KR101713581B1

KR101713581B1 - Ｈｉｇ２ 및 ｕｒｌｃ１０ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR101713581B1
Application number: KR1020117005809A
Authority: KR
Inventors: 타쿠야 츠노다; 류지 오사와; 사치코 요시무라
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2017-03-08
Also published as: EP2328600A1; DK2328600T3; AU2009283763B2; CN104958753B; JP5633025B2; SG193806A1; AU2009283763A2; IL211117A; US9119800B2; CA2734467A1; US20110243973A1; KR20110045052A; EP2328600A4; EP2328600B9; CN104958753A; TWI543767B; TW201019952A; TWI580431B; JP2012500184A; MX2011001883A

Abstract

본 발명은 HLA-A 항원이 HLA-A0206인 개체에서 암의 치료 및/또는 예방을 위하여 제형된 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 하나 또는 그 이상의 펩티드들, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 그러한 펩티드들, 폴리뉴클레오티드들 또는 약학적 제제들을 사용하여 CTL 및 항원-제시 세포들을 유도하는 방법을 제공한다.

Description

ＨＩＧ２ 및 ＵＲＬＣ１０ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신{HIG2 AND URLC10 EPITOPE PEPTIDE AND VACCINES CONTAINING THE SAME}

본 발명은 그 전체의 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는, 2008년 8월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/089,972호에 기반한다.

본 발명은 생명과학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 백신, 및 종양 예방 및 치료를 위한 약물로써 매우 효과적인 신규한 펩티드에 관한 것이다.

CD8 양성 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)는 주조직적합성 복합체(MHC, major histocompatibility complex) 클래스 I 분자에서 발견되는 종양 관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)으로부터 유래된 에피토프(epitope) 펩티드를 인식한 후, 상기 종양 세포를 사멸시킨다는 것이 입증되었다. TAA의 첫 번째 예로서, 멜라노마 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리가 발견된 후, 주로 면역학적인 접근을 통해 많은 다른 TAA가 발견되었다(비특허문헌 1: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; 비특허문헌 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). 몇몇의 이러한 TAA들은 현재 면역치료 타겟으로서, 임상 개발이 진행중이다.

강력하고, 특이적인 항종양 면역 작용을 유도할 수 있는 신규한 TAA의 동정은 다양한 암 종류를 위한 펩티드 백신 전략의 임상 활용 및 개발을 추가로 보장한다(비특허문헌 3: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; 비특허문헌 4: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; 비특허문헌 5: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; 비특허문헌 6: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; 비특허문헌 7: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; 비특허문헌 8: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; 비특허문헌 9: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; 비특허문헌 10: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). 현재까지, 이러한 종양 관련 항원 유래 펩티드를 이용한 임상 시험에 관한 다수의 보고가 있었다. 불행히도, 매우 낮은 객관적 반응률이 현재까지 이러한 암 백신 시험에서 관찰되었다(비특허문헌 11: Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; 비특허문헌 12: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; 비특허문헌 13: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

이 세상에 몇가지 타입의 HLA-A가 존재한다. 알려진 HLA 유전형들 중에, HLA-A0201, HLA-A0206, HLA-A1101, HLA-A2402, HLA-A2601, HLA-A3101 및 HLA-A3303의 유전형은 다른 타입들에 비하여 발현빈도가 더 높은 것으로 알려져 있다(비특허문헌 14: Lee K W, et al., Tissue Antigens 2005: 65: 437-447). 그러나, 각 유전형은 아미노산 서열이 다르고, 에피토프 펩티드에 대한 친화도가 상이하다(비특허문헌 15: Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190). 예를 들어, 상기 HLA-A0206 유전형의 알파 1-도메인의 아미노산 잔기는 HLA-A0201 유전형의 그것과 상이하다(즉, 서열번호: 8의 33번째 아미노산인 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 치환되어 있다). 이러한 차이점들로 인하여, HLA-A0201 제한된 에피토프 펩티드가 HLA-A0206 유전형을 가진 환자에 유용할 것 같아 보이지 않는다. 따라서, 당해 기술분야에서 다양한 타입의 환자들에 유용한 펩티드를 제공하는 것이 목표로 남아있다.

HIG2 (hypoxia-inducible gene 2) 및 URLC10 (또한, LY6K로 알려진; lymphocyte antigen 6 complex, locus K)는 마이크로어레이 분석에서 신장암 및 폐암과 같은 여러 암 조직에서 고발현 되는 것으로 확인되었다(특허문헌 1:WO2005/019475, 특허문헌 2:WO2004/031413). 따라서, HIG2 및 URLC10은 항암 면역치료에 대한 흥미로운 타겟이고, 그것으로부터 유래된 CTL 유도 에피토프 펩티드들이 당해 기술분야에서 조사되었다.

Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55 Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42 Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14 Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8 Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66 Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 Lee K W, et al., Tissue Antigens 2005: 65: 437-447 Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190

발명의 요약

본 발명은 서열번호: 1 또는 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는, 두 펩티드의 신규 적용의 발견에 부분적으로 근거한다. 본 발명의 내용에서, 건강한 기증자로부터 획득한 말초단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 HIG2 또는 URLC10로부터 유래된 후보 펩티드들로 자극되었다. 각각의 후보 펩티드로 펄스된 HLA-A0206 양성 타겟 세포를 특이적으로 인식하는 CTL이 확립되었으며, 종양 세포의 표면에서 발현되는 HIG2 또는 URLC10에 대하여 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A0206 제한적 에피토프 펩티드들이 동정되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열뿐만 아니라, CTL 유도성을 갖는 펩티드들을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 그렇게 만들어진 변형된 펩티드가 원래의 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가된, 변형된 펩티드의 용도를 고려한다.

HLA 항원이 HLA-A0206인 개체에 투여되었을 때, 본 발명의 펩티드는 항원 제시 세포의 표면에 제시되며, 그런 다음 각각의 펩티드를 타겟으로 하는 CTL을 유도한다. 따라서, 본 발명의 목적은 항원 제시 세포를 유도하는 방법뿐만 아니라, HLA-A0206 항원에 대한 본 발명의 펩티드들 중 어느 하나를 제시하는 항원 제시 세포 및 엑소좀(exosomes)를 제공하는 것이다.

항종양 면역 반응은 HIG2 또는 URLC10 폴리펩티드를 제시하는 엑소좀 및 항원 제시 세포뿐만 아니라, 상기 HIG2 또는 URLC10 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여에 의해서 유도된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 HLA 항원이 HLA-A0206인 개체에 투여하기 위한 그 활성 성분으로서 엑소좀 및 항원 제시 세포뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 약학적 제제는 백신으로서 유용성을 밝힌다.

더욱이, 본 발명의 다른 목적은 CTLs 유도 방법, 암(종양)에 대한 면역 반응 및 또한 항-종양 면역을 또한 유도하는 방법, 개체가 HLA-A0206 항원을 갖는 것을 특징으로 하는, 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 폴리펩티드, 서열번호: 1 또는 서열번호: 2를 제시하는 엑소좀(exosome) 또는 항원 제시 세포 또는 본 발명의 약학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는 그러한 방법뿐만 아니라, 암(종양)의 치료 및/또는 예방(즉, 방지), 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 방법을 제공하는 것이다. 아울러, 본 발명의 CTLs은 또한 암에 대한 백신으로서의 용도를 밝힌다. 타겟이 되는 암의 예로는 신장암, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성(cholangiocellular) 암종, 식도암, 위암, NSCLC, 골육종(osteosarcoma), 췌장암 및 연조직 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 본 발명의 요약 및 하기의 발명의 상세한 설명 모두는 내용을 예시한 것이며, 본 발명 또는 본 발명의 다른 내용이 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다양한 측면 및 활용은 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 상세한 설명 및 이에 따른 바람직한 실시예를 고려하면, 당업자에게 명백해질 수 있다:
[도 1] 도 1은 HIG2로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTLs의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는, 일련의 그림을 포함한다. HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)로 자극된 웰 번호 1, 번호 2, 번호 5, 번호 7, 번호8, 번호 10, 번호 13 및 번호 14에 있는 CTLs은 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 도면에서, "+"는 타겟 세포가 적합한 펩티드로 펄스된 것을 나타내고, "-"는 타겟 세포가 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 것을 나타낸다.
[도 2] 도 2는 I도 1은 HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)로 자극된 CTL 세포주의 확립 결과를 IFN-감마 ELISA 분석으로 보여주는 일련의 그림을 포함한다. HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)의 자극으로 확립된 CTL 세포주는 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다는 것을 입증한다. 도면에서, "+"는 타겟 세포가 적합한 펩티드로 펄스된 것을 나타내고, "-"는 타겟 세포가 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 것을 나타낸다.
[도 3] 도 3은 HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)로 자극된 CTL 클론의 확립 결과를 IFN-감마 ELISA 분석으로 보여주는 선 그래프를 나타낸다. 상기 나타난 결과들은 HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1) 자극으로 확립된 CTL 클론이 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다는 것을 증명한다. 도면에서, "+"는 타겟 세포가 적합한 펩티드로 펄스된 것을 나타내고, "-"는 타겟 세포가 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 것을 나타낸다.
[도 4] 도 4는 HIG2 및 HLA-A*0206을 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 CTL 활성을 나나태는 선 그래프이다. COS7 세포는 HLA-A*0206 단독으로 형질도입하고 HIG2로부터 유래된 부적합한 펩티드 또는 대조군으로 준비된 HIG2 단독으로 자극을 주었다. HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1)으로 확립된 CTL 클론은 HIG2 및 HLA-A0206 두 가지로 형질도입된 COS7 세포에 비하여(검은 마름모꼴-표시) 높은 특이적 CTL 활성을 나타내었다. 반면에, 특이적 CTL 활성은 HLA-A0206(열린 삼각형 표시) 또는 HIG2(열린 원)를 발현하는 타겟 세포에 비하여 큰 차이가 없었다.
[도 5] 도 5는 URLC10로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL들에 대한 IFN-감마 ELISPOT 분석의 결과를 나타내는 일련의 사진들이다. URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)로 자극된 웰 번호 7의 CTL들은 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생산을 보여준다. 도면에서, "+"는 타겟 세포가 적합한 펩티드로 펄스된 것을 나타내고, "-"는 타겟 세포가 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 것을 나타낸다.
[도 6] 도 6은 URLC10-A0206-10-211(서열번호: 2)로 자극이 된 CTL 세포주의 확립 결과를 IFN-감마 ELISA 분석로 보여주는 선 그래프이다. 상기 결과는 URLC10-A0206-10-211(서열번호: 2)로 자극이 된 CTL 세포주가 대조군에 대비하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 입증한다. 도면에서, "+"는 타겟 세포가 적합한 펩티드로 펄스된 것을 나타내고, "-"는 타겟 세포가 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 것을 나타낸다.
[도 7] 도 7은 URLC10-A0206-10-211(서열번호: 2)로 자극이 된 CTL 클론의 확립 결과를 IFN-감마 ELISA 분석으로 보여주는 선 그래프이다. 상기 결과는 URLC10-A0206-10-211(서열번호: 2)로 자극이 된 CTL 클론이 대조군에 대비하여 강력한 IFN-감마 생산을 보인다는 것을 입증한다. 도면에서, "+"는 타겟 세포가 적합한 펩티드로 펄스된 것을 나타내고, "-"는 타겟 세포가 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 것을 나타낸다.
[도 8] 도 8은 URLC10 및 HLA-A*0206을 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 CTL 활성을 나태내는 선 그래프이다. 총 길이의 URLC10 유전자 단독으로 형질감염 또는 HLA-A*0206 유전자 단독으로 형질도입한 COS7 세포를 대조군으로 준비하였다. URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)으로 확립된 CTL 클론이 HIG2 및 HLA-A0206 두 가지로 형질도입된 COS7 세포에 대하여 높은 특이적 CTL활성을 나타낸다(검은 마름모꼴-표시). 반면에, HLA-A0206(열린 삼각형 표시) 또는 URLC10(열린 원)을 발현하는 타겟 세포에 대하여 특이적 CTL 활성은 큰 차이가 없었다. 도면에서, "R"은 반응자를 의미하고, "S"는 자극자를 의미한다.

