TW201500055A

TW201500055A - Ｈｉｇ２與ｕｒｌｃ１０抗原決定位胜肽以及含此胜肽之疫苗

Info

Publication number: TW201500055A
Application number: TW103132024A
Authority: TW
Inventors: Takuya Tsunoda; Ryuji Ohsawa; Sachiko Yoshimura
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2008-08-19
Filing date: 2009-08-13
Publication date: 2015-01-01
Also published as: RU2011110376A; MX2011001883A; EP2328600B9; CA2734467A1; TWI543767B; CN102186491B; ES2566011T3; IL211117A; WO2010021112A1; IL211117A0; KR20110045052A; US20110243973A1; EP2328600B1; EP2328600A4; MX337756B; JP2012500184A; BRPI0917391A2; AU2009283763A2; SG193806A1; CA2734467C

Abstract

本發明提供一藥學試劑或組合物包括具有一或多個序列辨識號：1或2之胺基酸序列的胜肽或一或多個編碼出此胜肽的多核苷酸，其配製成用來在HLA-A抗原為HLA-A0206之個體中之癌症的治療及/或預防。此外，本發明提供一使用此胜肽、多核苷酸或藥學試劑誘導細胞毒殺性T淋巴球與抗原呈現細胞的方法。

Description

HIG2與URLC10抗原決定位胜肽以及含此胜肽之疫苗

本發明係關於生物科學領域，更特別對於癌症治療領域。特別是，本發明係關於新穎之胜肽，其當作癌症疫苗與治療與避免腫瘤之藥物為非常有效。

已證實CD8+細胞毒殺性T淋巴球辨認來自建造於主要組織相容性抗原複合體(major histocompatibility complex,MHC)class I分子上之腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens,TAAs)的抗原決定位胜肽，且之後殺死腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原(melanoma antigen,MAGE)家族為腫瘤相關抗原之第一個例子，主要藉由免疫方法已發現許多其他腫瘤相關抗原(NPL 1：Boon T,Int J Cancer 1993 May 8,54(2)：177-80；NPL 2：Boon T & van der Bruggen P,J Exp Med 1996 Mar 1,183(3)：725-9)。一些腫瘤相關抗原目前接受臨床發展當作免疫治療標的。

能誘導有效且專一之抗腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗原之辨認成為多種形式癌症之胜肽疫苗接種策略(vaccination strategies)之更進一步發展與臨床應用的根據(NPL 3：Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20)： 1442-55；NPL 4：Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999 Jul 1,59(13)：3134-42；NPL 5：Vissers JL et al.,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21)：5554-9；NPL 6：van der Burg SH et al.,J Immunol 1996 May 1,156(9)：3308-14；NPL 7：Tanaka F et al.,Cancer Res 1997 Oct 15,57(20)：4465-8；NPL 8：Fujie T et al.,Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2)：169-72；NPL 9：Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3)：459-66；NPL 10：Oiso M et al.,Int J Cancer 1999 May 5,81(3)：387-94)。迄今已有使用這些腫瘤相關抗原衍生之胜肽的臨床試驗的許多報導。不幸地，到目前為止，於這些癌症疫苗試驗中，僅觀察到一低的客觀反應率(objective response rate)(NPL 11：Belli F et al.,J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20)：4169-80；NPL 12：Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002 Oct,188：33-42；NPL 13：Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004 Sep,10(9)：909-15)。

世界中有幾種HLA-A的型式。已知的HLA基因型中，HLA-A0201、HLA-A0206、HLA-A1101、HLA-A2402、HLA-A2601、HLA-A3101與HLA-A3303的基因型為已知比其他型式具有較高頻率之表現(NPL 14：Lee KW,et al.,Tissue Antigens 2005：65：437-447)。然而，各基因型式具有一不同之胺基酸序列與不同之抗抗原決定位親和力(NPL 15：Journal of Immunological Methods,(1995),Vol.185,pp.181-190)。例如，HLA-A0206基因型之alpha 1區的胺基酸殘基不同於HLA-A0201基因型之alpha 1區的胺基酸殘基(即，在序列辨識號：8之第33個胺基酸的酪胺酸殘基以苯丙胺酸取代)。考慮到這些不同，一HLA-A0201限制之抗原決定位胜肽未必可用於具有HLA-A0206基因型之病患。因此，對於各種形式之病患有用之一胜肽仍是本技術領域的一目標。

藉由微陣列分析(microarray)已確認HIG2(低氧誘發因子基因2)與URLC10(也指，LY6K；淋巴球抗原6複合物，位置(locus)K)在一些癌症組織中，例如腎癌與肺癌(PTL 1：WO2005/019475,PTL 2：WO2004/031413)。因此HIG2與URLC10對於癌症免疫治療而言為一令人感興趣之標的且尋找來自其之細胞毒殺性T淋巴球誘導抗原決定位胜肽，藉由本技術領域中的那些。

【引用文獻】

[非專利文獻]

[NPL 1]: Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80

[NPL 2]: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9

[NPL 3]: Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55

[NPL 4]: Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42

[NPL 5]: Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9

[NPL 6]: van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14

[NPL 7]: Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8

[NPL 8]: Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72

[NPL 9]: Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66

[NPL 10]: Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94

[NPL 11]:BelliF et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80

[NPL 12]: Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42

[NPL 13]: Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15

[NPL 14]: Lee K W, et al., Tissue Antigens 2005: 65: 437-447

[NPL 15]: Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190.

[專利文獻]

[PTL 1]: WO2005/019475

[PTL 2]: WO2004/031413

本發明部分基於發現兩個具有顯示於序列辨識號：1或序列辨識號：2中之胺基酸序列的胜肽的新應用。在本發明內容中，以來自HIG2或URLC10之候選胜肽刺激自健康提供者獲得之周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。建立專一辨認經分別之候選胜肽脈衝(pulsed)之HLA-A0206+目標細胞的細胞毒殺性T淋巴球，且確認可誘導抗表現於腫瘤細胞表面之HIG2或URLC10之有效與專一之免疫反應的HLA-A0206限制抗原決定位胜肽。

因此，提供具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之胜肽與序列辨識號：1或2之一胺基酸序列為本發明之一目標。此外，本發明考慮經修飾之胜肽的使用，其中取代、刪除、插入及/或加入一、二或多個胺基酸，只要產生之經修飾的胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。

當投予一其HLA抗原為HLA-A0206之個體時，本發明胜肽被表現於抗原呈現細胞之表面，且之後誘導細胞毒殺性T淋巴球將分別之胜肽做為目標。因此提供與HLA-A0206抗原表現任一本發明胜肽之抗原呈現細胞與外吐小體及誘導抗原呈現細胞之方法為本發明之一目標。

藉由投予本發明之HIG2或URLC10多胜肽或編碼出該多胜肽之多核苷酸及表現HIG2或URLC10多胜肽之外吐小體與抗原呈現細胞誘導一抗腫瘤免疫反應。因此，提供一藥學試劑，其包含多胜肽或編碼出其之多核苷酸及外吐小體與抗原呈現細胞做為其打算投予HLA抗原為HLA-A0206之個體的活性成分，為本發明之另一目標。本發明之藥學試劑提供做為疫苗。

此外，提供癌症(腫瘤)之治療及/或預防(即避免)及/或其手術後復發之避免的方法，與誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法、誘導抗癌症(腫瘤)免疫反應及抗腫瘤免疫力的方法為本發明之一更進一步目標，其中一個體具有HLA-A0206抗原，而此方法包括投予本發明之序列辨識號：1或序列辨識號2之胜肽、表現序列辨識號：1或序列辨識號2之外吐小體或抗原呈現細胞，或藥學試劑的步驟。此外，本發明之細胞毒殺性T淋巴球也提供使用如抗癌疫苗。目標癌症的例子包括，但不限於腎癌、膀胱癌、子宮頸癌(cervical cnacer)、膽管細胞癌(cholangiocellular carcinoma)、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、骨肉瘤(osteosarcoma)、胰臟癌與軟組織腫瘤。

需要瞭解的是，本發明之前述發明內容與下列詳細敘述兩者為做為例子之實施例，並不限制本發明或本發明之其他替代實施例。

第1圖包括一系列照片，顯示於細胞毒殺性T淋巴球上之IFN-γ酵素結合免疫斑點分析(ELISPOT)的結果，其中以來自HIG2之胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球。與控制組相較，於孔(well)#1、#2、#5、#7、#8、#10、#13與#14中之以HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)刺激的細胞毒殺性T淋巴球，顯示強有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出目標細胞以適合之胜肽脈衝，而“-”指出目標細胞沒有被任何胜肽脈衝。

第2圖顯示一系列曲線圖，其以IFN-γ酵素結合免疫吸附分析顯示經HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株的建立的結果。其顯示，與控制組相較，藉由以HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出目標細胞以適合之胜肽脈衝，而“-”指出目標細胞沒有被任何胜肽脈衝。

第3圖顯示一曲線圖，其以IFN-γ酵素結合免疫吸附分析顯示經以HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製的建立結果。結果證明與控制組相較，藉由以HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出目標細胞以適合之胜肽脈衝，而“-”指出目標細胞沒有被任何胜肽脈衝。

