WO2001011044A1

WO2001011044A1 - Tumor antigen

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Publication number: WO2001011044A1
Application number: PCT/JP2000/005220
Authority: WO
Inventors: Kyogo Itoh
Original assignee: Kyogo Itoh
Priority date: 1999-08-05
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2001-02-15
Also published as: JP4051602B2; CA2381348A1; ATE464383T1; US7465452B2; DE60044193D1; EP1207199A1; AU6318300A; ES2340357T3; EP1207199A4; EP1207199B1; US20020128201A1; CA2381348C

Description

明細書

技術分野

本発明は、新規な腫瘍抗原に関し、詳しくは腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞による認識性を有するぺプチド、そのべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、このポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、組換えべクタ一を含む形質転換体、ペプチドの製造方法、ペプチドに対する抗体、これらに相互作用を有する化合物およびそのスクリーニング方法、これらを利用する医薬組成物、およびこれらを利用する診断のための分析手段に関する。従来技術

生体における癌の排除には免疫系、特に細胞傷害性 T細胞（Cyt o t ox i c T L ymp h o c y t e ：以下、 C T Lと略称することもある）が重要な役割を果たしている。癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性 T細胞の浸潤が認められている（Ar ch. Surg. ， 126 : 20 0— 205, 1990) 。この腫瘍特異的な細胞傷害性 T細胞の標的分子である腫瘍抗原の発見は、メラノーマにおいて初めてなされた。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて 8〜1 1個のアミノ酸からなるペプチド（腫瘍抗原ペプチド）になり、主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（Huma n Leuko cyt e A n t i g e n：以下、 H L Aと略称する）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。

HL Aは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。 HL Aはクラス I抗原とクラス II抗原に大別されるが、細胞傷害性 T細胞により抗原ペプチドとともに認識される HLAはクラス I抗原である。 HLAクラス I抗原はさらに HLA— A、 B、 Cなどに分類され、その遺伝子には多型が存在することが報告されている。 HLA— A24対立遺伝子（a l l e l e) は、日本人の人口の約 60% (多くはその 95 %の遺伝型が A 2402である）、コーカサス人の 20%、アフリカ人の 12%でみられる。 HL A— A 2対立遺伝子は、日本人の約 40%、中国人の 53%、北コ一カサス人の 49%、南コ一カサス人の 3 8%、黒人アフリカ人の 23 %においてみられる。

この HL Aに結合可能な腫瘍抗原ペプチドには、 HLAの型（t ype) ごとにその配列に規則性（モチーフ）がある。細胞傷害性 T細胞はこの腫瘍抗原ぺプチドと HL Aとの複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。ここにおいて、腫瘍抗原とは、腫瘍特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導しうる、腫瘍細胞が有する蛋白質またはペプチドを意味する。また腫瘍抗原ペプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、 HL A分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導または活性化しうるべプチドを意味する。さらに、腫瘍抗原が有する腫瘍特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導しうるアミノ酸配列の部位を腫瘍抗原ェビトープ（腫瘍抗原決定基）という。近年、細胞傷害性 T細胞により認識されうる腫瘍抗原をコードする多くの遺伝子が、ヒ卜の癌細胞の c DN Aから同定されている（S c i enc e, 254 : 1643〜 1647， 1991) (J. Exp. Med. , 183 : 1185〜 1192, 1996) 。これらは、 HER/neu (P r o c . Nat l. Ac ad. S c i. USA, 92 ： 432-436, 1995) 、変異 cdk (S c i ence, 269 : 1281〜 1284， 1995) 、そして変異 CAS P— 8 (J. Exp. Med. , 186 : 785〜 793, 1997 ) などであり、増殖性細胞および悪性形質転換体中の存在が認められている。 MAGE (メラノ一マ抗原）ファミリー（Canc er Re s. , 55 ： 3478〜 3482、 1995) や SART 1 ( J . Exp. Med. 187 ： 277〜 288、 19 98) などの他のいくつかの遺伝子産物は、悪性細胞と精巣の両方で選択的に発現しているが、その他の正常細胞では発現していない。

多くのメラノ一マ特異的な腫瘍抗原は、 MART— 1/me 1 anA、 gp 1 00、およびチロシナ一ゼなどであり、これらは正常メラニン細胞にも存在する (On c o ge ne Re s. , 1 : 357〜 374, 1 987) 。それゆえ、ヒトの腫瘍抗原はほとんどの場合、真に腫瘍特異抗原というのではなく、むしろそれらはいくつかの正常細 J¾¾や組織で発現する自己抗原といえる。

現在、欧米では、腫瘍抗原ペプチドを投与し、癌患者の体内の細胞傷害性 T細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされており、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原 gp 100ペプチドをメラノ一マ患者に皮下投与し、インタ一ロイキン一 2(1 L- 2) を静脈注射投与することにより、 42%の患者で腫瘍の縮小が認められている（Na t ur e Me d i c i ne, 4 : 32 1 , 1998) 。このように、腫瘍抗原はワクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。

しかしながら、同定されている腫瘍抗原はそのほとんどがメラノ一マ由来であり、発病頻度の高い上皮性の癌や腺癌由来の腫瘍抗原についての報告は少ない。既存の三大癌治療（手術療法、化学療法、および放射線治療）による 1 998 年における 5年生存率は全癌で 4 1%であるが、生存率をこれ以上増加させることは現状では難しく、上記三大治療法に加え新たな治療法の開発が望まれている。 s r cフアミリー膜型チロシンキナーゼの 1つである p 56 ^{l c k}蛋白質をコードする l c k遺伝子は、 T細胞の発生と機能において本質的な機能を有する。この 1 c k遺伝子の大腸癌細胞と小細胞性肺癌細胞における異常な発現（On e o gene Re s. , 1 : 357〜 374, 1 987) 、および転移性大腸癌での異所性発現が報告されている。また、腫瘍性形質転換の過程における L c k蛋白質の関与が示唆されてはいる（Canc e r Re s. , 58 : 4660〜 4 666、 1998 ) が、しかしながら、これらの癌細胞における L c k蛋白質の詳細な役割は知られていない。発明の開示

本発明は上記現状に鑑み、腺癌および上皮性の癌、例えば大腸癌や肺癌の患者の特異的免疫療法に有用な、細胞傷害性 T細胞による認識性を有する新規な腫瘍抗原を見いだし提供することを目的とする。

具体的には、少なくとも HLA— A2402拘束性または HLA— A2拘束性の細胞傷害性 T細胞により認識される、 1 c k遺伝子がコードする抗原ェビトープを有するぺプチドを見いだし、提供することが本発明の目的である。詳しくは、 HL A-A 2402拘束性または HLA— A 2拘束性の細胞傷害性 T細胞による認識性を有するぺプチド、該ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドに対する抗体、これらに相互作用を有する化合物およびそのスクリーニング方法、これらを利用する医薬組成物、およびこれらを利用する診断手段を提供することを目的とする。

課題解決のため、本発明者は、 HLA— A24と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化される HL A— A 2402拘束性腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞である K E4-CTL, ならびに HLA— A2と腫瘍抗原べプチドとを認識して活性化される HLA— A2拘束性腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞である OK— CTLおよび GK— CT Lを癌患者から樹立し、この腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を活性化しうる腫瘍抗原を、遺伝子発現クローニング法（Gene Expr e s s i on C lonin M e t h o d) を用いて、 K E腫瘍細胞株の c D N Aライブラリーから同定し、さらに HLA— A2402拘束性および Zまたは HL A— A 2 拘束性の細胞傷害性 T細胞により認識される該腫瘍抗原のェビトープを有するぺプチドを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

( 1 )配列表の配列番号 1、配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 1 1、配列番号 12、配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15、配列番号 16、または配列番号 17に記載のアミノ酸配列からなるベプチド、

(2) 下記の式で表されるアミノ酸配列（配列表の配列番号 10) からなるぺプチド、

Thr-Phe-Xaa-Xbb-Xcc-Xdd-Xee-Xff-Leu-Xgg-Asp-Xhh-Xii

ここで、 Xaaは、 Aspまたは Glu、

Xbbは、 Tyrまたは Phe、

Xccは、 Leuまたは Ile、

Xddは、 Argまたは Ghi、

Xeeは、 Serまたは Ala、

Xffは、 Valまたは Phe、

Xggは、 Gluまたは Asp、

Xhhは、 Pheまたは Tyr、

Xiiは、 Pheまたは Tyrである、

(3) 少なくとも前記（1) または（2) のべプチドからなる細胞傷害性 T細胞の誘導剤、

(4) 前記（1) または（2) のペプチドを用いることを特徴とする細胞傷害性 T細胞の誘導方法、

(5) 少なくとも前記（1) または（2) のべプチドからなる癌ワクチン、

(6) 前記（1) または（2) のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、

(7) 前記（ 6 ) のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダィゼ一ションするポリヌクレオチド、

(8) 前記（6) または（7) のポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えべクタ一、

(9) 前記（8) の組換えベクターで形質転換された形質転換体、

(10) 前記（9) の形質転換体を培養する工程を含むペプチドの製造方法、

(11) 前記（ 1) または（2) のペプチドを免疫学的に認識する抗体、 ( 12 ) 前記（ 1 ) または（2) のべプチドと相互作用して、少なくとも HL A -A 2402拘束性および/または H LA— A 2拘束性の細胞傷害性 T細胞による認識性を増強する化合物、および Zまたは前記（ 6 )もしくは（ 7 ) のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、前記（1) もしくは（2) のペプチド、前記（6) もしくは（7) のポリヌクレオチド、前記（8) の組換えベクター、前記 (9) の形質転換体、または前記（1 1) の抗体のうちの少なくとも 1つを用いることを特徴とするスクリーニング方法、