비록, 본 명세서에 기재된 어떠한 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 실시예를 수행 또는 검사하는데 사용될 수 있으나, 바람직한 방법, 도구, 및 재료는 여기에 기재된다. 그러나, 본 재료 및 방법이 기재되기 이전에, 본 발명은 명세서에 기재된 특정 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이들은 통상적인 실험 및 최적화에 부합하여 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 특정한 버전 또는 내용을 기술하기 위한 목적이나, 오직 첨부된 청구항으로 제한되는 본 발명의 범위로 제한하려는 의도는 아니다.

본 명세서에서 언급된 개별 공개, 특허 또는 특허 출원의 내용은 그 전체가 명세서에 참조로서 통합된다. 그러나, 본 명세서의 어느 것도 본 발명은 이전 발명으로 인하여 선행되는 문헌의 자격이 없다는 인정으로서, 만들어지지 않는다.

충돌이 일어날 경우, 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서에 따른다. 추가로, 상기 재료, 방법, 및 실시예만 설명될 수 있으나, 제한하려는 의도는 아니다.

I. 정의

본 발명에서 사용되는 단어는 별도로 명시되지 않는 한, 단수를 의미한다.

본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기로 된 아미노산 중합체가 변형된 잔기, 또는 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체와 같은 비천연 잔기에 적용된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체(mimetic)를 의미한다. 천연 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산, 및 세포에서 번역 후 변형된 아미노산[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(gamma-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]이다. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 천연 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 a탄소)를 가지고 있지만, 변형된 R기 또는 변형된 골격을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조를 갖지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 심볼 또는 1문자 심볼에 의해 기재되어 질 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한 호환적으로 사용되고 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 기재되는 아미노산과 유사하다.

별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "암"은 HIG2 또는 URLC10 유전자를 과발현하는 암을 말한다. HIG2를 과발현하는 암의 예는 신장암 및 연조직 암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다; URLC10 유전자를 과발현하는 암의 예는 방광암, 자궁경부암, 담관세포성(cholangiocellular) 암종, 식도암, 위암, 비소세포폐암(NSCLC), 골육종(osteosarcoma), 췌장암 및 연조직 종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다

본 발명에서 사용된 용어 "세포독성 T 림프구", "세포독성 T 세포" 및 "CTL"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 따로 특별히 나타내지 않는 한, 비-자가 세포(예를 들면, 종양 세포, 바이러스 감염된 세포)를 인식하고 이러한 세포의 사멸을 유도하는 T 림프구의 하위 군을 나타낸다.

별도로 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속한 업계에서 전통적인 기술중 하나로 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

II . 펩티드( Peptides )

HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1) 및 URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)의 펩티드가 세포 독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)에 의해 인식되는 항원으로서 역할을 한다는 것을 증명하기 위하여, 이들 펩티드들이 HLA-A0206에 의해 한정되는 항원 에피토프인지 여부를 분석하였다. 이러한 펩티드들을 담지한 수지상 세포(dendritic cells, DCs)에 의해 T 세포를 생체 외에서 자극한 후, HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1) 및 URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)의 펩티드들을 사용하여 CTLs을 성공적으로 확립하였다.

이렇게 확립된 CTLs은 각각의 펩티드들로 자극된, HLA-A0206 항원을 발현하는 타겟 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 상기 펩티드들이 HLA-A0206로 제한된 HIG2 및 URLC10의 에피토프 펩티드들일 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 펩티드들은 또한 HLA-A0201로 제한된 HIG2 또는 URLC10의 에피토프 펩티드들일 수 있기 때문에, 상기 펩티드들을 포함하는 약학적 제제 또는 조성물은 HLA-A0201-양성 개체 및 HLA-A0206 양성 개체들 모두에 적용할 수 있다.

HIG2 또는 URLC10 유전자는 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 식도암, 위암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 신장암 및 연조직 종양과 같은, 대부분의 암 조직에서 과발현되므로, 이것은 면역치료의 효과적인 표적이다. 특히, HIG2를 과-발현하는 암의 예는 신장암 및 연조직 종양을 포함한다. 또한, URLC10를 과-발현하는 암의 예는 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 식도암, 위암, NSCLC, 골육종, 췌장암 및 연조직 종양을 포함한다. 따라서, 본 발명은 HLA-A0206으로 제한되는 HIG2 또는 URLC10의 에피토프 펩티드들에 상응하는 노나펩티드(9개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드) 및 데카펩티드(10개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드)를 제공한다. 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드의 특별히 바람직한 실시예로는 서열번호: 1 및 2 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함한다. 좀더 바람직하게는, HLA-A0206으로 제한되는 HIG2의 에피토프 펩티드들의 예는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하고, HLA-A0206으로 제한되는 URLC10의 에피토프 펩티드들의 예는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다.

일반적으로, 단백질에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 끼치지 않고, 또는 몇몇의 경우에는 심지어 본래 펩티드의 원하는 기능을 강화시킬 수 있다. 사실, 변형된 펩티드(즉, 본래의 참조 서열과 비교하여, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기가 변형된(즉, 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입) 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 유지한다고 알려지고 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 따라서, 하나의 실시예에서, 본 발명의 상기 펩티드는 CTL 유도성 및 서열번호: 1 또는 2의 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 심지어 다수의 아미노산이 삽입, 첨가, 결실, 및/또는 치환된 아미노산 서열을 모두 가질 수 있다.

당업자는 단일 아미노산 또는 아미노산의 일부 비율이 바뀌는, 아미노산 서열 각각의 삽입 또는 치환이 본래 아미노산 측쇄의 특성을 보존하는 결과를 내는 경향이 있음을 알고 있다. 이렇게, 이들은 보통 단백질의 변화가 본래 단백질과 유사한 특성과 기능을 갖는 변형된 단백질을 만드는 "보존적 치환" 또는 "보존적 변형"이라고 일컫는다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 보존되는 아미노산 측쇄 특성의 예는 예를 들어, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기의 작용기 또는 공통적인 특성을 갖는 측쇄가 포함된다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 측쇄를 포함하는 수산기 군(S, T, Y); 측쇄를 포함하는 황 원자(C, M); 측쇄를 포함하는 카르복실산 및 아미드(amide)(D, N, E, Q); 측쇄를 포함하는 염기(R, K, H); 및 측쇄를 포함하는 방향족(H, F, Y, W). 아울러, 하기의 8개 군은 각각 보존적 치환으로서 당업계에서 서로 허용될 수 있는 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글라이신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루타민산(E);

3) 아스파르긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조).

이러한 보존적으로 변형된 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드로 간주된다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 이에 한정되지 않으며 상기 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 비-보존적 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, 변형된 펩티드는 CTL 유도성 펩티드의 다형성 변이, 종간 유사체(interspecies homologues), 및 HIG2 또는 URLC10의 대립 유전자를 제외하지 않는다.

면역치료의 문맥으로 이용될 때, 본 발명의 펩티드는 세포 또는 엑소좀의 표면에 제시되며, 바람직하게는 HLA-A0206 항원과의 복합체로서 제시된다. 따라서, CTLs을 유도하는 펩티드뿐만 아니라, 상기 HLA-A0206 항원에 대한 높은 결합 친화성을 가진 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해서, 상기 펩티드는 증가된 결합 친화성을 갖는 변형된 펩티드를 생산하기 위하여, 아미노산 잔기들의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가를 통해서 변형될 수 있다. 자연적으로 나타난 펩티드와 더불어, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있으며(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), 이러한 규칙성에 기반한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드에 도입될 수 있다. 치환은 마지막 아미노산에서뿐만 아니라, 펩티드의 잠재적 TCR 인지 위치에도 도입될 수 있다. 다수의 연구에서 예를 들어 CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_(369-377) 또는 gp100_(209-217)의 펩티드에서의 아미노산 치환은 본래와 동등하거나 또는 우수하다는 것을 보였다(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

또한, 본 발명은 하나 내지 두 개의 아미노산이 본 발명의 펩티드의 N 및/또는 C 말단에 첨가될 수도 있다는 것을 또한 고려한다. 또한 이러한 높은 HLA 항원 결합 친화성을 가지면서 CTL 유도성을 보유하는 변형된 펩티드는 본 발명에 포함된다.

그러나, 상기 펩티드 서열이 상이한 기능을 갖는 내인성 또는 외인성의 아미노산 서열의 일부와 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역 질환 및/또는 알러지 증상과 같은 부작용이 유도될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드의 서열과 일치하는 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 경우를 방지하기 위하여, 우선 이용가능한 데이타베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행하는 것이 바람직하다. 목적 펩티드와 비교하여 1개 또는 2개 아미노산의 차이가 있는 펩티드조차 존재하지 않는다는 상동성 검색 결과가 확실해진다면, 상기 목적 펩티드는 이의 HLA 항원과의 결합 친화성, 및/또는 상기와 같은 부작용의 위험이 없는 CTL 유도성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다.

비록 상기 기재된 바와 같이 변형된 펩티드는 매우 효과적일 것으로 예상되지만, 상기 후보 펩티드들은 더 효과적인 펩티드를 선별하기 위해 CTL 유도성의 존재를 더욱 조사되었다. 여기에서, 구문 "CTL 유도성"은 항원 제시 세포에 제시될 때, 세포독성 T 림프구(CTLs)를 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 나아가, "CTL 유도성"은 상기 펩타이드의 CTL 활성 유도, CTL 증식, 표적 세포의 CTL 용해 증진, 및 CTL IFN-감마 생성을 증가시키는 능력을 포함한다.

CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원(예를 들면, B-림프구, 대식세포, 및 수지상 세포(DCs)), 또는 좀더 특이적으로 인간 말초 혈액 단핵구성 백혈구로부터 유래된 수지상세포, 를 운반하는 항원 제시 세포를 유도하고, 상기 펩티드로 자극한 후, CD8-양성 세포를 혼합한 다음, 표적 세포에 대하여 CTL에 의해서 생성되고 방출된 IFN-감마를 측정하는 것으로 수행된다. 반응 체계로서, 인간 HLA-A0206 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물이 사용될 수 있다(BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79). 예를 들어, 상기 표적 세포는 ⁵¹Cr 등으로 방사선 표지 될 수 있으며, 세포독성 활성은 HLA 항원이 HLA-A0206인 상기 표적세포로부터 방출되는 방사능으로부터 산출될 수 있다. 대안적으로, CTL 유도성은 고정화된 펩티드를 운반하는 항원 제시 세포(APCs)의 존재 하에 CTL에 의해서 생성되고 방출되는 IFN-감마(IFN-gamma)를 측정하고, 항-IFN-감마 모노클로날 항체를 이용하여 상기 배지 내의 억제 구간을 가시화함으로써 측정할 수 있다.

또한, 상기 기재한 변형과 더불어, 본 발명의 펩티드는 결과적으로 연결된 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 다른 물질들과 연결될 수 있다. 적합한 물질들은 그 예로 펩티드, 지질, 당 및 당 사슬, 아세틸기(acetyl group), 천연 및 합성 폴리머 등을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 상기 펩티드는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한, 글리코실화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화(phosphorylation), 등과 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능을 부여하기 위하여(예를 들면, 표적화 기능, 및 전달 기능), 또는 상기 폴리펩티드를 안정화시키기 위하여 수행될 수 있다.

예를 들면, 폴리펩티드의 세포 내(in vivo) 안정성을 증가시키기 위하여, 당업계에는 D-아미노산, 아미노산 미메틱스(mimetics) 또는 비자연적인 아미노산을 도입할 수 있다는 것이 알려져 있다; 또한 이러한 개념은 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 펩티드가수분해효소 및 인간 혈장 및 혈청과 같은, 다양한 생물학적 배지가, 안정성을 시험하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302 참조).

추가로, 본 발명의 상기 펩티드들은 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)를 통해 다른 펩티드들과 연결될 수 있다. 다른 펩티드들의 예들은 다른 TAA로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 둘 또는 다수의 펩티드들은 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)를 통해 연결될 수 있다. 스페이서 또는 링커를 통해 연결된 상기 펩티드들은 동일하거나 서로 다를 수 있다. 스페이서 또는 링커는 특별히 제한되지 않지만, 펩티드인 것이 바람직하고, 펩티다제(psptidase), 프로테아제(protease) 및 프로테아좀(proteasome)과 같은 효소에 의해 절단될 수 있는 하나 또는 다수의 절단 위치를 갖는 펩티드인 것이 더욱 바람직하다. 링커 또는 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기들(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 펩티드는 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩티드에 연결된 이러한 펩티드를 포함한다.

본 발명의 펩티드는 MHC 분자와 조합된 복합체로서 인간 MHC 항원을 수반하는 세포(예로, 항원 제시 세포) 또는 엑소좀의 표면에 존재한 다음, CTLs을 유도할 수 있다. 상기 세포 및 엑소좀은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들면, 상기 세포가 본 발명의 펩티드로 접촉하여 준비될 수 있거나, 상기 엑소좀이 본 발명의 펩티드로 접촉된 세포로부터 엑소좀을 포함한 분획의 수집에 의해 준비될 수 있다(예로, 일본 특허 출원 코효(Kohyo) 공개번호 Hei 11-510507 및 WO99/03499 참조). 본 발명의 펩티드들은 MHC 분자와 조합된 복합체로 세포 또는 엑소좀의 표면에 존재하는 이러한 펩티드들을 포함한다.

또한, 명세서에서, 본 발명의 펩티드는 "HIG2 또는 URLC10 펩티드(들)" 또는 "HIG2 또는 URLC10 폴리펩티드(들)"로 기재될 수 있다.

Ⅲ. 펩티드들의 제조

본 발명의 펩티드는 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성을 사용하여, 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 상기 펩티드들은 각각 합성되거나, 둘 또는 이상의 펩티드로 구성되는 긴 폴리펩티드로서 합성될 수 있다. 다음으로, 상기 펩티드는 자연적으로 형성되는 숙주 세포 단백질 및, 이의 단편, 또는 다른 화학적 물질이 실질적으로 제거되도록 분리, 즉 정제 또는 분리될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 선별된 아미노산 서열을 기초로 한 화학 합성을 통해 얻어질 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 종래 펩티드 합성 방법의 예들은 하기를 포함하나, 이에 한정하지 않는다:

(ⅰ) 펩티드 합성(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966;

(ⅱ) 단백질(The Proteins), Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(ⅲ) 펩티드 합성(Peptide Synthesis)(일본어), Maruzen Co., 1975;

(ⅳ) 펩티드 합성의 기본 및 실험(일본어), Maruzen Co., 1985;

(ⅴ) 제약 개발(두 번째 권)(일본어), Vol. 14(펩티드 합성), Hirokawa, 1991;

(ⅵ) WO99/67288; 및

(ⅶ) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "고체상 펩티드 합성(Solid Phase peptide synthesis)", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

대안적으로, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 생산하기 위한 모든 공지된 유전 공학 기술을 적용하여 획득될 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). 예를 들면, 우선, 발현할 수 있는 형태로 목적 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터(예를 들면, 프로모터 서열에 상응하는 조절 서열의 하위 단계)가 제조되고 적합한 숙주 세포에 형질전환된다. 그리고 상기 숙주 세포는 관심있는 펩티드를 생산하기 위하여 배양된다. 또한, 상기 펩티드는 시험관 내 번역 체계(in vitro translation system)를 채택하여 시험관 내에서 생성될 수 있다.

IV . 폴리뉴클레오티드( Polynucleotides )

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 언급된 펩티드들을 암호화하는 폴리뉴클리레오티드를 제공한다. 이들은 MELK 유전자의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 자연적으로 발생되는 HIG2 또는 URL10 유전자(서열변호: 3 또는 5, GenBank 등록번호 NM_013332 또는 NM_017527)로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이하, 구문 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 퇴화도(degeneracy)로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 특정한 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해서 특정화되는 각 위치에서, 상기 코돈은 암호화되는 폴리펩티드를 변화시키지 않고 이에 상응되는 임의의 코돈으로 변화할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variation)"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 또한, 본 명세서에서 펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 일반적인 기술의 하나는 핵산 내의 각 코돈(예외 일반적으로 메티오닌(methionine)을 위한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판(tryptophan)을 위한 유일한 코돈인, TGG)은 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위하여 변형되는 것을 인식할 수 있다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 공개된 서열에 암시적으로 기재된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 이의 변이체로 구성될 수 있다. DNA는 A, T, C, 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되며, RNA에서는 T가 U로 치환된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 사이에 삽입하거나 또는 삽입하지 않은 채로, 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 삽입하는 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 위치(예, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대하여 임의의 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현을 위하여 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자 등이 있는 발현 벡터(플라스미드)일 수 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 폴리머라아제(polymerase) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드의 조작에 의해서 제조될 수 있다.

재조합 및 화학적 합성 기술 모두는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 컴피턴트(competent) 세포로 형질감염되었을 때 발현될 수 있는, 적합한 벡터 내로 삽입함으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술을 이용하여 증폭되거나 적합한 숙주에서 발현될 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 참조). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재된 바와 같이, 고체상(solid phase) 기술을 이용하여 합성될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 본 발명에 포함된다.

V. 엑소좀( Exosomes )

본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소좀으로 부르는 세포 소낭(intracellular vesicles)을 추가로 제공한다. 엑소좀은, 예를 들어, 일본 특허 출원 코효(Kohyo) 공개번호 Hei 11-510507 및 WO99/03499에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 치료 및/또는 예방을 위한 개체인 환자로부터 획득된 APCs를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 엑소좀은 본 발명의 펩티드와 유사한 모양으로, 백신으로써 접종될 수 있다.

본 발명의 문맥에서, 복합체들에 포함된 HLA 항원들의 타입은 HLA-A0206이어야 하고, 엑소좀이 접종된 개체는 HLA-A0206 항원을 반드시 가져야 한다. 일반적으로, 임상에서, 치료가 필요한 환자의 HLA 항원의 타입은 사전에 조사되고, 이것은 본 발명의 엑소좀으로 치료하는데 이점이 있을 것으로 기대되는 환자에게 적절한 선택이 가능하게 할 수 있다.

Ⅵ. 항원 제시 세포( Antigen - presenting cells , APCs )

또한, 본 발명은 HLA-A0206 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하고 있는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell, APCs)를 제공한다. 본 발명의 펩티드와 접촉 또는 발현가능한 형태의 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 도입함으로써 획득되는 APCs는 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 백신으로서 투여되거나 또는 본 발명의 펩티드, 엑소좀, 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 다른 약물과의 조합으로서 투여될 수 있다.

상기 APC는 특정 종류의 세포에 한정되지 않으나, 림프구에 의해서 인식되기 위하여 그들의 세포 표면에 단백질 항원을 제시하는 것으로 알려져 있는, 수지상 세포(DCs), 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 수지상 세포는 APCs 중에서 강력한 CTL 유도 활성을 갖는 대표적인 APC이기 때문에, DCs는 본 발명의 바람직한 APCs는 수지상 세포이다.

예를 들면, APC는 말초혈액 단핵구 백혈구로부터 유래된 DCs에 의해서 유도되고, 그런 다음 시험관 내, 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)하여 수득될 수 있다. 본 발명의 펩티드가 HLA-A 항원이 HLA-A0206인 상기 개체에 투여될 경우, 본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs는 개체의 체내에서 유도된다. 구문 "APC 유도"는 HLA-A0206 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 세포 표면에 제시하기 위해 본 발명의 펩티드, 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 세포와 접촉(자극)하는 것을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드를 상기 APCs에 도입하여, 상기 APCs가 상기 펩티드를 제시할 수 있게 한 후, 상기 APCs는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외(ex vivo) 투여는 하기의 단계를 포함한다:

a: HLA-A 항원이 HLA-A0206인 첫 번째 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;

b: 단계 a의 APCs와 펩티드를 접촉시키는 단계; 및

c: 펩티드가 담지된 APCs를 HLA-A 항원이 HLA-A0206인 두 번째 개체에 투여하는 단계.

