KR101705514B1

KR101705514B1 - Ｍｅｌｋ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR101705514B1
Application number: KR1020117004323A
Authority: KR
Inventors: 타쿠야 츠노다; 류지 오사와
Original assignee: 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2017-02-10
Also published as: CA2732721A1; JP2011529683A; IL210861A0; TWI466680B; SG193161A1; AU2009277811A1; HK1156341A1; CN102171340B; US9193765B2; IL210861A; AU2009277811A8; CN102171340A; IL232461A0; EP2321411B1; US20160101171A1; KR20110045018A; EP2321411A4; MX2011001194A; BRPI0916940A2; US8674069B2

Abstract

본 발명에 따르면, 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62의 아미노산 서열을 갖는 펩티드들이 세포독성 T 림프구(CTL) 유도성을 갖음을 증명하였다. 그러므로, 본 발명은 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 CTL 유도성을 유지하는 한, 하나, 둘, 또는 다수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 첨가되어 포함될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 이러한 임의의 펩티드를 포함한, 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술후 재발의 예방을 위한 약학적 제제를 제공한다. 본 발명의 약학적 제제는 백신을 포함한다.

Description

ＭＥＬＫ 에피토프 펩티드 및 이를 포함하는 백신{MELK EPITOPE PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME}

본 발명은 그 전체의 내용이 본 명세서에 참조로서 통합되는, 2008년 8월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/085,663호에 기반한다.

본 발명은 생명과학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 백신, 및 종양 예방 및 치료를 위한 약물로써 매우 효과적인 신규한 펩티드에 관한 것이다.

CD8 양성 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)는 주조직적합성 복합체(MHC, major histocompatibility complex) 클래스 I 분자에서 발견되는 종양 관련 항원(TAA)으로부터 유래된 에피토프(epitope) 펩티드를 인식한 후, 상기 종양 세포를 사멸시킨다는 것이 입증되었다. TAA의 첫 번째 예로서, 멜라노마 항원(MAGE) 패밀리가 발견된 후, 주로 면역학적인 접근을 통해 많은 다른 TAA가 발견되었다(Boon T, Int J 암 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). 몇몇의 이러한 TAA들은 현재 면역치료 표적으로서, 임상 개발이 진행중이다.

강력하고, 특이적인 항종양 면역 작용을 유도할 수 있는 신규한 TAA의 동정은 다양한 암 종류를 위한 펩티드 백신 전략의 임상 활용 및 개발을 추가로 보장한다(Harris CC, J Natl 암 Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., 암 Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., 암 Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., 암 Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J 암 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J 암 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J 암 1999 May 5, 81(3): 387-94). 현재까지, 이러한 종양 관련 항원 유래 펩티드를 이용한 임상 시험에 관한 다수의 보고가 있었다. 불행히도, 매우 낮은 객관적 반응률이 현재까지 이러한 암 백신 시험에서 관찰되었다(Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

최근에, HLA 클래스 I-결합 펩티드 서열을 예상할 수 있는 알고리즘(algorithms)이 개발되었다(Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-190, J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175, protein science, (2000), Vol.9, pp.1838-1846). 하지만, 예상되는 에피토프 펩티드가 자연적으로 표적 세포에서 제시되고 HLA 분자가 표적 세포 표면에 발현될 수 있는지를 측정하는 것이 어렵다. 더구나, 알고리즘에서, 예를 들어 BIMAS(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, et al., (1994) J Immunol.;152(1):163-75.; Kuzushima K, et al., (2001) Blood.;98(6):1872-81.))는 정확한 HLA 분자 결합 펩티드보다 적게 제시할 수 있다(Bachinsky MM, et. al., 암 Immun. 2005 Mar 22;5:6.). 따라서, 에피토프 펩티드를 동정하는 것은 도전적이고 어려운 것으로 남아있다.

MELK, maternal embryonic leucine zipper kinase는 포유류의 배아 발달에 관여하는 snf1/AMPK 세린-트레오닌 키나제 패밀리(serine-threonine kinase family)의 새로운 멤버로서 이미 동정되었다(Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug 215(4):344-51). 상기 유전자는 줄기 세포 재생(Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3):413-27), 세포-주기 진행(Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2):327-38; Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3):597-604) 및 pre-mRNA 스플라이싱(splicing)(Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10):8642-7. Epub 2003 Dec 29)에 중요한 역할을 수행하는 것으로 나타났다. 추가로, 23,040 유전자를 포함하는 게놈 와이드 cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현 프로파일의 분석을 통해서, MELK가 최근에 유방암에서 상향 조절되는 것으로 나타났다(Lin ML et al., 유방 암 Res. 2007; 9 (1):R17, WO2006/016525, WO2008/023841). 사실상, MELK는 여러 종류의 암 세포, 예를 들면, 폐, 방광, 림프종 및 자궁 경부암 세포에서 상향 조절된다(WO2004/031413, WO2007/013665, 및 WO2006/085684 참조, 상기 이러한 공개된 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다). 다수의 인간 조직 및 암 세포주의 노던 블랏 분석(Northern blot analysis)은 MELK가 정상적인 생체 기관(심장, 간, 폐 및 신장)에서는 발현되지 않고, 유방암 및 세포주의 과반수에서 현저하게 높은 수준으로 과발현되었음을 증명하였다(WO2006/016525). 게다가, siRNA에 의한 MELK 발현 저해는 인간 유방암 세포의 성장을 현저히 저해하는 것으로 나타났다. 따라서, MELK는 암 면역치료를 위한 적절한 표적이 될 수 있을 것으로 간주되며, 그로부터 유래된 에피토프 펩티드는 광범위한 분야의 암 종류의 치료에 효과적인 암 면역치료제로서 제공될 것으로 기대될 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 면역 치료에 적합한 표적의 발견에 부분적으로 근거한다. TAA가 일반적으로 면역 체계에서 "자가"로 인식되고, 따라서 종종 선천적 면역원성을 갖지 않기 때문에, 적절한 표적의 탐색이 매우 중요하다. MELK가 유방암, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, 비소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암(SCC)의 암 조직에서 상향 조절되어 확인된다는 것을 인식한 뒤, 본 발명은 추가 분석을 위해 GeneBank 등록 번호(GenBank Accession No.) NM_014791(서열번호: 93)의 유전자에 의해 암호화되는 maternal embryonic leucine zipper kinase(MELK) 단백질(서열번호: 94)을 표적으로 삼았다. 구체적으로, 상응되는 분자에 대하여 특이적으로 CTL을 유도하는 에피토프 펩티드를 포함하는 MELK 유전자 산물들이 연구를 위해 선택되었다. 건강한 기증자로부터 획득한 말초단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 MELK로부터 유래된 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201 결합 후보 펩티드를 이용하여 자극되었다. 각각의 후보 펩티드로 펄스된 HLA-A24 또는 HLA-A02 양성 표적 세포를 특이적으로 인식하는 CTL이 확립되었으며, 종양 세포의 표면에서 발현되는 MELK에 대하여 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A02 제한적 에피토프 펩티드가 동정되었다. 이러한 결과들은 MELK가 강력한 면역원성이며, 이의 에피토프가 종양 면역 치료법을 위해 효과적인 표적이라는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열뿐만 아니라, CTL 유도성을 갖는 펩티드를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 변형된 펩티드가 원래의 CTL 유도성을 유지하는 한, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 첨가된, 서열번호 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 또는 62의 아미노산 서열을 갖는 변형된 펩티드를 고려한다.

개체에 투여되었을 때, 본 발명의 펩티드는 항원 제시 세포의 표면에 제시되며, 그런 다음 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도한다. 따라서, 본 발명의 목적은 항원 제시 세포를 유도하는 방법뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드 중 어느 하나를 제시하는 항원 제시 세포를 제공하는 것이다. 항종양 면역 반응은 MELK 폴리펩티드를 제시하는 엑소솜 및 항원 제시 세포뿐만 아니라, 상기 MELK 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여에 의해서 유도된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 그 활성 성분으로 엑소솜 및 항원 제시 세포뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 약학적 제제는 백신으로서 유용성을 밝힌다.

본 발명의 다른 목적은 MELK 폴리펩티드, MELK 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, MELK 폴리펩티드를 제시하는 엑소솜(exosome) 또는 항원 제시 세포 또는 본 발명의 약학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, CTLs 유도 방법, 항-종양 면역을 유도하는 방법뿐만 아니라, 암(종양)의 치료 및/또는 예방(즉, 방지), 및/또는 이의 수술 후 재발의 방지를 위한 방법을 제공하는 것이다. 아울러, 본 발명의 CTLs은 또한 암에 대한 백신으로서의 용도를 밝힌다. 암의 예로는 이에 한정되지 않으나, 유방암, 방광암, 자궁경부 암, 담관세포성 암종, CML, 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, NSCLC, 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 SCC를 포함한다.