( 13) 前記（ 12 ) のスクリーニング方法で得られた化合物、

( 14 ) 前記（ 1 ) もしくは（ 2 ) のぺプチド、前記（ 6 ) もしくは（ 7 ) のポリヌクレオチド、前記（8)の組換えべクタ一、前記（9)の形質転換体、前記（ 1 1) の抗体、または前記（ 13) の化合物のうちの少なくとも 1 つを癌治療有効量を含んでなる癌治療に用いる医薬組成物、

(15) 前記（3) の細胞傷害性 T細胞の誘導剤、前記（5) の癌ワクチン、または前記（ 14) の医薬組成物を癌疾患に用いることを特徴とする治療方法、

(16) 前記（ 1) または（2) のペプチドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であって、（a) 該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、および/または（b) 個体由来の試料中の該ペプチドをマーカーとして分析することを含む方法、

( 17)前記（ 16)の方法に使用する試薬キッ卜であって、少なくとも前記（ 1) または（2) のペプチド、前記（6) または（7) のポリヌクレオチド、前記（ 1 1 ) の抗体のうちの 1つ以上からなる試薬キット、

からなる。図面の簡単な説明

図 1 ： 1 ck遺伝子産物を認識することにより、 HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞（ K E 4— C T L ) が活性化しイン夕一フエロン—ァ（IFN—ァ）を産生することを示す図である。

図 2 ： 1 ck遺伝子産物を認識することにより、 HLA— A2拘束性細胞傷害性 T細胞が活性化してインタ一フヱロンーァ（I FN—ァ）を産生することを示す図である。（A) 、（B) および（C) はそれそれ HLA— A2拘束性 CTL として、 OK— CTL一 e亜株、 GK—CTL 2— 2— 4亜株および GK— CT L 2— 2— 5亜株を用いたときの結果を示す。

図 3 ： L c k由来のぺプチドをトランスフエクシヨンした C 1R/A 2402 細胞で刺激した KE— C T Lからの I FN—ァ産生量を示す図である。

図 4 ： L ck由来のペプチドが濃度依存的に KE— CTLを活性することを示す図面である。

図 5 ： KE— CTLによるペプチド認識を種々の抗体存在下で行い、 KE— C TLの細胞表現型（phenot ype) および MH C拘束性を確認した結果を示す図である。（A) 、（B) および（C) はそれそれ L ck由来のペプチドとして、 Lck208— 216、 Lck486— 494、および Lck488— 4 97を用いたときの結果を示す。

図 6 ： £4ー( 丁1^亜株（sub l ine) のペプチド認識における差違を示す図面である。（A) 、（B) 、（C) および（D) はそれそれ亜株 # 19、亜株 #49、亜株 #93、およびクローン #80を用いた結果を示す。

図 7 ： L c k由来のペプチドが癌患者末梢血単核球（PBMC) から HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導しうることを、各種腫瘍細胞、 KE4 (H LA— A24+) 、 SW620 (HLA— A24+) 、 COLO201 (HLA - A 24") を標的細胞として CT Lからの I FN—ァ産生を指標に調べた結果を示す図である。

図 8 ： Lck由来ペプチドにより誘導される CTLの各種腫瘍細胞に対す細胞傷害性活性を、 ⁵¹Crの遊離試験により検討した結果を示す図である。（A)および（B) は、ベプチドとしてそれぞれ L ck488-497および L c k 20 8— 216を使用した結果を示す。

図 9 ：大腸癌患者の末梢血単核球（PBMC) からペプチドにより誘導された CTLの、ペプチドに対する特異性を示す図である。（A) 、（B) 、（C) および（D) は、それそれ癌患者の PBMCの事前刺激に、ペプチドを使用しなかつたとき、ベプチドとして L ck208— 2 16、 Lck486— 494、および Lck488— 497を使用したときの結果を示す。

図 10 ：大腸癌患者の末梢血単核球（PBMC) からのペプチドによる CTL 誘導を種々の抗体存在下で行い、誘導された CTLの細胞表現型（pheno t yp e) および MHC拘束性を確認した結果を示す図である。

図 11 ：大腸癌患者の末梢血単核球（PBMC) 中の、ペプチドにより誘導される C T L前駆細胞の頻度を示す図である。図中、横軸は 1ゥエルあたりの加えた CT L数を表し、縦軸は増殖陰性分画（f rac t i on ne at ive cu 1 t u r e) を表す。縦軸において、 1は CTLが誘導されず、 CTLにより溶解（lys i s) されるべき標的細胞が 100%生存していることを示し、 0. 2は標的細胞が 100%死滅している（CTL前駆細胞頻度 = 1/96) ことを示す。

図 12 : Sr cフアミリ一由来のぺプチドによる、 KE 4— CTLの活性化を示す図である。

図 13 ： L c k由来のペプチドの HLA—八2拘束性〇！"]^活性化能を分析した結果を示す図であり、（A) は HLA— A2拘束性 CTLとして OK— CTL 株を使用したときの結果を、（B) は GK— CTL 2— 2— 4亜株を使用したときの結果を示す。

図 14 ： Lck由来のペプチドが濃度依存的に HLA— A2拘束性 CTLを活性化することを示す図である。（A) 、 (B) および（C) は、それそれ OK— CTL-e亜株、 GK— CT L 2— 2— 4亜株、および G K— C T L 2— 2 _ 5 亜株を CTLとして使用したときの結果を示す。

図 15 ： L c k由来のペプチドが癌患者末梢血単核球（PBMC) から HLA —A2拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導しうることを示す図である。（A) および (B) は、大腸癌患者例 1由来の PBMCからの CTLの誘導を、 IFN—ァの産生を指標に検討した結果、および細胞傷害性試験で確認した結果を示す。（C) および（D) は、大腸癌患者例 2由来の PBMCからの CTLの誘導を同様に検討した結果を示す。発明を実施するための最良の形態

( 1 c k遺伝子の同定）

本発明者らは、まず日本人の多数においてみられる HL A— A分子の型である HLA— A24に着目し、この H L A— A 24と腫瘍抗原ペプチドとを認識して活性化される HL A— A 2402拘束性腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞（KE 4— CTL) を、食道癌患者から樹立した（Int. J. Canc er、 81 : 45 9一 466、 1999) 。この細胞傷害性 T細胞をエフェクターとして使用し、この細胞を活性化しうる腫瘍抗原を、遺伝子発現クローニング法を用いて、 KE 腫瘍細胞株の cDNAライブラリ一から同定した。細胞傷害性 T細胞の活性化の判定は、酵素免疫固相法（ELI SA) キットを用いて、該細胞傷害性 T細胞から産生されるィンターフェロンーァ（I FN—ァ）を測定することにより行った。その結果、 1つの cDNAクローンが HLA— A24拘束性 KE 4— CTLにより認識され、該 KE4— CTLを活性化すること（図 1参照）、およびこの c DNAクローンの塩基配列が 1 , 750塩基（bp) 長であり、かつ： L ck遺伝子の塩基配列におけるポジション 283— 2， 032と 100 %相同性を有することを見いだした。このポジションの 1 c k遺伝子の塩基配列は、 509ァミノ酸からなる L c k蛋白質においてその大部分を含むポジション 31—506のァミノ酸配列に対応する。

すなわち、 L c k遺伝子と HLA— A 2402とを遺伝子工学的手法により発現させた細胞が KE— CTLを活性化せしめることから、 L c k遺伝子がコードする蛋白質は、 HLA— A2402拘束性 CTLを活性化しうる腫瘍抗原であることを確認した。

また、 L ck蛋白質は、 HLA— A24拘束性 CTLのみならず、 HLA— A 2拘束性 C T Lをも活性化しうる腫瘍抗原であることを、大腸癌患者より樹立した CTL株〔01^—（ 1¹1^— 6亜株（sub l ine) (HLA— A0207)〕 (J. Immuno l. , 163 : 4999— 5004、 1999 ) および肺癌患者より樹立した C T L株〔GK— CTL2— 2— 4亜株および G K— C T L 2 -2-5 (HLA-AO 206 ) 〕の 3つの H L A— A 2拘束性 C T Lを用いて上記同様に見いだした（図 2参照）。

かくして、 l ck遺伝子が、 HLA— A24拘束性または HLA— A2拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞により認識される腫瘍抗原ェビトープ（tumo r e p i t o p e) をコードすることを見いだした。

(L c k蛋白質の組織局在）

種々の細胞および組織における蛋白質レベルでの L c k ( 56 kDおよび 59 kD) の発現を、抗 L c kモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析により検討した。

Lck蛋白質は、扁平上皮癌（以下、 SCCと略称することもある）または腺腫瘍細胞株などの試験した全ての悪性腫瘍細胞株、並びに食道癌、肺 SCCおよび肺腺癌細胞などの、多種の臓器から得た新鮮腫瘍組織の大多数で検出された。特に、 Lck蛋白質は大腸癌、肺癌、食道癌の組織で、高率に発現していた。一方、非腫瘍性の結腸組織のいずれでも全く検出されなかった。また、 Lck蛋白質は未刺激の末梢血単核球（PBMC) では認められなかったが、 10 zg/m 1のフィ卜へマグルチニン（phyt ohemagglut i n i n； P H A) で 48時間刺激した後の活性化された PBMC (PHA-b l as t) の細胞質画分には検出されるようになった。 (HL A-A 2402拘束性 CT Lを活性化しうるべプチド）

L c k蛋白質由来の H LA— A 2402分子への結合能を有するぺプチドを得るために、 HLA— A24に結合しうる規則的配列（モチーフ、 mot if) を有するぺプチドについて文献検索し、 13個の異なる 9— me rまたは 10— m erのペプチドを、 1 c k遺伝子産物の 509アミノ酸配列（Na t u r e、 3 19 ： 682〜 685、 1986 ) に基づいて合成した。但し、一部のアミノ酸に変更を加えたものもある。