상기 첫 번째 개체 및 두 번째 개체는 동일한 개체일 수 있으며, 또는 다른 개체일 수도 있다. 대안적으로, 본 발명에 따르면, 항원 제시 세포를 유도하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 이 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 또한, 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하고, 여기서 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 수용체를 함께 혼합하거나 제형화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 나아가, 또한 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 상기 단계 b에서 획득한 APCs는 백신으로서 상기 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면, 상기 APCs는 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는다. "높은 수준의 CTL 유도성" 용어에 있어서, 상기 높은 수준이란 펩티드와 접촉하지 않거나 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉한 APC에 의한 CTL 유도성 수준에 대한 상대적인 것이다. 이러한 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APCs는 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 APCs 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 전달하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 상기 도입된 유전자는 DNAs 또는 RNAs 형태일 수 있다. 도입을 위한 방법의 예는, 리포펙타민(lipofection), 전기천공법(electroporation), 및 인산 칼슘(calcium phosphate) 방법과 같이, 당업계에서 일반적으로 수행되는 다양한 방법을 특정한 제한없이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 상기 유전자를 APCs에 전달함으로써, 상기 유전자는 상기 세포 내에서 전사, 번역 등을 거치며, 그리고 나서 수득된 단백질은 MHC 클래스 또는 클래스 에 의해 처리되고, 펩티드를 제시하기 위하여 제시 기작(presentation pathway)을 통해서 진행된다.

Ⅶ. 세포독성 T 세포( Cytotoxic T cells , CTLs )

본 발명의 임의의 펩티드에 대해서 유도되는 세포독성 T 세포는 생체 내(in vivo)에서 암 세포를 표적으로 하는 면역 반응을 강화하며 따라서 펩티드 그 자체와 유사한 유형으로, 백신으로서 사용될 수 있다. 따라서, 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화되는 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.

이러한 세포독성 T 세포는 (1) 개체에 본 발명의 펩티드들을 투여하고, 개체로부터 유래된 세포독성 T 세포를 수집하거나 또는 (2) 개체 유래된 APCs, 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액 단핵구성 백혈구를 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 펩티드들과 접촉(자극)함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs로부터 자극됨으로써 유도되는, 상기 세포독성 T 세포는, 치료 및/또는 예방의 대상이 되고 HLA-A0206 항원을 가지는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 투여되거나, 또는 효과를 조절하기 위한 목적으로 본 발명의 펩티드 또는 엑소좀을 포함하는 다른 약물과 조합으로 투여될 수 있다. 상기 수득된 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적세포, 또는, 예를 들면, 유도에 사용된 동일한 펩티드에 대해 특이적으로 작용한다. 다른 말로, 상기 세포독성 T 세포는 표적 세포의 표면에서 HLA-A0206 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 T 세포 수용체와 함께 인지할 수 있고, 그 다음 표적 세포의 사멸을 유도하기 위해 표적 세포를 공격한다. 상기 표적 세포는 내인성으로 HIG2 또는 URLC10를 발현하는 세포이거나, 또는 상기 HIG2 또는 URLC10 유전자가 형질감염된 세포일 수 있다; 그리고 상기 펩티드에 의해서 자극되기 때문에 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 세포는 활성화된 CTL 공격의 표적으로서도 사용할 수 있다.

Ⅷ. T 세포 수용체 (T cell receptor , TCR )

또한, 본 발명은 T 세포 수용체(TCR)의 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 구성하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 상기 TCR 서브유닛은 HLA-A0602 항원으로 HIG2 펩티드들 또는 URLC10 펩티드들을 제시하는 종양 세포에 대하여 T 세포의 특이성을 줄 수 있는 TCRs을 형성하는 능력을 가진다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 이 발명의 상기 펩티드로 유도된 CTL에서 발현된 TCR의 알파(alpha-) 및 베타(beta-) 사슬의 핵산 서열이 동정될 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288(2003)). TCRs의 유도체는 높은 결합활성을 갖고 표적 세포에서 나타나는 HIG2 또는 URLC10 펩티드와 결합할 수 있으며, 선택적으로 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro)에서 HLA-A0602 항원으로 HIG2 또는 URLC10 펩티드를 제시하는 표적 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 매개할 수 있다.

상기 TCR 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열은, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)와 같은 적합한 벡터 내로 도입될 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 잘 알려졌다. 상기 핵산 또는 이들을 포함하는 벡터는 T 세포, 예를 들면, HLA-A 항원이 HLA-A0602인 환자로부터 유래한 T 세포 내로 유용하게 전이될 수 있다. 유리하게, 본 발명은 우수한 암 세포 사멸 특성을 갖는 변형된 T 세포를 신속하고 용이하게 생성하게 할 수 있도록 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유류의 T 세포)를 신속하게 변형시키는 규격화된 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 HIG2 또는 URLC10 펩티드 및 HLA-A0206 항원 간에 형성된 복합체에 결합하는 TCR 서브유닛 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 형질도입함으로써 제조되는 CTLs을 제공한다. 상기 형질도입된 CTLs은 생체 내의 암 세포로 귀소할 수 있으며, 공지된 시험관 내 배양 방법에 의해 증폭될 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 본 발명의 상기 T 세포는 치료 또는 보호를 필요로 하는 환자의 암을 치료 또는 방지하는데 유용한 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다(WO2006/031221).

Ⅸ. 약학적 제제 또는 조성물

용어 "방지" 및 "예방"은 질환으로부터 사망 또는 질병률의 부담을 감소시킬 수 있는 어떠한 행위로 일컬어지도록 여기서 교대해서 쓰인다. 방지 및 예방은 "첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 방지 단계"에서 발생할 수 있다. 첫 번째 방지 및 예방은 질병의 발생을 피할 수 있는 반면, 두 번째 및 세 번째 단계의 방지 및 예방은 기능 복구 및 질환 관련된 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적인 효과를 감소시킬 뿐만 아니라, 질병 및 위급한 증상의 발달의 방지 및 예방에 목표를 둔다. 대안적으로, 방지 및 예방은, 예를 들어, 종양의 증식 및 전이를 감소시키는, 신생혈관억제를 감소시키는, 특정 질환의 심화를 경감시키는 것을 목적으로 하는 다양한 종류의 예방적 치료법을 포함할 수 있다.

암의 치료 및/또는 예방 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지는 암 세포의 수술적 제거, 암성 세포 성장의 억제, 종양의 퇴화 또는 퇴행, 암 발생의 차도 및 억제의 유도, 종양 감소, 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 하기의 단계의 임의의 것을 포함한다. 효과적으로 암을 치료 및/또는 예방하는 것은 사망률을 감소시키고, 암을 가진 개인의 예후를 개선시키며, 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키며, 암에 동반되는 지각할 수 있는 증상들을 감소시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적으로 치료를 구성하며 및/또는 상기 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정적인 질환을 포함한다.

HIG2 또는 URLC10 발현이 정상 조직들에 비해서 다양한 암에서 상향 조절되므로, 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 재발을 방지하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공하며, 이는 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소좀 또는 약학적 제제 또는 조성물로서 사용되는 APCs와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 추가로, 상기 언급한 본 발명의 임의의 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 구문 "펩티드의 표적화"는 표적 세포의 표면에서 HLA-A0206 항원과 펩티드 사이에 형성된 복합체를 T 세포 수용체가 인지(즉, 결합)한 후, 상기 표적 세포의 사멸을 유도하기 위해 표적 세포를 공격하는 것을 의미한다.

또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하는데 있어서, 하기 중 선택되는 활성 성분의 용도를 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 본 발명은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 하기 중 선택되는 활성 성분을 추가로 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 본 발명은 유효 성분으로서 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 추가로 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하기 중 선택되는 유효 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 상기 유효 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(c) 본 발명의 APC, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 상기 본 발명의 약학적 조성물 또는 약제는 암의 예방 및 이의 수술 후 재발을 방지하기 위한 방법 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위해서 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 백신으로서의 용도를 확인하였다. 본 발명의 문맥에 있어서, 상기 구문 "백신"("면역원성 조성물"도 의미함)은 동물에 주사되어 항종양 면역력을 유도하는 기능을 갖는 물질을 일컫는다.

상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 암의 치료 및/또는 방지에 사용될 수 있으며, 및/또는 개체 또는 인간을 포함한 환자 및 특히 산업적으로 중요한 동물 또는 가축 동물인, 마우스, 쥐, 기니아 피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 비비원숭이(baboon), 및 침팬지에 한정하지 않지만, 이를 포함하는 임의의 다른 포유류 동물에서 이의 수술 후 재발을 방지하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 서열번호: 1 및 2 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, HIG2 또는 URLC10, 및 HLA-A0206를 발현하는 타겟 세포에 대한 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는, HLA-A0206 제한된 에피토프 펩티드라는 것을 발견하였다. 따라서, 서열번호: 1 및 2 중에서 선택되는 아미노산 서열의 이러한 폴리펩티드 중 어느 것을 포함하는 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 특히 HLA 항원이 HLA-A0206인 개체에 투여되는 것이 더욱 적합하다. 동일한 것이 이러한 폴리펩티드들 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물에 적용된다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물에 의해서 치료될 수 있는 암은 HIG2 또는 URLC10이 관련된, 예를 들면, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 식도암, 위암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 신장 암종 및 연조직 암종를 포함하는 모든 종류의 암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특히, HIG2를 표적으로 하는 약학적 제제 또는 조성물은 바람직하게는 신장 암종 및 연조직 암종에 적용할 수 있고, URLC10을 표적으로 하는 약학적 제제 또는 조성물은 바람직하게는 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 식도암, 위암, NSCLC, 골육종, 췌장암 및 연조직 암종에 적용할 수 있다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 추가로 상기 언급한 활성 성분, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력이 가진 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드를 제시하는 다른 세포 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력을 갖는 상기 다른 펩티드는 암 특이적 항원(예를 들면, 동정된 TAAs)에 의해서 예시화되나, 이에 한정되지 않는다.

만약 필요하다면, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 예를 들면, 본 발명의 임의의 펩티드와 같이, 물질이 활성 성분의 항종양 효과를 저해하지 않는 한, 선택적으로 활성 성분으로서 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제형은 항염증성 약제 또는 조성물, 진통제, 화학요법제 등을 포함할 수 있다. 약제 자체 내의 다른 치료학적 물질을 포함하는 것에 추가로, 본 발명의 상기 약제는 또한 하나 또는 다수의 다른 약학적 제제 또는 조성물과 연속적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 제제는 조성물의 양은 예를 들면, 어떤 종류의 약학적 제제(들) 또는 조성물(들)이 사용되었는지, 치료되어야 할 질환, 및 투여 일정 및 경로 등에 따른다.

