MX2011001883A - Peptido de epitope hig2 y urlc10 y vacunas que contienen el mismo. - Google Patents
Peptido de epitope hig2 y urlc10 y vacunas que contienen el mismo.Info
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Abstract
La presente invención proporciona un agente o composición farmacéutica que contiene uno o más péptidos que tienen la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ó 2, uno o más polinucleótidos que codifican dicho péptido formulado para el tratamiento y/o prevención de cáncer en un sujeto cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206. Además, la presente invención proporciona un método para inducir CTL y células que presentan antígenos utilizando dichos péptidos, polinucleótidos o agentes farmacéuticos.
Description
PÉPTIDQ DE EPÍTOPE H1G2 Y U LC10 Y VAGUMA8 QUE
CONTIENEN EL MISMO
P IORIDAD
La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud
Provisional Norteamericana No. 61/089,972, presentada el 19 de Agosto del 2008, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.
Campo de la Invención
La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica más específicamente, al campo de la terapia de cáncer. En particular, la presente invención se refiere a péptidos novedosos que son extremadamente efectivos como vacunas de cáncer, y fármacos para tratar y prevenir tumores.
Antecedentes de la II invención
Se ha demostrado que los CTLs positivos CD8 reconocen péptidos de epítope derivados de antígenos asociados con tumor (TAAs) encontrados en la molécula de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I, y posteriormente exterminan células de tumor. Desde el descubrimiento de la familia del antígeno de melanoma (MAGE) como el primer ejemplo de TAAs, se han descubierto muchos otros TAAs, principalmente a través de métodos inmunológicos (NPL 1: Boon T, Int J Cáncer 1993 Mayo 8, 54(2): 177-80; NPL 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Marzo 1, 183(3): 725-9).
Algunos de los TAAs actualmente están pasando por desarrollo clínico como objetivos inmunoterapéuticos.
La identificación de nuevos TAAs con la capacidad de inducir respuestas inmune anti-tumor potentes y específicas, garantiza el desarrollo adicional y la aplicación clínica de estrategias de vacunación con péptido para diversos tipos de cáncer (NPL 3: Harris CC, J Nati Cáncer Inst 1996 Octubre 16, 88(20): 1442-55; NPL 4: Butterfield LH y asociados, Cáncer Res 1999 Julio 1, 59(13): 3134-42; NPL 5: Vissers JL y asociados, Cáncer Res 1999 Noviembre 1, 59(21): 5554-9; NPL 6: van der Burg SH y asociados, J Immunol 1996 Mayo 1, 156(9): 3308-14; NPL 7: Tanaka F y asociados, Cáncer Res 1997 Octubre 15, 57(20): 4465-8; NPL 8: Fujie T y asociados, Int J Cáncer 1999 Enero 18, 80(2): 169-72; NPL 9: ikuchi M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): 459-66; NPL 10: Oiso M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): 387-94). Hasta la fecha, han habido diversos reportes de pruebas clínicas que utilizan estos péptidos derivados de antígeno asociados con péptidos. Desafortunadamente, únicamente se ha observado un bajo rango de respuesta objetivo en estas pruebas de vacunas de cáncer (NPL 11: Bel I i F y asociados, J Clin Oncol 2002 Octubre 15, 20(20): 4169-80; NPL 12: Coulie PG y asociados, Immunol Rev 2002 Octubre 188: 33-42; NPL 13: Rosenberg SA y asociados, Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).
Existen diversos tipos de HLA-A en el mundo. Uno de los genotipos HLA conocidos, los genotipos de HLA-A0201, HLA-A0206, HLA-A1101, HLA-A2402, HLA-A2601, HLA-A3101 y HLA-A3303 son conocidos por tener mayor frecuencia de expresión que otros tipos (NPL 14: Lee K W, y asociados, Tissue Antigens 2005: 65: 437-447). Sin embargo, cada genotipo tiene una diferente secuencia de aminoácido y diferente afinidad contra el péptido de epítope (NPL 15: Journal de Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190). Por ejemplo, el residuo de aminoácido del dominio alfa-1 del genotipo HLA-A0206, difiere desde el genotipo HLA-A0201 (por ejemplo, el residuo de tirosina en el 33° aminoácido de la SEC ID NO: 8 es reemplazado con fenilalanina). Debido a estas diferencias, es improbable que un péptido de epítope restringido por HLA-A0201 sea útil para un paciente que posee el genotipo HLA-A0206. Por consiguiente, un péptido útil para diversos tipos de pacientes permanece como una meta en la técnica.
Se confirmaron HIG2 (gen 2 inducible por hipoxia) y URLC10 (también referido como LY6K; complejo de antígeno de linfocito 6, locus ) se confirman como activados en diversos tejidos de cáncer, tal como cáncer renal y cáncer de pulmón a través de análisis de microformación (PTL 1: WO2005/019475, PTL 2: WO2004/031413). Por consiguiente, HIG2 y URLC10 son objetivos interesantes para la inmunoterapia de cáncer y los péptidos de epítope que inducen CTL derivados de los mismos son considerados en la técnica.
List di © Menciones
Leíeiraltura de no Paíenltes
[NPL 1']: Boon T, Int J Cáncer 1993 Mayo 8, 54(2): 177-80
[NPL 2]: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Marzo 1, 183(3): 725-9
[NPL 3]: Harris CC, J Nati Cáncer Inst 1996 Octubre 16, 88(20): 1442-55
[NPL 4]: Butterfield LH y asociados, Cáncer Res 1999 Julio 1, 59(13): 3134-42
[NPL 5]: Vissers JL y asociados, Cáncer Res 1999
Noviembre 1, 59(21): 5554-9
[NPL 6]: van der Burg SH y asociados, J Immunol 1996 Mayo 1, 156(9): 3308-14
[NPL 7]: Tanaka F y asociados, Cáncer Res 1997 Octubre 15, 57(20): 4465-8
[NPL 8]: Fujie T y asociados, Int J Cáncer 1999 Enero 18, 80(2): 169-72
[NPL 9]: Kikuchi M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): 459-66
[NPL 10]: Oiso M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5,
81(3): 387-94
[NPL 11]: Be 11 i F y asociados, J Clin Oncol 2002 Octubre 15, 20(20): 4169-80
[NPL 12]: Coulie PG y asociados, Immunol Rev 2002 Octubre, 188: 33-42
[NPL 13]: Rosenberg SA y asociados, Nat Med 2004 Septiembre, 10(9): 909-15
[NPL 14]: Lee K W, y asociados, Tissue Antigens 2005: 65: 437-447
[NPL 15]: Journal de Immunological Methods, (1995),
Vol.185, pp.181-190
Litera tu ira de Pateóte
[PTL 1]: WO2005/019475
[PTL 2]: WO2004/031413
Breve DescripcSó de la Ínvencióira
La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de una nueva aplicación de dos péptidos, los cuales tienen una secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2. Dentro del contexto de la presente invención, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de un donador saludable, fueron estimuladas con péptidos candidatos derivados de HIG2 o URLC10. Los CTLs que reconocen específicamente las células objetivo positivas HLA-A0206 impulsadas con los péptidos candidatos respectivos fueron establecidos, y se identificaron los péptidos de epítope restringidos por HLA-A0206 que pueden inducir respuestas inmune potentes y específicas contra HIG2 o URLC10 presentadas en la superficie de las células objetivo.
Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar péptidos que tienen inducibilidad CTL, así como una secuencia de aminoácido de las SEC ID NOs: 1 ó 2. Además, la presente invención contempla el uso de péptidos modificados, en donde uno, dos o más aminoácidos son sustituidos, eliminados, insertados y/o agregados, siempre que los péptidos modificados resultantes retengan la inducibilidad CTL del péptido original.
Cuando se administran a un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A0206, los péptidos de la presente invención se presentan en la superficie de las células que presentan antígenos y posteriormente inducen CTLs que dirigen los péptidos respectivos. Por consiguiente, es un objeto de la presente invención, proporcionar células que presentan antígeno y exosomas que presentan cualesquiera de los péptidos de la presente invención con el antígeno HLA-A0206, así como a métodos para inducir células que presentan antígenos.
Se induce una respuesta inmune anti-tumor a través de la administración de los polipéptidos HIG2 o URLC10 de la presente invención o los polinucleótidos que codifican los polipéptidos, así como exosomas y células que presentan antígenos, que presentan los polipéptidos HIG2 o URLC10. Por consiguiente, aún es otro objeto de la presente invención proporcionar agentes farmacéuticos que contienen los polipéptidos o polinucleótidos que los codifican, así como los exosomas y células que presentan antígenos, como sus ingredientes activos, los cuales están proyectados para administración a un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A0206. Los agentes farmacéuticos de la presente invención tienen uso como vacunas.
Además, es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar métodos para el tratamiento y/o profilaxis de (prevención) cánceres (tumores), y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria de los mismos, así como a métodos para inducir CTLs, métodos para inducir una respuesta inmune contra cánceres (tumores) y también inmunidad anti-tumor, en donde un sujeto tiene el antígeno HLA-A0206, incluyendo dichos métodos el paso de administrar los péptidos de la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO:, 2, exosomas o las células que presentan antígenos que presentan la SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2 o los agentes farmacéuticos de la presente invención. Además, los CTLs de la presente invención también tienen uso como vacunas contra cáncer. Los ejemplos de cánceres objetivo incluyen, pero no se limitan a, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático y tumor de tejido blando.
Quedará entendido que tanto la breve descripción de la invención anterior, como la descripción detallada que se encuentra más adelante, son modalidades de ejemplo, y no son restrictivas de la presente invención u otras modalidades alternativas de la misma.
Breve Pescrípcnón de las Fiqyras
Los expertos en la técnica podrán apreciar diversos aspectos y aplicaciones de la presente invención, al momento de la consideración de la breve descripción de las figuras y la descripción detallada de la presente invención y sus modalidades preferidas, que se encuentran a continuación:
La figura 1, incluye una serie de fotografías que ilustran los resultados del ensayo ELISPOT IFN-gamma en CTLs que fueron inducidos con el péptido derivado de HIG2. Los CTLs en los depósitos #1, #2, #5, #7, #8, #10, #13 y #14 estimulados con HIG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1), mostraron una potente producción IFN-gamma en comparación con el control. En las figuras, " + " indica que las células objetivo fueron impulsadas con el péptido adecuado, y "-" indica que las células objetivo no fueron impulsadas con los péptidos.