第4圖顯示一曲線圖，其顯示抗性表現HIG2與HLA-A^＊0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。將以單獨之HLA-A^＊0206轉染且以來自HIG2之不適合的胜肽脈衝的COS7細胞，或經單獨之HIG2轉染的COS7細胞製備為控制組。以HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示高的抗COS7細胞活性，其中COS7細胞以HIG2與HLA-A^＊0206兩者轉染(黑菱形標誌)。另一方面，沒有偵測到抗表現HLA-A^＊0206(空心三角形標誌)或HIG2(空心圓形)之目標細胞的顯著專一細胞毒殺性T淋巴球活性。

第5圖包括一系列照片，顯示於細胞毒殺性T淋巴球上之IFN-γ酵素結合免疫斑點分析(ELISPOT)的結果，其中以來自 URLC10之胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球。與控制組相較，於孔(well)#7中之以URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)刺激的細胞毒殺性T淋巴球，顯示強有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出目標細胞以適合之胜肽脈衝，而“-”指出目標細胞沒有被任何胜肽脈衝。

第6圖顯示一曲線圖，其以IFN-γ酵素結合免疫吸附分析顯示經URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)刺激之細胞毒殺性T淋巴球細胞株的建立的結果。結果顯示，與控制組相較，藉由以URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出目標細胞以適合之胜肽脈衝，而“-”指出目標細胞沒有被任何胜肽脈衝。

第7圖顯示一曲線圖，其以IFN-γ酵素結合免疫吸附分析顯示經以URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製的建立結果。結果證明與控制組相較，藉由以URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示強有力之IFN-γ產生。於圖中，“+”指出目標細胞以適合之胜肽脈衝，而“-”指出目標細胞沒有被任何胜肽脈衝。

第8圖顯示一曲線圖，其顯示抗性表現URLC10與HLA-A^＊0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性。將以單獨之全長之URLC10轉染的COS7細胞，或經單獨之HLA-A^＊0206基因轉染的COS7細胞製備為控制組。以URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)建立之細胞毒殺性T淋巴球複製顯示高的抗COS7細胞活性，其中COS7細胞以URLC10與HLA-A0206兩者轉染(黑菱形標誌)。另一方面，沒有偵測到抗表現HLA-A0206(空心三角形標誌)或URLC10(空心圓形)之目標細胞的顯著專一細胞毒殺性T淋巴球活性。在圖中，“R”代表應答子(responder)而“S”代表刺激子(stimulator)。

雖然於本發明實施例之實施或測試中可使用相似或等同於在此敘述之那些的任何方法與材料，但是現在敘述較佳之方法、元件與材料。然而在敘述本發明材料與方法之前，需瞭解的是，本發明並不限於敘述於此之特定大小、形狀、尺寸、材料、方法學、步驟等，例如按照慣例實驗法與最佳化可將其變更。也需瞭解的是，於此敘述中使用之專門用語僅是為了敘述特別之變化形式或實施例，且不傾向限制僅會受限於所附上之申請專利範圍的本發明範圍。

於本說明書中提及之各刊物、專利或專利公開之揭露特別地於此處引入參考文獻於其內容中。然而，於此並沒有被解釋為承認本發明由於先前發明之效力不被給予先於這些揭露之權力。

如果發生抵觸，本發明說明書，包括定義，將會控制。此外，材料、方法與實施例僅為說明，並不傾向於限制。

I.定義

於此使用之單字“一”與“該”意指“至少一”除非以別的方式明確指出。

於此可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽”與“蛋白質”意指胺基酸殘基之一聚合物。此用語適用於胺基酸聚合物，於其中一或多個胺基酸殘基為一經修飾之殘基或非自然發生之殘基，例如一對應自然發生胺基酸與自然發生胺基酸聚合物之人工化學模仿物。

於此使用之用語“胺基酸”意指自然發生與合成之胺基酸，及胺基酸類似物與胺基酸模仿物，其與自然發生之胺基酸起相似作用。自然發生胺基酸為基因密碼所編碼的那些與於細胞中在轉譯後被修飾的那些(例如羥脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷胺酸(gamma-carboxyglutamate)與O-磷絲胺酸(O-phosphoserine))。措辭“胺基酸類似物”意指具有與自然發生胺基酸相同之基礎化學結構(一α碳鍵結至一氫、一羧基、一胺基與一R基)的化合物，但具有一經修飾之R基或經修飾之骨架(例如，同絲胺酸(homoserine)、降亮胺酸(norleucine)、甲硫胺酸(methionine)、亞碸(sulfoxide)、甲基硫氨磺(methionine methyl sulfonium))。措辭“胺基酸模仿物”意指化學化合物其與一般胺基酸具有不同結構，但有相似的功能。

可藉由由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符號來指出於此處之胺基酸。

於此可替換使用用語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”與“核酸”，且除非以別的方式指出，以其一般被接受之單一字母密碼來指出。

除非以別的方式定義，用語“癌症”意指過度表現HIG2或URLC10基因之癌症。過度表現HIG2之癌症的例子包括，但不限於，腎癌與軟組織癌(soft tissue carcinoma)；過度表現URLC10基因之癌症的例子包括，但不限於，膀胱癌、子宮頸癌(cervical cnacer)、膽管細胞癌(cholangiocellular carcinoma)、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、骨肉瘤(osteosarcoma)、胰臟癌與軟組織腫瘤。

除非以別的方式定義，於此可替換使用且以別的方式特別指出用語“細胞毒殺性T淋巴球”、“細胞毒殺性T細胞”與“CTL”以意指T淋巴球之次族群，且除非以別的方式指出，意指T淋巴球之次群組(sub-group)可辨認非自身細胞(例如，腫瘤細胞、被病毒感染之細胞)，且誘導這些細胞死亡。

除非特別定義，於此使用屬與本發明之所有技術或科學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。

II.胜肽

為了證明HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)與URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)之胜肽作用如一被細胞毒殺性T淋巴球(CTLs)所辨認之抗原，分析這些胜肽以確定是否其為由HLA-0206所限制之抗原決定位。在藉由載有這些胜肽之樹突細胞(dendritic cell,DC)in vivo刺激T細胞之後，使用HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)與URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)之胜肽之各胜肽。

這些被建立的細胞毒殺性T淋巴球顯示強而專一之抗經分別之胜肽脈衝之表現HLA-A0206之目標細胞的細胞毒殺性T淋巴球活性。此處這些結果證明胜肽可為由HLA-A0206限制之HIG2或URLC10的抗原決定位。由於這些胜肽也可為由HLA-A0201限制之HIG2或URLC10的抗原決定位(WO2008/102557、PCT/JP2008/000290，藉由此處引用文獻引入)，包含胜肽之藥學試劑或組合物可被應用於HLA-A0201+之個體與HLA-A0206+之個體兩者。

由於HIG2或URLC10基因於大部分癌症組織中被過度表現，例如膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、腎癌與軟組織腫瘤，所以其為一良好之免疫治療標的。特別是，過度表現HIG2之癌症的例子包括腎癌與軟組織腫瘤。且，過度表現URLC10基因之癌症的例子包括膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌與軟組織腫瘤。因此，本發明提供九胜肽(胜肽由九個胺基酸殘基所組成)與十胜肽(胜肽由十個胺基酸殘基所組成)相當於由HLA-A0206所限制之HIG2或URLC10的抗原決定位胜肽。特別地，本發明九胜肽與十胜肽之較佳實施例包括具有擇自序列辨識號：1或2中之胺基酸序列的那些胜肽。更特別地，由HLA-A0206所限制之HIG2的抗原決定位胜肽的例子包括包含序列辨識號：1之胺基酸序列的胜肽，且由HLA-A0206所限制之URLC10的抗原決定位胜肽的例子包括包含序列辨識號：2之胺基酸序列的胜肽。

一般而言，於一蛋白質中一、二或多個胺基酸之修飾，不會影響蛋白質的功能，且在一些例子中，甚至增強原始蛋白質所需之功能。事實上，已知經修飾之胜肽(即，由胺基酸所組成之胜肽，與原始參考序列相較，於其中一、二或數個胺基酸已被修飾(即，取代、刪除、加入及/或插入))維持原始胜肽的生物活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79：6409-13)。因此，在一實施例中，本發明之胜肽可具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與序列辨識號：1或2之胺基酸序列，其中加入、插入、刪除及/或取代一、二甚至更多個胺基酸。