특히, 본 명세서에 언급된 성분에 추가로, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되는 형태의 제형을 갖는 당업계의 종래 다른 제제 또는 조성물을 포함할 수 있다고 이해된다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 제조의 물품 및, 예를 들어, 암과 같은 치료될 질환의 병리학적인 조건을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 상기 제조의 물품은 라벨(label)을 갖는 본 발명의 임의의 약학적 제제 또는 조성물의 용기(container)를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플리스틱과 같은, 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기 위의 라벨은 상기 약제 또는 조성물이 하나 또는 다수 조건의 질병의 치료 또는 예방을 위해서 사용된다는 것을 나타내야 한다. 또한, 상기 라벨은 투여 등에 대한 지시를 나타낼 수 있다.

상기 기재된 용기에 추가적으로, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함하는 키트는 약학적으로 허용가능한 희석제가 들어 있는 두 번째 용기를 선택적으로 추가하여 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 이용을 위한 지시가 있는 사용 설명서를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은, 가능하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 또는 다수의 유닛 복용량 형태를 포함하는 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 제시될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들면, 금속 또는 브리스터 팩(blister pack)과 같은, 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지시서와 수반될 수 있다.

(1) 활성 성분으로서 상기 펩티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

본 발명의 상기 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물 또는, 만약 필요하다면, 종래의 제형 방법에 의해서 제형화된 것으로 직접적으로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드에 추가로, 약물에 일반적으로 사용되는 담체, 첨가제 등을 특정한 제한 없이 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예는 멸균수, 생리식염수, 인산 완충액, 배양액 등이 있다. 더욱이, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 필요에 따라, 안정화제(stabilizer), 현탁액(suspension), 보존제(preservative), 계면활성제(surfactant) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 생체 내(in vivo)에서 CTL을 유도하기 위하여, 본 발명의 펩티드 둘 또는 그 이상으로 구성된 조합으로서 제조될 수 있다. 상기 펩티드 조합은 칵테일(cocktail)의 형태를 취할 수 있으며 또는 표준 기술을 이용하여 서로 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 화학적으로 연결되거나 또는 단일 융합 폴리펩티드 서열로서 발현될 수 있다. 상기 조합 내의 펩티드는 동일하거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드를 투여함으로써, 상기 펩티드는 APCs의 HLA-A0206 항원에 의하여 높은 농도로 제시된 뒤, 상기 나타난 펩티드와 HLA-A0206 항원 사이에 형성된 복합체에 대하여 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드로 HLA-A 항원이 HLA-A0206인 개체로부터 유래된 APCs(예를 들면, DCs)의 자극에 의해 수득될 수 있는, 본 발명의 임의의 펩티드를 그 세포 표면에 제시하는 APCs는 개체에 투여될 수 있고, 그 결과, CTLs이 개체 내에서 유도되고, 그리고, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 식도암, 위암, NSCLC, 골육종, 췌장암, 신장 암종 및 연조직 암종과 같은, 암 세포에 대한 공격성이 증가할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는, 암의 치료 및/또는 방지를 위한 약학적 제제 또는 조성물은, 세포의 면역력을 효과적으로 확립시킨다고 알려진 아쥬반트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 그들은 다른 유효 성분으로 투여될 수 있고, 그리고 그들은 과립으로 제조되어 투여될 수 있다. 아쥬반트는 면역학적 활성을 갖는 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여되었을 때 상기 단백질에 대한 면역 반응을 강화시키는 화합물을 일컫는다. 본 명세서에서 아쥬반트는 하기의 문헌에 기재된 바를 포함한다(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). 적합한 아쥬반트의 예로는 인산 알루미늄(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), 명반(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

더욱이, 상기 펩티드가 미세한 마이크로미터 직경의 비드에 결합되어 있는 리포솜(liposome) 제형, 과립 제형, 및 지질이 상기 펩티드에 결합되어 있는 제형이 일반적으로 사용될 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 CTL을 개시하는(prime) 성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에서 CTL을 개시할 수 있는 제제 또는 조성물로 확인되었다. 예를 들면, 팔미트산(palmitic acid) 잔기는 엡실론(epsilon) -및 라이신 잔기의 알파-아미노 군에 붙을 수 있으며, 그 뒤 본 발명의 펩티드에 연결될 수 있다. 상기 지질 펩티드는 그런 다음 리포솜에 결합되거나, 또는 아쥬반트에 유화되어 미셀(micelle) 또는 입자(particle)로 직접적으로 투여될 수 있다. CTL 반응의 지질 제조의 또 다른 예로서, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지질단백질은 적절한 펩티드에 공유 결합되었을 때, CTL을 개시하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).

투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 등, 및 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여할 수 있다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들어, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들어, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎, 이며 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.

(2) 유효 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

또한, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 발현할 수 있는 형태의 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 구문 "발현할 수 있는 형태"는 상기 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되었을 때, 항종양 면역력을 유도하는 폴리뉴클레오티드로서 생체 내(in vivo)에서 발현할 수 있음을 의미한다. 예시된 실시예에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 조절 요소(regulatory element)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 표적 세포의 게놈 내에 안정적으로 삽입되기 위하여 구비될 수 있다(예를 들면, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 기술을 위한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 제 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조한다. DNA 기반한 전달 기술의 예로는 "네이키드 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피바카인(bupivacaine), 폴리머(polymer), 펩티드-매개) 전달, 양이온성 지질 복합체, 및 입자-매게("유전자 총(gene gun)") 또는 압력-매개 전달(예를 들면, 미국 출원 제 5,922,687호 참조)을 포함한다.

또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해서 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은, 예를 들면, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터와 같은, 백시니아 바이러스의 이용을 수반한다. 숙주에 도입한 후, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 면역원성 펩티드를 발현하고, 이로 인하여 면역 반응이 유발된다. 면역화 프로토콜에 있어서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들면, 미국 특허 제 4,722,848호에 기재된다. 또 다른 벡터의 예로 BCG(Bacille Calmette Guerin)를 포함한다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재된다. 치료학적 투여 또는 면역화에 유용한 다양한 다른 벡터, 예를 들어, 아데노(adeno) 및 아데노 관련(adeno-associated) 바이러스 벡터, 레트로바이러스(retroviral) 벡터, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 벡터, 무독화시킨 탄저균 독소(detoxified anthrax toxin) 벡터 등, 이 명백할 것이다. 예를 들면, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85를 참조한다.

폴리뉴클레오티드의 개체로의 전달은, 상기 개체가 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 직접적으로 노출시키는 직접적, 또는 세포가 우선 시험관 내에서 관심있는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환된 후, 상기 세포를 개체에게 이식하는 간접적으로 이루어질 수 있다. 이러한 두 가지 접근은 각각 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 유전자 치료법으로서 알려져 있다.

유전자 치료 방법에 대한 일반적인 리뷰는, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에서 또한 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야의 일반적으로 알려진 방법은 eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; 및 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재된다.

투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사 등을 할 수 있으며, 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여의 용도를 발견한다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 적합한 수용체 내 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 양은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎이며, 예를 들면, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.

Ⅹ. 펩티드, 엑소좀 , APCs 및 CTLs 을 사용한 방법

본 발명의 펩티드 및 이러한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 APCs 및 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소좀 및 APCs는 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소좀 및 APCs는 화합물이 이들의 CTL 유도성을 억제하지 않는 한, 임의의 다른 화합물과 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 언급한 임의의 약학적 제제 또는 조성물은 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있으며, 이에 추가적으로, 상기 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물은 또한 하기 기재된 APCs를 유도하는데 사용될 수 있다.

⑴ 항원 제시 세포(APCs)를 유도하는 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 APCs를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 APCs의 유도는 "Ⅵ. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APCs를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 유도성은 또한 "VI. 항원 제시 세포"의 항목하에 언급되었다.

바람직하게는, APCs를 유도하는 방법은 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 포함한다:

a: 본 발명의 펩티드와 HLA-A 항원이 HLA-A0206인 APCs를 접촉하는 단계, 및

b: 발현할 수 있는 형태의 본 발명의 폴리펩티드를 HLA-A 항원이 HLA-A0206인 APCs내로 도입하는 단계.

이러한 APCs를 유도하는 방법은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)로 수행되는 것이 바람직하다. 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 상기 방법을 수행할 때, 유도되는 APCs는 처리한 개체 또는 HLA-A 항원이 HLA-A0206인 다른 개체로부터 수득될 수 있다.

⑵ CTLs을 유도하는 방법

더욱이, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 엑소좀 또는 상기 펩티드를 제시하는 APCs를 사용하여 CTLs을 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 세포 표면에서 본 발명의 펩티드 및 HLA-A0206 항원의 복합체를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CTLs을 유도하는 방법을 제공한다 바람직하게는, CTLs을 유도하는 방법은 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 포함한다:

a: CD8-양성 T 세포를 HLA-A0206 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 항원 제시 세포 및/또는 엑소좀과 접촉하는 단계, 및

b. 본 발명의 펩티드와 HLA-A0206 항원의 복합체를 인식하는 TCR 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포 내로 도입하는 단계.

이 발명의 펩티드를 개체에 투여하였을 때, CTL은 개체의 체내에서 유도되며, 상기 암 세포를 타겟팅하는 면역 반응의 힘을 강화시킨다. 대안적으로, 상기 펩티드 및 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 생체 외(ex vivo) 치료 방법으로 사용될 수 있으며, 이는 개체 유래 APCs, 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액 단핵구 백혈구를 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 접촉(자극)하고, CTL을 유도한 후, 상기 활성화된 CTL 세포는 개체로 돌아온다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a: HLA 항원이 HLA-A0206인 개체로부터 APCs를 수집하는 단계:,

b: 단계 a의 APCs와, 본 발명의 상기 펩티드를 접촉시키는 단계:,

c: 단계 b의 APCs와 HLA 항원이 HLA-A0206인 CD⁸ ⁺T 세포를 혼합하고, CTLs을 유도하기 위하여 공동 배양하는 단계: 및

d: 단계 c의 공동 배양으로부터 CD⁸ ⁺ T 세포를 수집하는 단계.

대안적으로, 본 발명에 따르면, CTLs을 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 수용체를 함께 혼합하거나 제형화하는 단계를 포함한, CTLs을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 CTLs을 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다.

단계 d에 의해 수득된 세포독성 활성을 갖는 상기 CD⁸ ⁺ T 세포는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 또한, 상기 단계 c에서 상기 CD⁸ ⁺ T 세포와 혼합된 APCs는 상기 "Ⅵ. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 APCs 내로 전이시킴으로써 제조될 수 있으나; 이에 한정되지 않고 본 발명의 펩티드를 효과적으로 제시하는 임의의 APC 또는 엑소좀은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하고, 당업자가 이를 만들고 사용하는 것을 도와주기 위하여 제시된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어느 방법으로든 한정하려는 의도가 아니다.