13個のぺプチドからの細胞傷害性 T細胞を活性化しうる腫瘍抗原べプチドの選択は、 CTLが産生する I FN—ァをその CTL活性化作用の指標として測定することにより行った。

これらのペプチドのうち、 3個のペプチド〔L c k 208— 216 (配列番号 3) 、 Lck486-494 (配列番号 1) 、 Lck488— 497 (配列番号 2) 〕が CTL活性化能を示し、 CTLによる I FN—ァ産生を増強した（図 3 参照）。 Lck486— 494 (配列番号 1 ) または L ck488-497 (配列番号 2) の CTL活性化能は濃度依存的であり、 1 nM程度で認められた。一方、 L ck208— 216 (配列番号 3 ) の活性は 100 nM以上で認められた (図 4参照）。

これら 3個のペプチドによる KE 4— CT Lの活性化は、抗 CD 3、抗 CD 8 および抗 MHCクラス Iモノクローナル抗体によって阻害されたが、抗 CD 4、抗 MH Cクラス IIおよび抗 CD 13モノクローナル抗体では阻害されなかった。従って、 KE 4— C T Lは CD 3+、 CD8+、 C D 4—の細胞表現型を有することが判明した。

(ペプチドによる HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導）

HLA-A24拘束性の K E— C T Lを濃度依存的に活性化する 3個のぺプチド〔Lck208— 216 (配列番号 3)、 L ck486-494 (配列番号 1 )、 Lck488-497 (配列番号 2) 〕はまた、大腸癌患者から得た末梢血単核球（PBMC) から、 L c kを発現している腫瘍細胞株（KE4、 SW620および COLO 201) に対する HLA— A 24拘束性 C T Lを誘導した。

すなわち、 L ck208— 216 (配列番号 3) 、 Lck486-494 (配列番号 1) 、 Lck488— 497 (配列番号 2) を用いて in v i t roで 3回刺激し、さらに放射線照射した自己 PBMC (aut o l ogous— PB MC) を相当するペプチドでパルスしたものを抗原提示細胞（AP C) として用いて刺激したとき、特に Lck486— 494 (配列番号 1 ) 、 L c k 488— 497 (配列番号 2) で刺激した PBMCは、 H L A— A 24—腫瘍細胞（ C 0 LO201) に対する反応より、 HLA— A24+腫瘍細胞（KE 4および SW 620 ) に対する反応においてより多くの I FN—ァを産生した。

一方、健常人から得た PBMCからは、抗原提示細胞（APC) として放射線照射した自己 P BMCに 3個のぺプチドのいずれかをパルスしたものを用いて刺激したときは、これら 3個のペプチドは HL A— A 24拘束性 CTLを誘導しなかった（表 3参照）。しかし、ペプチドをパルスした樹状細胞（D e nd r i t i c C e 11 ; D C) を AP Cとして用いて刺激したときには、これら 3個のぺプチドは健常人から得た PBMCから、 HLA— A24拘束性 CTLを誘導した。

さらに、上記ペプチドが誘導した CTL活性を、 ⁵¹ Cr遊離試験により確認した。これら L c k由来の 3個のペプチドで刺激した PBMCは、 HLA— A24 +KE腫瘍細胞および SW620腫瘍細胞を溶解（ 1 y s i s) したが、健常人から得た H L A— A 24 + P HA活性化 T細胞または H LA— A 24— C 0 L 0 201腫瘍細胞はいずれも溶解しなかった。

L c k由来の上記ぺプチドは大腸癌患者の P BMCにおいて HL A— A 24拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導することができた。また、 L ck由来のペプチドは、健常人の PBMCについては、腫瘍細胞に対する H L A— A 24 拘束性の CTL活性を誘導できなかった。これらの結果から、健常人の末梢血中の T細胞は L c kに対して免疫学的寛容状態にあると考えられる。本発明の L c kぺプチドは大腸癌患者の P BMC中に C T Lを誘導することができる。

(S r cフアミリ一由来のぺプチドによる HLA— A24拘束性 CTLの誘導） HLA-A24+腫瘍細胞株を認識する CTLを誘導することができる上記 3 個のペプチドのうち、 2個のペプチド L c k 486— 494 (配列番号 1 ) (T FDYLRSVL) および L ck488-497 (配列番号 2) (DYLRS V LEDF) に、アミノ酸配列上の相同性が認められた。（以降、アミノ酸配列を表記する場合、 1文字にて表記する場合と 3文字にて表記する場合がある。）この 2個のぺプチドの重なる領域である一定のアミノ酸 DYLR SVをェビトープとして認識する CTLは、腫瘍拒絶に対する意義を有することが推定される。このアミノ酸配列に相同性をもつぺプチドを検索したところ、 L c kと同じ S r cファミリ一に属するチロシンキナーゼ（Ann. Rev. B i o chem. 54 : 897— 930, 1985) に、相同性を有するぺプチドを含むものがあることが判明した（表 5参照）。

これら S r cフアミリー由来のベプチドのアミノ酸配列に基づいて合成したぺプチド、 S r c 51 1— 519 (配列番号 4 ： TFEYLQAFL) 、 Ye s 5 08-516 (配列番号 5 ： TFEYIQSFL) , Fyn512-520 (配列番号 6 : TFEYLQSFL) 、 Lyn489-497 (配列番号 7 ： T F D YLQSVL) , Hck 503 - 51 1 (配列番号 8 ： TFEYI QSVL) 、 B lk482-490 (配列番号 9 ： TFEFLQSVL) も、 L c k由来のぺプチドと同様、あるいはそれ以上の HL A— A 24拘束性 CTL活性化能を示した。

上記相同性を有するぺプチドのアミノ酸配列から導き出される、下記の一般式で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドであって、かつ少なくとも HLA— A 2402拘束性細胞傷害性 T細胞による認識性を有するペプチドも、本発明のぺプチドに含まれる。 Thr-Phe-Xaa-Xbb-Xcc-Xdd-Xee-Xff-Leu-Xgg-Asp-Xhh-Xii

ここで、 Xaaは、 Aspまたは Glu、

Xbbは、 Tyrまたは Phe、

Xccは、 Leuまたは Ile、

Xddは、 Argまたは Gln、

Xeeは、 Serまたは Ala、

Xffは、 Valまたは Phe、

Xggは、 Gluまたは Asp、

Xhhは、 Pheまたは Tyr、

Xiiは、 Pheまたは Tyr、

である。

(S r cフアミリ一由来のぺプチドによる癌患者における HL A— A 24拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導）

上記 S r cファミリー由来のペプチドは、癌患者より得た PBMCから HL A —A24拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導することができた。すなわち、 Sr cファミリー由来のぺプチドで刺激した癌患者より得た PBMCは、 KE 4細胞および SW 620細胞に対して反応し、 I FN—ァを産生した。 L ck486— 49 4 (配列番号 1 ) は癌患者 7例中 4例、 S r c 51 1— 519 (配列番号 4 ) は 3例中 2例、 Y e s 508— 516 (配列番号 5 ) は 3例中 1例、 F y n 5 12 - 520 (配列番号 6 ) は 2例中 1例、 H c k 503— 511 (配列番号 8 ) は 2例中 2例、 B lk 482— 490 (配列番号 9) は 2例中 1例において、 PB MCからの I FN—ァを産生を誘導した。

本発明の 3個の L c kぺプチドおよび S r cフアミリー由来のぺプチドは、大腸癌患者の PBMCにおいて HLA— A24拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導することができる。従って、本発明のペプチドは、腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞の誘導剤および誘導方法に使用可能である。また、 Lckは大腸、肺および食道を含む大多数の癌組織で検出される。 HLA— A24対立遺伝子（a l 1 e 1 e) は日本人の人口の約 60% (多くは、その 9 5 %の遺伝型が A 240 2である）、コ一カサス人の 20 %、アフリカ人の 12 % (HL A 1 99 1， Vo l . 1 : 1 06 5〜 12 20, Oxf o r d : Oxf o r d S c i e nt i f i c Pub l i c at i o ns, 1 992 ) で見られる。従って、本発明のべプチドは比較的多数の癌患者における特異的免疫治療に適用しうる。

( H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞を活性化しうるペプチド）

つぎに、 L c k蛋白質が HL A— A 2拘束性 CTLによっても認識されることから、 HL A— A 2分子への結合能をもつ L c k由来のぺプチドを得るために、 HL A— A 2に結合しうるモチーフを有するぺプチドについて文献検索し、 24 種の異なる 9—me rまたは 10— me rのべプチドを、 1 c k遺伝子産物の 5

09ァミノ酸配列（Na t ur e、 3 19 ： 682〜 685、 1 986 ) に基づいて合成した。〇丁1^として01(—〇^>11^株または01^—（ ^>11^亜株（sub 1

1 ne) 2— 2— 4を用い、各ペプチドの C T L活性化能は、 CTLが産生する I FN—ァを指標として測定した。

これらのぺプチドのうち、 7個のぺプチド〔： L c k 6 1— 69 (配列番号 1 1 )、 L ck 246 - 254 (配列番号 12)、 L c k2 94— 303 (配列番号 13)、 L ck 340- 348 (配列番号 14)、 L c k347 - 355 (配列番号 15)、 L ck422— 430 (配列番号 1 6)、 L c k492— 500 (配列番号 17)〕が CTL活性化能を示し、 CTLによる I FN—ァ産生を増強した〔図 13の（A) および（ B ) 参照〕。 L c k 6 1— 69 (配列番号 1 1) 、 L ck 246— 25 4 (配列番号 12) 、または L ck422— 430 (配列番号 16 ) の、 C T L 活性化能は濃度依存的であった〔図 14の（A) 、 (B) および（C) 参照〕。