상기 본 발명의 요약 및 하기의 발명의 상세한 설명 모두는 내용을 예시한 것이며, 본 발명 또는 본 발명의 다른 내용이 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 다양한 측면 및 활용은 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 상세한 설명 및 이에 따른 바람직한 실시예를 고려하면, 당업자에게 명백해질 수 있다.
[도 1] 도 1은 MELK로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTLs의 IFN-감마 ELISPOT 분석 결과를 나타내는, 일련의 그림, (a) 내지 (i)를 포함한다. MELK-A24-9-326(서열번호: 14)(a)로 자극된 웰 번호 #5, MELK-A24-9-78 (서열번호: 21) (b)로 자극된 웰 번호 #3, MELK-A24-10-637(서열번호: 23)(c)로 자극된 웰 번호 #4, MELK-A24-10-532(서열번호: 27)(d)로 자극된 웰 번호 #4, MELK-A02-9-138(서열번호: 36)(e)로 자극된 웰 번호 #5, MELK-A02-9-193(서열번호: 46)(f)로 자극된 웰 번호 #3, MELK-A02-9-171(서열번호: 57)(g)로 자극된 웰 번호 #1, MELK-A02-9-71(서열번호: 60)(h)로 자극된 웰 번호 #2, 및 MELK-A02-9-532(서열번호: 62)(i)로 자극된 웰 번호 #2에 있는 CTLs은 각각 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 사각형 상자로 나타낸 상기 웰 안의 세포는 CTLs 라인을 확립하기 위하여 증폭하였다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 웰에 있는 표적 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포를 나타낸다.
[도 2] 도 2는 IFN-감마 ELISA 분석에서 서열번호: 14(a), 서열번호: 21(b), 서열번호: 23(c), 서열번호: 27(d), 서열번호: 36(e), 서열번호: 46(f), 서열번호: 57(g), 서열번호: 60(h) 및 서열번호: 62(i)로 자극된 CTL 라인의 IFN-감마 생성을 나타내는 일련의 선 그래프, (a) 내지 (i)를 포함한다. 각각의 펩티드를 이용한 자극에 의해서 확립된 CTL 라인은 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다. 도면에서, "+"는 적합한 펩티드에 의해서 펄스된 표적 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포를 나타낸다.
[도 3] 도 3은 서열번호: 27로 자극된 CTL 라인으로부터 제한적인 희석에 의해 확립된 CTL 주의 IFN-감마 생성을 나타낸다. 상기 나타난 결과들은 서열번호: 27을 이용한 자극에 의해 확립된 CTL 주가 대조군에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타낸다는 것을 증명한다. 도면에서, "+"는 서열번호: 27에 의해서 펄스된 표적 세포를 나타내고, "-"는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 표적 세포를 나타낸다.
[도 4] 도 4는 MELK 및 HLA-A*0201이 외인성으로 발현되는 표적 세포에 대해 MELK-A02-9-138(서열번호: 36)(a) 또는 MELK-A02-9-171(서열번호: 57)(b)로 확립된 CTL 주의 특이적 CTL 활성을 나타내는 선 그래프 (a) 및 (b)로 구성된다. 상기 표적 세포는 MELK 및 HLA-A*0201 분자 유전자(-닫힌 다이아몬드형-) 둘 다의 전장을 COS7 세포에 공동-형질감염하여 준비하였고, 상기 대조군 표적 세포는 HLA-A*0201 분자 유전자를 COS7 세포에 형질감염하였고, 확립된 CTL 클론과 함께 펩티드와 다른 부적절한 펩티드로 펄스하여 준비하였으며(-열린 삼각형-), 또는 MELK 유전자로 COS7 세포에 형질감염시켰다(-열린 원형-). MELK -A02-9-138(서열번호: 36)(a) 및 MELK -A02-9-171(서열번호: 57)(b)로 확립된 CTL 주는 대조군(-열린 삼각형-, -열린 원형-)과 비교하여 MELK 및 HLA-A*0201(-닫힌 다이아몬드형-) 모두가 형질감염된 COS7 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타내었다.

비록, 본 명세서에 기재된 어떠한 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 실시예를 수행 또는 검사하는데 사용될 수 있으나, 바람직한 방법, 도구, 및 재료는 여기에 기재된다. 그러나, 본 재료 및 방법이 기재되기 이전에, 본 발명은 명세서에 기재된 특정 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이들은 통상적인 실험 및 최적화에 부합하여 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 특정한 버전 또는 내용을 기술하기 위한 목적이나, 오직 첨부된 청구항으로 제한되는 본 발명의 범위로 제한하려는 의도는 아니다.

본 명세서에서 언급된 개별 공개, 특허 또는 특허 출원의 내용은 그 전체가 명세서에 참조로서 통합된다. 그러나, 본 명세서의 어느 것도 본 발명은 이전 발명으로 인하여 선행되는 문헌의 자격이 없다는 인정으로서, 만들어지지 않는다.

충돌이 일어날 경우, 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서에 따른다. 추가로, 상기 재료, 방법, 및 실시예만 설명될 수 있으나, 제한하려는 의도는 아니다.

I. 정의

본 발명에서 사용되는 단어는 별도로 명시되지 않는 한, 단수를 의미한다.

본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기로 된 아미노산 중합체가 변형된 잔기, 또는 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 아미노산에 상응하는 인공 화학 모방체와 같은 비천연 잔기에 적용된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체(mimetic)를 의미한다. 천연 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산, 및 세포에서 번역 후 변형된 아미노산[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카복시글루탐산(gamma-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]이다. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 천연 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기에 결합하는 α탄소)를 가지고 있지만, 변형된 R기 또는 변형된 골격을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조를 갖지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 상징 또는 1문자 상징에 의해 기재되어 질 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 기재되는 아미노산과 유사하다.

별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "암"은 예로 유방암, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, 비소세포폐암(NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암(SCC)이 포함되는 MELK 유전자를 과발현하는 암을 나타내지만, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 "세포독성 T 림프구", "세포독성 T 세포" 및 "CTL"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며, 따로 특별히 나타내지 않는 한, 비-자가 세포(예를 들면, 종양 세포, 바이러스 감염된 세포)를 인식하고 이러한 세포의 사멸을 유도하는 T 림프구의 하위 그룹을 나타낸다.

별도로 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속한 업계에서 전통적인 기술중 하나로 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

II . 펩티드( Peptides )

MELK로부터 유래한 펩티드가 세포 독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)에 의해 인식되는 항원으로서 역할을 한다는 것을 증명하기 위하여, MELK로부터 유래된 펩티드(서열번호: 93)가 일반적으로 HLA 대립 유전자로 알려진, HLA-A24 또는 HLA-A02에 의해 한정되는 항원 에피토프인지 여부를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). MELK로부터 유래된 HLA-A24 또는 HLA-A02 결합 펩티드 후보는 HLA-A24 또는 HLA-A02에 대한 그들의 결합 친화성을 바탕으로 동정되었다. 이러한 펩티드를 담지한 수지상 세포(dendritic cells, DCs)에 의해 T 세포를 생체 외에서 자극한 후, 하기 펩티드를 사용하여 CTLs을 성공적으로 확립하였다:

MELK-A24-9-326(서열번호: 14),

MELK-A24-9-78(서열번호: 21),

MELK-A24-10-637(서열번호: 23),

MELK-A24-10-532(서열번호: 27),

MELK-A02-9-138(서열번호: 36),

MELK-A02-9-193(서열번호: 46),

MELK-A02-9-171(서열번호: 57),

MELK-A02-9-71(서열번호: 60),

및

MELK-A02-9-532(서열번호: 62).

이렇게 확립된 CTLs은 각각의 펩티드로 자극된 표적 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 보였다. 이러한 결과는 MELK가 CTL에 의해 인식되는 항원이고 상기 펩티드는 HLA-A24 또는 HLA-A02에 의해 한정되는 MELK의 에피토프 펩티드임을 나타낸다.

MELK 유전자는 유방암, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, CML, 대장 암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, NSCLC, 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 SCC와 같은, 대부분의 암 조직에서 과발현되므로, 이것은 면역치료의 효과적인 표적이다. 따라서, 본 발명은 CTL에 인식되는 MELK 유래 에피토프에 상응하는 노나펩티드(9개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드) 및 데카펩티드(10개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드)를 제공한다. 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드의 특별히 바람직한 실시예로는 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드를 포함한다.

일반적으로, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1,152(1): 163-75에 기재된 바와 같이, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 컴퓨터 상(in silico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성을 산출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; 및 Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81를 참조로 하여 기재되어 있는 바에 따라, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 측정하는 방법은, 예를 들면, Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190; 및 Protein Science, 2000, 9: 1838-1846에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 공지된 프로그램을 이용하여 동정된 HLA 항원에 결합하는 MELK의 펩티드를 포함한다.