[실시예]

재료 및 방법

세포주

PSCCA0922 (HLA-A0206)는 파마 SNP 컨소시엄(Pharma SNP Consortium; PSC)에서 구입하였다. 인간 B-림포블라스토이드 세포주, 및 COS7은 ATCC에서 구입하였다.

HIG2 및 URLC10 로부터 유래된 후보 펩티드들

HIG2 또는 URLC10로부터 유래된 9-머(9-mer) 및 10-머(10-mer) 펩티드는 표준 고체상 합성 방법에 따라 시그마(사뽀로, 일본) 또는 바이오신세시스 사(Biosynthesis Inc., 루이스빌, 텍사스)에 의해서 합성되었고 역상(reversed phase) 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatographym, HPLC)로 정제되었다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 동정은 각각, 분석적인 HPLC 및 질량분석법 분석에 의하여 측정되었다. 펩티드는 20 ㎎/㎖의 디메틸폭시화물(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 뒤 -80 ℃에 보관하였다.

시험관 내( In vitro ) CTL 유도

단핵구 유래 수지상 세포(DCs)는 인간 백혈구 항원(HLA)에 제시된 펩티드에 대하여 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하기 위하여, 항원 지시 세포(APCs)로서 사용되었다. DCs는 하기 기재된 바와 같이 시험관 내에서 생성되었다(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). 구체적으로, 정상 지원자(HLA-A0206 양성)로부터 피콜-플라크(Ficoll-Plaque)(Pharmacia) 용액에 의해서 분리된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)는 단핵구 분획을 강화시키기 위하여, 플라스틱 조직 배양 디쉬(Becton Dickinson)에 부착에 의해서 분리하였다. 상기 단핵구가 강화된 집단은 2% 열-불활성화 자가조직 유래의 혈청(AS)을 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)(R&D System) 1000 U/㎖ 및 인터루킨(interleukin, IL)-4(R&D System) 1000 U/㎖의 존재하에 배양되었다. 배양 7일 후, 상기 사이토카인 유도된 DCs는 AIM-V 배지에서 37 ℃에서 3시간 동안 3 마이크로-그램/㎖의 베타 2-마이크로글로불린(beta2-microglobulin) 존재 하에서 합성된 펩티드들 각각 20 마이크로-그램/㎖로 펄스되었다. 상기 생성된 세포는 이러한 세포의 표면에, CD80, CD83, CD86 및 HLA 클래스 Ⅱ와 같은, DC-관련된 분자들을 발현한다고 나타났다(결과 미기재). 그 다음에 이러한 펩티드-펄스된 DCs는 마디토마이신 C(Mitomycin C, MMC)(30분 동안 30 마이크로그램/)로 불활성화되었고 CD8 양성 분리 키트(Dynal)로 양성 선택에 의해 획득된, 자가 조직의 CD8+ T 세포와 1:20의 비율로 혼합되었다. 이러한 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에서 시행되었다; 각각의 웰은 0.5㎖ AIM-V/2 % AS 배지에 1.5×10⁴펩티드-펄스된 DCs, 3×10⁵CD8+ T 세포 및 10 ng/㎖ IL-7(R&D System)를 포함하였다. 3일 후, 이러한 배양은 최종 농도가 20 IU/㎖이 되도록 IL-2(CHIRON)을 보충하였다. 7일 및 14일에, 상기 T 세포는 상기 자가의 펩티드-펄스된 DCs로 추가로 자극되었다. 상기 DCs는 상기 기재된 방법에 의해서 매번 제조되었다. CTL은 21일에 펩티드 자극 3회 후 펩티드-펄스된 PSCCA0922 세포에 대하여 실험하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

CTL 증폭 과정

CTLs은 Riddell et al.에 의해서 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여, 배양액에서 증폭되었다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). 전체 5×10⁴CTLs은 40 ng/㎖ 항-CD3 모노클로날 항체(Pharmingen)의 존재 하에서, MMC에 의해서 비활성화된 2 종류의 인간 B-림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주를 이용하여 25 ㎖ AIM-V/5 % AS 배지에 현탁하였다. 상기 배양 시작 이후 첫째 날, 120 IU/㎖ IL-2을 상기 배양액에 첨가하였다. 상기 배양액은 5, 8 및 11일에, 30 IU/㎖ IL-2를 포함하는 신선한 AIM-V/5 % AS 배지가 공급되었다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

CTL 클론의 확립

96 둥근-바닥 마이크로 타이터 플레이트(96 round-bottomed micro titer plate)(Nalge Nunc International)에 0.3, 1, 및 3 CTLs/웰이 되도록 희석하였다. CTLs은 5% AS를 포함하는 총 150 마이크로 ℓ/웰의 AIM-V에서 7×10⁴세포/웰의 2 종류의 인간 B-림포블라스토이드 세포주, 30 ng/㎖ 항-CD3 항체, 및 125 U/㎖ IL-2로 배양하였다. 10일 후에 배지에 50 마이크로 ℓ/웰의 IL-2를 첨가하여 IL-2는 최종 농도 125 U/㎖가 되었다. CTLs의 CTL 활성은 14일에 시험하였고, CTL 클론은 상기와 같은 방법을 사용하여 증폭하였다.

특이적 CTL 활성

특이적 CTL 활성을 검사하기 위하여, 인터페론(IFN)-감마 효소-결합 면역스팟(ELISPOT) 분석 및 IFN-감마 효소-결합 면역흡착 검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 수행하였다. 구체적으로, 펩티드-펄스된 PSCCA0922 (1×10⁴/웰)는 자극(stimulator) 세포로서 제조되었다. 48 웰에서 배양된 세포는 반응(responder) 세포로서 사용되었다. IFN-감마 ELISPOT 분석 및 IFN-감마 ELISA 분석은 제조사의 과정에 따라 수행되었다.

타겟 유전자 및 HLA -A0206 유전자 중 어느 하나 또는 모두를 강력히 발현하는 세포들의 확립

타겟 유전자들(HIG2; 서열번호: 3 및 URLC10; 서열번호: 5) 또는 HLA-A0206 (서열번호: 7)의 열린 해독틀(open reading frame, ORF)을 암호화하는 cDNA는 PCR로 증폭하였다. PCR-증폭 산물은 pcDNA3.1 myc-His 벡터(Invitrogen)으로 클로닝하였다. 타겟 유전자들과 HLA-A0206 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 플라스미드를 제조자가 추천한 과정에 따라 리포펙타민(Invitrogen)을 사용하여 COS7으로 형질도입시켰다. 요약하면, 2.5x10⁶COS7 세포들을 140 V 및 1000 micro F에서 10 micro-g 플라스미드로 펄스를 주었다. 형질감염으로부터 2일 후, 형질감염된 세포들을 세포 해리 용액으로 처리하고 CTL 활성 분석을 위한 타겟 세포로 사용하였다.

결과

암에서 증가된 HIG2 및 URLC10 발현

cDNA-마이크로어레이를 사용하여 다양한 암에서 얻어진 전체적인 유전자 발현 프로파일은 HIG2 (GenBank Accession No. NM_013332; SEQ ID No: 3) and URLC10 (GenBank Accession No. NM_017527; SEQ ID No: 5) 발현이 증가되었다는 것을 나타내었다. HIG2 발현은 상응하는 정상 조직들과 비교하여 20종의 신장암 중 19종 및 9종의 연조직 종양 중의 7종에서 유효적으로 증가되었다. URLC10 발현은 상응하는 정상 조직들과 비교하여 29종의 방광암에서 29종, 16종의 자궁경부암에서 15종, 7종의 담관세포성(cholangiocellular)에서 7종, 19종의 식도암에서 7종, 3종의 위암에서 3종, 27종의 NSCLC에서 24종, 19종의 골육종(osteosarcoma)에서 15종, 5종의 췌장암에서 4종, 43종의 연조직 종양에서 33종에서 유효적으로 증가되었다.

HLA -A0206으로 제한된 HIG2 로부터 상기 펩티드로 CTL 유도 및 HIG2 유래된 펩티드들로 자극된 CTL 세포주의 확립

HIG2 유래된 펩티드를 위한 CTL들은 "물질 및 방법"에서 설명한 것과 같은 프로토콜에 따라 생산하였다. 펩티드 특이적 CTL 활성을 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 결정하였다(도 1). 여기서 상기 결과는 HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)이 대조군 웰들에 대비하여 강력한 IFN-감마 생산을 한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 서열번호: 1로 자극된 양성 웰 번호들인 1, 2, 5, 7, 8, 10, 13 및 14의 세포들은 CTL 세포주를 확립하기 위해 증폭시켰다. 그러한 CTL 세포주들의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA 분석으로 측정하였다(도 2). 여기서 결과들은 모든 CTL 세포주들이 펩티드 펄스가 없는 타겟 세포들에 대비하여 해당하는 펩티드로 펄스를 준 타겟 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생산을 한다는 것을 보여준다. 이렇게, HIG2-A0206-9-4는 HLA-A0206를 발현하는 타겟 세포들에 대한 강력한 CTL 세포주를 유도할 수 있다.

HIG2 유래 펩티드들로 자극된 CTL 클론들을 위한 확립

CTL 세포주들로부터 한계 희석(limiting dilution)은 상기 "물질 및 방법"에서 출발하는 프로토콜에 따라 실시하였다. HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)로부터 CTL클론의 확립은 도 3에서 보여진다. 이러한 CTL 클론은 펩티드 펄스가 없는 타겟에 대한 활성과 비교하여 펩티드-펄스된 타겟에 대하여 강력하고 특이적인 CLT 활성을 가졌다.

HIG2 및 HLA -A0206을 발현하는 타겟 세포들에 대한 특이적 CTL 활성

HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)에 대하여 생긴 확립된 CTL 클론들은 HIG2 및 HLA-A0206을 발현하는 타겟 세포들을 인식하는 그것들의 능력을 실험하였다. 완전한 길이의 HIG2 유전자 및 HLA- A0206 분자 모두로 형질감염된 COS7에 대한 특이적 CTL 활성은, 내재적으로 HIG2 및 HLA-A0206을 발현하는 타겟 세포들을 위한 특이적 모델로 제공되는, HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)에 의해 생긴 CTL 클론을 효과기 세포로 사용하여 테스트하였다. COS7은 완전한 길이의 HIG2를 제외한 HLA-A0206로 형질감염하고 다른 펩티드(HIG2-9-8:YLLGVVLTL)로 펄스를 주었으며 HLA-A0206가 아닌 완전한 길이의 HIG2로 형질감염시킨 COS7을 대조군으로 준비하였다. COS7에 대한 가장 높은 특이적 CTL 활성을 나타내는 CTL 클론들은 HIG2 및 HLA-A0206 모두로 형질감염된 것들이었다(도 4).