(ペプチドによる HLA— A2拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導）

また、 HLA— A2拘束性の C T Lを濃度依存的に活性化する 3個のペプチド CL c k 61 - 69 (配列番号 l l) 、 Lck246— 254 (配列番号 12)、 Lck422-430 (配列番号 16) 〕のうち、 Lck246— 254 (配列番号 12 ) または L c k 422— 430 (配列番号 16 ) は、転移性大腸癌患者の PBMCから、腫瘍細胞株である P an c— 1、 S W 620に対する H L A— A2拘束性 CTLを誘導した。

すなわち、転移を有する大腸癌患者の PBMCをこれら 3個のぺプチドのいずれかで in vi t roで 3回刺激し、さらに放射線照射した自己 P B M C (a ut o l o gous-PBMC) を相当するぺプチドでパルスしたものを抗原提示細胞（AP C) として用いて刺激したとき、 Lck246— 254 (配列番号 12) 、 L ck422— 430 (配列番号 16 ) で刺激した該大腸癌患者の P B MCは、 HLA— A2_大腸癌細胞株 COLO 320に対して反応しなかったが、 HLA— A2⁺大腸癌細胞株SW 620や H L A - A 2 +脬臓癌細胞株 P a n c 一 1に反応して I FN—ァを産生し〔図 15の（A) および（C) 参照〕、 HL A— A2+腫瘍細胞を溶解した〔図 15の（B) および（D)参照〕。

(癌患者における H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導）

Lck246-254 (配列番号 12 ) および L ck 422 -430 (配列番号 16) は、大腸癌患者だけではなく、転移を有する肺癌患者および食道癌患者より得た PBMCから HLA— A24拘束性 C T Lを誘導することができた。 H LA— A 2拘束性 C T Lの誘導は、 H L A— A 2 +大腸癌細胞株 S W 620に対する I FN—ァの産生を指標にして測定した。 Lck 246— 254 (配列番号 12) は癌患者 6例中 2例、 Lck422— 430 (配列番号 16) は 6例中 3 例において、 PBMC中にHLA— A2拘束性のCTLを誘導した（表 8参照）。従って、これら 3個のペプチドは、細胞傷害性 T細胞の誘導剤および誘導方法に使用可能である。また、 HLA— A2対立遺伝子（al l e l e) は日本人の人口の約 40%、北コ一カサス人の 49%、南コーカサス人の 38%、アフリカ人の 23%、中国人の 53% (HLA 199 1， Vo l. 1 : 1065〜； L 22 0， Oxf ord : Oxf o rd S c i ent i f i c Pub l i cat i ons， 1992 ) で見られる。従って、これらのペプチドは比較的多数の癌患者における特異的免疫治療に適用しうる。 (ペプチド）

本発明のぺプチドは、配列表の配列番号 1〜 9または配列番号 1 1 ~ 17に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明のペプチドは、 HLA— A2 4拘束性または HLA— A2拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導または/活性化することができる。

また、本発明のぺプチドは配列表の配列番号 10に記載のァミノ酸配列からなるペプチドであって、少なくとも HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導および/または活性化しうるべプチドでありうる。 HL A— A 24拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導およびノまたは活性化しうるべプチドの選択は、後述する実施例に記載の方法を用いて行うことができる。

さらに、本発明のペプチドは、 111^ ー24拘束性（ ^<1]^と111^八ー2拘束性 CT Lの両方を誘導および/または活性化できるぺプチドであってもよい。

このように特定されたべプチドを元にして、少なくとも HLA— A 2402拘束性および Zまたは H L A— A 2拘束性の細胞傷害性 T細胞による認識性の強さを指標とすることにより、 1ないし数個のアミノ酸の欠失■置換 ·付加などの変異あるいは誘発変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドも提供される。欠失 ·置換 ·付加などの変異あるいは誘発変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（Ulme r， L . M. ， S c i enc e, 219， 66 6, 1983 )を利用することが出来る。さらに、これら利用できるぺプチドは、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。

また、 1 c k遺伝子のコードする蛋白質は、多型にもとづくと推定されるアミノ酸配列が若干異なるものがいくつか報告されている（Nat ure, 319 : 682 - 685, 1986、 Eur. J. I mmun o 1. , 16 ： 1643 - 1646, 1986、 J. Ce l l. B i o c h em. ， 38 : 1 17 - 126， 1988、 Gene, 84 : 105— 113, 1989) 。本発明のぺプチドは、このアミノ配列が異なる 1 c k遺伝子産物由来のぺプチドであって、 HLA— A 24拘束性および/または HLA— A 2拘束性の C T Lを誘導できるものも含まし o

例えば、本発明のベプチドの 1つである L ck488-497は配列表の配列番号 2に記載するァミノ酸配列 D Y LRSVLEDFからなるが、 Natur e, 319 : 682-685, 1986に報告されている L c k蛋白質のアミノ酸配列に基づく 488— 497位のアミノ酸配列は DYLRSVLDDFであり、この配列も HL A— A 24結合モチーフに含まれる。

本発明のぺプチドは、 HLA— A24拘束性および/または HLA— A 2拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性 C T Lを誘導および Zまたは活性化しうる腫瘍抗原べプチドであり、腫瘍特異的細胞傷害性 CT Lを誘導および/または活性化するために使用できる。すなわち、本発明のペプチドは、癌ワクチンなどとして癌の特異的免疫治療に使用できるものである。

(ポリヌクレオチド）

本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、配列番号 1〜 9および配列番号 11〜 17に記載のペプチド、およびこれらペプチドのアミノ酸配列において 1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有し、かつ少なくとも HLA— A2402拘束性および/または HLA— A 2拘束性の細胞傷害性 T細胞による認識性を有するぺプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖である。さらに本発明のポリヌクレオチドには、これらポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドも包含される。ポリヌクレオチド分子として DNA分子を代表例にとると、「DNA分子にストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする DN A分子」は、例えば前述の Mo 1 e c u 1 e r C l on i ngに記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイプリタイズする」とは、例えば、 6 xSSC、 0. 5%SDSおよび 50 %ホルムアミドの溶液中で 42°Cにて加温した後、 0, l xSSC、 0. 5%SD Sの溶液中で 68°Cにて洗浄する条件でも依然として陽性のハイプリタイズのシグナルが観察されることを表す。

本発明のポリヌクレオチドは、いずれも本発明のぺプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸としての試薬 ·標準品としても利用できる。

(形質転換体）

本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、レトロウイルス等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によって、本発明からなるぺプチドの提供が可能である。本発明のペプチドは、単純蛋白質の状態で細胞傷害性 T細胞による認識性が確認されており、蛋白質への糖付加の有無を無視できるため、遺伝子組換え技術による製造方法において宿主の選択は生産性のみを考慮すればよく容易にできる。

形質転換は、自体公知の手段が応用され、例えばレブリコンとして、プラスミド、染色体、ウィルス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法があるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系が利用できる。ベクターは、選択した宿主の種類により選別され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。組合せは原核細胞、真核細胞によって分別され、プロモー夕一、リボソーム結合部位、ターミネ一夕一、シグナル配列、ェンハンサ一等を自体公知の方法によって組合せ利用できる。形質転換体は、自体公知の各宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、発現産生されるペプチドの生理活性、特に細胞傷害性 T細胞による認識性を指標にしておこなってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養によって生産される。

(化学合成）

本発明のペプチドは、通常のペプチド化学において知られる方法でも製造できる。例えば、ペプチド合成（丸善） 1975年、 "Pept i de Synt h e s i s, I nt e rs c i ence, New Yo rk 1996"が例示されるが、無論既知の方法が広く利用可能である。 (ペプチドの回収）

本発明のペプチドの回収は、細胞傷害性 T細胞による認識性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差に基づく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。より好ましくは、該ペプチドに対する抗体を作成し、ポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。 (抗体）

本発明のぺプチドを免疫学的に認識する抗体は、自体公知の抗体作製法に従つて得ることができる。例えば、本発明のペプチドをアジュバントの存在下または非存在下で単独または担体に結合して動物に投与し、体液性応答および/または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、兎、ャギ、馬等が好適に用いられる。

ポリクロ一ナル抗体は、本発明のペプチドで免疫された動物の血清から自体公知の抗体回収法、例えば好ましい手段として免疫ァフィ二テイク口マトグラフィ一法により得られる。モノクローナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。

かくして得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本発明のペプチドの精製用抗体、試薬、標識マ一力一などとして利用できる。

(スクリーニング）

本発明のペプチド、該べプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのァミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、または本発明のペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数を組合せることによって細胞傷害性 T細胞を誘導または活性化しうる化合物のスクリー二ングに有効な手段を提供する。スクリーニング方法は、自体公知の医薬品スクリ —ニングシステムを利用して構築可能である。本発明は、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物も対象とする。該化合物は、本発明のペプチドの H L A - A 2 4 0 2拘束性および/または H L A— A 2拘束性の C T Lによる認識性を増強する化合物、本発明のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物、本発明のぺプチドと同様に細胞傷害性 T細胞を誘導もしくは活性ィ匕しうる化合物、また本発明のぺプチドによる C T Lの誘導もしくは活性化を増強する化合物などでありうる。

(医薬組成物）

本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき作製したベクタ一、該ベクターにより形質転換させた細胞、本発明のぺプチドを免疫学的に認識する抗体、本発明のスクリーニング方法によって得られる本発明のペプチドの H L A— A 2 4 0 2拘束性および/または H L A— A 2拘束性の C T Lによる認識性を増強する化合物や本発明のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物などを、単独または複数組合せて利用することによって、これらの少なくとも 1つを含んでなる医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は癌の治療において有用である。

例えば、本発明のペプチドを含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用される。このとき細胞性免疫の賦活のために、本発明のペプチドは適当なアジュバン卜の存在または非存在下で、単独で用いるかまたは担体に結合して用いる。担体は、それ自体が人体に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。剤形は、自体公知のペプチド製剤の手段を応用して適宜選択できる。その投与量は、細胞傷害性 T細胞による認識性により変化するが、一般的には活性本体として 0 . 0 1 m g〜 l 0 O m g/日/成人ヒト、好ましくは 0 . l m g〜 l O m g/日/成人ヒトである。これを数日ないし数月に 1回投与する。