La figura 2, ilustra una serie de gráficas de línea que muestran los resultados del establecimiento de las líneas CTL estimuladas con H IG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1) con el ensayo ELISA IFN-gamma. Se demostró que las líneas CTL establecidas mediante estimulación con H IG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1), mostraron una potente producción IFN-gamma en comparación con el control. En las figuras, " + " indica que las células objetivo fueron impulsadas con el péptido adecuado, y "-" indica que las células objetivo no habían sido impulsadas con algún péptido.
La figura 3, ilustra una gráfica de líneas que muestra los resultados del establecimiento de un clon CTL estimulado con HIG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1) con el ensayo ELISA IFN-gamma. Los resultados demuestran que el clon CTL establecido mediante estimulación con HIG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1), mostró una potente producción IFN-gamma en comparación con el control. En las figuras, " + " indica que las células objetivo fueron impulsadas con el péptido adecuado, y "-" indica que las células objetivo no habían sido impulsadas con algún péptido.
La figura 4, ilustra una gráfica de líneas que muestra la actividad CTL específica contra las células objetivo que expresan HIG2 y HLA-A*0206. Las células COS7 transfectadas con HLA-A*0206 solas o impulsadas con un péptido no adecuado derivado de HIG2, o con HIG2 sólo, fueron preparadas como control. El clon CTL establecido con HIG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1), mostró alta actividad específica CTL contra células COS7 transfectadas tanto con HIG2 como con HLA-A0206 (marca de pastilla negra). Por otra parte, no se detectó actividad CTL específica importante contra células objetivos que expresan ya sea HLA-A0206 (marca triangular abierta) o HIG2 (círculo abierto).
La figura 5, incluye una serie de fotografías que ilustran los resultados del ensayo ELISPOT IFN-gamma en CTLs que fueron inducidos con un péptido derivado de URLC10. Los CTLs en el depósito #7 estimulados con URLC10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2) mostraron potente producción IFN-gamma comparada con el control. En las figuras, " + " indica que las células objetivo fueron impulsadas con el péptido adecuado, y "-" indica que las células objetivo no habían sido impulsadas con algún péptido.
La figura 6, ilustra una gráfica de líneas que muestra los resultados del establecimiento de las líneas CTL estimuladas con URLC10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2) con el ensayo ELISA IFN-gamma. Los resultados demuestran que la línea CTL establecida mediante estimulación con URLC10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2), mostró una potente producción IFN-gamma en comparación con el control. En las figuras, " + " indica que las células objetivo fueron impulsadas con el péptido adecuado, y "-" indica que las células objetivo no habían sido impulsadas con algún péptido.
La figura 7, ilustra una gráfica de líneas que muestra el resultado del establecimiento del clon CTL estimulado con URLC10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2) con el ensayo ELISA IFN-gamma. Los resultados demuestran que el clon CTL establecido mediante estimulación con URLC10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2), mostró una potente producción IFN-gamma en comparación con el control. En las figuras, " + " indica que las células objetivo fueron impulsadas con el péptido adecuado, y "-" indica que las células objetivo no habían sido impulsadas con algún péptido.
La figura 8, ilustra una gráfica de líneas que muestra la
actividad CTL específica contra las células objetivo que expresan URLC10 y HLA-A*0206. Las células COS7 transfectadas con la longitud total del gen URLC10 sólo o con el gen HLA-A*0206 sólo, se prepararon como el control. El clon CTL establecido con U RLC 10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2) mostró alfa actividad CTL específica contra células COS7 transfectadas tanto con HIG2 como con HLA-A0206 (marca de pastilla negra). Por otra parte, no se detectó actividad CTL específica importante contra células objetivo que expresan ya sea HLA-A0206 (marca triangular abierta) o URLC10 (círculo abierto). En las figuras, "R" significa Que Responde y "S" significa Estimulador.
Descnpcflón DeftalBadla de la II n vención
Aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos en la práctica o pruebas de las modalidades de la presente invención, a continuación se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Sin embargo, antes de que se describan los materiales y métodos de la presente invención, quedará entendido que la presente invención no se Umita a los tamaños, formas, dimensiones, materiales, metodologías, protocolos, etc, particulares aquí descritos, ya que pueden variar de acuerdo con la experimentación y optimización de rutina. También quedará entendido que la terminología utilizada en la descripción es con el propósito de describir las versiones y modalidades particulares únicamente, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención, el cual estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
La descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente mencionada en la presente especificación, está incorporada en forma específica y en su totalidad a la presente invención como referencia. Sin embargo, nada de lo que se encuentra en el presente documento, será construido como una admisión de que la presente invención no está titulada para anteceder dicha descripción, en virtud de la invención previa.
En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, tomarán el control. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no pretenden ser limitantes.
I. Definiciones
Las palabras "un", "uno, una", y "el, la", tal como se utilizan en la presente invención, significan "al menos uno" a menos que se indique específicamente de otra manera.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican a polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido son un residuo modificado, o un residuo que no ocurre naturalmente, tal como un mimético químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente, correspondiente, así como a polímeros de aminoácido que ocurren naturalmente.
El término "aminoácido" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a aminoácidos sintéticos y que ocurren naturalmente, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente. Los aminoácidos que ocurren naturalmente son codificados por el código genético, así como los que son modificados después de la traducción en células (por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, y O-fosfoserina). La frase "análogo de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un alfa carbono enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxi, un grupo amino y un grupo R), como un aminoácido que ocurre naturalmente pero tienen un grupo R modificado o esqueletos modificados (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, sulfonio de metilo de metionina). La frase "mimético de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen diferentes estructuras pero funciones similares a las de los aminoácidos generales.
Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente invención, por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.
Los términos "gen", "polinucleótidos", "nucleótidos" y "ácidos nucleicos" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, a menos que se indique especifique lo contrario, y son, en forma similar a los aminoácidos, referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
A menos que se defina de otra manera, los términos
"cáncer", se refiere a cánceres que sobre-expresan el genHIG2 o URLC10. Los ejemplos de cánceres que sobreexpresan HIG2 incluyen pero no se limitan a cáncer renal, cáncer de tejido blando; los ejemplos de cánceres que sobreexpresan el gen URLC10 incluyen, pero no se limitan a cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), osteosarcoma, cáncer pancreático y tumor de tejido blando.
A menos que se defina lo contrario, los términos "linfocito T citotóxico", "célula T citotóxica", y "CTL" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, y a menos que se indique específicamente lo contrario, se refieren a un sub-grupo de linfocitos T que tienen la capacidad de reconocer células no propias (por ejemplo, células de tumor, células infectadas con virus) e inducir la muerte de dichas células.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención, tienen los mismos significados a los comúnmente comprendidos por los expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención.
II. Péptidos
Para demostrar que los péptidos de H IG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1) y URLC10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2) funcionan como un antígeno reconocido por linfocitos T citotóxicos (CTLs), estos péptidos fueron analizados para determinar si fueron epítopes de antígeno restringidos por HLA-A0206. Después de estimulación in vitro de célula T mediante células dendríticas (DCs) cargadas con estos péptidos, los CTLs fueron establecidos en forma exitosa utilizando cada uno de los péptidos HIG2-A0206-9-4 (SEC ID NO: 1) y URLC10-A0206-10-211 (SEC ID NO: 2).
Estos CTLs establecidos mostraron potente actividad CTL específica, contra células objetivo que expresan el antígeno HLA-A0206, que son impulsadas con los péptidos respectivos. Los resultados en la presente invención, demuestran que los péptidos pueden ser péptidos de epítope de HIG2 y URLC10 restringidos por HLA-A0206. Ya que estos péptidos también pueden ser péptidos de HIG2 o URLC10 restringidos por HLA-A0201 (WO2008/102557, PCT/JP2008/000290, incorporada a la presente invención como referencia), el agente o composición farmacéutica que comprende los péptidos puede ser aplicable tanto a sujetos positivos HLA-A0201 como a sujetos positivos HLA-A0206.
Ya que el gen HIG2 o URLC10 se sobreexpresan en la mayor parte de los tejidos de cáncer, tal como cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, cáncer renal y tumor de tejido blando, es un buen objetivo para inmunoterapia. En particular, los ejemplos de cáncer que sobreexpresan HIG2 incluyen cáncer renal y tumor de tejido blando. Asimismo, los ejemplos de cáncer que sobreexpresan URLC10 incluyen cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático y tumor de tejido blando. Por lo tanto, la presente invención proporciona nonapéptidos (péptidos que consisten en 9 residuos de aminoácido) y decapéptidos (péptidos que consisten en 10 residuos de aminoácido) que corresponden a los péptidos de epítope de HIG2 o URLC10 restringidos por HLA-A0206. Los ejemplos particularmente preferidos de nonapéptidos y decapéptidos de la presente invención, incluyen los péptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada de entre las SEC ID NOs: 1 y 2. Más particularmente, los ejemplos de los péptidos de epítope de HIG2 restringidos por HLA-A0206, incluyen el péptido que comprende una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, y los ejemplos de los péptidos de epítope de URLC10 restringidos por HLA-A0206, incluyen el péptido que comprende una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2.
En general, la modificación de uno, dos o más aminoácidos en una proteína no influenciará la función de la proteína, o en algunos casos incluso aumentará la función deseada de la proteína original. De hecho, los péptidos modificados (por ejemplo, compuestos de una secuencia de aminoácido en la cual, se han modificado, uno, dos o diversos residuos de aminoácido (es decir, sustituido, eliminado, agregado y/o insertado) en comparación con una secuencia de referencia original) han sido conocidos por retener la actividad biológica del péptido original (Mark y asociados, Proc Nati Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller y Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland y asociados, Proc Nati Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Por lo tanto, en una modalidad, los péptidos de la presente invención pueden tener tanto inducibilidad CTL como una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1 ó 2 en donde, 1, 2 o incluso más aminoácidos son agregados, insertados, eliminados, y/o sustituidos.