熟悉此技藝人士認定改變一單一胺基酸或一小百分比之胺基酸之個別的加入或取代至一胺基酸序列傾向產生保存原始胺基酸支鏈的特性。因此，它們一般被意指為“保守取代(conservative substitutions)”或“保守修飾(conservative modifications)”，其中一蛋白質之改變形成一具有特性且與原始蛋白質同功之經修飾的蛋白質。保守取代表提供功能相似胺基酸已為本技術領域所熟知。令人滿意以保留之胺基酸支鏈特徵的例子包括，例如疏水胺基酸(A,I,L,M,F,P,W,Y,V)、親水胺基酸(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T)與具有下列共同官能基或特徵之支鏈：一脂肪族支鏈(G,A,V,L,I,P)；一含羥基支鏈(S,T,Y)；含硫原子支鏈(C,M)；含羧酸與胺基支鏈(D,N,E,Q)；含鹼支鏈(R,K,H)；以及含芳香族支鏈(H,F,Y,W)。此外，下列八個族群各包含在本技術領域中被接受為彼此為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天門冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天門冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)； 4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫丁胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫丁胺酸(M)(參見Creighton,Proteins 1984)。

此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而，本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要經修飾之胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。更進一步而言，經修飾之胜肽不應排除多形變體(polymorphic variant)之細胞毒殺性T淋巴球誘發的胜肽、種間同質體(interspecies homologues)與HIG2或URLC10基因對偶基因(alleles)。

當使用於文中之免疫治療時，本發明之胜肽應被表現於一細胞或外吐小體之表面上，較佳作為一具有HLA-A0206抗原之複和物。因此，較佳為選擇不只誘導細胞毒殺性T淋巴球，且擁有對HLA-A0206抗原之高結合親和力之胜肽。為此目的，可藉由胺基酸殘基之取代、插入、刪除及/或加入來修飾胜肽以產生一經修飾之胜肽其具有經改善之結合親和力。除了自然表現之胜肽外，由於藉由結合至HLA抗原表現之胜肽序列的規則為已知(J Immunol 1994,152：3913；Immunogenetics 1995,41：178；J Immunol 1994,155：4307)，可將基於此規則之修飾引入本發明之致免疫性胜肽。可將取代引入不止於末端胺基酸，也可於胜肽之潛在TCR辨認位置。一些研究已證實於一胜肽中之胺基酸取代可等於或比原來更好，例如CAP1、p53_(264-272)、Her-2/neu_(369-377)或gp100_(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57,4570-4577,1997,T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.,S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206與S.O.Dionne et al.Cancer Immunology,Immunotherapy(2004)53,307-314)。

本發明也考慮也可將加入一或兩個胺基酸加至目前胜肽之N及/或C端。本發明也包括具有高HLA抗原結合親和力且維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之此種經修飾的胜肽。

然而當胜肽序列與一具有不同功能之外生或內生蛋白質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導副作用，例如自體免疫疾病及/或抗特定物質之過敏症候群。因此較佳為，首先使用可得之資料庫執行同源搜尋以避免胜肽之胺基酸序列符合其他蛋白質之胺基酸序列的情況。當由與目標胜肽相較不止存在具有一或兩個胺基酸不同之胜肽的同源搜尋變得清楚時，為了增加其與HLA抗原之結合親和力，及/或增加其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力而不具副作用之任何危險，可修飾目標胺基酸。

雖然預期如上述修飾之胜肽為高效能，仍測試候選胜肽細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的表現以選擇高效能之胜肽。此處措辭“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”意指當表現於抗原呈現細胞時，胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球的能力。此外，“細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”包括胜肽誘導細胞毒殺性T淋巴球活化、細胞毒殺性T淋巴球增殖、促進細胞毒殺性T淋巴球分解目標細胞與增加細胞毒殺性T淋巴球IFN-γ產生的能力。

藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞(例如B-淋巴球、巨噬細胞與樹突細胞)或更專一地來自人類周邊血液單核細胞之樹突細胞，並在以胜肽刺激之後與CD8+細胞混合，且之後測量由抗目標細胞之細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放之IFN-γ來達成細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類HLA-A0206之基因轉殖動物(BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000 Aug,61(8)：764-79)。例如可以⁵¹Cr放射標示目標細胞，且可從自HLA抗原為HLA-A0206之目標細胞釋放出的放射活性計算細胞毒殺活性。或者在攜帶經固定之胜肽之抗原呈現細胞存在下，藉由測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放的IFN-γ，且使用抗IFN-γ單株抗體來使於培養基上之抑制區可見來評估細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。

除了上述修飾之外，本發明之胜肽也可連接其他物質，只要所產生之經連接的胜肽維持原始胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。適合的物質包括，但不限於，胜肽、脂質、糖與糖鏈、乙醯基，天然與合成之聚合物等。胜肽可包括修飾，例如醣基化、支鏈氧化或磷酸化等，所提供之修飾不損壞原始胜肽之生物活性。可執行此修飾以授予額外之功能(例如目標功能與傳送功能)或穩定多胜肽。

例如，為了in vivo增加多胜肽之穩定度，本技術領域已知引入D-胺基酸、胺基酸模仿物或非天然胺基酸；此內容也適合本發明之多胜肽。可以一些方法分析一多胜肽的穩定度。例如，可使用肽酶與多種生物培養基，例如人類血漿與血清，來測試穩定度(參見，例如Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11：291-302)。

更進一步而言，經由間隔器(spacer)或連結器(linker)，本發明胜肽可連結至其他胜肽。其他胜肽的例子包括，但不限於來自其他腫瘤相關抗原之細胞毒殺性T淋巴球誘發胜肽。或者，藉由間隔器或連結器可連結兩個或多個之本發明胜肽。藉由間隔器或連結器連結之胜肽可為彼此相同或不同。間隔器或連結器並不特別限於，但較佳為胜肽，更加為具有一或多個切割位(cleavage site)之胜肽，切割位可被酵素，例如胜肽酶、蛋白酶與蛋白酶體(proteasome)切割。間隔器或連結器的例子包括，但不限於：AAY(P.M.Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165：7308-7315)或一至幾個離胺酸殘基(S.Ota et al.,Can Res.62,1471-1476,K.S.Kawamura et al.,J Immunol.2002,168：5709-5715)。本發明胜肽包括經由間隔器或連結器連結至其他胜肽的那些胜肽。

本發明胜肽可被表現於帶有人類MHC抗原之細胞(例如，抗原呈現細胞)或外吐小體的表面，做為與MHC分子結合之複合物且誘導細胞毒殺性T淋巴球。藉由本技術領域熟知的方法可製備此細胞與外吐小體，例如藉由與本發明胜肽接觸可製備此細胞，與藉由收集來自與本發明胜肽接觸之細胞的一含外吐小體部分(參見，例如Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos.Hei 11-510507與WO99/03499)。本發明胜肽包括存在於細胞或外吐小體表面為一與MHC結合之複合物的那些胜肽。

此處，本發明之胜肽可被描述為“HIG2或URLC10胜肽”或“HIG2或URLC10多胜肽”。

III.胜肽之製備

使用熟知之技術可製備本發明之胜肽。例如，使用重組DNA技術或化學合成可以合成方法地製備胜肽。本發明胜肽可單獨合成或為由兩或多個胜肽所組成之較長多胜肽。之後可分離此胜肽，即純化或分離，以使其實質上無其他自然發生之宿主細胞蛋白質與其片段或任何其他化學物質。

藉由根據經選擇之胺基酸序列的化學合成可獲得本發明之胜肽。適合此合成之一般胜肽合成方法的例子包括，但不限於：(i)胜肽合成(Peptide Synthesis)Interscience,New York,1966；(ii)蛋白質(The Proteins),Vol.2,Academic Press,New York,1976；(iii)胜肽合成(Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co.,1975；(iv)胜肽合成之基礎與實驗(Basics and Experiment of Peptide Synthesis)(in Japanese),Maruzen Co.,1985；(v)藥學的發展(Development of Pharmaceuticals)(second volume)(in Japanese),Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；(vi)WO99/67288；以及(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,“Solid Phase Peptide Synthesis”,Academic Press,New York,1980,100-118。

或者，藉由適應任何已知產生胜肽之基因工程方法可獲得本發明之胜肽(例如，Morrison J,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu et al.)1983,101：347-62)。例如，首先製備一適合之載體，其懷有一多核苷酸其編碼出目標胜肽於一可表達的形式中(例如，調控序列之下游相當於啟動子序列)，並將載體轉殖進入適合之宿主細胞。之後培養宿主細胞以產生感興趣之胜肽。使用一in vitro轉譯系統可in vitro產生胜肽。

IV.多核苷酸

本發明也提供一多核苷酸，其編碼出本發明上述之胜肽。這些包括來自自然發生之HIG2或URLC10基因(序列辨識號：3或5SEQ ID NO：3 or 5，GenBank Accession NO NM_013332或NM_017527)的核苷酸序列與具有其之保守修飾之核苷酸序列的那些。此處措辭“保守修飾之核苷酸序列”指序列其編碼出相同或實質上相同之胺基酸序列。由於基因密碼的退化，一大份之功能相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。例如，密碼GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼出胺基酸丙胺酸。因此，於藉由一密碼具體指定丙胺酸之每個位置，可改變密碼成為任何上述不會改變編碼出之胜肽的對應密碼。此核酸變化為“沈默變化(silent variation)”，其為保守修飾變化的一種。此處編碼出一胜肽之每個核酸序列也描述核酸之每種可能的沈默變化。熟悉此技藝人士明白於一核酸中各密碼(除了AUG，其原本為甲硫胺酸之唯一密碼、與TGG其原本為色胺酸之唯一密碼)可被修飾以產生一功能相同分子。因此編碼出一胜肽之核酸的各沈默變化係為於各所揭露之序列中被暗示性描述。