または、患者の末梢血より単核球画分を採取し、本発明のペプチドとともに培養し、 C T Lが誘導された該単核球画分を患者の血液中に戻すことによつても、有効な癌ワクチン効果を得ることができる。培養するときの単核球濃度、ぺプチドの濃度等の培養条件は、簡単な実験により決定することができる。また、培養時、ィン夕一ロイキン 2などのリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。本発明のぺプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、癌の遺伝子治療のために有用である。これら D N Aをベクターに担持させ、直接体内に導入する方法またはヒ卜から細胞を採取したのち体外で導入する方法があるが、いずれも利用できる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ヮクシニアウィルス等が知られているが、レトロウイルス系が推奨される。無論これらウィルスは複製欠陥性である。その投与量は、細胞傷害性 T細胞による認識性により変化するが、一般的には本発明のベプチドをコードするポリヌクレオチド含量として 0 . 〜： I 0 O m gノ日/成人ヒト、好ましくは l g〜5 0 m gZ日/成人ヒトである。これを数日ないし数月に 1回投与する。 (診断方法および診断用試薬キット）

本発明のペプチドは、該ペプチドの発現に関連した疾患（特に消化器系癌）の診断方法として有用であり、例えば当該べプチドをコ一ドしている核酸配列との相互作用 ·反応性を利用して、相応する核酸配列の存在量を決定すること、および Zまたは当該ペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、および/ または当該べプチドの存在、個体由来の試料中の存在量を決定することによって行われる。すなわち、本発明のぺプチドを診断マ一カーとして検定するのである。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、 PCR反応系等を利用すればよい。また本発明には、上記診断方法に使用する試薬キットも含まれる。本発明の試薬キットは、少なくとも本発明のペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ぺプチドを認識する抗体のうち 1つ以上からなるものである。実施例

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明'するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

実施例 1

( 1 c k遺伝子の同定）

細胞傷害性 T細胞を活性化しうる腫瘍抗原を得るために、 KE 4腫瘍細胞の c DNAライブラリーから作製した合計 10⁵個の cDNAクローンを HLA— A 2402と共にトランスフエクシヨンした VA 13細胞を刺激細胞（s t imu l at or) として用い、 CTLとともに培養して、 CTLを活性化せしめる c DNAクローンを得た。 CTLの活性化は、 I FN—ァの産生を指標にして測定した。この方法により、腫瘍拒絶抗原をコ一ドする遺伝子の同定が可能である（ J . Exp. Med. 187 : 277〜 288、 1998) 。

具体的には、エフェクター細胞として用いた C T Lは、 HLA— A2402拘束性腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞（KE4— CTL) である。この細胞は、食道癌患者から樹立した（I nt. J. Canc e r, 81 : 457— 466、 19 99) 。また、腫瘍抗原を得るために、 KE 4腫瘍細胞を用いてそのポリ（A) + RNAを cDNAに変換し、これを Sai lアダプターと結合して発現べクタ -pSV-SPO T- 1 (G I B C 0 B L) 中に挿入した。 HLA— A2 402または対照である HL A— AO 201の。0 八を、逆転写 PC R (RT -P CR) によって得、そして、真核生物発現べクタ一 p CR 3 (I nvi t r 0 g e n) 中にクローン化した。ブラスミド DNAプールまたは KE 4 cDNA ライブラリーのクローンの 2 O Ongと、 HLA— A2402の CDNA200 ngとを、 OPT I— MEM (GIBCO BRL) 70 1中で、リボフェクチン 1 1と、 15分間混合した。

混合物の 30 1を、ついで、 2 X 10⁴個の VA 13細胞に添加し、 5時間インキュベーションした。次に、 10%の？。3を含む11卩1^ 1— 1640培地 200 1を加え、 2日間培養した。その後、 KE4— CTL ( 10⁴細胞/ゥエル）を添加した。 18時間ィンキュベ一ション後、上清の 100 / 1を回収し、既に報告した（J. Exp. Med. 187 ： 277〜 288、 1998) ように、 E L I S Aキットを用いて I FN—ァを測定した。

その結果、 1つのクローン（クローン 21) が、 HLA— A24拘束性 KE 4 — CTLを活性化することを見いだした（図 1) 。この c DNAクローンの塩基配列は 1， 750塩基（bp) 長であり、かつ 509アミノ酸からなる L c k蛋白質のアミノ酸配列のポジション 31 - 506に対応する塩基配列であるポジシヨン 283— 2, 032と 100 %相同性を有することが判明した。すなわち、 Lck遺伝子がコードする蛋白質は、 HLA— A2402拘束性に CTLを活性化しうる腫瘍抗原であることが示唆された。

また、 HLA— A 2402拘束性 KE— CTLの代わりに、大腸癌患者より樹立した CTL株（OK— CTL) の亜株である 0 K— C T L一 e亜株（HLA— A0207 ) (J. Immuno 1. 、 163 : 4999-5004, 1999 ) ならびに肺癌患者より樹立した C T L株（GK— CTL) の 2つの亜株である G K-CTL 2 - 2— 4亜株（HLA— A02 06) および GK— C T L 2 - 2 - 5亜株（HLA— A02 06 ) の合計 3つの H L A— A 2拘束性 C T Lをェフエクタ一細胞として用い、 1 c k遺伝子と HL A— A 020 1、 HLA— AO 2 0 6、 H L A- A 02 07, HLA-A 240 2, または H L A— A 26 0 1とをトランスフエクシヨンした VA 1 3細胞を刺激細胞として用いて、 L c k蛋白質が11 八ー八24拘束性 CTLのみならず、 11 八ー八2拘束性〇11^をも活性化しうる腫瘍抗原であることを見いだした〔図 2の（A)、（B) および（C) 〕。実施例 2

(L c k蛋白質の発現）

種々の細胞および組織における蛋白質レベルでの L c k ( 5 6 kDおよび 5 9 kD) の発現を、抗 L c kモノクローナル抗体を用いてウエスタンプロット分析により検討した。

原発性の結腸癌（ n = 49 ) 、非腫瘍性の結腸（ n = 5 ) 、肺癌〔腺癌： n = 8, 扁平上皮癌（S CC) ： n= 8〕、食道癌細胞を検討に使用した。さらに、大腸癌細胞株（COLO 20 1 , COLO 2 0 5 , COLO 320 , HCT 1 1 6 , および SW 6 20) 、肺癌細胞株（LK 87 ：腺癌細胞、および LK 7 9 ：小細胞癌細胞）、食道癌細胞株（KE 4) も検討に用いた。

試料は、 1 OmMの T r i s— HC 1、 H 7. 4、 1 50 mM NaC l、 0. 5 T r i t o n X - 1 00、 0. 2 mM PMS F (S i gma Ch emi c a l C o. ) と 0. 03 トリプシンインヒビ夕一単位 ,m 1のァプロチニンからなる緩衝液で溶解し、超音波処理し、そして 14, O O O rpmで 2 0 分間遠心した。得られた上清を、細胞質（c y t o s o 1)画分として使用した。溶解物は、 1 0%SD S— PAGEで分離した。

ァクリルアミドゲル中で得られた蛋白質は、 Hy b o nd^TM—ポリビニリジンジフルオラィド膜（Ame r s h am) に転写（b l o t ) し、抗 L c kモノクロナ一ル抗体（S ant a C r u z) と室温で 4時間ィンキュベ一シヨンした。他の方法は、既報告（I nt. J. Canc er, 54 : 158- 165, 19 95) のウエスタンブロヅト分析に従った。

L c k蛋白質は未刺激の末梢血単核球（PBMC) では認められなかったが、 10//g/mlのフィ卜へマグノレチニン (phyt ohemagglut i n i n； PHA) で 48時間刺激した後の活性化された PBMC (PHA-b l as t ) の細胞質（ c y t o s o 1) 画分には検出されるようになった。 L c k蛋白質は S CCまたは腺腫瘍細胞株などの試験した全ての悪性腫瘍細胞株、並びに食道癌、肺 S CCおよび肺腺癌細胞などの多種の臓器から得られた新鮮腫瘍組織の大多数で検出された。一方、非腫瘍性の結腸組織のいずれでも全く検出されなかつた（表 1 ) 。

Lck蛋白質の発現

細胞の種類/由来

細胞株組織正常細胞

末梢血単核球 2/2

PHA-blast 2/2

C0S-7/VA13 0/2

非癌部大腸組織 4/6 非癌部食道組織 4/6 非癌部子宮組織 4/6 癌細胞

大腸癌 7/7 38/49

6/14 5/9

肺癌 4/17 4/10

2/8 ND

子宮癌 5/7 55/64

卵巣癌 0/12 ND 肝細胞癌 0/13 ND 骨肉腫 0/16 ND 原発性脳腫瘍 0/16 5/24

転移性脳腫瘍 6/6

ND：未確定

実施例 3

(HLA-A24拘束性 CT Lにより認識される腫瘍抗原ぺプチド）

HL A-A24分子結合性の L c k由来の腫瘍抗原ペプチドを特定するために、

13個の異なったぺプチドを合成して C 1 R/A2402に導入し、 KE4— C

TLによる I FN—ァ産生を増強する能力について試験した。

HLA-A2402分子への結合能をもつ L ck由来ぺプチドは、 HLA— A

24結合モチーフ（mo t i f) に対するペプチドについて文献検索し、 13種の異なるぺプチドを、 1 c k遺伝子産物の 509アミノ酸配列（Na t ur e, 3 19 : 682〜685、 1 986 ) に基づいて合成した。但し、一部アミノ酸に変更を加えたものもある。合成したぺプチドを表 2に示す。表 2