본 발명의 상기 노나펩티드 및 데카펩티드는 상기 펩티드가 그 CTL 유도성을 유지하는 한, 부가적인 아미노산 잔기를 인접시킬 수 있다. CTL 유도성을 갖는 이러한 펩티드는 전형적으로는 약 40 아미노산 미만, 흔히 약 20 아미노산 미만, 보통 약 15 아미노산 미만이다. 본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드에 인접한 상기 특정 아미노산 서열(예로, 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택된 아미노산 서열로 구성된 펩티드)은 원래의 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한 제한되지 않고 임의의 종류의 아미노산으로 구성될 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 CTL 유도성을 갖고, 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다.

일반적으로, 단백질에서 하나, 둘 또는 다수의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 끼치지 않으며, 몇몇의 경우에는 심지어 본래 펩티드의 원하는 기능을 강화시킬 수 있다. 사실, 변형된 펩티드(즉, 본래의 참조 서열과 비교하여, 하나, 둘 또는 다수의 아미노산 잔기가 변형된(즉, 치환, 결실, 첨가 또는 삽입) 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 유지한다고 알려지고 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). 따라서, 하나의 실시예에서, 본 발명의 상기 펩티드는 CTL 유도성 및 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택되는 아미노산 서열에서 하나, 둘 또는 심지어 다수의 아미노산이 삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 모두 가질 수 있다.

당업자는 단일 아미노산 또는 아미노산의 일부 비율이 바뀌는, 아미노산 서열 각각의 삽입 또는 치환이 본래 아미노산 측쇄의 특성을 보존하는 결과를 내는 경향이 있음을 알고 있다. 보통, 이들은 단백질의 변화가 본래 단백질과 유사한 기능을 갖는 변형된 단백질을 만드는 "보존적 치환" 또는 "보존적 변형"이라고 일컫는다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 보존되는 아미노산 측쇄 특성의 예는 예를 들어, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기의 작용기 또는 공통적인 특성을 갖는 측쇄가 포함된다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 측쇄를 포함하는 수산기 그룹(S, T, Y); 측쇄를 포함하는 황 원자(C, M); 측쇄를 포함하는 카르복실산 및 아미드(amide)(D, N, E, Q); 측쇄를 포함하는 염기(R, K, H); 및 측쇄를 포함하는 방향족(H, F, Y, W). 아울러, 하기의 8개 그룹은 각각 보존적 치환으로서 당업계에서 서로 허용될 수 있는 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글라이신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루타민산(E);

3) 아스파르긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조).

이러한 보존적으로 변형된 펩티드는 또한 본 발명의 펩티드로 간주된다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 이에 한정되지 않으며 상기 변형된 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 비-보존적 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, 변형된 펩티드는 CTL 유도성 펩티드의 다형성 변이, 종간 유사체(interspecies homologues), 및 MELK의 대립 유전자를 제외하지 않는다.

필요한 CTL 유도성을 유지하기 위하여, 소수(예를 들어, 1, 2 또는 몇몇) 또는 적은 퍼센트의 아미노산을 변형(삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환)할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 용어 "몇몇"은 5개 미만의 아미노산, 예를 들어, 3개 또는 그 이하를 의미한다. 변형된 아미노산의 퍼센트는 바람직하게 20% 미만이며, 보다 바람직하게는 15% 미만이며, 그보다 더욱 바람직하게는 10% 미만 또는 1 내지 5%이다.

본 발명의 바람직한 펩티드의 상동성 분석은, MELK-A24-9-326(서열번호: 14), MELK-A24-9-78(서열번호: 21), MELK-A24-10-637(서열번호: 23), MELK-A24-10-532(서열번호: 27), MELK-A02-9-138(서열번호: 36), MELK-A02-9-193(서열번호: 46), MELK-A02-9-171(서열번호: 57), MELK-A02-9-71(서열번호: 60) 및 MELK-A02-9-532(서열번호: 62)가 다른 공지의 인간 유전자 산물로부터 유래한 펩티드와 현저한 유사성을 가지고 있지 않다는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 펩티드가 면역치료를 위해 사용되었을 경우, 알려지지 않거나 원하지 않은 면역 반응을 발생시킬 수 있는 가능성은 매우 낮다. 따라서, 이러한 펩티드는 유방암, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, CML, 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, NSCLC, 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 SCC와 같은, 암 세포에서 MELK에 대한 종양 환자의 면역력을 유도하는데 매우 유용할 것으로 예상된다.

면역치료의 문맥으로 이용될 때, 본 발명의 펩티드는 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시되며, 바람직하게는 HLA 항원과의 복합체로서 제시된다. 따라서, CTLs을 유도할 뿐만 아니라, 상기 HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성을 가진 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해서, 상기 펩티드는 증가된 결합 친화성을 갖는 변형된 펩티드를 생산하기 위하여, 아미노산 잔기들의 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가를 통해서 변형될 수 있다. 자연적으로 나타난 펩티드와 더불어, HLA 항원에 결합함으로써 나타나는 펩티드 서열의 규칙성은 이미 알려져 있으며(J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), 이러한 규칙성에 기반한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들면, HLA-A24 결합을 증가시키기 위하여, N 말단의 두 번째 아미노산을 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 치환, 및/또는 C 말단의 아미노산을 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan), 또는 메티오닌(methionine)으로 치환하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 서열번호의 아미노산 서열에서 N 말단의 두 번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 타이로신(tyrosine), 메티오닌(methionine), 또는 트립토판(tryptophan)으로 치환, 및/또는 서열번호의 아미노산 서열에서 C 말단이 페닐알라닌(phenylalanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 트립토판(tryptophan), 또는 메티오닌(methionine)으로 치환된, 서열번호: 14, 서열번호: 21, 서열번호: 23 및 서열번호: 27 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 본 발명에 의해서 포함된다. 반면에, 높은 HLA-A02 결합 친화도를 갖는 펩티드들은 류신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)으로 치환된 N 말단으로부터 두 번째 아미노산, 및/또는 발린(valine) 또는 류신(leucine)으로 치환된 C 말단의 아미노산을 갖는다. 따라서, N 말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)으로 치환, 및/또는 C 말단이 발린(valine) 또는 류신(leucine)으로 치환된 서열번호: 36, 서열번호: 46, 서열번호: 57, 서열번호: 60 및 서열번호: 62 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드들은 본 발명에 의해서 포함된다. 치환은 마지막 아미노산에서 뿐만 아니라, 펩티드의 잠재적 TCR 인지 위치에도 도입될 수 있다. 다수의 연구에서 예를 들어 CAP1, p53_(264-272), Her-2/neu_(369-377) 또는 gp100_(209-217)의 펩티드에서의 아미노산 치환은 본래와 동등하거나 또는 우수하다는 것을 보였다(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 및 S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

또한, 본 발명은 상기 펩티드의 N 및/또는 C 말단에 하나 내지 두 개의 아미노산의 첨가를 고려한다. 또한 이러한 높은 HLA 항원 결합 친화성을 가지면서 CTL 유도성을 보유하는 변형된 펩티드는 본 발명에 포함된다.

그러나, 상기 펩티드 서열이 상이한 기능을 갖는 내인성 또는 외인성의 아미노산 서열의 일부와 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역 질환 및/또는 알러지 증상과 같은 부작용이 유도될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드의 서열과 일치하는 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 경우를 방지하기 위하여, 우선 이용가능한 데이타베이스를 이용하여 상동성 검색을 수행하는 것이 바람직하다. 목적 펩티드와 비교하여 1개 또는 2개 아미노산의 차이가 있는 펩티드조차 존재하지 않는다는 상동성 검색 결과가 확실해진다면, 상기 목적 펩티드는 이의 HLA 항원과의 결합 친화성, 및/또는 상기와 같은 부작용의 위험이 없는 CTL 유도성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다.

비록 상기 기재된 바와 같이 HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 펩티드는 매우 효과적일 것으로 예상되지만, 지표로서 높은 결합 친화성의 존재에 따라 선택된 상기 후보 펩티드들은 CTL 유도성의 존재에 대해 더욱 조사된다. 여기에서, 구문 "CTL 유도성"은 항원 제시 세포에 제시될 때, 세포독성 T 림프구(CTLs)를 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 나아가, "CTL 유도성"은 상기 펩타이드의 CTL 활성 유도, CTL 증식, 표적 세포의 CTL 용해 증진, 및 CTL IFN-감마 생성을 증가시키는 능력을 포함한다.

CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원(예를 들면, B-림프구, 대식세포, 및 수지상 세포(DCs))을 운반하는 항원 제시 세포를 유도하고, 상기 펩티드로 자극한 후, CD8-양성 세포와 유도된 항원 제시 세포를 혼합한 다음, 표적 세포에 대하여 CTL에 의해서 생성되고 방출된 IFN-감마를 측정하는 것에 의해서 수행된다. 항원 제시 세포가 인간 말초혈액 단핵구 백혈구로부터 유래된 DCs임이 바람직하다. 반응 체계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들어, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class restricted T(H) response에 기재됨)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포는 ⁵¹Cr 등으로 방사선 표지될 수 있으며, 세포독성 활성은 상기 표적세포로부터 방출되는 방사능으로부터 산출될 수 있다. 대안적으로, CTL 유도성은 고정화된 펩티드를 운반하는 항원 제시 세포(APCs)의 존재하에 CTL에 의해서 생성되고 방출되는 IFN-감마(IFN-gamma)를 측정하고, 항-IFN-감마 단일클론 항체를 이용하여 상기 배지 내의 억제 구간을 가시화함으로써 측정할 수 있다.

상기 기재한 바와 같이 상기 펩티드의 CTL 유도성 검사 결과, HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 것으로 예측되는 펩티드들이 반드시 높은 CTL 유도성을 갖지 않는다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 상기 확인되고 검사된 펩티드 가운데, 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 노나펩티드 또는 데카펩티드는, 특히 높은 CTL 유도성을 보인다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이러한 펩티드들은 본 발명의 바람직한 실시예로서 시험된다.

또한, 상기 기재한 변형과 더불어, 본 발명의 펩티드는 결과적으로 연결된 펩티드가 본래 펩티드의 CTL 유도성을 유지하는 한, 다른 물질들과 연결될 수 있다. 적합한 물질들은 그 예로 펩티드, 지질, 당 및 당 사슬, 아세틸기(acetyl group), 천연 및 합성 폴리머 등을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 상기 펩티드는 본래 펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한, 글리코실화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화(phosphorylation), 등과 같은 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능을 부여하기 위하여(예를 들면, 표적화 기능, 및 전달 기능), 또는 상기 폴리펩티드를 안정화시키기 위하여 수행될 수 있다.

예를 들면, 폴리펩티드의 세포 내(in vivo) 안정성을 증가시키기 위하여, 당업계에는 D-아미노산, 아미노산 미메틱스(mimetics) 또는 비자연적인 아미노산을 도입할 수 있다는 것이 알려져 있다; 또한 이러한 개념은 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 펩티드가수분해효소 및 인간 혈장 및 혈청과 같은, 다양한 생물학적 배지가, 안정성을 시험하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302 참조).

추가로, 본 발명의 상기 펩티드들은 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)를 통해 다른 펩티드들과 연결될 수 있다. 다른 펩티드들의 예들은 다른 TAA로부터 유래된 펩티드로 유도된 CTL을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 본 발명의 둘 또는 다수의 펩티드들은 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)를 통해 연결될 수 있다. 스페이서 또는 링커를 통해 연결된 상기 펩티드들은 동일하거나 서로 다를 수 있다. 스페이서 또는 링커는 특별히 제한되지 않지만, 펩티드인 것이 바람직하고, 펩티다제(psptidase), 프로테아제(protease) 및 프로테아좀(proteasome)과 같은 효소에 의해 절단될 수 있는 하나 또는 다수의 절단 위치를 갖는 펩티드인 것이 더욱 바람직하다. 링커 또는 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 펩티드들은 스페이서 또는 링커를 통해 다른 펩티드에 연결된 이러한 펩티드를 포함한다.

본 발명의 펩티드는 MHC 분자와 조합된 복합체로서 인간 MHC 항원을 수반하는 세포(예로, 항원 제시 세포) 또는 엑소솜의 표면에 존재한 다음, CTLs을 유도할 수 있다. 상기 세포 및 엑소솜은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들면, 상기 세포가 본 발명의 펩티드로 접촉하여 준비될 수 있거나, 상기 엑소솜이 본 발명의 펩티드로 접촉된 세포로부터 엑소솜을 포함한 분획의 수집에 의해 준비될 수 있다(예로, 일본 특허 출원 코효(Kohyo) 공개번호 Hei 11-510507 및 WO99/03499 참조). 본 발명의 펩티드는 MHC 분자와 조합된 복합체로 세포 또는 엑소솜의 표면에 존재하는 이러한 펩티드들을 포함한다.

또한, 명세서에서, 본 발명의 펩티드는 "MELK 펩티드(들)" 또는 "MELK 폴리펩티드(들)"로 기재될 수 있다.

Ⅲ. MELK 펩티드의 제조

본 발명의 펩티드는 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성을 사용하여, 합성적으로 제조될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 각각 합성되거나, 둘 또는 이상의 펩티드로 구성되는 긴 폴리펩티드로서 합성될 수 있다. 다음으로, 상기 펩티드는 자연적으로 형성되는 숙주 세포 단백질 및, 이의 단편, 또는 다른 화학적 물질이 실질적으로 제거되도록 분리, 즉 정제 또는 분리될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 선별된 아미노산 서열을 기초로 한 화학 합성을 통해 얻어질 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 종래 펩티드 합성 방법의 예들은 하기를 포함하나, 이에 한정하지 않는다:

(i) 펩티드 합성(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966;

(ii) 단백질(The Proteins), Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) 펩티드 합성(Peptide Synthesis)(일본어), Maruzen Co., 1975;

(iv) 펩티드 합성의 기본 및 실험(일본어), Maruzen Co., 1985;

(v) 제약 개발(두 번째 권)(일본어), Vol. 14(펩티드 합성), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; 및

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "고체상 펩티드 합성(Solid Phase peptide synthesis)", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

대안적으로, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 생산하기 위한 모든 공지된 유전 공학 기술을 적용하여 획득될 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). 예를 들면, 우선, 발현할 수 있는 형태로 목적 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적합한 벡터(예를 들면, 프로모터 서열에 상응하는 조절 서열의 하위 단계)가 제조되고 적합한 숙주 세포에 형질전환된다. 그리고 상기 숙주 세포는 관심있는 펩티드를 생산하기 위하여 배양된다. 또한, 상기 펩티드는 시험관 내 번역 체계(in vitro translation system)를 채택하여 시험관 내에서 생성될 수 있다.

IV . 폴리뉴클레오티드( Polynucleotides )

또한, 본 발명은 상기 언급된 본 발명의 임의의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클리레오티드를 제공한다. 이들은 MELK 유전자의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 자연적으로 발생되는 MELK 유전자(GenBank 등록번호 NM_014791(서열번호: 93))로부터 유래되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이하, 구문 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 퇴화도(degeneracy)로 인하여, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 특정한 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG, 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해서 특정화되는 각 위치에서, 상기 코돈은 암호화되는 폴리펩티드를 변화시키지 않고 이에 상응되는 임의의 코돈으로 변화할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이(silent variation)"이며, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 또한, 본 명세서에서 펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 일반적인 기술의 하나는 핵산 내의 각 코돈(예외 일반적으로 메티오닌(methionine)을 위한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판(tryptophan)을 위한 유일한 코돈인, TGG)은 기능적으로 동일한 분자를 생산하기 위하여 변형되는 것을 인식할 수 있다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 공개된 서열에 암시적으로 기재된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 및 이의 변이체로 구성될 수 있다. DNA는 A, T, C, 및 G와 같은 염기로 적절하게 구성되며, RNA에서는 T가 U로 치환된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 사이에 삽입하거나 또는 삽입하지 않은 채로, 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 삽입하는 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 위치(예, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 더욱이, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대하여 임의의 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현을 위하여 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자 등이 있는 발현 벡터(플라스미드)일 수 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 폴리머라아제(polymerase) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드의 조작에 의해서 제조될 수 있다.

재조합 및 화학적 합성 기술 모두는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 컴피턴트(competent) 세포로 형질감염되었을 때 발현될 수 있는, 적합한 벡터 내로 삽입함으로써 생산될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술을 이용하여 증폭되거나 적합한 숙주에서 발현될 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989 참조). 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재된 바와 같이, 고체상(solid phase) 기술을 이용하여 합성될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포 또한 본 발명에 포함된다.

V. 엑소솜( Exosome )

본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는, 엑소솜으로 부르는 세포소낭(intracellular vesicles)을 추가로 제공한다. 엑소솜은 예를 들어, 일본 특허 출원 코효(Kohyo) 공개번호 Hei 11-510507 및 WO99/03499에 기재된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 치료 및/또는 예방을 위한 개체인 환자로부터 획득된 APCs를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 엑소솜은 본 발명의 펩티드와 유사한 모양으로, 백신으로써 접종될 수 있다.

상기 복합체를 포함하는 HLA 항원의 타입(type)은 치료 및/또는 예방이 필요한 개체와 매치(match)되어야만 한다. 예를 들면, 일본 인구에서는, HLA-A24, 특히 HLA-A2402가 일반적이므로, 일본인 환자의 치료를 위해서 적합하다. 일본인 및 백인 중에서 높게 발현되는 A24 타입 또는 A02 타입의 이용은 효과적인 결과를 얻는데 유리하고, A2402 또는 A0201과 같은 아형(subtype) 또한 이용될 수 있다. 일반적으로, 임상에서, 치료가 필요한 환자의 HLA 항원의 타입이 사전에 조사되고, 특정 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화력을 갖거나, 항원 제시에 의해 CTL 유도성을 갖는 펩티드를 적절히 선택할 수 있다. 게다가, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성 모두를 갖는 펩티드를 얻기 위하여, 자연적으로 유발된 MELK 부분 펩티드의 아미노산 서열을 기본으로 1, 2, 또는 다수 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 첨가가 이루어질 수 있다.