Los expertos en la técnica reconocerán que las adiciones o sustituciones individuales a una secuencia de aminoácido que altera un aminoácido simple o un pequeño porcentaje de aminoácidos, tiende a dar como resultado la conservación de las propiedades de la cadena lateral de aminoácido original. Por lo tanto, son referidos convencionalmente, como "sustituciones conservadoras" o "modificaciones conservadoras", en donde la alteración de una proteína da como resultado una proteína modificada que tiene propiedades y funciones análogas a la proteína original. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares, son conocidas en la técnica. Las características de la cadena lateral de los aminoácidos de ejemplo, que se desean conservar, incluyen por ejemplo, aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, , S, T), y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene un ácido carboxílico y una amida (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un aromático (H, F, Y, W). Además, los siguientes 8 grupos contienen cada uno aminoácidos que son aceptados en la técnica como sustituciones conservadoras una por otra.
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Aspargina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Usina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver la Publicación de Creighton, Proteins 1984).
Dichos péptidos modificados en forma conservadora también se consideran como péptidos de la presente invención. Sin embargo, los péptidos de la presente invención no se restringen a estos y pueden incluir modificaciones no conservadoras, siempre que el péptido retenga la inducibilidad CTL del péptido original. Además, los péptidos modificados no deben excluir los péptidos inducibles CTL de la variantes polimórficas, homólogos interespecie y alelos de HIG2 o URLC10.
Cuando se utilizan dentro del contexto de inmunoterapia, los péptidos de la presente invención deben presentarse en la superficie de una célula o exosoma, preferentemente como un complejo con un antígeno HLA-A0206. Por consiguiente, es preferible seleccionar péptidos que no únicamente inducen CTLs, sino también poseen alta afinidad de enlace con el antígeno HLA-A0206. Para este fin, los péptidos pueden ser modificados mediante sustitución, inserción, eliminación y/o adición de los residuos de aminoácido para producir un péptido modificado que tiene afinidad de enlace mejorada. Además de los péptidos que se despliegan naturalmente, ya que la regularidad de las secuencias de los péptidos desplegada mediante enlace a los antígenos HLAs ya es conocida (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), se pueden introducir modificaciones con base en dicha regularidad en los péptidos inmunogénicos de la presente invención. Las sustituciones pueden ser introducidas no únicamente en los aminoácidos terminales sino también en la posición del reconocimiento TCR potencial de los péptidos. Varios estudios han demostrado que las sustituciones de aminoácido en un péptido pueden ser iguales o mejores a las originales, por ejemplo CAP1, p53 (26 -272), Her-2/neu (369-377) o gp100 (209-217) (Zaremba y asociados Cáncer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann y asociados J Immunol. (2002) Feb 1 ;168(3):1338-47., S. O. Dionne y asociados Cáncer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 y S. O. Dionne y asociados Cáncer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
La presente invención también contempla la adición de uno a dos aminoácidos que se pueden agregar al N y/o C-término de los péptidos de la presente invención. Dichos péptidos modificados que tienen alta afinidad de enlace del antígeno HLA e inducibilidad o CTL retenida, también se incluyen en la presente invención.
Sin embargo, cuando la secuencia de péptido es idéntica a una parte de la secuencia de aminoácido de una proteína endógena o exógena que tiene diferente función, se pueden inducir efectos secundarios tales como trastornos autoinmune y/o síntomas alérgicos contra sustancias específicas. Por consiguiente es preferible llevar a cabo primero búsquedas de homología utilizando bases de datos disponibles para evitar situaciones en las cuales la secuencia del péptido coincide con la secuencia del aminoácido de otra proteína. Queda claro a partir de las búsquedas de homología que no existe un péptido con una o dos diferencias de aminoácidos en comparación con el péptido objetivo, el péptido objetivo puede ser modificado con el objeto de incrementar su afinidad de enlace con antígenos HLAs, y/o incrementar su inducibilidad CTL sin algún peligro de dichos efectos secundarios.
Aunque los péptidos modificados tal como se describió anteriormente, se espera que sean altamente efectivos, se revisan los péptidos candidatos con respecto a la presencia de inducibilidad CTL para seleccionar péptidos más efectivos. Aquí, la frase "inducibilidad CTL" indica la capacidad del péptido para inducir linfocitos citotóxicos (CTLs) cuando se presentan en células que presentan antígenos. Además, la "inducibilidad CTL" incluye la capacidad que tiene el péptido de inducir la activación CTL, proliferación CTL, promover la lisis CTL de células objetivo, e incrementar la producción CTL IFN-gamma .
La confirmación de la inducibilidad CTL se logra induciendo células que presentan antígenos que llevan antígenos MHC humanos (por ejemplo, B-linfocitos, macrófagos, y células dendríticas (DCs)), o más específicamente DCs derivadas de leucocitos mononucleares de sangre periférica humana, y después de estimulación con los péptidos, mezclando con células positivas CD8, y posteriormente midiendo el IFN-gamma producido y liberado mediante CTL contra las células objetivo. Como el sistema de reacción, se pueden utilizar animales transgénicos que han sido producidos para expresar el antígeno HLA humano (BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Ago, 61(8): 764-79). Por ejemplo, las células objetivo pueden ser radioetiquetadas con 51Cr y similares, y dicha actividad citotóxica puede ser calculada de la radioactividad liberada de las células objetivo cuyo antígeno HLA es HLA-A0206. Como alternativa, la inducibilidad CTL puede ser evaluada midiendo el IFN-gamma producido y liberado mediante CTL en la presencia de células que presentan antígeno (APCs) que llevan péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición en el medio, utilizando anticuerpos monoclonales anti-IFN-gamma.
Además de las modificaciones descritas anteriormente, los péptidos de la presente invención también pueden ser enlazados a otras sustancias, siempre que el péptido enlazado resultante retenga la inducibilidad CTL de requisito del péptido original. Los ejemplos de sustancias adecuadas incluyen pero no se limitan a: péptidos, lípidos, azúcares y cadenas de azúcar, grupos acetilo, polímeros naturales y sintéticos, etc. Los péptidos pueden contener modificaciones tales como glucosilación, oxidación de cadena lateral o fosforilación, efe, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Estos tipos de modificaciones se pueden llevar a cabo para conferir funciones adicionales (por ejemplo, dirigir la función y suministrar la función) o para estabilizar el polipéptido.
Por ejemplo, para incrementar la estabilidad ¡n vivo de un polipéptido, es conocido en la técnica introducir D-aminoácidos, miméticos de aminoácidos o aminoácidos no naturales; este concepto también puede ser adaptado a los polipéptidos de la presente invención. La estabilidad que tiene un polipéptido puede ser ensayada en una cantidad de formas. Por ejemplo, las peptidasas y diversos medios biológicos, tal como plasma y suero humano, se pueden utilizar para probar la estabilidad (ver por ejemplo la publicación de Verhoef y asociados, Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11:291-302)
Además, los péptidos de la presente invención pueden enlazarse a otros péptidos a través de espaciadores o enlazadores. Los ejemplos de otros péptidos incluyen pero no se limitan a péptidos inducibles mediante CTL derivados de otros TAAs. Como alternativa, se pueden enlazar dos o más péptidos de la presente invención a través de espaciadores o enlazadores. Los péptidos enlazados a través de espaciadores o enlazadores pueden ser los mismos o diferentes entre sí. Los espaciadores o enlazadores no están limitados en forma específica, pero son preferentemente péptidos, más preferentemente péptidos que tienen uno o más sitios de disociación que tienen la capacidad de ser disociados mediante enzimas tales como peptidasas, proteasas y proteasomas. Los ejemplos de enlazadores o espaciadores incluyen, pero no se limitan a: AAY (P. M. Daftarian y asociados, J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller y asociados, J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) o, de uno a varios residuos de lisina (S. Ota y asociados, Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura y asociados, J Immunol. 2002, 168: 5709-5715). El péptido de la presente invención comprende los péptidos enlazados a otros péptidos a través de enlazadores o espaciadores.
Los péptidos de la presente invención pueden existir en la superficie de una célula que lleva antígenos MHC humanos (por ejemplo célula que presenta antígeno) o un exosoma, en la forma de complejos en combinación con moléculas MHC y posteriormente inducir CTLs. Las células y los exosomas pueden prepararse a través de métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, las células pueden prepararse contactándolas con péptidos de la presente invención, y los exosomas pueden ser preparados recolectando una fracción que comprende exosoma de las células contactadas con los péptidos de la presente invención (ver las Publicaciones de Kohyo de Solicitud de Patente Japonesa Nos. Hei 11-510507 y WO99/03499). Los péptidos de la presente invención comprenden los péptidos que existen en la superficie de una célula o una exosoma como complejos en combinación con moléculas MHC.
Aquí, los péptidos de la presente invención también se pueden describir como péptido(s) "HIG2 o URLC10" o "polipéptido(s) HIG2 o URLC10".
III. Preparación de péptidos
Los péptidos de la presente invención pueden prepararse utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos pueden prepararse en forma sintética utilizando tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar en forma individual o como polipéptidos más grandes, compuestos de dos o más péptidos. Los péptidos pueden aislarse es decir, purificarse o aislarse para quedar sustancialmente libres de otras proteínas de célula huésped que ocurren naturalmente y fragmentos de las mismas o cualesquiera de otras sustancias químicas.
Un péptido de la presente invención puede obtenerse a través de síntesis química con base en la secuencia de aminoácido seleccionada. Los métodos de síntesis de péptidos convencionales, que se pueden adaptar a la síntesis incluyen pero no se limitan a:
(i) Síntesis de Péptido, Interscience, Nueva York, 1966;
(ii) Proteínas, Volumen 2, Academic Press, Nueva York,
1976;
(iii) Síntesis de Péptido (en Japonés), Maruzen Co., 1975; (iv) Bases y Experimentos de Síntesis de Péptidos (en Japonés), Maruzen Co., 1985;
(v) Desarrollo de Farmacéuticos (segundo volumen) (en Japonés), Volumen 14 (síntesis de péptido), Hirokawa, 1991;
(vi) W099/67288; y
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Péptidos Volumen 2,
"Síntesis de Péptido de Fase Sólida", Academic Press, Nueva York, 1980, 100-118.