L c kぺプチドアミノ酸配列

39-46 R Ν G S E Y R D P し n-B ： S Υ Ε P S H D G D し

Π 4-122 ： N F V A K A N S し

162-170 ： S F S し S V R D F

191-199 ； F Υ 1 S P R 1 T F

208-216 ： H Υ Τ N A S D G し

303-31 Z ；し Υ A V V T Q E P 1

317-325 ： E 丫 M E N G S し V

353-361 ： A F ！ E E R N Y 1

393-402 ： E Υ T A R E G A K F

445-453 ： T Ν P E V 1 Q N し

486-494 ：丁 F D 丫し R $ V し

488-497 ： D Υ し R S V し E D F 腫瘍抗原ぺプチドの特定のために、 HLA— A2402でトランスフエクションした C 1 R/A 2402細胞の 2 10⁴個を、終濃度 10 Mのべプチドと 2時間パルスした。ついで、 1 X 10⁴個の KE 4— C T Lを加え、 18時間ィンキュベーシヨンした。上清の 100 1を回収し、 EL I SAによって、 I F N— yを測定した。

合成した 13個のぺプチドのうち、 6個のぺプチド〔L c k 71— 80、 L c k 208 - 216 (配列番号 3) 、 Lck317— 325、 Lck353— 36 l、 Lck486— 494 (配列番号 1)、 L ck488— 497 (配列番号 2 )〕が、 CTLにおける I FN—ァ産生増強活性を有しており（図 3) 、特に 3個のぺプチド〔Lck208— 216 (配列番号 3 ) 、 L c k 486— 494 (配列番号 1) 、 Lck488— 497 (配列番号 2 ) 〕で強い活性が認められた。 L ck486-494 (配列番号 1)、または L ck488— 497 (配列番号 2 ) ぺプチドの、 CTLによる I FN—ァ産生を増強する活性は濃度依存的であり、 1 nM程度で認められた。一方、 Lck208— 216 (配列番号 3) の活性は 100 nM以上で認められた（図 4) 。

C 1 R/A 2402細胞の代わりに VA 13細胞（ 2 x 10⁴個）を用い、 H LA— A2402でトランスフエクシヨンしてこれらのぺプチドをパルスし、刺激細胞（s t imulat o r) として使用した場合も、同様の結果が得られた。また、上記の CTL活性化試験において、抗 CD3 (NuT 3)、抗 CD4 (N UTh/s) 、抗 CD8 (NuTC/i) 、抗 CD 13 (MCS— 2) 、抗 MH Cクラス I (W6/32) または抗 MHCクラス II (HDR 1 ) 抗体（Int. J. Cance r, 58 ： 317〜 323, 1994) を用いたところ、 3つの各ぺプチドでパルスした C 1 R/A 2402細胞に対する反応における KE 4一 CTLによる I FN—ァ産生は、抗 CD3、抗 C D 8および抗 MH Cクラス Iモノクロ一ナル抗体によって阻害されたが、抗 CD4、抗 MHCクラス IIおよび抗 CD 13モノクローナル抗体では阻害されなかった〔図 5の（A) 、 (B) および（C)〕。従って、 KE4— CTLは、 CD 3 + CD 8 + C D 4—表現型を有し、 MHCクラス Iを認識する細胞傷害性 T細胞であることが確認された。さらに、 CT Lにおけるペプチドの特異性を確認するために、 KE4—CTL の亜株（sub l ine) を、親株である HLA— A2402拘束性 KE4— C T Lから、限界希釈培養（l imi t ing d i lut i on c u 1 t u r e) によって、樹立した（J. Exp. Med. 187 : 277〜 288、 19 98) 。得られた CD 3 ⁺ CD 8 + CD 4—表現型を有する 20の異なった KE 4 — CT Lの細胞亜株（sub l ine) について、上記 3個の各ぺブチドに対する反応性にいて試験した。

その結果、 2つの亜株（亜株 #49および # 93) が L c k488— 497 (配列番号 2) を、 1つのクローン（クローン # 80) が L c k 486— 49 4 (配列番号 1) を認識した〔図 6の（B) 、 (C) および（D) 〕。亜株 # l ^iLck208— 216 (配列番号 3 ) および L c k 486— 494 (配列番号 1 ) の両方と反応した〔図 6の（A) 〕。他の 16の亜株はこれらのベプチドのいずれとも反応しなかった。このことから、 C T Lは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることが示唆される。実施例 4

(ペプチドによる HLA— A24拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導）

3個のペプチド〔（Lck208— 216 (配列番号 3) 、 Lck486-4 94 (配列番号 1) 、 Lck488— 497 (配列番号 2 ) 〕について、大腸癌患者から得た PBMCから、 L c k蛋白質を発現している腫瘍細胞株（KE4、 SW620および COLO201) に対する HLA— A24拘束性 CTLを誘導する活性を試験した。

HL A-A24+患者または健常人の PBMCの 2 10⁶個を、培養培地（4 5 %RPM I _ 1640培地、 45%A IM— V®培地 I B CO BRL、および I L一 2の 10 OU/mlと 0. 1 mMの M E Mノンエッセンシャルアミノ酸溶液 ZG IB CO BR Lを含む 10 %F C S) 2mlを含む 24ゥエルプレートの各ゥエル中で、ぺプチド 10 Mとィンキュベ一シヨンした。培養 7日目および 14日目にこの細胞を回収して洗浄し、放射線照射（50グレイ）した自己 PBMCまたは樹状細胞をぺプチドでパルスしたものを抗原提示細胞（APC) として用いて刺激した。この樹状細胞は、 10%FCSと 100 UZm 1の I L一 4と 100 U/mlの GM— C S F (顆粒球 .マクロファージ一コロニー刺激因子）を含む RPM I 1640 (GIBCO BRL) 中で、 P BMC (2 x 10⁶細胞/ゥエル）を 7日間インキュベーションすることにより s¾守しァこ。

培養 21日目に採取した細胞をエフェクターとし、直ちに種々の夕一ゲヅト（標的細胞）に対する反応性を、 I FN—ァの産生能を指標として E L I S A法により測定した。その結果を図 7に示す。 Lck208— 216 (配列番号 3) 、 L ck486-494 (配列番号 1) 、 Lck488— 497 (配列番号 2 ) を用いて i n v i t r oで 3回刺激した PBMC、特に∑ 0¾:486— 494 (配列番号 1) 、 Lck488— 497 (配列番号 2) で刺激した PBMCは、 HL A— A 24-腫瘍細胞（CO LO 201 ) に対する反応より、 11 八ー八24⁺腫瘍細胞（KE 4および SW620 ) に対する反応において、より多くの I FN— ァを産生した。一方、健常人から得た PBMCは、抗原提示細胞（APC) として放射線照射した PBMCを用いてパルスした 3個のぺプチドのいずれを用いて刺激しても、 HLA— A24拘束性の CTL活性は示さなかった。健常人から得られた PBMCはぺプチドをパルスした樹状細胞（Dendr i t i c C e 1 1 ； DC) を APCとして用いて刺激したときには HLA— A 24拘束性の CT L活性を示した（表 3) 。表 3

癌細胞株の認識によるイン夕一フヱロン-ァ産生量ドナー抗原提示細胞ぺプチド

(pg/ml)

KE4 SW620 COL0201

(A24⁺) (A24+) (A24-) 大腸癌患者自己末梢血単核なし 1079 Q02 194

Lck208-216 1479 1113 188

Lck486-494 1857 1724 289

Lck488-497 2527 2140 424 健常卜ナー 1 目己樹状細胞なし 230 380 54

Lck208-216 570 786 124

1105 2061 177

Lck488-497 621 966 122 健常ドナー 2 自己末梢血単核なし 101 187 0

Lck208-216 82 128 1

Lck486-494 41 94 10

Lck488-497 90 140 6 また、標的細胞からの⁵¹ C r遊離試験のために、ベプチドを用いて 3回刺激した上記 PBMCを、相当するぺプチドで予めパルス処理した放射線処理 HL A— A 24+異種 PBMC (2 X 10⁵細胞 Zゥエル）からなるフィーダ一細胞と共にさらに培養した。再培養の約 24日目に、これら細胞の細胞傷害性 T細胞活性を I FN—ァ産生量の測定により確認し、さらにこれら細胞について 6時間の⁵¹ C r遊離試験をエフェクター /ターゲット（標的細胞）の比率を変えて行い、細胞傷害性を直接的に検討した。上記 3つの L c k由来のぺプチドで刺激した PBM Cは、 HLA— A24 + 1^£腫瘍細胞ぉょび3 620腫瘍細胞を溶解したが、健常人からの H L A— A 24 + P HA活性化 T細胞または H LA— A 24— C 0 L O 2 0 1腫瘍細胞を溶解しなかった。 L c k 4 8 8— 4 9 7を用いた結果を図 8の（A) に、 L c k 2 0 8— 2 1 6を用いた結果を図 8の（B) に示す。従つて、 L c k由来のぺプチドは HL A— A 2 4拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導しうることが明らかとなつた。実施例 5

(癌患者から得た末梢血単核球における HLA— A 2 4拘束性 C T Lの誘導）

3個のぺプチ〔L c k 2 0 8— 2 1 6 (配列番号 3 ) 、 L c k 4 8 6 - 4 9 4 (配列番号 1 ) 、 L c k 4 8 8— 4 9 7 (配列番号 2 ) 〕について、癌患者から得た P BMCから、 L c k蛋白質を発現した腫瘍細胞株（KE 4、 SW6 2 0 および C O L O 2 0 1 )に対する HLA— A 2 4拘束性 C T Lを誘導する活性を、 I FN—ァ産生量を指標に測定した。 C T Lの誘導方法、および I FN—ァ測定方法は実施例 4と同様の方法を用いた。