A24 타입 HLA 항원을 포함하는 엑소솜을 이용할 때는, 서열번호: 14, 21, 23 및 27 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드들이 유용하다. 반면에, A02 HLA 항원을 포함하는 엑소솜을 이용할 때는, 서열번호: 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택된 서열을 갖는 펩티드가 바람직하다.

VI . 항원 제시 세포( Antigen - presenting cells , APCs )

또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하고 있는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell, APCs)를 제공한다. 본 발명의 펩티드와 접촉 또는 발현가능한 형태의 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 도입함으로써 획득되는 APCs는 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 백신으로서 투여되거나 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜, 또는 세포독성 T 세포를 포함하는 다른 약물과의 조합으로서 투여될 수 있다.

상기 APC는 특정 종류의 세포에 한정되지 않으나, 림프구에 의해서 인식되기 위하여 그들의 세포 표면에 단백질 항원을 제시하는 것으로 알려져 있는, 수지상 세포(DCs), 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 대식세포, B 세포, 및 활성화된 T 세포를 포함한다. DC는 APCs 중에서 강력한 CTL 유도 활성을 갖는 대표적인 APC이기 때문에, DCs는 본 발명의 APCs로서 사용할 수 있다.

예를 들면, APC는 말초혈액 단핵구 백혈구로부터 유래된 DCs에 의해서 유도되고, 그런 다음 시험관 내, 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)하여 수득될 수 있다. 본 발명의 펩티드가 상기 개체에 투여될 경우, 본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs는 개체의 체내에서 유도된다. 구문 "APC 유도"는 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 세포 표면에 제시하기 위해 본 발명의 펩티드, 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 세포와 접촉(자극)하는 것을 포함한다. 본 발명의 펩티드를 상기 APCs에 도입하여, 상기 APCs가 상기 펩티드를 제시할 수 있게 한 후, 상기 APCs는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 생체 외(ex vivo) 투여는 하기의 단계를 포함한다:

a: 첫 번째 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;

b: 단계 a의 APCs와 펩티드를 접촉시키는 단계; 및

c: 펩티드가 담지된 APCs를 두 번째 개체에 투여하는 단계.

상기 첫 번째 개체 및 두 번째 개체는 동일한 개체일 수 있으며, 또는 다른 개체일 수도 있다. 대안적으로, 본 발명에 따르면, 항원 제시 세포를 유도하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 또한, 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하는 약학적 조성물을 제조하기 위해 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 수용체를 함께 혼합하거나 제형화하는 단계를 포함한, 방법 또는 과정을 제공한다. 나아가, 또한 본 발명은 항원 제시 세포를 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 상기 단계 (b)에서 획득한 APCs는 백신으로서 상기 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면, 상기 본 발명의 APCs는 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는다. "높은 수준의 CTL 유도성" 용어에 있어서, 상기 높은 수준이란 펩티드와 접촉하지 않거나 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉한 APC에 의한 CTL 유도성 수준에 대한 상대적인 것이다. 이러한 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APCs는 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 APCs 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 전달하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다. 상기 도입된 유전자는 DNAs 또는 RNAs 형태일 수 있다. 도입을 위한 방법의 예는, 리포펙타민(lipofection), 전기천공법(electroporation), 및 인산 칼슘(calcium phosphate) 방법과 같이, 당업계에서 일반적으로 수행되는 다양한 방법을 특정한 제한없이 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Published Japanese Translation of International Publication No. 2000-509281에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 상기 유전자를 APCs에 전달함으로써, 상기 유전자는 상기 세포 내에서 전사, 번역 등을 거치며, 그리고 나서 수득된 단백질은 MHC 클래스 Ⅰ 또는 클래스 Ⅱ에 의해 처리되고, 펩티드를 제시하기 위하여 제시 기작(presentation pathway)을 통해서 진행된다.

VII . 세포독성 T 세포( Cytotoxic T cell )

본 발명의 임의의 펩티드에 대해서 유도되는 세포독성 T 세포는 생체 내(in vivo)에서 암 세포를 표적으로 하는 면역 반응을 강화하며 따라서 펩티드 그 자체와 유사한 유형으로, 백신으로서 사용될 수 있다. 따라서, 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화되는 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.

이러한 세포독성 T 세포는 (1) 개체에 본 발명의 펩티드를 투여하고, 개체로부터 유래된 세포독성 T 세포를 수집하거나 또는 (2) 개체 유래된 APCs 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액 단핵구 백혈구를 시험관 내(in vitro)에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)하고, 세포독성 T 세포를 분리함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 펩티드를 제시하는 APCs로부터 자극됨으로써 유도되는, 상기 세포독성 T 세포는, 치료 및/또는 예방의 대상이 되는 환자로부터 유래될 수 있으며, 그 자체로 투여되거나, 또는 효과를 조절하기 위한 목적으로 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하는 다른 약물과 조합으로 투여될 수 있다. 상기 수득된 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드를 제시하는 표적세포, 예를 들면, 유도에 사용된 동일한 펩티드에 대해 특이적으로 작용한다. 다른 말로, 상기 세포독성 T 세포는 표적 세포의 표면에서 HLA 항원과 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 T 세포 수용체와 함께 인지할 수 있고, 그 다음 표적 세포의 사멸을 유도하기 위해 표적 세포를 공격한다. 상기 표적 세포는 내인성으로 MELK를 발현하는 세포이거나, 또는 상기 MELK 유전자가 형질감염된 세포일 수 있다; 그리고 상기 펩티드에 의해서 자극되기 때문에 본 발명의 펩티드를 세포 표면에 제시하는 세포는 활성화된 CTL 공격의 표적으로서도 사용할 수 있다.

VIII . T 세포 수용체 (T cell receptor , TCR )

또한, 본 발명은 T 세포 수용체(TCR)의 서브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물, 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 상기 TCR 서브유닛은 MELK를 제시하는 종양 세포에 대하여 T 세포의 특이성을 줄 수 있는 TCRs을 형성하는 능력을 가진다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 펩티드로 유도된 CTL에서 발현된 TCR의 알파(alpha-) 및 베타(beta-) 사슬의 핵산 서열이 동정될 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J Immunol, 171, 3288(2003)). TCRs의 유도체는 높은 결합활성을 갖고 표적 세포에서 나타나는 MELK 펩티드와 결합할 수 있으며, 선택적으로 생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro)에서 MELK 펩티드를 제시하는 표적 세포를 효과적으로 사멸시키는 것을 매개할 수 있다.

상기 TCR 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)와 같은 적합한 벡터 내로 도입될 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 잘 알려졌다. 상기 핵산 또는 이들을 포함하는 벡터는 T 세포, 예를 들면, 환자로부터 유래한 T 세포 내로 유용하게 전이될 수 있다. 유리하게, 본 발명은 우수한 암 세포 사멸 특성을 갖는 변형된 T 세포를 신속하고 용이하게 생성하게 할 수 있도록 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유류의 T 세포)를 신속하게 변형시키는 규격화된 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 HLA-A24 또는 HLA-A02의 문맥에서, 예를 들면, 서열번호: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 및 62의 MELK 펩티드와 결합하는 TCR 서브유닛 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질도입함으로써 제조되는 CTLs을 제공한다. 상기 형질도입된 CTLs은 생체 내의 암 세포로 귀소할 수 있으며, 공지된 시험관 내 배양 방법에 의해 증폭될 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461(1989)). 본 발명의 상기 T 세포는 치료 또는 보호를 필요로 하는 환자의 암을 치료 또는 방지하는데 유용한 면역원성 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다(WO2006/031221).

IX . 약학적 제제 또는 조성물

방지 및 예방은 질환으로부터 사망 또는 질병률의 부담을 감소시킬 수 있는 임의의 활동을 포함한다. 방지 및 예방은 "첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 방지 단계"에서 발생할 수 있다. 첫 번째 방지 및 예방은 질병의 발생을 피할 수 있는 반면, 두 번째 및 세 번째 단계의 방지 및 예방은 기능 복구 및 질환 관련된 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적인 효과를 감소시킬 뿐만 아니라, 질병 및 위급한 증상의 발달의 방지 및 예방에 목표를 둔다. 대안적으로, 방지 및 예방은, 예를 들면, 종양의 증식 및 전이를 감소시키는, 신생혈관억제를 감소시키는, 특정 질환의 심화를 경감시키는 것을 목적으로 하는 다양한 종류의 예방적 치료법을 포함한다.