Como alternativa, los péptidos de la presente invención se pueden obtener adaptando cualesquiera métodos de ingeniería genética conocidos para producir péptidos (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, ethods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, primero se prepara un vector adecuado que contiene un polinucleótido que codifica el péptido objetivo en una forma expresable (por ejemplo, la corriente descendente de una secuencia reguladora que corresponde a una secuencia promotora) y se transforma en una célula huésped adecuada. Posteriormente la célula huésped se cultiva para producir el péptido de interés. El péptido también puede producirse in vitro adoptando un sistema de traducción in vitro.
IV. Polinucleótidos
La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica los péptidos antes mencionados de la presente invención. Estos incluyen polinucleótidos derivados del gen HIG2 o URLC10 que ocurre naturalmente (SEQ ID NO: 3 o 5, Acceso GenBank No. NM_013332 o NM_017527) así como los que tienen una secuencia de nucleótido modificada en forma conservadora de los mismos. Aquí, la frase "secuencia de nucleótido modificada en forma conservadora" se refiere a secuencias que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmenfe idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU, todos codifican el aminoácido, alanina. Por lo tanto, en cada posición en donde la alanina es especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualesquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipépfido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico, son "variaciones silentes" las cuales son una especie de variaciones modificadas en forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente invención, que codifica un péptido también describe cada posible variación silente del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual ordinariamente es el único codón para metionina, y TGG, el cual ordinariamente es el único codón para triptofan) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silente de un ácido nucleico que codifica un péptido, se describe en forma implícita en cada secuencia descrita.
El polinucleótido de la presente invención puede estar compuesto de ADN, ARN y derivados de los mismos. Un ADN está compuesto en forma adecuada de bases tales como A, T, C, y G, y T es reemplazado por U en un ARN.
El polinucleótido de la presente invención puede codificar múltiples péptidos de la presente invención, con o sin secuencias de aminoácido de intervención entre ellas. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido de intervención puede proporcionar un sitio de disociación (por ejemplo, secuencia de reconocimiento de enzima) del polinucleótido o los péptidos traducidos. Además, el polinucleótido puede incluir cualquier secuencia adicional a la secuencia de codificación que codifica el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye secuencias reguladoras requeridas para la expresión del péptido o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores y similares. En general, dichos polinucleót idos recombinantes pueden prepararse mediante la manipulación de polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales, que utilizan, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas.
Las técnicas de síntesis tanto químicas como recombinantes se pueden utilizar para producir los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido puede producirse mediante la inserción en un vector adecuado, el cual puede ser expresado cuando se transfecta en una célula competente. Como alternativa, se puede amplificar un polinucleótido utilizando técnicas PCR o expresión en huéspedes adecuados (por ejemplo ver la Publicación de Sambrook y asociados, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989). Como alternativa, se puede sintetizar un polinucleótido utilizando las técnicas de fase sólida tal como se describe en la Publicación de Beaucage SL & lyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes y asociados, EMBO J 1984, 3: 801-5.
Los vectores que contienen el polinucleótido de la presente invención, y las células huésped que contienen los vectores, también están incluidas en la presente invención.
V. Exosomas
La presente invención proporciona además vesículas intracelulares llamadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de la presente invención y antígenos HLA en su superficie. Los exosomas pueden ser preparados, por ejemplo, utilizando los métodos detallados en las Publicaciones de Kohyo, de las Solicitudes de Patente Japonesa Nos. Hei 11-510507 y WO99/03499, y se pueden preparar utilizando las APCs obtenidas de pacientes quienes son sometidos a tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención, se pueden inocular como vacunas, en una forma similar a los péptidos de la presente invención.
Dentro del contexto de la presente invención, el tipo de antígenos HLA incluido en los complejos debe ser HLA-A0206, y el sujeto al cual se inoculan los exosomas deben poseer el antígeno HLA-A0206. Normalmente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento, se investiga por adelantado, lo cual permite la selección adecuada de pacientes que se espera se beneficien del tratamiento con los exosomas de la presente invención.
VI. Células que presentan antígeno (APCs)
La presente invención también proporciona APCs aisladas que presentan complejos formados entre antígenos HLA-A0206 y los péptidos de la presente invención en su superficie. Las APCs que se obtienen contactando los péptidos de la presente invención, o que introducen los nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención en una forma expresable, se pueden derivar de pacientes que son sujetos para tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar como vacunas por sí mismas, o en combinación con otros fármacos que incluyen los péptidos de la presente invención, exosomas o células T citotóxicas.
Las APCs no están limitadas a un tipo de células en particular, e incluyen células dendríticas (DCs), células de Langerhans, macrófagos, células B y células T activadas, las cuales son conocidas por presentar antígenos proteináceos en su superficie celular para ser reconocidas por los linfocitos. Ya que una DC es una APC representativa que tiene la acción de inducción CTL más fuerte entre las ACPs, preferentemente las APCs de la presente invención son DCs.
Por ejemplo, una APC puede obtenerse induciendo DCs de monocitos de sangre periférica y posteriormente contactándolas (estimulándolas) con los péptidos de la presente invención, in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente invención se administran al sujeto cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206, las APCs que presentan los péptidos de la presente invención se inducen en el cuerpo del sujeto. La frase "que induce APC" incluye contactar (estimular) una célula con los péptidos de la presente invención, o nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención, para presentar complejos formados entre los antígenos HLA-A0206, y los péptidos de la presente invención en la superficie celular. Como alternativa, después de introducir los péptidos de la presente invención a las APCs para permitir que la APCs presente los péptidos, las APCs se pueden administrar al sujeto como una vacuna. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir los pasos de: a: recolectar las APCs de un primer sujeto con el antígeno
HLA-A es HLA-A0206,
b: contactarlas con las APCs del paso a, con el péptido y c: administrar las APCs cargadas con péptido a un segundo sujeto con el antígeno HLA-A es HLA-A0206.
El primer sujeto y el segundo sujeto pueden ser el mismo individuo, o pueden ser individuos diferentes. Como alternativa, de acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de péptidos de la presente invención para fabricar una composición farmacéutica que induce células que presentan antígenos. Además, la presente invención proporciona un método o proceso para fabricar una composición farmacéutica que induce células que presentan antígenos, en donde el método incluye el paso de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un transportador farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención también proporciona los péptidos de la presente invención para inducir células que presentan antígenos. Las APCs obtenidas mediante el paso b pueden administrarse al sujeto en la forma de una vacuna.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, las APCs tienen un alto nivel de inducibilidad CTL. El término "alto nivel de inducibilidad CTL", es un alto nivel relativo al nivel del de las APC contactadas con no péptidos o péptidos, que no pueden inducir CTL. Dichas APCs, que tienen un alto nivel de inducibilidad CTL, se pueden preparar a través de un método que incluye el paso de transferir genes que contienen polinucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención a APCs in vitro. Los genes introducidos pueden estar en la forma de ADNs o ARNs. Los ejemplos de métodos para introducción incluyen, sin limitaciones particulares, diversos métodos llevados a cabo convencionalmente en el campo, tal como método de lipofección, electroporación y fosfato de calcio. Más específicamente, se pueden llevar a cabo tal como se describe en las Publicaciones de Cáncer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Internacional No. 2000-509281. Al transferir gen en las APCs, el gen pasa por transcripción, traducción, y similares en la célula, y posteriormente la proteína obtenida es procesada mediante MHC Clase I o Clase II y procede a través de un trayectoria de presentación para presentar péptidos.
VII. Células T Citotóxicas (CTLsl
Una célula T citotóxica inducida contra cualesquiera de los péptidos de la presente invención, refuerza la respuesta inmune dirigida hacia el endotelio asociado con tumor in vivo y por lo tanto se puede utilizar como vacuna, en una forma similar al propio péptido. Por lo tanto, la presente invención también proporciona células T citotóxicas aisladas que son inducidas específicamente o activadas a través de cualesquiera de los péptidos de la presente invención.
Las células T citotóxicas se pueden obtener mediante (1) administrando los péptidos de la presente invención a un sujeto, y posteriormente recolectando las células T citotóxicas del sujeto o (2) contactar (estimular) las APCs derivadas del sujeto, y células positivas-CD8 o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con los péptidos de la presente invención .
Las células T citotóxicas, que han sido inducidas mediante estimulación a partir de las APCs que presentan los péptidos de la presente invención, se pueden derivar de pacientes que son sometidos a tratamiento y/o prevención y poseen un antígeno HLA-A0206, y se pueden administrar como están o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de la presente invención o exosomas para el propósito de regular los efectos. Las células T citotóxicas obtenidas actúan específicamente contra células objetivo que presentan los péptidos de la presente invención, o por ejemplo, los mismos péptidos utilizados para inducción. En otras palabras, las células T citotóxicas pueden reconocer (por ejemplo enlazar a) un complejo formado entre HLA-A0206 y el péptido de la presente invención en una superficie de célula objetivo con el receptor de célula T y posteriormente atacar la célula objetivo para inducir la muerte de dicha célula objetivo. Las células objetivo pueden ser células que expresan en forma endógena HIG2 o URLC10, o células que son transfectadas con el gen HIG2 o URLC10; y células que presentan un péptido de la presente invención en la superficie celular debido a estimulación a través del péptido, también pueden servir como objetivos de ataque CTL activado.