여기서 상기 결과들은 HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1)이 자연적으로 가공되고 HLA-A0206 분자를 가진 타겟 세포 표면에 제시되며 CTL을 인식한다는 것을 명확히 나타낸다. 더욱이, HIG2-A0206-9-4는 HLA항원이 HLA-A0206인 개체에서 HIG2가 발현된 암세포를 타겟팅하는 암 백신으로 제공될 수 있다.

HLA -A0206로 한정된 URLC10 로부터 상기 펩티드로 CLT 유도 및 URLC10 유래 펩티드들로 자극된 CTL 세포주의 확립

URLC10 유래된 펩티드를 위한 CTL들은 "물질 및 방법"에서 설명한 것과 같은 프로토콜에 따라 생산하였다. 펩티드 특이적 CTL 활성을 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 결정하였다(도 5). 여기서 상기 결과는 URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)가 대조군 웰들에 비교하여 강력한 IFN-감마 생산을 한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 서열번호: 2로 자극된 양성 웰 번호 7의 세포들은 CTL 세포주를 확립하기 위해 증폭시켰다. 상기 CTL 세포주의 CTL 활성은 IFN-감마 분석으로 결정하였다(도 6). 여기서 결과들은 CTL 세포주가 펩티드 펄스가 없는 타겟 세포들에 비교하여 상응하는 펩티드로 펄스를 준 타겟 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생산을 한다는 것을 보여준다. 이렇게, URLC10-A0206-10-211은 강력한 CTL 세포주를 유도할 수 있다.

URLC10 유래 펩티드로 자극한 CTL 클론의 확립

이들 CTL 세포주들로부터 한계 희석(limiting dilution)은 상기 "물질 및 방법"에서 출발하는 프로토콜에 따라 실시하였다. URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)로부터 CTL 클론의 확립은 도 7에서 보여진다. 이 CTL 클론은 펩티드 펄스가 없는 타겟에 대한 활성과 비교하여 펩티드-펄스된 타겟에 대하여 강력하고 특이적인 CLT 활성을 가진다.

URLC10 및 HLA -A0206을 발현하는 타겟 세포들에 대한 특이적 CTL 활성

URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)에 대하여 생긴 확립된 CTL 클론들은 URLC10 및 HLA-A0206을 발현하는 타겟 세포들을 인식하는 그것들의 능력을 실험하였다. 완전한 길이의 URLC10 유전자 및 HLA- A0206 분자 모두로 형질감염된 COS7에 대한 특이적 CTL 활성은, 내재적으로 URLC10 및 HLA-A0206을 발현하는 타겟 세포들을 위한 특이적 모델로 제공되는, URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)에 의해 생긴 CTL 클론을 효과기 세포로 사용하여 실험하였다. HLA-A0206을 제외한 완전한 길이의 URLC10로 형질감염된 COS7 및 완전한 길이의 URLC10가 아닌 HLA-A0206으로 형질감염된 COS7을 대조군으로 준비하였다. COS7에 대해 가장 높은 특이적 CTL 활성을 나타내는 CTL 클론은 URLC10 및 HLA-A0206 모두로 형질감염된 것이었다(도 8).

여기서 상기 결과들은 URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)이 자연적으로 가공되고 HLA-A0206 분자를 가진 타겟 세포 표면에 제시되며 CTL을 인식한다는 것을 명확히 나타낸다. 더욱이, URLC10-A0206-10-211는 HLA항원이 HLA-A0206인 개체에서 URLC10이 발현된 암세포를 타겟팅하는 암 백신으로 제공될 수 있다.

결론으로, 신규한 HLA-A0206 에피토프 펩티드 HIG2-A0206-9-4 (서열번호: 1) 및 URLC10-A0206-10-211 (서열번호: 2)이 동정되었고 HLA항원이 HLA-A0206인 개체에서 암 면역치료를 위해 적용될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명은 신규한 TAAs에 대해서 기술하고 있으며, 구체적으로 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도하고 다양한 암 형태에 적용가능한 HIG2 또는 URLC10로부터 유래한 TAAs에 대해서 기술하고 있다. 이러한 TAAs는 또한 예를 들면, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종(cholangiocellular carcinoma), 식도암, 위암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 골육종(osteosarcoma), 췌장암, 신장 암종 및 연조직 종양(soft tissue tumor)와 같은 암, HIG2 또는 URLC10와 관련된 질환에 대한 펩티드 백신으로서 개발을 더욱 정당화한다.