암의 치료 및/또는 예방 또는, 및/또는 이의 수술후 재발의 방지는 암 세포의 수술적 제거, 암성 세포 성장의 억제, 종양의 퇴화 또는 퇴행, 암 발생의 차도 및 억제의 유도, 종양 감소, 및 전이의 감소 또는 억제와 같은 하기의 단계의 임의의 것을 포함한다. 효과적으로 암을 치료 및/또는 예방하는 것은 사망률을 감소시키고, 암을 가진 개인의 예후를 개선시키며, 혈액 내 종양 마커의 수준을 감소시키며, 암에 동반되는 지각할 수 있는 증상들을 감소시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적으로 치료를 구성하며 및/또는 상기 예방은 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정적인 질환을 포함한다.

MELK 발현이 정상 조직에 비해서 다양한 암에서 상향 조절되므로, 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방, 및/또는 수술 후 재발을 방지하기 위해서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발을 방지하는 약학적 제제 또는 조성물을 제공하며, 이는 하나 또는 다수의 본 발명의 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 활성 성분으로 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소솜 또는 약학적 제제 또는 조성물로서 사용되는 APCs와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 추가로, 상기 언급한 본 발명의 임의의 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 구문 "펩티드의 표적화"는 표적 세포의 표면에서 HLA 항원과 펩티드 사이에 형성된 복합체를 T 세포 수용체가 인지(즉, 결합)한 후, 상기 표적 세포의 사멸을 유도하기 위해 표적 세포를 공격하는 것을 의미한다.

또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 암 또는 종양의 치료를 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하는데 있어서, 하기 중 선택되는 활성 성분의 용도를 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 기재된 펩티드를 암호화하는 핵산,

(c) APC 또는 본 발명의 펩티드를 그 표면으로 제시하는 엑소솜, 및

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 본 발명은 암 또는 종양을 치료하는데 사용하기 위한 하기 중 선택되는 활성 성분을 추가로 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 본 발명은 활성 성분으로서 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 제형화하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 제제를 제조하는 방법 또는 과정을 추가로 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

또한, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하기 중 선택되는 활성 성분과 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 상기 활성 성분과 혼합하는 단계를 포함하는, 암 또는 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 약제를 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드,

(d) 본 발명의 세포독성 T 세포.

대안적으로, 상기 본 발명의 약학적 조성물 또는 약제는 암 또는 종양의 예방 및 이의 수술 후 재발을 방지하기 위한 방법 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위해서 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 백신으로서의 용도를 확인하였다. 본 발명의 문맥에 있어서, 상기 구문 "백신"("면역원성 조성물"도 의미함)은 동물에 주사되어 항종양 면역력을 유도하는 기능을 갖는 물질을 일컫는다.

상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 암 또는 종양의 치료 및/또는 방지에 사용될 수 있으며, 및/또는 개체 또는 인간을 포함한 환자 및 특히 산업적으로 중요한 동물 또는 가축 동물인, 마우스, 쥐, 기니아 피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 비비원숭이(baboon), 및 침팬지에 한정하지 않지만, 이를 포함하는 임의의 다른 포유류 동물에서 이의 수술 후 재발을 방지하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 서열번호: 14, 21, 23 및 27 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호: 36, 46, 57, 60 및 62 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 각각, HLA-A24 또는 HLA-A02 제한적 에피토프 펩티드 또는 강력하고 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 후보자라는 것을 발견하였다. 따라서, 서열번호: 14, 21, 23 및 27 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 이러한 임의의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 특히 HLA 항원이 HLA-A24인 개체에 투여되는 것이 더욱 적합하다. 반면에, 서열번호: 36, 46, 57, 60 및 62의 아미노산 서열을 갖는 이러한 임의의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 특히 HLA 항원이 HLA-A02인 개체에 투여되는 것이 더욱 접합하다. 동일한 것이 이러한 임의의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제에 적용된다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물에 의해서 치료될 수 있는 암 또는 종양은 MELK가 관련된, 예를 들면, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, CML, 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, NSCLC, 림프종, 골육종, 난소암, 췌장 암, 전립선암, 신장 암종 및 SCC를 포함하는 모든 종류의 암 또는 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 추가로 상기 언급한 활성 성분, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력이 가진 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드를 제시하는 다른 세포 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 암성 세포에 대하여 CTL을 유도할 수 있는 능력을 갖는 상기 다른 펩티드는 암 특이적 항원(예를 들면, 동정된 TAAs)에 의해서 예시화되나, 이에 한정되지 않는다.

만약 필요하다면, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 예를 들면, 본 발명의 임의의 펩티드와 같이, 물질이 활성 성분의 항종양 효과를 저해하지 않는 한, 선택적으로 활성 성분으로서 다른 치료학적 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 제형은 항염증성 약제, 진통제, 화학요법제 등을 포함할 수 있다. 약제 자체 내의 다른 치료학적 물질을 포함하는 것에 추가로, 본 발명의 상기 약제는 또한 하나 또는 다수의 다른 약학적 제제와 연속적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약제 및 약학적 제제의 양은 예를 들면, 어떤 종류의 약학적 제제(들)가 사용되었는지, 치료되어야 할 질환, 및 투여 일정 및 경로 등에 따른다.

특히, 본 명세서에 언급된 성분에 추가로, 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 논의가 되는 형태의 제형을 갖는 당업계의 종래 다른 제제를 포함할 수 있다고 이해된다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 제조의 물품 및 예를 들면, 암과 같은 치료될 질환의 병리학적인 조건을 치료하는데 유용한 물질을 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 상기 제조의 물품은 라벨(label)을 갖는 본 발명의 임의의 약학적 제제 또는 조성물의 용기(container)를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이얼(vial), 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플리스틱과 같은, 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기 위의 라벨은 상기 약제가 하나 또는 다수 조건의 질병의 치료 또는 예방을 위해서 사용된다는 것을 나타내야 한다. 또한, 상기 라벨은 투여 등에 대한 지시를 나타낼 수 있다.

상기 기재된 용기에 추가적으로, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물을 포함하는 키트는 약학적으로 허용가능한 희석제가 들어 있는 두 번째 용기를 선택적으로 추가하여 포함할 수 있다. 이는 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 이용을 위한 지시가 있는 사용 설명서를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 제제 또는 조성물은, 가능하다면, 활성 성분을 포함하는 하나 또는 다수의 유닛 복용량 형태를 포함하는 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser) 장치에 제시될 수 있다. 상기 팩은, 예를 들면, 금속 또는 브리스터 팩(blister pack)과 같은, 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지시서와 수반될 수 있다.

(1) 활성 성분으로서 상기 펩티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

본 발명의 상기 펩티드는 약학적 제제 또는 조성물로서, 만약 필요하다면, 종래의 제형 방법에 의해서 제형화된 것으로 직접적으로 투여될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드에 추가로, 약물에 일반적으로 사용되는 담체, 첨가제 등을 특정한 제한 없이 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예는 멸균수, 생리식염수, 인산 완충액, 배양액 등이 있다. 더욱이, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 필요에 따라, 안정화제(stabilizer), 현탁액(suspension), 보존제(preservative), 계면활성제(surfactant) 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 제제 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 생체 내(in vivo)에서 CTLs을 유도하기 위하여, 본 발명의 펩티드 둘 또는 그 이상으로 구성된 조합으로서 제조될 수 있다. 상기 펩티드 조합은 칵테일(cocktail)의 형태를 취할 수 있으며 또는 표준 기술을 이용하여 서로 결합될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 화학적으로 연결되거나 또는 단일 융합 폴리펩티드 서열로서 발현될 수 있다. 상기 조합 내의 펩티드는 동일하거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드를 투여함으로써, 상기 펩티드는 APCs의 HLA 항원에 의하여 높은 농도로 제시된 뒤, 상기 나타난 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체에 대하여 특이적으로 반응하는 CTL이 유도된다. 대안적으로, 본 발명의 펩티드로 개체로부터 유래된 APCs(예를 들면, DCs)의 자극에 의해 수득될 수 있는, 본 발명의 임의의 펩티드를 그 세포 표면에 제시하는 APCs는 개체에 투여될 수 있고, 그 결과, CTLs이 개체내에서 유도되고, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, CML, 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, NSCLC, 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 SCC 세포와 같은, 암 세포에 대한 공격성이 증가할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드를 활성 성분으로 포함하는, 암 또는 종양의 치료 및/또는 방지를 위한 약학적 제제 또는 조성물은, 세포의 면역력을 효과적으로 확립시킨다고 알려진 보조제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 약학적 제제 또는 조성물은 다른 활성 성분과 함께 투여되거나 또는 과립으로 제조되어 투여될 수 있다. 보조제는 면역학적 활성을 갖는 단백질과 함께(또는 연속적으로) 투여되었을 때 상기 단백질에 대한 면역 반응을 강화시키는 화합물을 일컫는다. 본 명세서에서 보조제는 하기의 문헌에 기재된 바를 포함한다(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). 적합한 보조제의 예로는 인산 알루미늄(aluminum phosphate), 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide), 명반(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

더욱이, 상기 펩티드가 미세한 마이크로미터 직경의 비드에 결합되어 있는 리포솜(liposome) 제형, 과립 제형, 및 지질이 상기 펩티드에 결합되어 있는 제형이 일반적으로 사용될 수 있다.