VIII. Célula receptora T (TCR)
La presente invención también proporciona un polinucleótido compuesto de una secuencia de ácido nucleico que codifica los polipéptidos que tienen la capacidad de formar una subunidad de un receptor de célula T (TCR) y métodos para utilizar los mismos. Las subunidades TCR tienen la capacidad de formar TCRs que confieren especificidad a células T contra células de tumor que presentan péptidos HIG2 o péptidos URLC10 con un antígeno HLA-A0602. Al utilizar los métodos conocidos en la técnica, se puede identificar la secuencia de ácido nucleico de las cadenas alfa- y beta- del TCR expresado en el CTL inducido con el péptido de la presente invención (WO2007/032255 y Morgan y asociados, J Immunol, 171, 3288 (2003)). Los TCRs derivados pueden enlazar al péptido HIG2 o URLC10 que se despliega en las células objetivo con alta avidez, y opcionalmente, transmitir una exterminación eficiente de las células objetivo que presentan el péptido HIG2 o URLC10 con el antígeno HLA-A0602 in vivo y in vitro.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican las subunidades TCR se pueden incorporar en vectores adecuados, por ejemplo, vectores retrovirales. Estos vectores son conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos o vectores que los contienen, normalmente pueden ser transferidos en una célula T, por ejemplo, una célula T de un paciente cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206. En forma conveniente, La presente invención proporciona una composición fuera del anaquel que permite la modificación rápida de las propias células T del paciente (o las de otro mamífero) para producir en forma rápida y fácil células T modificadas que tienen excelentes propiedades de exterminio de células de cáncer.
Asimismo, la presente invención proporciona CTLs que son preparadas mediante transducción con un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico que codifica los polipépfidos de subunidades TCR que enlazan a un complejo formado entre el péptido HIG2 o URLC10 y un antígeno HLA-A0206. Los CTLs transducidos tienen la capacidad de alojar células de cáncer in vivo, y se pueden expander a través de métodos de cultivo in vitro bien conocidos (por ejemplo, Kawakami y asociados, J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Las células T de la presente invención, se pueden utilizar para formar una composición inmunogénica útil para tratar o para prevenir cáncer en un paciente que necesita de terapia o protección (WO2006/031221 ).
IX. Agentes o composiciones farmacéuticas
Los términos "prevención" y "profilaxis" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para referirse a una actividad que reduce la carga de mortalidad o morbididad de la enfermedad. La prevención y profilaxis puede ocurrir "en niveles de prevención primarios, secundarios y terciarios". Aunque la prevención y profilaxis primaria evita el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundarios y terciarios de prevención y profilaxis comprenden actividades dirigidas a la prevención y profilaxis del progreso de una enfermedad, y surgimiento de los síntomas, así como la reducción del impacto negativo de una enfermedad ya establecida restaurando la función y reduciendo las complicaciones relacionadas con la enfermedad. Como alternativa, la prevención y profilaxis puede incluir un amplio rango de terapias profilácticas con el objetivo de aliviar la severidad del trastorno particular, por ejemplo, reducir la proliferación y metástasis de tumores.
El tratamiento y/o profilaxis de cáncer y/o la prevención de la recurrencia postoperatorio del mismo, incluye cualesquiera de los siguientes pasos, tal como la eliminación quirúrgica de células de cáncer, la inhibición del crecimiento de células cancerígenas, la involución o regresión de un tumor, la inducción de remisión y supresión de surgimiento de cáncer, la regresión de un tumor, y la reducción o inhibición de metástasis. En forma efectiva, el tratamiento y/o la profilaxis de cáncer disminuye la mortalidad y mejora el pronóstico de individuos que tienen cáncer, disminuye los niveles de marcadores de tumor en la sangre y alivia síntomas detectables que acompañan cáncer. Por ejemplo, la reducción o mejoría de síntomas que constituyen el tratamiento y/o la profilaxis efectiva, incluyen el 10%, 20%, 30% o más de reducción, o una enfermedad estable.
Ya que la expresión HIG2 o URLC10 es activada en diversos cánceres en comparación con tejidos normales, los péptidos de la presente invención o polinucleótidos que codifican dichos péptidos, se pueden utilizar para el tratamiento y/o la profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operatoria de los mismos. Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente o composición farmacéutica para tratar y/o prevenir cáncer, y/o prevenir la recurrencia postoperatoria del mismo, que incluye uno o más de los péptidos de la presente invención, o polinucleótidos que codifican los péptidos como un ingrediente activo. Como alternativa, los péptidos de la presente invención se pueden expresar en una superficie de cualesquiera de los exosomas o células anteriores, tal como APCs para el uso como agentes o composiciones farmacéuticos. Además, las células T citotóxicas antes mencionadas que dirigen cualesquiera de los péptidos de la presente invención, también se pueden utilizar como el ingrediente activo de los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención. Dentro del contexto de la presente invención, la frase "dirección de un péptido" se refiere al reconocimiento (por ejemplo, enlace a) un complejo formado entre un antígeno HLA-A0206 y un péptido en una superficie de célula objetivo con el receptor de célula T, y posteriormente el ataque de la célula objetivo para inducir la muerte de la misma.
En otra modalidad, la presente invención también proporciona el uso de un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido tal como se describe en la presente invención en una forma expresable, (c) una APC de la presente invención, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención en la fabricación de una composición o agente farmacéutico para tratar cáncer.
Como alternativa, la presente invención proporciona además un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido tal como se describe en la presente invención en una forma expresable,
(c) una APC de la presente invención, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención para utilizarse en el tratamiento de cáncer.
Como alternativa, la presente invención proporciona además un método o proceso para fabricar una composición farmacéutica o agente para tratar cáncer, en donde el método o proceso incluye el paso de formular un transportador farmacéutica o fisiológicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido tal como se describe en la presente invención en una forma expresable, (c) una APC de la presente invención, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención en la forma de ingredientes activos.
En otra modalidad, la presente invención también proporciona un método o proceso para fabricar una composición farmacéutica o un agente para tratar cáncer, en donde el método o proceso incluye el paso de mezclar en adiciones un ingrediente activo con un transportador farmacéutica o fisiológicamente aceptable, en donde el ingrediente activo es seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido tal como se describe en la presente invención en una forma expresable,
(c) una APC de la presente invención, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención.
Como alternativa, la composición o agente farmacéutico de la presente invención, se puede utilizar ya sea para cualquiera o ambas de la profilaxis de cáncer y la prevención de la recurrencia post-operatoria del mismo.
Los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención, encuentran uso como vacuna. Dentro del contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (también referida como "composición inmunogénica") se refiere a una sustancia que tiene la función de inducir inmunidad anti-tumor al momento de la inoculación en animales.
Los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención, se pueden utilizar para tratar para y/o prevenir cánceres y/o para la prevención de la recurrencia de los mismos en sujetos o pacientes incluyendo humanos y cualquier otro mamífero, incluyendo pero sin limitarse a ratón, rafa, cerdo de guinea, conejo, gato, perro, oveja, cabra, cerdo, ganado, caballo, mono, mandril, y chimpancé, particularmente un animal comercialmente importante o un animal doméstico.
De acuerdo con la presente invención, los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada de entre las SEQ ID NOs: 1 y 2 se ha encontrado que son péptidos de epítope restringidos por HLA-A0206 que pueden inducir una respuesta inmune potente y especifica contra células objetivo que expresan HIG2 o URLC10, y HLA-A0206. Por consiguiente, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención que incluyen uno de estos polipéptidos con la secuencia de aminoácido seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1 y 2, son particularmente adecuados para la administración a sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A0206. Lo mismo aplica a agentes o composiciones farmacéuticas que incluyen polinucleótidos que codifican cualesquiera de estos polipéptidos.
Los cánceres que serán tratados a través de los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención, no están limitados e incluyen todos los tipos de cánceres en donde está implicado HIG2 o URLC10, incluyendo, por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, carcinoma renal y tumor de tejido blando. Particularmente, los agentes o composiciones farmacéuticas que dirigen MIG2 son aplicables preferentemente a carcinoma renal, y tumor de tejido blando, y los agentes o composiciones farmacéuticas que dirigen URLC10, son aplicables preferentemente a cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático y tumor de tejido blando.
Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener además de los ingredientes activos antes mencionados, otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTLs contra células cancerígenas, otros polinucleótidos que codifican los otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, o similares. En la presente invención, los otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTLs contra células cancerígenas, se ejemplifican mediante antígenos específicos de cáncer (por ejemplo, TAAs identificado), pero no se limitan a los mismos.
Si se necesita, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras sustancias terapéuticas como un ingrediente activo, siempre que la sustancia no inhiba el efecto anti-tumor del ingrediente activo, por ejemplo, cualesquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir agentes o composiciones anti-inflamatorias, exterminadores de dolor, quimioterapéuticos, y similares. Además de incluir otras sustancias terapéuticas en el propio medicamento, los medicamentos de la presente invención también se pueden administrar en secuencias o en forma concurrente con el uno o más agentes o composiciones farmacológicas. Las cantidades de medicamento y agente o composición farmacológica dependen, por ejemplo, de qué tipo de agente(s) o composición(s) farmacológica se utiliza, la enfermedad que esté siendo tratada y la programación y rutas de administración.
Deberá quedar entendido que además de los ingredientes mencionados de manera particular en la presente invención, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden incluir otros agentes o composiciones convencionales en la técnica, que se refieren al tipo de la formulación en cuestión.
En una modalidad de la presente invención, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluirse en artículos de fabricación y equipos que contienen materiales útiles para tratar las condiciones patológicas de la enfermedad que será tratada, por ejemplo, cáncer. El artículo de fabricación puede incluir un contenedor de cualesquiera de los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención con una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen botellas, frascos y tubos de prueba. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta en el contenedor debe indicar el agente o composiciones que se utilizan para el tratamiento o prevención de una o más condiciones de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar direcciones para administración, etc.
Además del contenedor descrito anteriormente, un equipo que incluye un agente o composición farmacéutica de la presente invención, puede incluir opcionalmente en forma adicional un segundo contenedor que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de paquete con instrucciones para uso.
Las composiciones farmacéuticas, si se desea, pueden presentarse en un paquete o dispositivo de abastecimiento que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. Por ejemplo, el paquete puede incluir láminas de metal o plástico, tal como un paquete blíster. El paquete o dispositivo de abastecimiento puede estar acompañado de instrucciones para administración.
