行するための本発明者の知るところの最良の形態を含む、本開示のある種の態様が記載されている。もちろん、記載のこれらの態様に対する変形例が、前述の記載を読めば当業者には自明となろう。本発明者らは、当業者がそのような変形例を適宜使用することを予測しており、本発明者らは、本開示が、本明細書に具体的に記載したものとは別の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示は、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の主題の適応法によって許容されるあらゆる修正例および均等物を包含している。さらに、本明細書において特に記載のない限り、あるいは文脈と明確に矛盾していない限り、可能な全ての変形例における上記の要素の任意の組み合わせが本開示に包含される。
本明細書に開示の具体的な態様は、特許請求の範囲において、～からなる、および/または本質的に～からなるという文言の使用によりさらに限定されている場合がありうる。そのように請求項に記載されている本開示の態様は、本明細書において固有に、または明白に記載され、実施可能である。
本明細書に開示した本開示の態様は、本開示の原理の例示であることは理解されよう。使用されうる他の修正は本開示の範囲に含まれる。したがって、一例であって限定されないが、本開示の別の構成が本明細書の教示に従って使用されうる。したがって、本開示は図示および記載のものに厳密には限定されない。
本開示を本明細書において種々の具体的な材料、手順および実施例を参照して記載および説明したが、本開示が、その目的のために選択した材料および手順の具体的な組み合わせに制限されないことは理解されよう。そのような詳細の数多くの変形例が暗示され得、当業者には認識されよう。本明細書および実施例は例示的にすぎないとみなされることを意図しており、本開示の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって示される。本出願において言及した参考文献、特許および特許出願は全て、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
Claims (21)
- エタノールおよび1つまたは複数の共生産物の生産のための方法であって、以下の段階:
(a) 発酵性炭素源を発酵培地中でエタノール生産酵母と接触させる段階;
(b) 該酵母を該発酵培地中で発酵させる段階であって、該酵母が該発酵性炭素源からエタノールおよび1つまたは複数の共生産物を生産し、生産されたエタノールが、生産された共生産物よりも高いmg/mL濃度で存在する、段階; ならびに
(c) 該エタノールおよび該1つまたは複数の共生産物を単離する段階
を含み、
該酵母が、該1つまたは複数の共生産物を生産するように遺伝子改変された組換え酵母である、方法。 - 炭素源が、グルコースまたはデキストロースである、請求項1記載の方法。
- 炭素源が、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、米、またはそれらの混合物などの、デンプンに基づく原材料の糖化によって得られる再生可能な穀物源に由来する、請求項1または2記載の方法。
- 炭素源が、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、またはそれらの混合物などの、再生可能な糖由来である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- エタノール生産酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- サッカロマイセス・セレビシエが、工業用株、エタノール工業において使用される任意の一般的な菌株、典型的な実験室菌株、または菌株間の典型的な交配方法から生じる任意の菌株である、請求項5記載の方法。
- 共生産物が、エタノール生産酵母にとって非毒性の濃度で生産される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 生産されたエタノールが、生産されたエタノールおよび共生産物の総重量に基づき少なくとも70重量%、例えば少なくとも75重量%、少なくとも80重量%、少なくとも85重量%、少なくとも90重量%、または少なくとも95重量%の量で存在する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 発酵が、バッチプロセス、流加回分プロセス、または連続プロセスとして実行される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 発酵が、約15℃から約60℃の温度で約24時間から約96時間、嫌気条件下で実行される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 発酵が、工業用エタノールプラントで、好ましくは既存の工業用エタノールプラントで実行される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の共生産物が、エタノール以外のアルコール; ケトン; グリコール; エーテル; エステル; ジアミン; カルボン酸; アミノ酸; ジエン、およびアルケンからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 1つまたは複数の共生産物が、1-ブタノール、2-ブタノール、イソブタノール、メタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、イソアミルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、プロピオン酸メチル、1,3-プロパンジオール、モノエチレングリコール、プロピレングリコール、クエン酸、乳酸、コハク酸、アジピン酸、酢酸、グルタミン酸、プロピオン酸、フランジカルボン酸、2,4フランジカルボン酸、2,5-フランジカルボン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、イタコン酸、グルタミン酸、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸プロピル、イソプレノール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール、ジエタノールアミン、トリプトファン、スレオニン、メチオニン、リジン、セリン、チロシン、ブタジエン、イソプレン、エタン、およびプロペンからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- エタノールおよび1つまたは複数の共生産物を単離する段階が、蒸留、吸着、結晶化、吸収、電気透析、溶媒抽出、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、蒸発、またはそれらの組み合わせから選択されるプロセスを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- エタノールおよび1つまたは複数の共生産物の生産のための方法であって、以下の段階:
(a) 発酵性炭素源を発酵培地中でエタノール生産酵母と接触させる段階;
(b) 該酵母を該発酵培地中で発酵させる段階であって、該酵母が該発酵性炭素源からエタノールおよび1つまたは複数の低沸点共生産物を生産し、生産されたエタノールが、生産された共生産物よりも高いmg/mL濃度で存在する、段階; ならびに
(c) 該エタノールおよび該1つまたは複数の低沸点共生産物を単離する段階
を含み、
該酵母が、該1つまたは複数の共生産物を生産するように遺伝子改変された組換え酵母である、方法。 - 低沸点共生産物が、100 kPa (1バール)の標準圧力で、100℃またはそれ以下、例えば99℃もしくはそれ以下、98℃もしくはそれ以下、97℃もしくはそれ以下、95℃もしくはそれ以下、90℃もしくはそれ以下、85℃もしくはそれ以下、80℃もしくはそれ以下、75℃もしくはそれ以下、70℃もしくはそれ以下、65℃もしくはそれ以下、または60℃もしくはそれ以下の沸点を有する、請求項15記載の方法。
- 1つまたは複数の低沸点共生産物が、アセトン、1-プロパノール、2-プロパノール、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項15または16のいずれか一項記載の方法。
- エタノールおよび1つまたは複数の低沸点共生産物を単離する段階が、連続蒸留ユニットによって行われる、請求項15、16、または17のいずれか一項記載の方法。
- エタノールおよび1つまたは複数の共生産物の生産のための方法であって、以下の段階:
(a) 発酵性炭素源を発酵培地中でエタノール生産酵母と接触させる段階;
(b) 該酵母を該発酵培地中で発酵させる段階であって、該酵母が該発酵性炭素源からエタノールおよび1つまたは複数の高沸点共生産物を生産し、生産されたエタノールが、生産された共生産物よりも高いmg/mL濃度で存在する、段階; ならびに
(c) 該エタノールおよび該1つまたは複数の高沸点共生産物を単離する段階
を含み、
該酵母が、該1つまたは複数の高沸点共生産物を生産するように遺伝子改変された組換え酵母である、方法。 - 高沸点共生産物が、100 kPa (1バール)の標準圧力で、100℃超、例えば105℃超、110℃超、120℃超、130℃超、140℃超、150℃超、160℃超、170℃超、180℃超、190℃超、200℃超、210℃超、220℃超、230℃超、240℃超、または250℃超の沸点を有する、請求項19記載の方法。
- エタノールおよび1つまたは複数の高沸点共生産物を単離する段階が、蒸留と、それに続く結晶化、溶媒抽出、クロマトグラフィー分離、塩分解、沈降、酸性化、イオン交換、蒸発、またはそれらの組み合わせから選択されるプロセスによって行われる、請求項19または20のいずれか一項記載の方法。
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