일부 실시예에서, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 CTLs을 개시하는(prime) 성분을 추가로 포함할 수 있다. 지질은 생체 내에서 바이러스 항원에서 CTLs을 개시할 수 있는 제제로서 확인되었다. 예를 들면, 팔미트산(palmitic acid) 잔기는 엡실론(epsilon) -및 라이신 잔기의 알파-아미노 그룹에 붙을 수 있으며, 그 뒤 본 발명의 펩티드에 연결될 수 있다. 상기 리피드 펩티드는 그런 다음 리포솜에 결합되거나, 또는 보조제에 유화되어 미셀(micelle) 또는 입자(particle)로 직접적으로 투여될 수 있다. CTLs 반응의 리피드 제조의 또 다른 예로서, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지질단백질은 적절한 펩티드에 공유 결합되었을 때, CTL을 개시하는데 사용될 수 있다(예를 들면, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4 참조).

투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 등, 및 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여할 수 있다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들면, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.

(2) 유효 성분으로서 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물

또한, 상기 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 발현할 수 있는 형태의 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 여기서, 상기 구문 "발현할 수 있는 형태"는 상기 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되었을 때, 항종양 면역력을 유도하는 폴리뉴클레오티드로서 생체 내(in vivo)에서 발현할 수 있음을 의미한다. 예시된 실시예에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 조절 요소(regulatory element)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드(들)는 표적 세포의 게놈 내에 안정적으로 삽입되기 위하여 구비될 수 있다(예를 들면, 상동성 재조합 카세트 벡터에 대한 기술을 위한 Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 참조). 예를 들면, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; 미국 특허 제 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720을 참조한다. DNA 기반한 전달 기술의 예로는 "네이키드 DNA(naked DNA)", 촉진된(부피바카인(bupivacaine), 폴리머(polymer), 펩티드-매개) 전달, 양이온성 지질 복합체, 및 입자-매게("유전자 총(gene gun)") 또는 압력-매개 전달(예를 들면, 미국 출원 제 5,922,687호 참조)을 포함한다.

또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해서 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예는 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은, 예를 들면, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터와 같은, 백시니아 바이러스의 이용을 수반한다. 숙주에 도입한 후, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 상기 면역원성 펩티드를 발현하고, 이로 인하여 면역 반응이 유발된다. 면역화 프로토콜에 있어서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예를 들면, 미국 특허 제 4,722,848호에 기재된다. 또 다른 벡터의 예로 BCG(Bacille Calmette Guerin)를 포함한다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재된다. 치료학적 투여 또는 면역화에 유용한 다양한 다른 벡터, 예를 들면, 아데노(adeno) 및 아데노 관련(adeno-associated) 바이러스 벡터, 레트로바이러스(retroviral) 벡터, 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 벡터, 무독화시킨 탄저균 독소(detoxified anthrax toxin) 벡터 등이 명백할 것이다. 예를 들면, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85를 참조한다.

폴리뉴클레오티드의 개체로의 전달은, 상기 개체가 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 직접적으로 노출시키는 직접적, 또는 세포가 우선 시험관 내에서 관심있는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 형질전환된 후, 상기 세포를 개체에게 이식하는 간접적으로 이루어질 수 있다. 이러한 두 가지 접근은 각각 생체 내(in vivo) 및 생체 외(ex vivo) 유전자 치료법으로서 알려져 있다.

유전자 치료 방법에 대한 일반적인 리뷰는, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215를 참조한다. 본 발명에서 또한 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야의 일반적으로 알려진 방법은 eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; 및 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990에 기재된다.

투여의 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사 등을 할 수 있으며, 표적 위치에 근접한 곳에 전신 투여 또는 국소 투여의 용도를 발견한다. 상기 투여는 단일 투여 또는 다수의 투여에 의해서 부스팅되어 수행될 수 있다. 적합한 수용체 내 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 양은 치료되는 질병, 환자의 나이, 체중, 투여 방법 등에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 보통 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎이며, 예를 들면, 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎이며, 며칠 내지 몇 달에 한 번씩 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 복용량을 적절하게 선택할 수 있다.

X. 펩티드, 엑소솜 , APCs 및 CTLs 을 사용한 방법

본 발명의 펩티드 및 이러한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 APCs 및 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 APCs는 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APCs는 화합물이 이들의 CTL 유도성을 억제하지 않는 한, 임의의 다른 화합물과 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 언급한 임의의 약학적 제제 또는 조성물은 CTLs을 유도하는데 사용될 수 있으며, 이에 추가적으로, 상기 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 제제 또는 조성물은 또한 하기 기재된 APCs를 유도하는데 사용될 수 있다.

(1) 항원 제시 세포(APCs)를 유도하는 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 APCs를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 APCs의 유도는 "VI. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다. 또한, 본 발명은 높은 수준의 CTL 유도성을 갖는 APCs를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 유도성은 또한 "VI. 항원 제시 세포"의 항목하에 언급되었다.

바람직하게는, APCs를 유도하는 방법은 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 포함한다:

a: 본 발명의 펩티드와 APCs를 접촉하는 단계, 및

b: 발현할 수 있는 형태의 본 발명의 폴리펩티드를 APCs내로 도입하는 단계.

이러한 APCs를 유도하는 방법은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)로 수행되는 것이 바람직하다. 시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo)에서 상기 방법을 수행할 때, 유도되는 APCs는 처리한 개체 또는 HLA 항원이 상기 개체와 같은 다른 개체로부터 수득될 수 있다.

(2) CTLs을 유도하는 방법

더욱이, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 또는 상기 펩티드를 제시하는 APCs를 사용하여 CTLs을 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 세포 표면에서 상기 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CTLs을 유도하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, CTLs을 유도하는 방법은 하기로부터 선택되는 적어도 하나의 단계를 포함한다:

a: CD8-양성 T 세포를 HLA 항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 항원 제시 세포 및/또는 엑소솜과 접촉하는 단계, 및

b. 본 발명의 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 인식하는 TCR 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 T 세포내로 도입하는 단계.

본 발명의 펩티드를 개체에 투여하였을 때, CTLs은 개체의 체내에서 유도되며, 상기 종양 세포를 표적하는 면역 반응의 힘을 강화시킨다. 대안적으로, 상기 펩티드 및 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 생체 외(ex vivo) 치료 방법으로 사용될 수 있으며, 이는 개체 유래 APCs 및 CD8-양성 세포, 또는 말초혈액 단핵구 백혈구를 시험관 내에서 본 발명의 펩티드를 이용하여 접촉(자극)하고, CTL을 유도한 후, 상기 활성화된 CTL 세포는 개체로 돌아온다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APCs를 수집하는 단계;

b: 단계 a의 APCs와, 상기 펩티드를 접촉시키는 단계;

c: 단계 b의 APCs와 CD⁸ ⁺T 세포를 혼합하고, CTLs을 유도하기 위하여 공동 배양하는 단계; 및

d: 단계 c의 공동 배양으로부터 CD⁸ ⁺ T 세포를 수집하는 단계.

대안적으로, 본 발명에 따르면, CTLs을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드의 용도가 제공된다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 수용체를 함께 혼합하거나 제형화하는 단계를 포함한, CTLs을 유도하는 약학적 제제 또는 조성물을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 또한 CTLs을 유도하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 단계 d에 의해 수득된 세포독성 활성을 갖는 상기 CD⁸ ⁺ T 세포는 백신으로서 개체에 투여될 수 있다. 또한, 상기 단계 c에서 상기 CD⁸ ⁺ T 세포와 혼합된 APCs는 상기 "VI. 항원 제시 세포" 부분에 기재된 바와 같이, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자를 APCs 내로 전이시킴으로써 제조될 수 있으나; 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 효과적으로 제시하는 임의의 APCs 또는 엑소솜들은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하고, 당업자가 이를 만들고 사용하는 것을 도와주기 위하여 제시된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 어느 방법으로든 한정하려는 의도가 아니다.

실시예

재료 및 방법

세포주

A24 림포블라스토이드 세포주(A24 lymphoblastoid cell line, A24LCL)는 엡스테인 바(Epstein-bar) 바이러스를 HLA-A24 양성 인간 B 림프구에 형질전환함으로써 확립하였다. T2(HLA-A2), 인간 B-립포블라스토이드 세포주, 및 COS7은 ATCC에서 구입하였다.