(1) Agentes y composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos como el ingrediente activo
Los péptidos de la presente invención se pueden administrar directamente como un agente o composición farmacéutica, o si es necesario, pueden administrarse tal como hayan sido formulados a través de métodos de formulación convencional. En el último caso, además de los péptidos de la presente invención, se pueden incluir, según sea lo adecuado sin limitaciones particulares, transportadores, excipientes y similares o utilizados en forma ordinaria para fármacos. Los ejemplos de dichos transportadores son agua esterilizada, solución salina fisiológica, amortiguador de fosfato, fluido de cultivo y similares. Además, los agentes o composiciones farmacéuticas pueden contener, según sea necesario, estabilizadores, suspensiones, conservadores, tensoactivos y similares. Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar con propósitos anticáncer.
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar como una combinación compuesta de dos o más péptidos de la presente invención, para inducir CTL in vivo. La combinación de péptidos puede tomar la forma de un cóctel o puede conjugarse entre sí utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos pueden ser enlazados químicamente o expresados como una secuencia de polipéptido de fusión simple. Los péptidos en la combinación pueden ser los mismos o diferentes. Al administrar los péptidos de la presente invención, los péptidos se presentan en una alta densidad a través de los antígenos HLA-A0206 en APCs, posteriormente se inducen los CTLs que reaccionan en forma específica hacia el complejo formado entre el péptido desplegado y el antígeno HLA-A0206. Como alternativa, las APCs que presentan cualesquiera de los péptidos de la presente invención en su superficie celular, que se pueden obtener estimulando APCs (por ejemplo, DCs) derivadas de un sujeto con péptidos de la presente invención, se pueden administrar al sujeto, y como resultado, los CTLs se inducen en el sujeto y se puede incrementar la agresividad hacia las células de cáncer, tal como cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, carcinoma renal, y tumor de tejido blando.
Los agentes o composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o prevención de cáncer, que incluyen un péptido de la presente invención como el ingrediente activo, también pueden incluir un adyuvante conocido por establecer en forma efectiva la inmunidad celular. Como alternativa, se pueden administrar con otros ingredientes activos y se pueden administrar mediante formulación en gránulos. Un adyuvante se refiere a un compuesto que aumenta la respuesta inmune contra la proteína cuando se administra junta (o en forma sucesiva) con la proteína que tiene actividad inmunológica. Los adyuvantes aquí contemplados incluyen los descritos en la literatura (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alum, toxina de cólera, toxina de salmonella, y similares, pero no se limitan a estos.
Además, se pueden utilizar de manera conveniente formulaciones de liposomas, formulaciones granulares, en las cuales el péptido se une a gránulos de unos cuantos micrómetros de diámetro, y formulaciones en las cuales un lípido se une al péptido.
En algunas modalidades, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden incluir además un componente que imprima CTL. Los lipidos han sido identificados como agentes o composiciones con la capacidad de imprimar CTL in vivo contra antígeno virales. Por ejemplo, se pueden unir residuos de ácido palmítico a los grupos epsilon y alfa-amino de un residuo de lisina, y posteriormente enlazarse a un péptido de la presente invención. Posteriormente el péptido lipidado puede administrarse ya sea directamente en una micela o partícula, incorporarse en un liposoma, o emulsificarse en un adyuvante. Como otro ejemplo de imprimación de lipidos de respuestas CTL, se pueden utilizar lipoproteínas E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) para imprimar CTL cuando se unen en forma covalente a un péptido adecuado (ver la Publicación de Deres y asociados, Nature 1989, 342: 561-4).
El método de administración puede ser oral, inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa o similares, y administración sistémica o administración local a los alrededores de los sitios objetivo. La administración se puede llevar a cabo a través de administración simple o reforzarse a través de múltiples administraciones. La dosis de los péptidos de la presente invención se puede ajustar en forma adecuada de acuerdo con la enfermedad que será tratada, edad del paciente, peso, método de administración, y similares, y normalmente es de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.1 mg a 10 mg, y se puede administrar una vez en varios días hasta varios meses. Un experto en la técnica puede seleccionar en forma adecuada una dosis correcta.
(2) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo.
Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener ácidos nucleicos que codifican los péptidos aquí descritos en una forma expresable. Aquí, la frase "una forma expresable" significa que el polinucleótido, cuando se introducen en una célula, será expresado in vivo como un polipéptido que induce inmunidad anti-tumor. En una modalidad ejemplificada, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés incluye elementos reguladores necesarios para la expresión del polinucleótido. El polinucleótido(s) puede equiparse de modo que logre la inserción estable en el genoma de la célula objetivo (ver la Publicación de Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 para una descripción de los vectores de cartucho de recomendación homologa). Ver la Publicación de Wolff y asociados, Science 1990, 247: 1465-8; Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; y WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de suministro a base de ADN incluyen "ADN descubierto", un suministro facilitado ("transmitido mediante bupivacaína, polímeros, péptidos), complejos de lípidos catiónicos, y suministro transmitido por partículas "pistola genética") o transmitido por presión (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,922,687).
Los péptidos de la presente invención también pueden ser expresados a través de vectores virales o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen receptores virales atenuados tales como vacuna o fowlpox. Este método implica el uso de un virus de vacuna por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótido que codifican el péptido. Al momento de la introducción en un huésped, el virus de vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de esta forma provoca una respuesta inmune. Los vectores de vacuna y métodos útiles en protocolos de inmunización se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 4,722,848. Los ejemplos de otro vector incluyen BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en la Publicación de Stover y asociados, Nature 1991, 351: 456-60. Se podrán apreciar una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica, por ejemplo, vectores de virus adeno y adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax desintoxicada y similares. Ver las Publicaciones de Shata y asociados, Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock y asociados, J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp y asociados, In Vivo 2000, 14: 571-85.
El suministro de un polinucleótido en un sujeto puede ser ya sea directo, caso en el cual, el sujeto es expuesto directamente a un vector que lleva un polinucleótido, o indirecto, en cuyo caso, las células se transforman primero con el polinucleótido de interés in vitro, posteriormente las células se trasplantan en el sujeto. Estos dos métodos son conocidos, respectivamente, como terapias genéticas in vivo y ex vivo.
Para revisiones generales de los métodos de terapia genética consultar las Publicaciones de Goldspiel y asociados, Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que se pueden utilizar también para la presente invención, se describe en las Publicaciones de eds. Ausubel y asociados, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; y Krieger, Gene Transfer y Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.
El método de administración puede ser oral, inyección iníradérmica, subcutánea, intravenosa o similares, y administración sistémica o administración local en los alrededores de los sitios objetivo. La administración se puede llevar a cabo a través de administración simple o reforzarse a través de múltiples administraciones. La dosis del polinucleótido en el transportador adecuado o células transformadas con el polinucleótido que codifica los péptidos de la presente invención, se pueden ajustar en forma adecuada de acuerdo con la enfermedad que será tratada, edad del paciente, peso, método de administración, y similares, y normalmente es de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.1 mg a 10 mg, y se puede administrar una vez en unos cuantos días o una vez en unos cuantos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar en forma adecuada la dosis correcta.
X. Métodos para utilizar los péptidos, exosomas. APCs y CTLs Los péptidos de la presente invención y los polinucleótidos que codifican dichos péptidos se pueden utilizar para inducir APCs y CTLs. Los exosomas y APCs de la presente invención también se pueden utilizar para inducir CTLs. Los péptidos, polinucleótidos, exosomas y APCs se pueden utilizar en combinación con cualesquiera otros compuestos siempre que los compuestos no inhiban su inducibilidad CTL. Por lo tanto, cualesquiera de los agentes o composiciones farmacéuticas antes mencionadas de la presente invención, se pueden utilizar para inducir CTLs, y además de esto, los que incluyen los péptidos y polinucleótidos también se pueden utilizar para inducir APCs tal como se describe más adelante.
(1) Método para inducir células que presentan antígenos (APCs)
La presente proporciona métodos para inducir APC utilizando los péptidos de la presente invención o polinucleótidos que codifican los péptidos. La inducción de APCs puede llevarse a cabo tal como se describió anteriormente en la sección "VI. Células que presentan antígenos". La presente invención también proporciona un método para inducir APCs que tiene un alto nivel de inducibilidad CTL, cuya inducción también ha sido mencionada bajo la sección de "VI. Células que presentan antígenos", supra.
Preferentemente, los métodos para inducir APCs incluyen al menos un paso seleccionado de entre:
a: contactar una APCs cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206 con los péptidos de la presente invención, y
b: introducir los péptidos de la presente invención en una forma expresable en APCs, cuyo antígeno HLA-A es HLA A0206.
Dichos métodos para inducir APCs se llevan a cabo preferentemente in vitro o ex vivo. Cuando los métodos son llevados a cabo in vitro o ex vivo, las APCs que serán inducidas pueden obtenerse de un sujeto que será tratado u otros cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206.
(2) Método para inducir CTLs
Además, la presente invención proporciona métodos para inducir CTLs utilizando los péptidos de la presente invención, polinucleótidos que codifican los péptidos o exosomas o APCs que presentan los péptidos.
La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs utilizando un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de formar una subunidad de receptor de célula T (TCR) que reconoce (es decir, enlaza a) un complejo de los péptidos de la presente invención y un antígeno HLA-A0206 en una superficie celular. Preferentemente, los métodos para inducir CTLs incluyen al menos un paso seleccionado de entre:
A: contactar una célula T positiva CD8 con una célula que presenta antígenos y/o un exosoma que presente en su superficie un complejo de un antígeno HLA-A0206 y un péptido de la presente invención, y
b: introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido que tienen la capacidad de formar una subunidad TCR que reconoce un complejo de un péptido de la presente invención y un antígeno HLA-A0206 en una célula T positiva.