本發明之多核苷酸可由DNA、RNA與其衍生物所組成。DNA由鹼基，例如A、T、C、G所適合地組成，而T於RNA中為U所取代。

本發明之多核苷酸可編碼出本發明之多個胜肽，具有或不具有介於中間之胺基酸序列於其之間。例如介於中間之胺基酸序列可提供多核苷酸或經轉譯之胜肽一裂解位(例如酵素辨認序列)、更進一步而言，多核苷酸可包括任何額外之序列至編碼出本發明胜肽之編碼序列。例如，多核苷酸可為一重組多核苷酸，其包括胜肽表現所需之調控序列，或可為一具有標誌基因與此類之表現載體(質體)。一般而言，可製備此重組多核苷酸，藉由經由使用一般重組技術，例如聚合酶與內切酶之多核苷酸操作。

可使用重組與化學合成技術以產生本發明之多核苷酸。例如，藉由插進入一適合之載體可產生一多核苷酸，當轉染進入一勝任細胞時，其可被表現。或者，使用PCR技術或表現於適合的宿主可將一多核苷酸放大(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,198)。或者，使用固態技術如於Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48：2223-311；Matthes et al.,EMBO J 1984,3：801-5中所敘述，可合成多核苷酸。

含有本發明多核苷酸的載體與懷有此載體之宿主細胞也包含於本發明中。

V.外吐小體(exosomes)

本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡(intracellular vesicles)，其呈現形成於本發明之胜肽與人類白血球抗原表面之間的複合物。利用例如Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos.Hei 11-510507與WO99/03499所詳述的方法以及從接受治療和/或預防之病人所得的抗原表現細胞可製備外吐小體。本發明之外吐小體可如疫苗般地接種，在一方式中，類似於本發明的胜肽。

在本發明內容中，包含於複合物中之HLA的形式應為HLA-A0206抗原，且被接種外吐小體之個體必須具有HLA-A0206抗原。一般在臨床上，需接受治療之病患的人類白血球抗原形式係進行預先的研究，這使被預期對以本發明外吐小體治療獲益之病患的適當選擇為可能。

VI.抗原呈現細胞

本發明也提供抗經分離之原呈現細胞，其表現形成於HLA-A0206抗原與本發明胜肽之間的複合物於其表面。藉由接觸本發明胜肽或引入編碼出本發明之胜肽於一合適形式所獲得之抗原呈現細胞可來自受到治療或避免之病患，與藉由其或與包括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球之其他藥物結合，可被投予如一疫苗。

抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突細胞、蘭格罕細胞(Langerhans cell)、巨嗜細胞、B細胞與活化之T細胞，已知其表現蛋白質(proteinaceous)抗原於其細胞表面以被淋巴球所辨認。由於樹突細胞為一典型抗原呈現細胞，其於抗原呈現細胞中具最強之細胞毒殺性T淋巴球誘導作用，因此本發明較佳之抗原呈現細胞為樹突細胞。

例如，藉由誘導來自周邊血液單核細胞之樹突細胞與之後in vitro、ex vivo或in vivo以本發明胜肽接觸(刺激)其可獲得一抗原呈現細胞。當本發明之胜肽投予至一HLA-A抗原為HLA-A0206之個體，於個體身體內誘導表現本發明胜肽之抗原呈現細胞。措辭“誘導抗原呈現細胞”包括以本發明之胜肽或編碼出本發明胜肽之核苷酸接觸(刺激)一細胞，以表現形成於HLA-A0206抗原與本發明胜肽之間的複合物於細胞表面。或者，在引入本發明胜肽至抗原呈現細胞以允許抗原呈現細胞表現胜肽後，將抗原呈現細胞投予一個體作為一疫苗。例如，ex vivo投予可包括步驟：a：自一HLA-A抗原為HLA-A0206之第一個體收集抗原呈現細胞；b：以胜肽接觸步驟a之抗原呈現細胞；以及c：將載有胜肽之抗原呈現細胞投予一HLA-A抗原為HLA-A0206之第二個體。

第一個體與第二個體可為相同個體或可為不同個體。或者，根據本發明，提供本發明胜肽的使用，用以製造一誘導抗原呈現細胞之藥學組合物。此外，本發明提供用以製造誘導抗原呈現細胞之藥學組合物的方法或製程，其中方法包括以藥學上可接受之載體混合或配製本發明胜肽的步驟。另外，本發明也提供用以誘導抗原呈現細胞之本發明胜肽。自步驟b獲得之抗原呈現細胞可投予至一個體做為疫苗。

根據本發明一方面，本發明之抗原呈現細胞具高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。在用語“高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力”中，高程度相對於藉由抗原呈現細胞沒有與胜肽接觸或與無法誘導細胞毒殺性T淋巴球之胜肽接觸的程度。藉由包括in vitro將包含編碼出本發明胜肽之多核苷酸的基因轉移至抗原呈現細胞的步驟的方法，可製備此種具高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。此經引入之基因可為DNA或RNA形式。引入方法的例子包括，並無特別限制，可使用各種於此領域一般被執行的方法，例如脂質體轉染(lipofection)、電穿孔法(electroporation)與磷酸鈣方法。更特別地，可執行其如Cancer Res 1996,56：5672-7；J Immunol 1998,161：5607-13；J Exp Med 1996,184：465-72；Published Japanese Translation of International Publication No.2000-509281中所述。藉由轉移基因進入抗原呈現細胞，基因遇到轉錄、轉譯與此類於細胞中，且之後藉由MHC Class I或Class II處理獲得之蛋白質，且經由一呈現途徑來繼續以呈現胜肽。

VII.細胞毒殺性T淋巴球

經誘導抗任何本發明胜肽之細胞毒殺性T淋巴球增強in vivo以腫瘤相關內皮(endothelia)為標的之免疫反應，且因此可使用如一疫苗，就其本身而言在一方式中相似於胜肽。因此本發明也提供經分離之細胞毒殺性T淋巴球其藉由任何本發明之胜肽專一地被誘導或活化。

可獲得此種細胞毒殺性T淋巴球，藉由(1)將本發明胜肽投予至一個體，且之後自該個體收集細胞毒殺性T淋巴球或(2)將來自個體之抗原呈現細胞與CD8+細胞或周邊血液單核淋巴球與本發明之胜肽in vivo接觸(刺激)。

已藉由表現本發明胜肽之抗原呈現細胞刺激誘導的細胞毒殺性T淋巴球可來自一受到治療及/或避免與具有HLA-A0206抗原之病患，且藉由其或與包括本發明之胜肽或為了調節作用之外吐小體的其他藥物結合可被投予。所獲得之細胞毒殺性T淋巴球起專一抗目標細胞的作用，而目標細胞其表現本發明胜肽，或，例如用於誘導之相同胜肽。換言之，細胞毒殺性T細胞可以T細胞受器辨認(即，結合至)於目標細胞表面上之形成於HLA-A0206抗原與本發明胜肽之間的複合物，且之後攻擊目標細胞以誘導目標細胞死亡。目標細胞可為細胞其內生性表現HIG2或URLC10，或被以HIG2或URLC10基因轉殖之細胞；且由於藉由胜肽刺激表現本發明胜肽於細胞表面之細胞，也可做為經活化之細胞毒殺性T淋巴球攻擊的目標。

VIII.T細胞受體(TCR)

本發明也提供一多核苷酸其由編碼出可形成T細胞受體之次單位之多胜肽的核酸序列所組成，與其使用方法。T細胞受體之次單位具有能力形成T細胞受體，其授與專一性至抗腫瘤細胞的T細胞，腫瘤細胞表現HIG2胜肽或URLC10胜肽與HLA-A0206抗原。藉由使用本技術領域所知的方法可確認表現於細胞毒殺性T淋巴球中之T細胞受體次單位的α-與β-支鏈之核酸序列，而細胞毒殺性T淋巴球以本發明之胜肽所誘導(WO2007/032255與Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。引出之T細胞受體可以高親合力結合表現於目標細胞上之HIG2或URLC10胜肽，且視需要in vivo與in vitro居中有效殺死表現HIG2或URLC10胜肽與HLA-A0206抗原之目標細胞。

編碼出T細胞受體次單位的核酸序列可合併進入適合之載體，例如反轉錄病毒載體。這些載體為本技術領域所熟知。通常包含其之核酸或載體可被轉移至一T細胞，例如一來自一HLA-A抗原為HLA-A0206之病患的T細胞。有用地，本發明提供一現成(off-the-shelf)的組合物允許快速修飾病人所擁有之T細胞(或其他哺乳動物之那些)以快速簡單產生具有優秀之癌症細胞殺死特性的經修飾T細胞。