본 발명은 명세서에서 상세하고, 이의 특이적인 실시예를 참조로 기재되어 있으나, 앞서 기술한 설명은 본질적으로 예시 및 설명이며, 본 발명과 이의 바람직한 실시예를 예시하는 바로 이해될 수 있다. 일반적인 실험을 통해, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있으며, 본 발명의 목적 및 한계는 첨부된 청구항에 의해서 정의된다는 것을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> HIG2 AND URLC10 PEPTIDE AND VACCINES COMPRISING THE SAME <130> 11fpi-02-05 <150> 61/089,972 <151> 2008-08-19 <150> 2009/003897 <151> 2009-08-14 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 1 Val Leu Asn Leu Tyr Leu Leu Gly Val 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 2 Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 1372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (206)..(394) <400> 3 gcacgagggc gcttttgtct ccggtgagtt ttgtggcggg aagcttctgc gctggtgctt 60 agtaaccgac tttcctccgg actcctgcac gacctgctcc tacagccggc gatccactcc 120 cggctgttcc cccggagggt ccagaggcct ttcagaagga gaaggcagct ctgtttctct 180 gcagaggagt agggtccttt cagcc atg aag cat gtg ttg aac ctc tac 229 Met Lys His Val Leu Asn Leu Tyr 1 5 ctg tta ggt gtg gta ctg acc cta ctc tcc atc ttc gtt aga gtg atg 277 Leu Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu Ser Ile Phe Val Arg Val Met 10 15 20 gag tcc cta gaa ggc tta cta gag agc cca tcg cct ggg acc tcc tgg 325 Glu Ser Leu Glu Gly Leu Leu Glu Ser Pro Ser Pro Gly Thr Ser Trp 25 30 35 40 acc acc aga agc caa cta gcc aac aca gag ccc acc aag ggc ctt cca 373 Thr Thr Arg Ser Gln Leu Ala Asn Thr Glu Pro Thr Lys Gly Leu Pro 45 50 55 gac cat cca tcc aga agc atg tgataa gacctccttc catactggcc 420 Asp His Pro Ser Arg Ser Met 60 atattttgga acactgacct agacatgtcc agatgggagt cccattccta gcagacaagc 480 tgagcaccgt tgtaaccaga gaactattac taggccttga agaacctgtc taactggatg 540 ctcattgcct gggcaaggcc tgtttaggcc ggttgcggtg gctcatgcct gtaatcctag 600 cactttggga ggctgaggtg ggtggatcac ctgaggtcag gagttcgaga ccagcctcgc 660 caacatggcg aaaccccatc tctactaaaa atacaaaagt tagctgggtg tggtggcaga 720 ggcctgtaat cccagttcct tgggaggctg aggcgggaga attgcttgaa cccggggacg 780 gaggttgcag tgaaccgaga tcgcactgct gtacccagcc tgggccacag tgcaagactc 840 catctcaaaa aaaaaaagaa aagaaaaagc ctgtttaatg cacaggtgtg agtggattgc 900 ttatggctat gagataggtt gatctcgccc ttaccccggg gtctggtgta tgctgtgctt 960 tcctcagcag tatggctctg acatctctta gatgtcccaa cttcagctgt tgggagatgg 1020 tgatattttc aaccctactt cctaaacatc tgtctggggt tcctttagtc ttgaatgtct 1080 tatgctcaat tatttggtgt tgagcctctc ttccacaaga gctcctccat gtttggatag 1140 cagttgaaga ggttgtgtgg gtgggctgtt gggagtgagg atggagtgtt cagtgcccat 1200 ttctcatttt acattttaaa gtcgttcctc caacatagtg tgtattggtc tgaagggggt 1260 ggtgggatgc caaagcctgc tcaagttatg gacattgtgg ccaccatgtg gcttaaatga 1320 ttttttctaa ctaataaagt ggaatatata tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1372 <210> 4 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Lys His Val Leu Asn Leu Tyr Leu Leu Gly Val Val Leu Thr Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ile Phe Val Arg Val Met Glu Ser Leu Glu Gly Leu Leu Glu 20 25 30 Ser Pro Ser Pro Gly Thr Ser Trp Thr Thr Arg Ser Gln Leu Ala Asn 35 40 45 Thr Glu Pro Thr Lys Gly Leu Pro Asp His Pro Ser Arg Ser Met 50 55 60 <210> 5 <211> 1735 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (242)..(910) <400> 5 gttatcagag gtgagcccgt gctcttcagc ggagaagatc ccctacctgg ccgccggcca 60 ctttctgtgg gccgtggggt cctcaaggag acggcccttg ggctcagggg ctgcgtttcc 120 acacgcgcct ttcccagggc tcccgcgccc gttcctgcct ggccgccggc cgctccaaca 180 gcagcacaag gcgggactca gaaccggcgt tcagggccgc cagcggccgc gaggccctga 240 g atg agg ctc caa aga ccc cga cag gcc ccg gcg ggt ggg agg 283 Met Arg Leu Gln Arg Pro Arg Gln Ala Pro Ala Gly Gly Arg 1 5 10 cgc gcg ccc cgg ggc ggg cgg ggc tcc ccc tac cgg cca gac ccg ggg 331 Arg Ala Pro Arg Gly Gly Arg Gly Ser Pro Tyr Arg Pro Asp Pro Gly 15 20 25 30 aga ggc gcg cgg agg ctg cga agg ttc cag aag ggc ggg gag ggg gcg 379 Arg Gly Ala Arg Arg Leu Arg Arg Phe Gln Lys Gly Gly Glu Gly Ala 35 40 45 ccg cgc gct gac cct ccc tgg gca ccg ctg ggg acg atg gcg ctg ctc 427 Pro Arg Ala Asp Pro Pro Trp Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu 50 55 60 gcc ttg ctg ctg gtc gtg gcc cta ccg cgg gtg tgg aca gac gcc aac 475 Ala Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Pro Arg Val Trp Thr Asp Ala Asn 65 70 75 ctg act gcg aga caa cga gat cca gag gac tcc cag cga acg gac gag 523 Leu Thr Ala Arg Gln Arg Asp Pro Glu Asp Ser Gln Arg Thr Asp Glu 80 85 90 ggt gac aat aga gtg tgg tgt cat gtt tgt gag aga gaa aac act ttc 571 Gly Asp Asn Arg Val Trp Cys His Val Cys Glu Arg Glu Asn Thr Phe 95 100 105 110 gag tgc cag aac cca agg agg tgc aaa tgg aca gag cca tac tgc gtt 619 Glu Cys Gln Asn Pro Arg Arg Cys Lys Trp Thr Glu Pro Tyr Cys Val 115 120 125 ata gcg gcc gtg aaa ata ttt cca cgt ttt ttc atg gtt gcg aag cag 667 Ile Ala Ala Val Lys Ile Phe Pro Arg Phe Phe Met Val Ala Lys Gln 130 135 140 tgc tcc gct ggt tgt gca gcg atg gag aga ccc aag cca gag gag aag 715 Cys Ser Ala Gly Cys Ala Ala Met Glu Arg Pro Lys Pro Glu Glu Lys 145 150 155 cgg ttt ctc ctg gaa gag ccc atg ccc ttc ttt tac ctc aag tgt tgt 763 Arg Phe Leu Leu Glu Glu Pro Met Pro Phe Phe Tyr Leu Lys Cys Cys 160 165 170 aaa att cgc tac tgc aat tta gag ggg cca cct atc aac tca tca gtg 811 Lys Ile Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile Asn Ser Ser Val 175 180 185 190 ttc aaa gaa tat gct ggg agc atg ggt gag agc tgt ggt ggg ctg tgg 859 Phe Lys Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys Gly Gly Leu Trp 195 200 205 ctg gcc atc ctc ctg ctg ctg gcc tcc att gca gcc ggc ctc agc ctg 907 Leu Ala Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu 210 215 220 tct tgagccacgg gactgccaca gactgagcct tccggagcat ggactcgctc 960 Ser cagaccgttg tcacctgttg cattaaactt gttttctgtt gattacctct tggtttgact 1020 tcccagggtc ttgggatggg agagtgggga tcaggtgcag ttggctctta accctcaagg 1080 gttctttaac tcacattcag aggaagtcca gatctcctga gtagtgattt tggtgacaag 1140 tttttctctt tgaaatcaaa ccttgtaact catttattgc tgatggccac tcttttcctt 1200 gactcccctc tgcctctgag ggcttcagta ttgatgggga gggaggccta agtaccactc 1260 atggagagta tgtgctgaga tgcttccgac ctttcaggtg acgcaggaac actgggggag 1320 tctgaatgat tggggtgaag acatccctgg agtgaaggac tcctcagcat ggggggcagt 1380 ggggcacacg ttagggctgc ccccattcca gtggtggagg cgctgtggat ggctgctttt 1440 cctcaacctt tcctaccaga ttccaggagg cagaagataa ctaattgtgt tgaagaaact 1500 tagacttcac ccaccagctg gcacaggtgc acagattcat aaattcccac acgtgtgtgt 1560 tcaacatctg aaacttaggc caagtagaga gcatcagggt aaatggcgtt catttctctg 1620 ttaagatgca gccatccatg gggagctgag aaatcagact caaagttcca ccaaaaacaa 1680 atacaagggg acttcaaaag ttcacgaaaa aattgaatta aaagataaaa attaa 1735 <210> 6 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Arg Leu Gln Arg Pro Arg Gln Ala Pro Ala Gly Gly Arg Arg Ala 1 5 10 15 Pro Arg Gly Gly Arg Gly Ser Pro Tyr Arg Pro Asp Pro Gly Arg Gly 20 25 30 Ala Arg Arg Leu Arg Arg Phe Gln Lys Gly Gly Glu Gly Ala Pro Arg 35 40 45 Ala Asp Pro Pro Trp Ala Pro Leu Gly Thr Met Ala Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Leu Val Val Ala Leu Pro Arg Val Trp Thr Asp Ala Asn Leu Thr 65 70 75 80 Ala Arg Gln Arg Asp Pro Glu Asp Ser Gln Arg Thr Asp Glu Gly Asp 85 90 95 Asn Arg Val Trp Cys His Val Cys Glu Arg Glu Asn Thr Phe Glu Cys 100 105 110 Gln Asn Pro Arg Arg Cys Lys Trp Thr Glu Pro Tyr Cys Val Ile Ala 115 120 125 Ala Val Lys Ile Phe Pro Arg Phe Phe Met Val Ala Lys Gln Cys Ser 130 135 140 Ala Gly Cys Ala Ala Met Glu Arg Pro Lys Pro Glu Glu Lys Arg Phe 145 150 155 160 Leu Leu Glu Glu Pro Met Pro Phe Phe Tyr Leu Lys Cys Cys Lys Ile 165 170 175 Arg Tyr Cys Asn Leu Glu Gly Pro Pro Ile Asn Ser Ser Val Phe Lys 180 185 190 Glu Tyr Ala Gly Ser Met Gly Glu Ser Cys Gly Gly Leu Trp Leu Ala 195 200 205 Ile Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ile Ala Ala Gly Leu Ser Leu Ser 210 215 220 <210> 7 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1095) <400> 7 atg gcc gtc atg gcg ccc cga acc ctc gtc ctg cta ctc tcg ggg gct 48 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 ctg gcc ctg acc cag acc tgg gcg ggc tct cac tcc atg agg tat ttc 96 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 20 25 30 tac acc tcc gtg tcc cgg ccc ggc cgc ggg gag ccc cgc ttc atc gca 144 Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 35 40 45 gtg ggc tac gtg gac gac acg cag ttc gtg cgg ttc gac agc gac gcc 192 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala 50 55 60 gcg agc cag agg atg gag ccg cgg gcg ccg tgg ata gag cag gag ggt 240 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly 65 70 75 80 ccg gag tat tgg gac ggg gag aca cgg aaa gtg aag gcc cac tca cag 288 Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln 85 90 95 act cac cga gtg gac ctg ggg acc ctg cgc ggc tac tac aac cag agc 336 Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser 100 105 110 gag gcc ggt tct cac acc gtc cag agg atg tat ggc tgc gac gtg ggg 384 Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly 115 120 125 tcg gac tgg cgc ttc ctc cgc ggg tac cac cag tac gcc tac gac ggc 432 Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly 130 135 140 aag gat tac atc gcc ctg aaa gag gac ctg cgc tct tgg acc gcg gcg 480 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 gac atg gca gct cag acc acc aag cac aag tgg gag gcg gcc cat gtg 528 Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val 165 170 175 gcg gag cag ttg aga gcc tac ctg gag ggc acg tgc gtg gag tgg ctc 576 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu 180 185 190 cgc aga tac ctg gag aac ggg aag gag acg ctg cag cgc acg gac gcc 624 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala 195 200 205 ccc aaa acg cat atg act cac cac gct gtc tct gac cat gaa gcc acc 672 Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr 210 215 220 ctg agg tgc tgg gcc ctg agc ttc tac cct gcg gag atc aca ctg acc 720 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 tgg cag cgg gat ggg gag gac cag acc cag gac acg gag ctc gtg gag 768 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu 245 250 255 acc agg cct gca ggg gat gga acc ttc cag aag tgg gcg gct gtg gtg 816 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val 260 265 270 gtg cct tct gga cag gag cag aga tac acc tgc cat gtg cag cat gag 864 Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu 275 280 285 ggt ttg ccc aag ccc ctc acc ctg aga tgg gag ccg tct tcc cag ccc 912 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro 290 295 300 acc atc ccc atc gtg ggc atc att gct ggc ctg gtt ctc ttt gga gct 960 Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala 305 310 315 320 gtg atc act gga gct gtg gtc gct gct gtg atg tgg agg agg aag agc 1008 Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser 325 330 335 tca gat aga aaa gga ggg agc tac tct cag gct gca agc agt gac agt 1056 Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser 340 345 350 gcc cag ggc tct gat gtg tct ctc aca gct tgt aaa gtg tga 1098 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val 355 360 365 <210> 8 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 20 25 30 Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 35 40 45 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln 85 90 95 Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser 100 105 110 Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly 115 120 125 Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly 130 135 140 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val 165 170 175 Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu 180 185 190 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala 195 200 205 Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr 210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val 260 265 270 Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu 275 280 285 Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro 290 295 300 Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala 305 310 315 320 Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser 340 345 350 Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val 355 360 365

Claims

약학적으로 허용가능한 담체와 조합되며, 서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드로서 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 유도성을 가지는 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 상기 펩티드들 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하기 (ⅰ) 내지 (ⅳ)로 구성되는 군으로부터 선택된 목적을 위한 약학적 제제:
(ⅰ) HLA-A 항원이 HLA-A0206인 개체에서 암의 치료,
(ⅱ) HLA-A 항원이 HLA-A0206인 개체에서 암의 예방,
(ⅲ) HLA-A 항원이 HLA-A0206인 개체에서 암의 수술후 재발 방지, 및
(ⅳ) 이들의 조합.
제 1항에 있어서, 상기 암은 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종(cholangiocellular carcinoma), 식도암, 위암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 골육종(osteosarcoma), 췌장암, 신장 암종 및 연조직 종양(soft tissue tumor)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
제 1항에 있어서, 상기 제제는 백신으로 제형된 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
CTL 유도성을 가지며 HLA-A0206 항원을 발현하는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)를 유도하는 시험관내(in vitro) 방법으로서 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 방법:
⒜ 서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드와 항원-제시 세포를 접촉시키는 단계; 및
⒝ 서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 항원-제시 세포로 도입하는 단계.
서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 사용하여 HLA-A0206 항원 및 상기 펩티드의 복합체를 인식하는 CTL을 유도하는 시험관내(in vitro) 방법.
서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 HLA-A0206 항원의 복합체를 표면에 제시하는 분리된 항원-제시 세포.
서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 HLA-A0206 항원의 복합체를 인식하는, 분리된 CTL.
하기 ⒜ 또는 ⒝를 포함하는, CTL 유도성을 가지며 HLA-A0206 항원을 발현하는 항원-제시 세포를 시험관 내에서 유도하기 위한 제제:
⒜ 서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드로서 CTL 유도성을 가지는 하나 또는 그 이상의 펩티드;
⒝ 상기 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드.
HLA 항원이 HLA-A0206인 개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 제제를 제조하기 위하여, CTL 유도성을 가지며 서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 청구항 제 6항의 분리된 항원-제시 세포, 또는 청구항 제 7항의 분리된 CTL을 이용하는 방법.
삭제
하기 ⒜, (b), (c), (d) 또는 ⒠를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된, HLA 항원이 HLA-A0206인 개체에서 암에 대한 면역 반응을 유도하는 제제:
⒜ 서열번호: 2 및 1로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드로서 CTL 유도성을 가지는 하나 또는 그 이상의 펩티드;
⒝ 그러한 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드;
⒞ 청구항 제 6항의 하나 또는 그 이상의 분리된 항원-제시 세포;
⒟ 청구항 제 7항의 하나 또는 그 이상의 분리된 CTLs; 또는
⒠ 이들의 조합.
제11항에 있어서, 상기 암은 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종(cholangiocellular carcinoma), 식도암, 위암, 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC), 골육종(osteosarcoma), 췌장암, 신장 암종 및 연조직 종양(soft tissue tumor)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제제.