Cuando los péptidos de la presente invención se administran a un sujeto, el CTL se induce en el cuerpo del sujeto, y se aumenta la fuerza de la respuesta inmune que se dirige a las células de cáncer. Como alternativa, los péptidos y polinucleótidos que codifican los péptidos se pueden utilizar para un método terapéutico ex vivo, en el cual las APCs derivadas del sujeto, y las células positivas CD8, o leucocitos mononucleares de sangre periférica, se ponen en contacto (estimulan) con los péptidos de la presente invención in vitro, y después de inducir el CTL, las células CTL activadas se regresan al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir los pasos de:
a: recolectar APCs del sujeto cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206,
b: contactar con las APCs de paso a, con el péptido de la presente invención,
c: mezclar las APCs del paso b con células T CD8+ cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206, y co-cultivar para inducir CTLs: y
d: recolectar células T CD8+ del co-cultivo del paso c.
Como alternativa, de acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de los péptidos de la presente invención para fabricar una composición farmacéutica induciendo CTLs. Además, la presente invención proporciona un método o proceso para fabricar un agente o composición farmacéutica induciendo CTLs, en donde el método incluye el paso de mezclar en adiciones o formular el péptido de la presente invención con un transportador farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención también proporciona el péptido de la presente invención para inducir CTLs.
Las células T CD8+ que tienen actividad citotóxica obtenida de paso d se puede administrar al sujeto como una vacuna. Las APCs que serán mezcladas con las células T CD8+ en el paso c anterior, también se pueden preparar transfiriendo genes que codifican los péptidos de la presente invención en las APCs tal como se describe anteriormente en la sección "VI. Células que presentan antígenos"; pero no se limitan a las mismas, y se pueden utilizar para este método cualquier APC o exosoma que presenta en forma efectiva los péptidos de la presente invención a las células T.
Se presentan los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invención y para ayudar a un experto en la técnica a elaborar y utilizar la misma. Los ejemplos no están proyectados en forma alguna para limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplos
Materiales v métodos
Líneas Celulares
Se compró PSCCA0922 (HLA-A0206) en Pharma SNP Consortium; PSC. Se compraron la línea de célula linfoblastoide-B humana y COS7 en ATCC.
Péptidos candidatos derivados de HIG2 y URLC10
Se sintetizaron los péptidos 9-mer y 10-mer derivados de HIG2 o URLC10 en Sigma (Sapporo, Japón) o Biosynthesis Inc. (Lewisville, TX) de acuerdo con un método de síntesis de fase sólida estándar y se purificaron mediante cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (HPLC). Se determinó la pureza (>90%) y la identidad de los péptidos mediante HPLC analítico y análisis de espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) en 20 mg/ml y se almacenaron a una temperatura de -80 grados C.
Inducción CTL In Vitro
Se utilizaron células dendríticas derivadas de monocito (DCs) como células que presentan antígenos (APCs) para inducir respuestas de linfocito T citotóxico (CTL) contra péptidos presentados en antígeno de leucocito humano (HLA). Las DCs se generaron in vitro tal como se describe en otras partes (Nakahara S y asociados, Cáncer Res 2003 Julio 15, 63(14): 4112-8). En forma específica, se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de un voluntario normal (positivo HLA-A0206) mediante solución Ficoll-Plaq ue (Pharmacia), mediante la adherencia a un plato de cultivo de tejido de plástico (Becton Dickinson) para enriquecerlas de esta forma, como la fracción de monocito. Se cultivó la población enriquecida con monocito en la presencia de 1000 U/ml de factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) (R&D System) y 1000 U/ml de interleucina (IL)-4 (R&D System) en un Medio AIM-V (Invitrogen) que contiene 2% de suero autólogo desactivado por calor al 2% (AS). Después de 7 días de cultivo, se impulsaron las DCs inducidas por citocina con 20 micro-g/ml de cada uno de los péptidos sintetizados en la presencia de 3 micro-g/ml de beta2-microglobulina durante 3 horas a 37 grados C en un medio AIM-V. Las células generadas parecieron expresar moléculas asociadas con DC-, tal como CD80, CD83, CD86 y HLA clase II, en su superficie celular (datos no mostrados). Estas DCs impulsadas con péptido se desactivaron posteriormente a través de Mitomicina C (MMC) (30 micro-g/ml durante 30 minutos) y se mezclaron en una proporción de 1:20 con células T CD8+ autólogas, obtenidas mediante selección positiva con el Equipo de Aislamiento Positivo (Dynal). Estos cultivos se establecieron en placas de 48 depósitos (Corning); cada depósito contenía 1.5 x 104 de DCs impulsada con péptido, 3 x 105 de célula T CD8+ y 10 ng/ml de IL-7 (R&D System) en 0.5 mi delin medio AIM-V/2%. Tres días después, estos cultivos se suplementaron con IL-2 (CHIRON) hasta una concentración final de 20 lU/ml. El día 7 y 14, las células T se estimularon en forma adicional con las DCs impulsadas con péptido autólogo. Las DCs se prepararon cada vez de la misma forma descrita anteriormente. El CTL se detectó contra células PSCCA0922 impulsadas con péptido después de la tercera vuelta de estimulación con péptido el día 21 (Tanaka H y asociados, Br J Cáncer 2001 Enero 5, 84(1): 94-9; Umano Y y asociados, Br J Cáncer 2001 Abril 20, 84(8): 1052-7; Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Diciembre 15, 10(24): 8577-86; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): 411-9; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Agosto 96(8): 498-506).
Procedimiento de Expansión CTL
Se expandieron CTLs en cultivo utilizando el método similar al descrito por Riddell y asociados. (Walter EA y asociados, N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR y asociados, Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). Se suspendieron un total de 5 x 104 CTLs en 25 mi de un medio AIM-V/5% con 2 tipos de línea de célula linfoblastoide-B humana desactivada mediante MMC, en la presencia de 40 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después del inicio de los cultivos, se agregaron 120 lU/ml de IL-2 a los mismos. Los cultivos se alimentaron con un medio AIM-V/5% AS fresco que contiene 30 lU/ml de IL-2 los días 5, 8 y 11 (Tanaka H y asociados, Br J Cáncer 2001 Enero 5, 84(1): 94-9; Umano Y y asociados, Br J Cáncer 2001 Abril 20, 84(8): 1052-7; Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Diciembre 15, 10(24): 8577-86; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): 411-9; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Agosto 96(8): 498-506).
Establecimiento de Clones CTL
Las diluciones se elaboraron para tener 0.3, 1 y 3 CTLs/depósito en una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 depósitos (Nalge Nunc International). Los CTLs se cultivaron con 7x104 células/depósito de 2 tipos de líneas de célula linfoblastoide-B humana, 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3 y 125 U/ml de IL-2 en total de 150 micro 1/depósito de AIM-V que contiene 5%AS. Se agregaron 50 micro 1/depósito de IL-2 al medio 10 días después, de modo que IL-2 se convirtiera en 125 U/ml en la concentración final. La actividad CTL de los CTLs se probó el día 14, y los clones CTL se expandieron utilizando el método anterior.
Actividad CTL Específica
Para revisar la actividad CTL específica, se llevaron a cabo ensayo de inmunomanchado enlazado por enzimas de interferón (IFN)-gamma (ELISPOT) y ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas IFN-gamma (ELISA). En forma específica, la PSCCA0922 pulsada con péptido (1 x 10 /depósito) se preparó como una célula estimuladora. Las células cultivadas en 48 depósitos se utilizaron como células de respuesta.
Se llevó a cabo el ensayo IFN-gamma ELISPOT y el ensayo IFN-gamma ELISA bajo un procedimiento de fabricación.
Establecimientos de células que expresan de manera forzada cualquiera de. o tanto el gen objetivo como el gen HLA-A0206
El cADN que codifica un cuadro de lectura abierta de los genes objetivo (HIG2; SEQ ID NO: 3 y URLC10; SEQ ID NO: 5) o HLA-A0206 (SEQ ID NO: 7), se amplificó mediante PCR. Se clonó el producto amplificado-PCR en vector pcDNA3.1 myc-His (Invitrogen). Los plásmidos que contenían cualquiera de o ambos de los genes objetivo y HLA-A0206, se transfectaron en COS7 utilizando lipofectamina (Invitrogen) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. En síntesis, se impulsaron 2.5x106 células COS7 con 10 micró-g de plásmido en 140V y 1000 micro F. Después de 2 días de la transfección, las células transfectadas se trataron con una solución de disociación celular y se utilizaron como las células objetivo para el ensayo de actividad CTL.
Resultados
Expresión HIG2 v URLC10 aumentada en cánceres
Los datos de perfil de expresión de gen global obtenidos de diversos cánceres utilizando microformacion cADN, revelaron que la expresión HIG2 (Acceso GenBank No. NM_013332; SEQ ID No: 3) y URLC10 (Acceso GenBank No. N M_017527; SEQ ID No: 5) fue elevada. La expresión HIG2 se elevó en forma válida en 19 de 20 de cáncer renal y 7 de 9 de tumor de tejido blando en comparación con tejidos normales correspondientes. La expresión URLC10 se elevó en forma válida en 29 de 29 de cáncer de vejiga, 15 de 16 de cáncer cervical, 7 de 7 de carcinoma colangiocelular, 7 de 19 de cáncer de esófago, 3 de 3 de cáncer gástrico, 24 de 27 de NSCLC, 15 de 19 de osteosarcoma, 4 de 5 de cáncer pancreático y 33 de 43 de tumor de tejido blando en comparación con tejidos normales correspondientes.
Inducción CTL con el péptido de HIG2 restringido con HLA-A0206 v establecimiento para líneas CTL estimuladas con pépticos derivados de HIG2
Las CTLs para el péptido derivado de HIG2, fueron generadas de acuerdo con los protocolos tal como se describe en la sección de "Materiales y Métodos". La actividad CTL específica del péptido se determinó mediante ensayo IFN-gamma ELISPOT (figura 1). Los resultados en la presente invención muestran que HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1), demuestra una potente producción IFN-gamma en comparación con los depósitos de control. Además, las células en los números de depósitos positivos 1, 2, 5, 7, 8, 10, 13 y 14 estimulados con SEQ ID NO: 1, se expandieron para establecer líneas CTL. Las actividades CTL de dichas lineas CTL se determinaron mediante ensayo IFN-gamma ELISA (figura 2). Los resultados aquí mostrados indican que todas las líneas CTL demuestran potente producción IFN-gamma contra las células objetivo impulsadas con el péptido correspondiente, en comparación con células objetivo sin impulso de péptido. Por lo tanto, HIG2-A0206-9-4 puede inducir potentes líneas CTL contra las células objetivo que expresan HLA-A0206.