本發明也提供細胞毒殺性T淋巴球，其藉由以具有編碼出與形成於HIG2或URLC10胜肽與HLA-A0206抗原間之複合物結合之T細胞受體次單位多胜肽的核酸的多核苷酸轉導來製備。經轉導之細胞毒殺性T淋巴球可in vivo自引導至癌症細胞，且可藉由熟知的培養方法in vivo擴張(例如Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-3461(1989))。本發明之T細胞也可用來形成一致免疫組合物，其於一需要治療或保護之病患中治療或避免癌症為有效(WO2006/031221)。

IX.藥學試劑或組合物

於此交替使用措辭“避免”與“預防”以意指任何活性，其減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率。避免與預防可方生於“初期、第二期與第三期避免層級”。初期避免與預防避免疾病之發展，而第二期與第三期層級之避免與預防包括藉由恢復功能與減少疾病相關併發症，以疾病之發展與症狀之浮現及減少已建立之疾病之負向發展的避免與預防為目的。或者，治療或避免可包括一廣範圍之預防疾病治療，其以減緩特別疾病之嚴重度為目標，例如減少腫瘤之增殖與轉移。

癌症之治療及/或預防及/或其手術後復發的避免包括任何下列步驟，例如癌細胞之手術移除、似癌細胞之生長抑制、腫瘤之衰退或退化、癌發生之減緩與抑制的誘導、腫瘤退化與血管新生抑制的誘導。癌症之有效治療及/或預防減少致死率與改善具有癌症之個體的預後、減低癌症標記於血液中的程度與減緩伴隨著癌症之可偵測症狀。例如，症狀之減少或改善構成有效治療及/或預防包括10%、20%、30%或更減輕或穩定疾病。

由於與正常組織相較，HIG2或URLC10表現特別於一些癌症中被向上調控，本發明之胜肽或編碼出此種胜肽之多核苷酸可用來治療或預防癌症，及/或用來避免其手術後之復發。因此，本發明提供一藥學試劑或組合物用來治療及/或避免癌症，及/或避免其手術後之復發，其包括一或多個本發明胜肽或編碼出胜肽之多核苷酸作為活性成分。或者，本發明之胜肽可表現於任何前述外吐小體或細胞表面，例如抗原呈現細胞，以用來作為藥學試劑或組合物。此外，上述以本發明任何胜肽為標的之細胞毒殺性T淋巴球也可用來作為本發明藥學試劑或組合物之活性成分。在本發明內容中，措辭“將一胜肽作為目標”意指以T細胞受器辨認(即，結合至)於目標細胞表面上之一形成HLA-A0206抗原與一胜肽之間的複合物，且之後攻擊目標細胞以誘導目標細胞死亡。

在另一實施例中，本發明也在製造用以治療癌症之藥學組合物或試劑中提供一活性成分的使用，其擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)本發明之抗原呈現細胞；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。

或者，本發明更提供一用以治療癌症的活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。

或者，本發明更提供一製造用以治療癌症之藥學組合物的方法或製程，其中方法或製程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起配製的步驟，活性成分擇自： (a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)本發明之抗原呈現細胞；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球，為活性成分。

在另一實施例中，本發明也提供一製造用以治療癌症之藥學組合物的方法或製程，其中方法或製程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起混合的步驟，其中活性成分擇自：(a)本發明胜肽；(b)於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜肽的核酸；(c)本發明之抗原呈現細胞；以及(d)本發明之細胞毒殺性T淋巴球。

或者，本發明之藥學組合物或試劑可用於癌症之預防與其手術後復發的避免。

本發明之藥學組合物或試劑提供使用如一疫苗。在本發明全文中，措辭“疫苗”(也指一致免疫組合物)意指一物質，其藉由接種至動物具有誘導抗腫瘤免疫力。

本發明之藥學組合物或試劑可用於治療及/或避免癌症，及/或其手術後復發的避免於一個體或病患中，個體或病患包括人類於任何及他哺乳動物，其包括但，不限於小鼠、大鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子、狒狒與黑猩猩，特別是一商業上重要動物或被馴養了的動物。

根據本發明，具有擇自序列辨識號：1與2之胺基酸序列的多胜肽已被發現為HLA-A0206限制之抗原決定位胜肽，其可誘導強而專一之抗表現HIG2或URLC10與HLA-A0206之目標細胞的免疫反應。因此包括任何具有序列辨識號：1與2之胺基酸序列之這些多胜肽的本發明藥學試劑或組合物特別適合投予HLA抗原為HLA-A0206之個體。相同的實施至包含編碼出任何這些胜肽之多核苷酸的藥學試劑或組合物。

由本發明藥學試劑或組合物治療之癌症不限於，且包括其中關於HIG2或URLC10所有種類的癌症，包括，例如膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、腎癌與軟組織腫瘤。特別是，以HIG2為目標之藥學試劑或組合物為較佳應用至腎癌與軟組織腫瘤，而以URLC10為目標之藥學試劑或組合物為較佳應用至膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌與軟組織腫瘤。

本發明藥學試劑或組合物可包括除了上述活性成分外，具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苷酸、其他表現此其他胜肽之細胞或此類。於此，具有誘導細胞毒殺性T淋巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽由癌症專一抗原所例示(例如，經定義之腫瘤相關抗原)，但不限於此。

若需要，本發明之藥學試劑或組合物可視需要包括其他治療物質為一活性成分，只要此物質不抑制活性成分之抗腫瘤功效，活性成分例如任何本發明胜肽。例如，配方可包括抗發炎試劑或組合物、止痛劑、化學治療與其類似。除了包括其他治療物質於藥劑其本身中，也可將本發明之藥劑與一或多個其他生理試劑或組合物相繼或同時投予。藥劑與生理試劑或組合物的量依照，例如使用何種生理試劑或組合物、要治療之疾病與投藥的計畫與方式。

應瞭解的是，除了此處特別提及之成分外，本發明之藥學試劑與組合物可包括本技術領域一般之其他試劑或組合物，其具有關於討論中之配方形式。

在本發明一實施例中，本發明之藥學試劑或組合物可被包含於製造之商品與套組，其包含對於要被治療之疾病，例如癌症的病理情況有用之材料。製造之商品可包含具有一標籤之任何本發明藥學試劑或組成物的容器。適合的容器包括瓶、小瓶(vial)與試管。容器可形成自各種材料，例如玻璃或塑膠。於容器上之標籤需指出試劑或組合物為用來治療或避免疾病之一或多個情況。標籤也可指出投藥指示等。

除了上述容器外，套組包括本發明藥學試劑或組合物可視需要更進一步包括一第二容器，其儲藏一藥學上可接受之稀釋液。其可更包括商業或使用者觀點需要之其他材料，包括其他緩衝溶液、稀釋液、濾器、針、注射器與具有使用說明之包裝插入物。

藥學組合物若需要可被呈現於一包或一分配器，其可包含含有活性成分之一或多單位劑量形式。包裝可例如包括金屬或塑膠箔，例如一泡棉箱(blister pack)。包或分配器可伴隨著投藥指示。

(1)藥學試劑或組合物包含胜肽作為活性成分。

可直接投予本發明胜肽為一藥學試劑或組合物，若需要的話，其已被一般配方方法所配製。在之後的例子，除了本發明胜肽外、若適合可包括載體、賦形劑與原始做為藥物使用之此類而無特別限制。上述載體的例子為滅菌水生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體(culture fluid)與此類。更進一步而言，若必須，藥學試劑或組合物可含安定劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此類。本發明之藥學試劑或組合物可用來抗癌目的。

可將本發明之胜肽製備為一組合，其由兩或更多個本發明之胜肽所組成，以in vivo誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜肽組合可以雞尾酒形式或可使用標準技術彼此結合。例如，胜肽可被化學連接或表現如一單一融合多胜肽序列。結合之胜肽可為相同或不同。藉由投予本發明之胜肽，藉由HLA-A0206抗原，高密度呈現胜肽於抗原呈現細胞上，之後對形成於呈現胜肽與HLA-A0206抗原之間的複合物專一反應之細胞毒殺性T淋巴球被誘導。或者，表現任何本發明之胜肽於其細胞表面之抗原細胞可被投予一個體，且因此於個體中誘導細胞毒殺性T淋巴球，且可增加朝向癌細胞，例如膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、腎癌與軟組織腫瘤之侵犯，表現任何本發明之胜肽於其細胞表面之抗原細胞可藉由以本發明之胜肽刺激來自一HLA-A抗原為HLA-A0206之個體的抗原呈現細胞(例如樹突細胞)來獲得。

治療及/或避免癌症之藥學試劑或組合物，其包括本發明之一胜肽為活性成分，也可包含一已知有效建立細胞免疫力之佐劑。或者，它們可與其他活性成分一起被投予或它們可以配製成細粒被投予。佐劑指一化合物，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予(或依次)時，其增強抗蛋白質之免疫反應。此處考慮之佐劑，包括於文獻(Clin Microbiol Rev 1994,7：277-89)中所描述的那些。適合之佐劑的例子包括，但不限於磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素與此類但不限於此。