その結果、表 4に示すように、大腸癌患者および食道癌患者の P BMCから、 L c k 2 0 8 - 2 1 6 (配列番号 3) 、 L c k 4 8 8— 4 9 7 (配列番号 2 ) により C T Lが誘導された。表 4

L ckペプチドによる C T L誘導症例年齢性別癌ゃ鱼転移の有無ぺブチド Lck208-216 Lck486-494 Lck488-497

(-)

N.I. 51 男性大腸想 + - + - +

Y.K. 73 女性食道癌 + 試験せず + - + 次に、該大腸癌患者の P BMC ( 2 x l 0⁶個）を予め、 3個のペプチド、 L c k 2 0 8— 2 1 6 (配列番号 3) 、 L c k 4 8 6— 4 9 4 (配列番号 1 ) 、 L c k 4 8 8 - 4 9 7 (配列番号 2 ) を加えて刺激し、その後、抗原提示細胞として各ぺプチドを 10 xg/ml加えてィンキュベ一シヨンした HLA— A24 + C 1R/A 2402細胞に加えてさらに培養し、培養上清中に産生された I FN 一ァ量を測定した。図 9の（A) 、 (B) 、 (C) および（D) に示すように、予め、 Lck486— 494 (配列番号 1 ) または L c k 488— 497 (配列番号 2) で刺激した大腸癌患者の PBMCは、抗原提示細胞に提示されたべプチド、それそれ L c k 486— 494 (配列番号 1 ) または L c k 488— 497 (配列番号 2) にのみ反応して I FN—ァ産生、すなわち CTLを誘導した。つまり、 Lck486— 494 (配列番号 1) または Lck488— 497 (配列番号 2) は大腸癌患者の PBMCから、予備刺激することによりペプチド特異的な CTLを誘導しうることが判明した。一方、 Lck 208— 216 (配列番号 3) またはペプチド非存在下で大腸癌患者の PBMCを予め刺激した場合は、ぺプチド特異的な CT Lは誘導できなかった。

次に、該大腸癌患者から誘導された CTLの性状を検討するために、標的細胞として SW620細胞を用い、抗 CD4 (NUTh/s) 、抗 CD 8 (NuTC /i) 、抗 CD 14、抗 MHCクラス I (W6/32) または抗 MHCクラス II (HDR 1 ) 抗体をそれそれ 10 Adg/ml、 Lck488-497 (配列番号 2) を l O^g/ml加え、さらに上記大腸癌患者から誘導された CTLを加えて、インキュベーションし、上清中に産生される I FN—ァ量を測定した（図 1 0) 。その結果、 CTLからの I FN—ァ産生は抗 CD 8および抗 MHCクラス Iモノクローナル抗体によって阻害された。すなわち、大腸癌患者から誘導された CTLは、 CD 8 + CD4—表現型を有し MHCクラス Iを認識する細胞傷害性 T細胞であることが確認された。

上記大腸癌患者の PBMC中の CT L前駆細胞について検討を行った。 96ゥエルプレートに SW 620細胞を播いてィンキュベ一ションし、予め L ck48 8 - 497 (配列番号 2 ) で刺激した上記大腸癌患者の CTLを 1個〜 100個 /ゥエルとなるよう加えてさらに培養し、標的細胞である SW620細胞の生存するゥエルを確認した。対照として、ペプチドで刺激しない上記大腸癌患者の C TLを用いた。結果は図 1 1に示す。大腸癌患者の PBMC中の CTL前駆細胞の頻度は、ペプチドで刺激しないときは 1/634であるが、 Lck488— 4 97 (配列番号 2) で刺激すると 1/81となる。すなわち、ペプチドで刺激することにより、 CTL前駆細胞が増加することが認められた。実施例 6

(HLA— A24拘束性 CT L誘導性を有するベプチドの検討）

以上のように、 L c k由来の 3個のペプチド L c k 208— 216 (配列番号 3) (HYTNASDGL) L ck486— 494 (配列番号 1) (TFDYL RSVL)および L ck488— 497 (配列番号 2) (DYLRSVLEDF) が11 ー 24+腫瘍細胞株を認識する CT Lを誘導することができることを見いだした。これらの結果から、 2個のペプチド L c k486— 494 (配列番号 1 ) および L ck488— 497 (配列番号 2 ) の重なる領域である一定のァミノ酸 DYLRSVを、ぺプチドで誘導された CT Lが腫瘍抗原ェビトープとして認識すること、および L c k蛋白質においてキナーゼドメインに含まれるこの部位が腫瘍拒絶に対する意義を有することが示唆される。このアミノ酸配列 DY LRSVに着目し、この配列に相同性をもつペプチドを検索したところ、表 5に示す様に、 L c kと同じ S r cファミリ一に属するチロシンキナーゼ（Ann. Rev. B i o chem. 54 : 897— 930, 1985) に、相同性を有するアミノ酸配列をもつものがあることが判明した。

36

表 5

Lck 4Θ6-498 ：丁 F D Y し R S V し £ D F F

翻 rag

翻 4ob一 4y4 g

r- re • 1 r c Y L Q A r し L· C u Y r c

T • • I c Γ e c V I 【 W o r し Β n u v p y Γ

Far 504-516 ：丁 F E Y し d s p し Ε D F F

，

Fyn 512-524 ： T F E Y L Q s F し B D Y F

Lyn 489-501 ：丁 F D Y し Q s V し D D F Y

Hck 503-515 ： τ F E Y 1 Q s V し D D F Y

B!k 482-494 ： τ F E F し Q s V L E D F Y これら S r cファミリ一由来のぺプチドのァミノ酸配列に基づいて、 S r c 5 11-519 (配列番号 4 : TFEYLQAFL) 、 Ye s 508— 516 (配列番号 5 ： TFEY I QSFL) 、 Fyn512-520 (配列番号 6 ·· T F E YLQSFL) , Lyn489-497 (配列番号 7 ： TFDYLQSVL) 、 Hck503— 51 1 (配列番号 8 ： TFE Y I QSVL) 、 B lk482-4 90 (配列番号 9 ： TFEFLQSVL) を合成し、各 10〃g/mlを標的細胞としての SW620細胞とともにィンキュベ一シヨンし、さらに実施例 1および実施例 2で用いた K E 4— C T L細胞を加えて培養し、培養上清中に産生された I FN—ァ量を指標として CTL誘導活性を調べた。また、陽性コントロールとして標的細胞に KE 4を使用した。その他の方法は実施例 4と同様の方法を用いた。図 12に示すように、各 S r cフアミリー由来のベプチドは、 L c k由来のべプチドと同様、あるいはそれ以上の CT L誘導能を示した。実施例 7

(癌患者における S r cフアミリー由来のぺプチドによる C T Lの誘導）

L c k486 -494 (配列番号 1 ： TFDYLRSVL) 、 S r c 5 1 1— 5 19 (配列番号 4 : TFEYLQAFL) 、 Ye s 508— 5 1 6 (配列番号 5 : TFEY I QS FL) 、 Fyn5 12 - 520 (配列番号 6 ： TFEYLQ SFL) 、 Lyn489 -497 (配列番号 7 ： TFDYLQSVL) 、 H c k 503 - 5 1 1 (配列番号 8 ： TFEY I QSVL)、 B l k482— 490 (配列番号 9 ： TFE FLQ SVL) について、転移性癌患者より得た P B M Cから HLA-A24拘束性 CTLを誘導しうるか検討した。 CTLの誘導方法および CTLの活性測定法は実施例 4と同様の方法により行い、標的細胞としては、 K E 4細胞（HLA— A2402/26) 、 SW620細胞（HLA— A020 1 ノ 24) 、 COLO201細胞（HLA - Α010 ΐΖ0201) 、 νΑ13細胞（HLA— A02) を用いた。 L c k486— 494 (配列番号 1 ) は癌患者 7例中 4例、 S r c 5 1 1— 5 1 9 (配列番号 4 ) は 3例中 2例、 Y e s 508 - 5 1 6 (配列番号 5 ) は 3例中 1例、 F y n 5 12— 520 (配列番号 6 ) は 2例中 1例、 H c k 503— 5 1 1 (配列番号 8 ) は 2例中 2例、 B 1 k 482 - 490 (配列番号 9)は 2例中 1例において、？81^ ( 中に（ 1¹1^を誘導した。しかし、 Lyn489— 497は検討した 2例いずれにおいても C T Lは誘導しなかった。実施例 8

(HLA— A 2拘束性 C TLにより認識される腫瘍抗原ぺプチド）

HL A— A2分子結合性の L c k由来の腫瘍抗原べプチドを特定するために、 24個の異なったペプチドを合成して VA 13 (HLA-A02) に導入し、 0 K一 CTLまたは GK— CTL亜株（2— 2— 4) による I F N—ァ産生を増強する能力について実施例 3と同様の方法で試験した。

HL A— A 2分子への結合能をもつ L c k由来べプチドは、 111^八—八2結合モチーフ（mo t i f) に対するペプチドについて文献検索し、 24種の異なるぺプチドを、 1 c k遺伝子産物の 509アミノ酸配列（Nature、 319 : 682〜 685、 1986 ) に基づいて合成した。合成したぺプチドを表 6および表 7に示す。