Establecimiento de clones CTL estimulados con péptidos derivados de HIG2
La dilución limitante de estas líneas CTL, se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos establecidos en la sección de "Materiales y Métodos" descrita anteriormente. El establecimiento de la línea CTL HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1), se muestra en la figura 3. Estos clones CTL tienen actividades CTL potentes y específicas contra un objetivo impulsado con péptido en comparación con las actividades contra el objetivo sin impulso de péptido.
Actividad CTL específica contra células objetivo que expresan HIG2 v HLA-A0206
Los clones CTL establecidos elevados contra HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1), se revisaron con respecto a su capacidad de reconocer las células objetivo que expresan HIG2 y HLA-A0206. La actividad CTL específica contra COS7 transfectada tanto con el gen HIG2 de longitud total, como con la molécula HLA-A0206, que sirve como un modelo específico para células objetivo que expresan en forma endógena HIG2 y HLA-A0206, se probó utilizando como células efectoras, el clon CTL elevado mediante HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1). COS7 transfectada con HIG2 de longitud total pero no HLA-A0206 e impulsada con otro péptido (HIG2-9-8:YLLGVVLTL) y COS7 transfectada con HLA-A0206 pero no con HIG2 de longitud total se prepararon como controles. Los clones CTL que demuestran la más alta actividad CTL específica contra COS7, fueron los transfectados tanto con HIG2 como con HLA-A0206 (figura 4).
Los resultados aquí mencionados demuestran claramente que HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1) se procesa en forma natural y se presenta en la superficie de célula objetivo con la molécula HLA-A0206 y reconoce CTL. Por consiguiente, HIG2-A0206-9-4 puede servir como una vacuna de cáncer que dirige células de cáncer expresadas mediante HLA en un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A0206.
Inducción CTL con péptido de URLC10 restringido con HLA-A0206 v establecimiento para líneas CTL estimuladas con péptidos derivados de URLC10
Los CTLs para los péptidos derivados de URLC10 fueron generados de acuerdo con los protocolos tal como se describe en la sección de "Materiales y Métodos". La actividad CTL específica del péptido se determinó mediante ensayo IFN-gamma ELISPOT (figura 5). Los resultados en la presente invención muestran que URLC10 -A 0206-10-211 (SEQ ID NO: 2) demuestra una potente producción IFN-gamma en comparación con los depósitos de control. Además, las células en el número de depósito positivo 7 estimulado con SEQ ID NO: 2, se expandieron y establecieron la línea CTL. Se determinó la actividad CTL en la línea CTL mediante ensayo IFN-gamma ELISA (figura 6). El resultado de la presente invención muestra que la línea CTL demuestra potente producción IFN-gamma contra las células objetivo impulsadas con el péptido correspondiente, en comparación con células objetivo sin impulso de péptido. Por lo tanto, URLC10-A0206-10-211 puede inducir una línea CTL potente.
Establecimiento de clon CTL estimulado con péptido derivado de URLC10
La dilución limitante de estas líneas CTL, se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos establecidos en la sección de "Materiales y Métodos" anterior. El establecimiento del clon CTL a partir de la línea CTL URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2) se muestra en la figura 7. Este clon CTL, tiene actividad CTL potente y específica contra el objetivo impulsado con péptido en comparación con las actividades contra el objetivo sin impulso de péptido.
Actividad CTL específica contra células objetivo que expresan URLC10 v HLA-A0206
Los clones CTL establecidos elevados contra URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2) fueron revisados con respecto a su capacidad de reconocer las células objetivo que expresan URLC10 y HLA-A0206. La actividad CTL específica contra COS7 transfectada tanto con el gen URLC10 de longitud total como con la molécula HLA-A0206, que sirve como un modelo específico para dirigir células que expresan en forma endógena URLC10 y HLA-A0206, se probó utilizando como células efectoras, el clon CTL elevado mediante URLC10-A 0206-10-211 (SEQ ID NO: 2). COS7 transfectada con URLC10 de longitud total pero no con HLA-A0206 y COS7 transfectada con HLA-A0206 pero no con URLC10 de longitud total, se prepararon como controles. El clon CTL que demuestra la más alta actividad CTL específica contra COS7 fue la transfectada tanto con URLC10 como con HLA-A0206 (figura 8).
Los resultados en la presente invención demuestran claramente que URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 16) se procesa en forma natural y se presenta en la superficie de célula objetivo con la molécula HLA-A0206 y reconoce CTL. Además, URLC10-A0206-10-211 puede servir como una vacuna de cáncer que dirige células de cáncer expresadas por URLC10 en un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A0206.
En conclusión, se identificaron péptidos de epítope HLA- A0206 novedosos HIG2-A0206-9-4 (SEQ ID NO: 1) y URLC10-A0206-10-211 (SEQ ID NO: 2), y se demuestran como aplicables para inmunoterapia de cáncer en un sujeto cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206.
ApSicabSOidad Industrial
La presente descripción describe TAAs novedosos, particularmente los derivados de HIG2 o URLC10 que inducen respuestas inmune anti-tumor potentes y específicas y tienen aplicabilidad para una amplia gama de tipos de cáncer. Dichos TAAs garantizan el desarrollo adicional como vacunas de péptido contra enfermedades asociadas con HIG2 o URLC10, por ejemplo, cánceres tales como cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), osteosarcoma, cáncer pancreático, carcinoma renal y tumor de tejido blando.
Aunque la presente invención se describe con detalle con referencia a modalidades específicas de la misma, quedará entendido que la descripción anterior tiene naturaleza de ejemplo y de explicación, y está proyectada para ilustrar la presente invención y sus modalidades preferidas. A través de experimentación de rutina, un experto en la técnica reconocerá fácilmente que se pueden realizar varios cambios y modificaciones en la presente invención sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, cuyas asignaciones y límites son definidos por las reivindicaciones adjuntas.
Claims (11)
1. Un agente farmacéutico, en donde el agente comprende uno o más péptidos que tienen inducibilidad de linfocito T citotoxica (CTL), en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 1 , y 2; y (b) SEQ ID NO: 1 , y 2 en donde 1, 2, o diversos aminoácidos son sustituidos, insertados, eliminados y/o agregados, o uno o más polinucleótidos que codifican dicho péptido, en combinación con un transportador farmacológicamente aceptable formulado para un propósito seleccionado del grupo que consiste en: (i) tratamiento de cáncer en un sujeto cuyo antígeno HLA- A es HLA-A0206, (ii) profilaxis de cáncer en un sujeto cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206, (iii) prevención de la recurrencia postoperatoria de cáncer en un sujeto cuyo antígeno HLA-A es HLA-A0206, y (iv) combinaciones de los mismos.
2. El agente farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), osteosarcoma, cáncer pancreático, carcinoma renal y tumor de tejido blando.
3. El agente farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque se formula como una vacuna.
4. Un método para inducir una célula que presenta antígenos con alta inducibilidad CTL, en donde el método comprende el paso seleccionado del grupo que consiste en: (a) contactar una célula que presenta antígeno con un péptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 y 2, o un péptido en el cual al menos un aminoácido es agregado, insertado, eliminado y/o sustituido con otro aminoácido; y (b) introducir un polinucleótido que codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 y 2, o un péptido en el cual al menos un aminoácido es agregado, insertado, eliminado y/o sustituido con otro aminoácido, en una célula que presenta antígeno, en donde la célula que presenta antígenos expresa un antígeno HLA-A0206
5. Un método para inducir CTL utilizando un péptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1 y 2, o un péptido en el cual al menos un aminoácido es agregado, insertado, eliminado y/o sustituido con otro aminoácido, en donde CTL reconoce un complejo de un antígeno HLA-A0206 y el péptido.
6. Una célula que presenta antígenos aislada, que presenta en su superficie un complejo de un antígeno HLA- A0206 y un péptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 y 2, o un péptido en el cual al menos un aminoácido es agregado, insertado, eliminado y/o sustituido con otro aminoácido.
7. Un CTL aislado, el cual reconoce un complejo de un antígeno HLA-A0206 y un péptido que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 y 2, o un péptido en el cual al menos un aminoácido es agregado, insertado, eliminado y/o sustituido con otro aminoácido.
8. Un agente para inducir una célula que presenta antígenos con alta inducibilidad CTL, en donde el agente comprende: (a) uno o más péptidos que tienen inducibilidad CTL, en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NOs: 1 y 2; y (ii) SEQ ID NOs: 1 y 2, en donde 1, 2, o diversos aminoácidos son sustituidos, insertados, eliminados y/o agregados. (b) uno o más polinucleótidos que codifican un péptido;
9. Un método para inducir una respuesta inmune contra cáncer en un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A0206, caracterizado porque comprende el paso de administrar al sujeto un agente que comprende un péptido que tiene inducibilidad CTL y una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 y 2, un péptido en el cual al menos un aminoácido es agregado, insertado, eliminado y/o sustituido con otro aminoácido, un polinucleótido que codifica dicho péptido, una célula que presenta antígenos aislada tal como se describe en la reivindicación 6, o un CTL aislado tal como se describe en la reivindicación 7.
10. El método tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, cáncer de esófago, cáncer gástrico, NSCLC, osteosarcoma, cáncer pancreático, carcinoma renal y tumor de tejido blando.
11. Un agente para inducir una respuesta inmune contra cáncer en un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A0206, en donde el agente comprende: (a) uno o más péptidos que tienen inducibilidad CTL, en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NOs: 1 y 2; y (ii) SEQ ID NOs: 1 y 2, en donde 1, 2, o diversos aminoácidos son sustituidos, insertados, eliminados y/o agregados. (b) uno o más polinucleótidos que codifican un péptido; (c) una o más células que presentan antígenos aisladas tal como se describe en la reivindicación 6; (d) uno o más CTLs aislados tal como se describe en la reivindicación 7; o (e) una combinación de los mismos. en combinación con un transportador farmacológicamente aceptable.
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