更進一步而言，於微脂體(liposome)配方與細粒配方中，胜肽連結至幾個微米直徑之小珠，且於配方中，可便利地使用連結至胜肽之脂質。

在一些實施例中，本發明之藥學試劑或組合物可更包括一成分其啟動細胞毒殺性T淋巴球。已定義脂質為可in vivo啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性T淋巴球的試劑或組合物。例如，可將棕櫚酸殘基黏附至離胺酸殘基之ε-與α-胺基，且之後連結至本發明之一胜肽。之後脂質胜肽可被直接投予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於一佐劑中。如脂質啟動細胞毒殺性T淋巴球反應之另一例子，E.coli脂蛋白，例如三軟脂酸-S-甘油半胱氨酰-絲氨酰基絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysternyl-seryl-serine,P3CSS)可使用來啟動細胞毒殺性T淋巴球，當共價附加至一合適之胜肽(參見，例如Deres et al.,Nature 1989,342：561-4)。

投藥之方法可為口服、皮膚內、皮下、靜脈內注射或此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。本發明之胜肽劑量可適合地調整根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量一般為0.001mg至1000mg，例如0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg，且可於數天至數個月投藥一次。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。

(2)藥學試劑或組合物包含多核苷酸為活性成分

本發明之藥學試劑或組合物也可包括編碼出此處揭露之胜肽的核酸於一可表達之形式中。此處措辭“於一可表達之形式中”意指多核苷酸，當引入一細胞，in vivo會被表現成一誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一代表實施例中，感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多核苷酸而言必須之調控要素。可裝配多核苷酸以達到穩定插入目標細胞之基因體(參見，例如Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51：503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors)。參見，例如Wolff et al.,Science 1990,247：1465-8；U.S.Patent Nos.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；and WO 98/04720。DNA輸送技術的例子包括“裸DNA”、經促進(bupivacaine、聚合物、胜肽居中之)之輸送、陽離子脂質複合物與顆粒居中之(“基因槍”)或壓力居中之傳送(參見，例如U.S.Patent No.5,922,687)。

本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體來表現。表現載體的例子包括減弱病毒宿主，例如牛痘或禽痘。此方法包括使用牛痘病毒，例如為一載體以表現編碼胜肽之核苷酸序列。藉由引入一宿主，此重組之牛痘病毒表現致免疫胜肽且因此引起一免疫反應。於免疫步驟中為有效之牛痘載體與方法敘述於，例如U.S.Patent No.4,722,848。另一載體的例子包括BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG載體敘述於Stover et al.,Nature 1991,351：456-60中。對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例如腺與腺病毒相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其類似為明顯的。參見，例如Shata et al.,Mol Med Today 2000,6：66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68：793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14：571-85。

輸送多核苷酸進入一個體可為直接，於其例子中，個體直接暴露於一攜帶多核苷酸之載體，或為間接，於其例子中，細胞首先in vitro以感興趣之多核苷酸轉形，之後將細胞轉殖進入個體。此兩方法分別為已知，為in vivo與ex vivo基因治療。

基因治療之方法之大體回顧，參見Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12：488-505；Wu and Wu,Biotherapy 1991,3：87-95；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33：573-96；Mulligan,Science 1993,260：926-32；Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62：191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5)：155-215)。也可用於本發明之於重組DNA技術中一般熟知的方法如於eds.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY, 1993；and Krieger,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990中所述。

投藥之方法可為口服、皮膚內、皮下、靜脈內注射或此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域提供使用。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。於適合載體中或於以編碼出本發明之胜肽的多核苷酸轉形之細胞中的多核苷酸的劑量可適合地調整，根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量一般為0.001mg至1000mg，例如0.001mg至1000mg，例如0.1mg至10mg，且可於每數天一次至每數個月一次投藥。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。

X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球的方法

可使用本發明之胜肽與編碼出此胜肽之多核苷酸來誘導抗原呈現細胞與細胞毒殺性T淋巴球。也可使用本發明之外吐小體與抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球。胜肽、多核苷酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物結合使用，只要化合物不抑制其細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。因此，任何上述之本發明藥學試劑或組合物可用來誘導細胞毒殺性T淋巴球，且除此之外，包括胜肽與多核苷酸的那些也可用來誘導抗原呈現細胞，如下所討論。

(1)誘導抗原呈現細胞的方法

本發明提供使用本發明之胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸來誘導抗原呈現細胞的方法。如前述段落“VI.抗原呈現細胞” 中所述執行抗原呈現細胞的誘導。本發明也提供誘導具有高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法，其之誘導也已於先前項目“VI.抗原呈現細胞”下所提及。

較佳為，誘導抗原呈現細胞的方法包括至少一步驟，擇自：a：將HLA-A抗原為HLA-A0206之抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸，以及b：將於一表現形式中之本發明多胜肽引入HLA-A抗原為HLA-A0206之抗原呈現細胞中。

較佳in vitro或ex vivo執行誘導抗原呈現細胞的此種方法。當in vitro或ex vivo執行此方法時，可自要被治療之一個體或HLA-A抗原為HLA-A0206之其他個體獲得要被誘導之抗原呈現細胞。

(2)誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法

更進一步而言，本發明提供使用本發明胜肽、編碼出此胜肽之多核苷酸、表現此胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法。

本發明也提供使用編碼出一多胜肽之多核苷酸來誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，此多胜肽具形成一T細胞受體次單位的能力，而此T細胞受體次單位辨認(即，結合至)一本發明胜肽與HLA-A0206抗原之複合物。較佳為，誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法包括至少一步驟擇自：a：將一CD8+ T細胞與一抗原呈現細胞及/或一外吐小體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體表現一HLA-A0206抗原與本發明胜肽之複合物於其表面，以及b：將一多核苷酸引入一CD8+ T細胞，其中該多核苷酸編碼出一多胜肽，該多胜肽具形成一T細胞受體次單位的能力，而該T細胞受體次單位辨認一本發明胜肽與HLA-A0206抗原之複合物。

當本發明胜肽投予一個體時，誘導於個體體內之細胞毒殺性T淋巴球，且以癌症細胞為標的之免疫反應強度增強。或者，胜肽或編碼出此胜肽之多核苷酸可使用為一ex vivo治療方法，於其中來自個體之抗原呈現細胞與CD8+T細胞或周邊血液單核淋巴球in vitro以本發明胜肽接觸(刺激)，且在誘導細胞毒殺性T淋巴球後，經活化之細胞毒殺性T淋巴球回至個體內。例如，方法可包括步驟：a：自HLA-A抗原為HLA-A0206之個體收集抗原呈現細胞；b：將步驟a之抗原呈現細胞與本發明之胜肽接觸；c：將步驟b之抗原呈現細胞與HLA-A抗原為HLA-A0206之CD8+T細胞混合，且共培養以誘導細胞毒殺性T淋巴球；以及d：自步驟c之共培養收集CD8+T細胞。

或者，根據本發明，提供用以製造誘導細胞毒殺性T淋巴球之藥學組合物之本發明胜肽的使用。此外，本發明提供製造誘導細胞毒殺性T淋巴球之藥學試劑或組合物的方法或製程，其中方法包括將本發明胜肽與藥學上可接受之載體混合或配製的步驟。更進一步而言，本發明也提供用以誘導細胞毒殺性T淋巴球之本發明胜肽。

藉由步驟d所獲得之具細胞毒殺性之CD8+T細胞可投予至一個體做為疫苗。於上述步驟c中要與CD8+T細胞混合之抗原呈現細胞也可藉由轉移編碼出本發明胜肽之基因進入抗原呈現細胞來製備，如先前詳述於段落“VI.抗原呈現細胞”中；但不限於此，且，任何抗原呈現細胞或外吐小體，其有效表現胜肽至T細胞可用於本發明方法。

呈現下列實施例以說明本發明與以協助熟悉此技藝人士製造與使用本發明。實施例並不傾向於在其他方面限制本發明範圍任何方式中。

【實施例】

材料與方法

細胞株

PSCCA0900(HLA-A0206)為自Pharma SNP Consortium；PSC所購得。人類B細胞細胞株、與COS7為自ATCC所購得。

來自HIG2與URLC10之候選物胜肽

根據一標準固相合成方法且藉由逆相高效能液體層析(reversed phase high performance liquid chromatography,HPLC)之純化由Sigma(Sapporo,Japan)或Biosynthesis Inc.(Lewisville,TX)來合成來自HIG2與URLC10之9-員與10員胜肽。分別藉由分析型HLPC與質譜分析確認這些胜肽之純度(>90%)與身份(identity)。將胜肽溶解於DMSO中於20mg/ml且儲存於-80℃。