表 6

L c k由来ぺプチドの H L A— A 0 2 0 1結合モチーフ

340-348 ： K しし D M A A Q I

185-193 ： N し D N G G F Y I

36-44 ·' しし I R N G S E V

387-395 ： R L I E D N E Y 丁

347-355 ： Q I A E Q M A F I

492-500 ： S V し E D F F T A

299-307 ： R し V R し Y A V V

493-501 ： V し E 0 F F T A T

246-254 ： K し V E R L G A A

279-287 ： S M S P D A F L A

293-901 ： K Q し Q H Q R し V

151 -159 ； F し I R E S E S T

35-44 ：しし I R N G s E V

201 -210 ： G し H e し V R H Y T

231-240 ： W w E D E W E V

379-388 ： K I A 0 F G し A R し

294-303 ： Q し Q H Q R し V R し

335-344 ： K L T τ N K しし D

1 10-1 19 ： F I P F N F V A K A

250-259 ： R し Q A A Q F Q E V 表 7

L c k由来べプチドの HLA— A0206結合モチーフ

61-69 ：し Q D N し V I A し

239-247 ： E V P R E T しし

422-430 ： D V W S F G I し L

27-36 ： I V R し D G K D R L

腫瘍抗原ペプチドの特定のために、 HLA— A2でトランスフエクシヨンした VA13細胞の 2 X 10⁴個を、終濃度 10 /Mのべプチドと 2時間パルスした。ついで、 1 X 10⁴個の KE 4— C T Lを加え、 18時間インキュベーションした。上清の 100 1を回収し、 EL I SAによって、 I FN—ァを測定した。これらのぺプチドのうち、 7個のベプチド〔L c k 61— 69 (配列番号 1 1)、 Lck246-254 (配列番号 12)、 Lck294— 303 (配列番号 13)、 Lck340— 348 (配列番号 14)、 L ck347-355 (配列番号 15)、 Lck422-430 (配列番号 16)、 Lck492— 500 (配列番号 17)〕が OK— CTL亜株および GK— CTL亜株（2— 2— 4) の I FN—ァ産生を増強した〔図 13の（A) および（B) 〕。また、パルスするペプチドの濃度を変化させて同様の実験を行ったところ、 Lck61— 69 (配列番号 1 1) は特に OK— C T L亜株を、 Lck246— 254 (配列番号 12 ) は特に GK— C TL亜株（2— 2— 4) を、また Lck422— 430 (配列番号 16) は特に GK— CTL亜株（2— 2— 5) を、濃度依存的に活性化し、これら CT からの I FN—ァ産生を増強した〔図 14の（A) 、 (B) 、および（C) 〕。実施例 9

(ペプチドによる HLA— A2拘束性細胞傷害性 T細胞の誘導） 3個のぺプチド〔（Lck61— 69 (配列番号 11) 、 Lck246— 25 4 (配列番号 12) 、 Lck422-430 (配列番号 16) 〕について、転移を有する大腸癌患者から得た PBMCから、腫瘍細胞株 Pane— 1、 SW62 0、 COLO320および VA13に対する H L A— A 2拘束性 C T Lを誘導する活性について試験した。

転移を有する HL A— A2+大腸癌患者の PBMCを用い、実施例 4と同様の方法で CT Lの誘導および I FN— yの測定を行った〔図 15の（A)および（C)：)。また C T Lの細胞傷害活性を ⁵¹ C r遊離試験により直接的に測定した〔図 15の (B) および（D) 〕。 Lck246— 254 (配列番号 12 ) および L c k 4 22 - 430 (配列番号 16) は、転移を有する HLA— A 2+大腸癌患者からの PBMCから、 111^八—八2拘束性腫瘍特異的01¹1^を誘導した。実施例 10

(癌患者における HL A— A 2拘束性 CT Lの誘導）

3個のぺプチド（；（Lck61— 69 (配列番号 11) 、 Lck246— 25 4 (配列番号 12) 、 Lck422-430 (配列番号 16) 〕について、種々の癌患者から得た PBMCから、 HL A— A 2拘束性 CT Lを誘導しうるか検討した。 C T Lの誘導方法および C T Lの活性測定法は実施例 4と同様の方法により行い、標的細胞としては、 SW620細胞（HLA— A0201/24) を用いた。 Lck246— 254 (配列番号 12 ) は癌患者 6例中 2例、 L c k 42 2 -430 (配列番号 16) は 6例中 3例において、 PBMC中にCTLを誘導した（表 8) 。表 8

Lckぺプチドによる CTL誘導転移

征年齢性別ステーシ、、ぺプチ Lck246-254 Lck61-69 Lck422-430 例ドなし

1 53 女性大腸 IV + + - 一

2 72 女性大腸癌 W + + - +

3 57 女性大 fe癌 Ilia +

4 76 男性肺癌 III + 一 - +

5 50 男性食道癌 IV + - - +

6 73 男性 I

産業上の利用の可能性

本発明の L c k由来のぺプチドおよび S r cフアミリー由来のぺプチドは、腫瘍抗原べプチドであり、癌患者の PBMCから HL A— A 24拘束性および/または H L A— A 2拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導することができる。 Lck蛋白質は大腸、肺および食道を含む大多数の癌組織で発現している。すなわち、本発明の腫瘍抗原ペプチドは、癌を対象とする特異的免疫治療に用いることができる。また、 HL A— A 24対立遺伝子（a l l e l e) は、日本人の人口の約 60 % (多くはその 95%の遺伝型が A 2402である）、コ一カサス人の 20%、アフリカ人の 12 %でみられる。 HLA— A2対立遺伝子は、日本人の約 40%、中国人の 53 %、北コ一カサス人の 49 %、南コーカサス人の 38%、黒人アフリカ人の 23%においてみられる。従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドを使用する特異的免疫療法は、多数の癌患者に適用しうる。本発明により提供されるペプチド、これをコードするポリヌクレオチド、これを認識する抗体は、癌の治療および診断の分野で、極めて有用な手段を提供するものである。

配列表フリーテキスト配列番号 1 0 ：

<220>

<230> S r cファミリーチロシンキナ一ゼのアミノ酸配列に基づいて作製した- H L A - 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導する能力を有するぺプチド,

<222> (3)

<230> Xaaは、 Aspまたは Gluでありうる。 <222> (4) く 230> Xaaは、 Tyrまたは Pheでありうる。 <222> (5 )

<230> Xaaは、 Leuまたは l ieでありうる。 <222> (6)

<230> Xaaは、 Argまたは Ginでありうる。 <222> (7)

<230> Xaaは、 Serまたは Alaでありうる。 <222> (8)

<230> Xaaは、 Valまたは Pheでありうる。 <222> ( 10) <230> Xaaは、 Gluまたは Aspでありうる。 <222> ( 12) く 230> Xaaは、 Pheまたは Tyrでありうる。 <222> (13)

<230> Xaaは、 Pheまたは Tyrでありうる。

Claims

請求の範囲 .配列表の配列番号 1、配列番号 2、配列番号

3、配列番号

4、配列番号 5、配列番号 6、配列番号 7、配列番号 8、配列番号 9、配列番号 1 1、配列番号 1 2、配列番号 1 3、配列番号 1 4、配列番号 1 5、配列番号 1 6、または配列番号 1 7に記載のアミノ酸配列からなるぺプチド。

. 下記の式で表される配列表の配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列からなるぺプチド；

Thr-Phe-Xaa-Xbb-Xcc-Xdd-Xee-Xff-Leu-Xgg-Asp-Xhh-Xii

ここで、 Xaaは、 Aspまたは Glu、

Xbbは、 Tyrまたは Phe、

Xccは、 Leuまたは Ile、

Xddは、 Argまたは Gln、

Xeeは、 Serまたは Ala、

Xffは、 Valまたは Phe、

Xggは、 Gluまたは Asp、

Xhhは、 Pheまたは Tyr、

Xiiは、 Pheまたは Tyrである。

. 少なくとも請求の範囲第 1項または第 2項に記載のぺプチドからなる細胞傷害性 T細胞の誘導剤。

.請求の範囲第 1項または第 2項に記載のベプチドを用いることを特徴とする細胞傷害性 T細胞の誘導方法。

5 .少なくとも請求の範囲第 1項または第 2項に記載のぺプチドからなる癌ワクチン。

6 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のぺプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。

7 . 請求の範囲第 6項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィゼ一シヨンするポリヌクレオチド。

8 .請求の範囲第 6項または第 7項に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。

9 .請求の範囲第 8項に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。

1 0 . 請求の範囲第 9項に記載の形質転換体を培養する工程を含むペプチドの製造方法。

1 1 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。

1 2 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のペプチドと相互作用して、少なくとも H L A— A 2 4 0 2拘束性およびノまたは H L A— A 2拘束性の細胞傷害性 T細胞による認識性を増強する化合物、および/または請求の範囲第 6 項もしくは第 7項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を増強する化合物のスクリーニング方法であって、請求の範囲第 1項もしくは第 2 項に記載のベプチド、請求の範囲第 6項もしくは第 7項に記載のポリヌクレォチド、請求の範囲第 8項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 9項に記載の形質転換体、または請求の範囲第 1 1項に記載の抗体のうちの少なくとも 1つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。

1 3 . 請求の範囲第 1 2項に記載のスクリーニング方法で得られた化合物。

1 4 . 請求の範囲第 1項もしくは第 2項に記載のペプチド、請求の範囲第 6項もしくは第 7項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 8項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 9項に記載の形質転換体、請求の範囲第 1 1項に記載の抗体、または請求の範囲第 1 3項に記載の化合物のうちの少なくとも 1 つを癌治療有効量を含んでなる、癌治療に用いる医薬組成物。

1 5 . 請求の範囲第 3項に記載の細胞傷害性 T細胞の誘導剤、請求の範囲第 5項に記載の癌ワクチン、または請求の範囲第 1 4項に記載の医薬組成物を癌疾患に用いることを特徴とする治療方法。

1 6 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のペプチドの発現または活性に関連した疾病の診断方法であって、（a ) 該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、および/または（b ) 個体由来の試料中の該ペプチドをマ一力一として分析することを含む方法。

. 請求の範囲第 1 6項に記載の方法に使用する試薬キットであって、少なくとも請求の範囲第 1項または第 2項に記載のぺプチド、請求の範囲第 6項または第 7項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 1 1項に記載の抗体のうちの 1つ以上からなる試薬キット。