In vitro細胞毒殺性T淋巴球誘導

使用來自單核白血球之樹突細胞做為抗原呈現細胞以誘導抗表現於人類白血球組織抗原(HLA)上之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球反應。In vitro產生樹突細胞如別處所述(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003 Jul 15,63(14)：4112-8)。特別地，由Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液分離自一正常自願者(HLA-A0206+)之周邊血液單核細胞，藉由貼附至一塑膠組織培養盤(Becton Dickinson)來分離以豐富其如一單核白血球部分。將經豐富單核白血球之族群培養在1000U/ml之人類顆粒-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(R&D System)與1000U/ml之白細胞介素(interleukin,IL)-4(R&D System)存在下於含2%之熱去活性自身取得血清(autologous serum,AS)之AIM-V培養基(Invitrogen)中。培養7天後，於AIM-V培養基中，於3mcg/ml之β-2微球蛋白(beta 2-microglobulin)存在下以20μg/ml之各合成胜肽脈衝(pulsed)細胞激素誘導之樹突細胞3小時於37℃。所產生之細胞顯示表現樹突細胞相關分子，例如CD80、CD83、CD86與HLA Class II於其細胞表面(資料未顯示)。之後以Mitomycin C(MMC)(30mcg/ml，30min)將這些胜肽脈衝之樹突細胞去活性且將其以1：20之比例與自身取得CD8+T細胞混合，CD8+T細胞藉由以CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)正選擇獲得。這些培養物設置於48孔盤(Corning)；各孔含1.5 x 10⁴胜肽脈衝之樹突細胞、3 x 10⁵ CD8+ T細胞與10ng/ml之IL-7(R&D System)於0.5ml之AIM-V/2%自身取得血清培養基中。三天之後，以IL-2(CHIRON)添加至培養物至終濃度為20 IU/ml。第7天與第14天更以自身取得胜肽脈衝之樹突細胞進一步刺激T細胞。以與上述相同之方法每次製備樹突細胞。於第21天，第三輪之胜肽刺激後，將細胞毒殺性T淋巴球進行抗胜肽脈衝之PSCCA0922細胞測試(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。

細胞毒殺性T淋巴球擴張步驟

使用與由Riddell et al.(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16)：1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996 Feb,2(2)：216-23)敘述之相似方法於培養中擴張細胞毒殺性T淋巴球。全部5 x 10⁴細胞毒殺性T淋巴球懸浮於25ml之含有由MMC去活化之兩種人類B類淋巴母細胞株之AIM-V/5%自身取得血清培養基，在40ng/ml之抗-CD3單株抗體(Pharmingen)存在下。在開始培養1天後，120IU/ml之IL-2加入培養中。於第5、8、11天以新鮮之含30IU/ml之IL-2的AIM-V/5%自身取得血清培養基提供給培養物(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006 May,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005 Aug,96(8)：498-506)。

細胞毒殺性T淋巴球複製的建立

稀釋以使細胞毒殺性T淋巴球以0.3、1與3細胞毒殺性T淋巴球/孔的含量於96 round-bottomed微效價盤(Nalge Nunc International)中。細胞毒殺性T淋巴球與7 x 10⁴細胞/孔之2種兩種人類B類淋巴母細胞株、30ng/ml之抗-CD抗體與125U/ml之IL-2於全部150μl/孔之含5%自身取得之血清的AIM-V培養基中一起培養。10天後將50μl/孔之IL-2加入培養基中以使IL-2變成終濃度125U/ml。於第14天測試細胞毒殺性T淋巴球之細胞毒殺性T淋巴球活性，且使用上述相同方法擴張細胞毒殺性T淋巴球複製。

專一之細胞毒殺性T淋巴球活性

為了測試專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，執行IFN-γ酵素結合免疫斑點(ELISPOT)分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附(ELISA)分析。特別地，製備胜肽脈衝之PSCCA0922(1 x 10⁴/well)為刺激細胞。培養之細胞於48孔中做為應答細胞。於製造步驟下執行IFN-γ酵素結合免疫斑點分析與IFN-γ酵素結合免疫吸附分析。

強有力地表現目標基因或HLA-A0206基因或兩者之細胞的建立

藉由PCR放大編碼出目標基因(HIG2；序列辨識號：3與URLC10；序列辨識號：5)或HLA-A0206(序列辨識號：7)之開放讀取框的cDNA。複製PCR放大產物進入pCDNA3.1 myc-His載體(Invitrogen)中。使用lipofectamine 2000(Invitrogen)，根據廠商建議步驟，將包含目標基因或 HLA-A0206基因或兩者之質體轉染進入COS7。簡單而言，在140V與1000μ F下，以10μ-g質體對2.5 x 10⁶ COS7細胞進行脈衝。轉染2天後，將經轉染之細胞以細胞分離溶液(cell dissociation solution)處理，且做為細胞毒殺性T淋巴球活性分析之目標細胞。

結果

於癌症中增強之HIG2與URLC10表現

使用c-DNA微陣列獲得自各種癌症之總體基因表現概況(profile)顯示HIG2(GenBank Accession No.NM_013332；序列辨識號：3)與URLC10(GenBank Accession No.NM_017527；序列辨識號：5)被提升。與對應之正常組織比較，於腎癌中21個有19個，且於軟組織腫瘤中9個有7個，有根據地提升HIG2表現。與對應之正常組織比較，於膀胱癌中29個有29個、子宮頸癌中16個有15個、膽管細胞癌中7個有7個、食道癌中19個有7個、胃癌中3個有3個、非小細胞肺癌中27個有24個、骨肉瘤中19個有15個、胰臟癌中5個有4個與軟組織腫瘤中43個有33個，有根據地提升URLC10表現。

以HLA-A0206限制之來自HIG2之胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘導與經以HIG2衍生胜肽刺激的細胞毒殺性T淋巴球株的建立

根據敘述於“材料與方法”中之步驟產生對於那些來自HIG2之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IFN-γ酵素結合免疫斑點分析測定胜肽之專一的細胞毒殺性T淋巴球活性(第1圖)。此處結果顯示與控制孔(well)相較，HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1) 展現強有力之IFN-γ產生。此外，經序列辨識號：1刺激之於正孔洞編號1、2、5、7、8、10、13與14中之細胞被擴展以建立細胞毒殺性T淋巴球株。藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析測定這些細胞毒殺性T淋巴球株的細胞毒殺性T淋巴球活性(第2圖)。此結果於此處顯示，與無胜肽脈衝之目標細胞相較，所有細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗對應胜肽脈衝之目標細胞的IFN-γ產生。因此，HIG2-A0206-9-4可誘導強有力之抗表現HLA-A0206之目標細胞的細胞毒殺性T淋巴球株。

經以HIG2衍生胜肽刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製的建立

根據提出於先前段落“材料與方法”中之步驟執行限數稀釋(limiting dilution)。來自HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)細胞毒殺性T淋巴球株之細胞毒殺性T淋巴球複製的建立顯示於第3圖。與抗無胜肽脈衝目標之活性相較，這些細胞毒殺性T淋巴球複製具有強有力且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性抗胜肽脈衝目標。

抗表現HIG2與HLA-A0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性

測試經提升抗HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)之所建立的細胞毒殺性T淋巴球複製其對於辨認表現HIG2與HLA-A0206之目標細胞的能力。使用由HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)提升的效應細胞(effector cell)細胞毒殺性T淋巴球細胞株做為影響細胞來測試抗COS7細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性，而COS7細胞經全長之HIG2基因與HLA-A0206 分子轉染，其作為目標細胞外生表現現HIG2與HLA-A0206之特有模型。經HLA-A0206但無全長之HIG2轉染且以其他胜肽(HIG2-9-8：YLLGVVLTL)脈衝的COS7細胞及經全長之HIG2但無HLA-A0206轉染的COS7細胞製備為控制組。展現最高之專一抗COS7之細胞毒殺性T淋巴球活性的細胞毒殺性T淋巴球複製為以HIG2與HLA-A0206兩者轉染的那些(第4圖)。

此處結果清楚展現HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)被自然處理且以HLA-A0206分子呈現於目標細胞表面並被細胞毒殺性T淋巴球所辨認。因此，HIG2-A0206-9-4可作為在一HLA抗原為HLA-A0206之個體中以表現HIG2之癌症細胞為目標的一癌症疫苗。

以HLA-A0206限制之來自URLC10之胜肽之細胞毒殺性T淋巴球誘導與經以URLC10衍生胜肽刺激的細胞毒殺性T淋巴球株的建立

根據敘述於“材料與方法”中之步驟產生對於那些來自URLC10之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IFN-γ酵素結合免疫斑點分析測定胜肽之專一的細胞毒殺性T淋巴球活性(第5圖)。此處結果顯示與控制孔(well)相較，URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)展現強有力之IFN-γ產生。此外，經序列辨識號：2刺激之於正孔洞編號7中之細胞被擴展並建立了細胞毒殺性T淋巴球株。藉由IFN-γ酵素結合免疫吸附分析測定這些細胞毒殺性T淋巴球株的細胞毒殺性T淋巴球活性(第6圖)。此結果於此處顯示，與無胜肽脈衝之目標細胞相較，細胞毒殺性T淋巴球細胞株顯示強的抗對應胜肽脈衝之目標細胞的IFN-γ產生。因此，URLC10-A0206-10-211可誘導強有力之細胞毒殺性T淋巴球株。

經以URLC10衍生胜肽刺激之細胞毒殺性T淋巴球複製的建立

根據提出於先前段落“材料與方法”中之步驟執行限數稀釋(limiting dilution)。來自URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)細胞毒殺性T淋巴球株之細胞毒殺性T淋巴球複製的建立顯示於第7圖。與抗無胜肽脈衝目標之活性相較，這些細胞毒殺性T淋巴球複製具有強有力且專一之細胞毒殺性T淋巴球活性抗胜肽脈衝目標。

抗表現URLC10與HLA-A0206之目標細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性

測試經提升抗URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)之所建立的細胞毒殺性T淋巴球複製其對於辨認表現URLC10與HLA-A0206之目標細胞的能力。使用由URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)提升的效應細胞(effector cell)細胞毒殺性T淋巴球細胞株做為影響細胞來測試抗COS7細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性，而COS7細胞經全長之URLC10基因與HLA-A0206分子轉染，其作為目標細胞外生表現現URLC10與HLA-A0206之特有模型。經全長之URLC10但無HLA-A0206轉染的COS7細胞及經HLA-A0206但無全長之URLC10轉染的COS7細胞製備為控制組。展現最高之專一抗COS7之細胞毒殺性T淋巴球活性的細胞毒殺性T淋巴球複製為以URLC10與HLA-A0206兩者轉染的那個(第8圖)。

此處結果清楚展現URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)被自然處理且以HLA-A0206分子呈現於目標細胞表面並被細胞毒殺性T淋巴球所辨認。因此，URLC10-A0206-10-211可作為在一HLA抗原為HLA-A0206之個體中以表現URLC10之癌症細胞為目標的一癌症疫苗。

結論，新穎之HLA-A0206抗原決定位胜肽HIG2-A0206-9-4(序列辨識號：1)與URLC10-A0206-10-211(序列辨識號：2)被確認且顯示適用於在一HLA抗原為HLA-A0206之個體中之癌症免疫治療。

產業利用性

本發明敘述新的腫瘤相關抗原，特別是來自HIG2或URLC10的那些，其誘導強且專一的抗腫瘤免疫反應，且對於癌症形式之寬的範圍而言具有應用性。此腫瘤相關抗原准許更進一步發展為抗HIG2或URLC10相關疾病之胜肽疫苗，例如癌症，例如，膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、腎癌與軟組織腫瘤。

當於此詳述本發明與提及其特定實施例時，需瞭解的是，前述敘述本質為示範與解釋且意為說明本發明與其較佳實施例。於例行實驗之中，熟悉此技藝人士可立即瞭解在不脫離本發明之精神下其可實行各種改變與修飾，本發明之邊界與範圍為所附之申請專利範圍所界定。

<110> 腫瘤療法.科學股份有限公司

<120> HIG2與URLC10抗原決定位胜肽以及含此胜肽之疫苗

<130> ONC-A0815-TW

<150> US 61/089,972

<151> 2008-08-19

<160> 8

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成胜肽

<400> 1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 人工合成胜肽

<400> 2

<210> 3

<211> 1372

<212> DNA

<213> 人類

<220>

<221> CDS

<222> (206)..(397)

<400> 3

<210> 4

<211> 63

<212> PRT

<213> 人類

<400> 4

<210> 5

<211> 1735

<212> DNA

<213> 人類

<220>

<221> CDS

<222> (242)..(913)

<400> 5

<210> 6

<211> 223

<212> PRT

<213> 人類

<400> 6

<210> 7

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人類

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1098)

<400> 7

<210> 8

<211> 365

<212> PRT

<213> 人類

<400> 8

Claims

一種藥學試劑，其中該試劑包括具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之一或多個胜肽，其中該胜肽係由一胺基酸序列所組成，且該胺基酸序列係擇自由下列所組成之群組：(a)序列辨識號：1；以及(b)序列辨識號：1，於其中1或2個胺基酸被取代，或編碼出由(a)或(b)所組成之胜肽之一或多個多核苷酸，結合一藥學上可接受之載體，而該藥學上可接受之載體係為了一目的而配製，該目的係擇自由下列所組成之群組：(i)於一個體中之癌症的治療，該個體之HLA-A抗原為HLA-A0206；(ii)於一個體中之癌症的預防，該個體之HLA-A抗原為HLA-A0206；(iii)於一個體中避免癌症之手術後復發，該個體之HLA-A抗原為HLA-A0206；以及(iv)其組合。
如申請專利範圍第1項所述之藥學試劑，其中該癌症係擇自由膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、腎癌與軟組織腫瘤所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之藥學試劑，其被配置成一疫苗。
一種in vitro誘導具有高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞方法，其中該方法包括係擇自由下列所組成之群組的步驟：(a)將一抗原呈現細胞與由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的一胜肽，或與在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽接觸：以及(b)將一多核苷酸引入一抗原呈現細胞，而該多核苷酸編碼出由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的一胜肽，或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽，其中該抗原呈現細胞表現一HLA-A0206抗原。
一種in vitro誘導細胞毒殺性T淋巴球方法，藉由使用由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的一胜肽，或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽，其中該細胞毒殺性T淋巴球辨認一HLA-A0206抗原與該胜肽之複合物。
一種經分離之抗原呈現細胞，其呈現一HLA-A0206抗原與由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的一胜肽或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽之複合物於其表面上。
一種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其辨認一HLA-A0206抗原與由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的一胜肽或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽之複合物。
一種誘導具有高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的試劑，其中該試劑包括：(a)具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之一或多個胜肽，其中該胜肽係由一胺基酸序列所組成，且該胺基酸序列係擇自由下列所組成之群組： (i)序列辨識號：1；以及(ii)序列辨識號：1，於其中1或2個胺基酸被取代；或(b)編碼出(i)或(ii)之胜肽之一或多個多核苷酸；其中該抗原呈現細胞表現一HLA-A0206抗原。
一種下列(a)-(e)用於製造用以於一個體中誘發抗癌免疫反應之試劑的用途，該個體之HLA抗原為HLA-A0206：(a)具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力與序列辨識號：1之一胺基酸序列的一胜肽、(b)在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸加入、插入、刪除及/或取代之(a)之胜肽、(c)編碼出該胜肽之一多核苷酸、(d)一如申請專利範圍第6項所述之經分離之抗原呈現細胞或(e)一如申請專利範圍第7項所述之經分離之細胞毒殺性T淋巴球。
如申請專利範圍第9所述之用途，其中該癌症係擇自由膀胱癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胰臟癌、腎癌與軟組織腫瘤所組成之群組。
一種於個體中誘導抗癌免疫反應的試劑，該個體之HLA-A抗原為HLA-A0206，其中該試劑包含選自於下列所組成之群組：(a)具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之一或多個胜肽，其中該胜肽係由一胺基酸序列所組成，且該胺基酸序列係擇自由下列所組成之群組：(i)序列辨識號：1；以及(ii)序列辨識號：1，於其中取代1或2個胺基酸；(b)編碼出(i)或(ii)之胜肽之一或多個多核苷酸； (c)一或多個如申請專利範圍第6項所述之經分離之抗原呈現細胞；(d)一或多個如申請專利範圍第7項所述之經分離之細胞毒殺性T淋巴球；及(e)其組合結合一藥學上可接受之載體。
一種in vitro誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法，其中該方法包括擇自由下列所組成之步驟：(a)將CD-8陽性T細胞與一抗原呈現細胞及/或一外吐小體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體於其表面表現一HLA-A0206抗原與由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的一胜肽或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽的複合物；以及(b)將一多核苷酸引入一CD8陽性T細胞，該多核苷酸編碼出一多胜肽，該多胜肽具形成一T細胞受體次單位的能力，該T細胞受體次單位辨認一胜肽與一HLA-A0206抗原的一複合物，其中該胜肽係由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成，或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽。
一種誘導細胞毒殺性T淋巴球的試劑，其中該試劑包括：(a)一或多個胜肽其具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，其中該胜肽係由一胺基酸序列所組成，且該胺基酸序列係擇自由下列所組成之群組：(i)序列辨識號：1；以及(ii)序列辨識號：1，於其中取代1或2個胺基酸； (b)編碼出(i)或(ii)之胜肽之一或多個多核苷酸；(c)一或多個外吐小體及/或抗原呈現細胞，其於其表面表現一HLA-A0206抗原與由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的胜肽或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽的複合物。
一種下列(a)之胜肽或(b)用於製造用以誘發具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的醫藥組合物的用途：(a)一胜肽其係由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成，或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽：或(b)一多核苷酸編碼出由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的胜肽或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽，其中該抗原呈現細胞表現一HLA-A0206抗原。
一種下列(a)之胜肽或(b)用於製造用以於一個體中誘發細胞毒殺性T淋巴球的醫藥組合物的用途，其中該個體之HLA-A抗原為HLA-A0206：(a)一胜肽其係由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成，或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽：或(b)一多核苷酸編碼出由序列辨識號：1之一胺基酸序列所組成的胜肽或在其中1或2個胺基酸以其他胺基酸取代之該胜肽。