MELK 로부터 유래된 펩티드의 후보자 선택

HLA-A*2402 및 HLA-A*0201 분자에 결합하는 MELK로부터 유래된 9머(9-mer) 및 10-머(10-mer) 펩티드는 결합 예측 소프트웨어 "BIMAS"(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)를 사용하여 측정되었으며, 이 알고리즘은 Parker KC et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75) 및 Kuzushima K et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)에 기재되어 있다. 이러한 펩티드는 표준 고체상 합성 방법에 따라 Sigma(Sapporo, Japan) 또는 Biosynthesis Inc.(Lewisville, TX)에 의해서 합성되었으며, 역상 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatographym, HPLC)에 의해서 정제되었다. 상기 펩티드의 순도(>90%) 및 동정은 각각 분석적인 HPLC 및 질량분석법 분석에 의하여 측정되었다. 펩티드는 20 mg/㎖ 디메틸폭시화물(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 뒤 -80℃에 보관하였다.

시험관 내( In vitro ) CTL 유도

단핵구 유래 수지상 세포(DCs)는 인간 백혈구 항원(HLA)에 제시된 펩티드에 대하여 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도하기 위하여, 항원 지시 세포(APCs)로서 사용되었다. DCs는 하기 기재된 바와 같이 시험관 내에서 생성되었다(Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). 구체적으로, 정상 지원자(HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201 양성)로부터 피콜-플라크(Ficoll-Plaque)(Pharmacia) 용액에 의해서 분리된 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)는 단핵구 분획을 강화시키기 위하여, 플라스틱 조직 배양 디쉬(Becton Dickinson)에 부착에 의해서 분리하였다. 상기 단핵구가 강화된 집단은 2% 열-불활성화 자가조직 유래의 혈청(AS)을 포함하는 AIM-V 배지(Invitrogen)에서 과립구-대식세포 콜리니-자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)(R&D System) 1000 U/㎖ 및 인터루킨(interleukin, IL)-4(R&D System) 1000 U/㎖의 존재하에 배양되었다. 배양 7일 후, 상기 사이토카인 유도된 DCs는 37℃에서 3시간 동안 베타 2-마이크로불린(beta2-microglobulin) 3 마이크로그램/㎖의 존재하에 AIM-V 배지에서 20 마이크로그램/㎖의 각각의 합성된 펩티드를 사용하여 펄스되었다. 상기 생성된 세포는 이러한 세포의 표면에, CD80, CD83, CD86 및 HLA 클래스 Ⅱ와 같은 DC-관련된 분자를 발현한다고 나타났다(결과는 보이지 않음). 그리고 이러한 펩티드 펄스된 DCs는 미토마이신 C(Mitomycin C, MMC)(30분 동안 30 마이크로그램/㎖)에 의해서 비활성화되었으며 CD8 양성 분리 키트(Dynal)를 이용한 양성 선택에 의해서 획득된, 자가 조직의 CD8+ T 세포와 1:20의 비율로 혼합되었다. 이러한 배양은 48-웰 플레이트(Corning)에 셋팅되었다; 각각의 웰에는 1.5 × 10⁴ 펩티드 펄스된 DCs, 3 × 10⁵ CD8+ T 세포 및 10 ng/㎖ IL-7(R&D System)이 있는 0.5 ㎖ AIM-V/2% AS 배지가 포함되었다. 3일이 지난 후, 이러한 배양은 최종 농도가 20 IU/㎖이 되도록 IL-2(CHIRON)을 첨가하였다. 7일 및 14일에, 상기 T 세포는 상기 자가의 펩티드 펄스된 DCs를 사용하여 추가적으로 자극되었다. 상기 DCs는 상기 기재된 방법에 의해서 매번 제조되었다. CTL은 21일째 펩티드 자극 3회 이후, 펩티드 펄스된 A24LCL 또는 T2 세포에 대하여 실험하였다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

CTL 증폭 과정

CTLs은 Riddell et al.에 의해서 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여, 배양액에서 증폭되었다(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). 전체 5 × 10⁴CTLs은 항-CD3 단일클론 항체(Pharmingen) 40 ng/㎖의 존재하에서, MMC에 의해서 비활성화된 2 종류의 인간 B-림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주를 이용하여 AIM-V/5% AS 배지 25 ㎖에 현탁하였다. 상기 배양 시작 이후 첫째 날, IL-2 120 IU/㎖을 상기 배양액에 첨가하였다. 상기 배양액은 5, 8 및 11일에, IL-2 30 IU/㎖을 포함하는 신선한 AIM-V/5% AS 배지가 공급되었다(Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

CTL 클론의 확립

96 둥근 바닥 마이크로 타이터 플레이트(96 round-bottomed micro titer plate)(Nalge Nunc International)에 0.3, 1, 및 3 CTLs/웰이 되도록 희석하였다. CTLs은 5% AS가 포함된 총 150 micro l/웰의 AIM-V 배지에서 1 × 10⁴세포수/웰의 2 종류의 인간 B-림포블라스토이드 세포주, 항-CD3 항체 30 ng/㎖ 및 IL-2 125 U/㎖과 함께 배양하였다. 125 U/㎖ IL-2로 최종 농도를 맞추기 위하여 10일 뒤 50 micro l/웰의 IL-2를 상기 배지에 첨가하였다. CTL 활성은 14일째 날에 측정하였고, CTL 클론은 상기 기재된 같은 방법을 사용하여 증폭하였다(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506).

특이적 CTL 활성

특이적 CTL 활성을 검사하기 위하여, 인터페론(IFN)-감마 효소-결합 면역스팟(ELISPOT) 분석 및 IFN-감마 효소-결합 면역흡착검사(ELISA)를 수행하였다. 구체적으로, 펩티드 펄스된 A24LCL 또는 T2(1 × 10⁴/웰)는 자극(stimulator) 세포로서 제조되었다. 48 웰에서 배양된 세포는 반응(responder) 세포로서 사용되었다. IFN-감마 ELISPOT 분석 및 IFN-감마 ELISA 분석은 제조사의 과정에 따라 수행되었다.

결과

암에서 과발현

cDNA 마이크로어레이를 이용한 다양한 암으로부터 얻어진 광범위한 유전자 발현 프로필은 MELK(GenBank Accession No. NM_014791; 서열번호 93)의 발현이 증가한다는 것을 나타낸다. MELK 발현은 상응하는 정상 조직과 비교하여, 방광암 29종 중 29종, 유방암 34종 중 31종, 자궁경부암 15종 중 14종, 담관세포성 암종 11종 중 11종, CML 13종 중 10종, 대장암 15종 중 12종, 자궁내막중 2종 중 2종, 식도암 42종 중 19종, 위암 6종 중 5, 간암 4종 중 4, NSCLC 11종 중 11종, 림프종 14종 중 13종, 골육종 18종 중 14종, 난소암 6종 중 3종, 췌장암 2종 중 2종, 전립선암 21종 중 18종, 신장 암종 6종 중 5종, 소세포폐암 15종 중 15종에서 유효하게 증가하였다(표 1).

MELK 로부터 유래된 HLA -A24 및 HLA -A2 결합 펩티드의 예측

표 2 내지 4는 MELK의 HLA-A24 및 HLA-A2 결합 펩티드를 높은 결합 친화성 순서대로 나타낸다.에피토프 펩티드를 결정하기 위하여 잠재적인 HLA-A24 결합 활성을 갖는 총 34개의 펩티드들이 선별 및 검사되었고(표 2), 에피토프 펩티드를 결정하기 위하여 잠재적인 HLA-A2 결합 활성을 갖는 총 58개의 펩티드들이 유사하게 선별 및 검사되었다(표 3 및 4).

HLA -A*2402 또는 HLA -A*0201에 의해 제한된 MELK 로부터 예측되는 펩티드에 의한 CTL 유도 및 MELK 유래 펩티드로 자극된 CTL 라인 확립

이러한 MELK로부터 유래된 펩티드에 대한 CTL은 "재료 및 방법"에 기재된 프로토콜에 따라 생성되었다. 펩티드 특이적 CTL 활성은 IFN-감마 ELISPOT 분석(도 1a~i)에 의해 결정되었다. MELK-A24-9-326(서열번호: 14)로 자극된 #5(a), MELK-A24-9-78(서열번호: 21)로 자극된 #3(b), MELK-A24-10-637(서열번호: 23)로 자극된 #4(c), MELK-A24-10-532(서열번호: 27)로 자극된 #4(d), MELK-A02-9-138(서열번호: 36)로 자극된 #5(e), MELK-A02-9-193(서열번호: 46)로 자극된 #3(f), MELK-A02-9-171(서열번호: 57)로 자극된 #1(g), MELK-A02-9-71(서열번호: 60)로 자극된 #2(h) 및 MELK-A02-9-532(서열번호: 62)로 자극된 #2(i)는 대조군 웰에 비하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타냄을 보였다. 더욱이, 서열번호: 14로 자극된 양성 웰 번호 #5, 서열번호:21로 자극된 #3, 서열번호: 23으로 자극된 #4, 서열번호: 27로 자극된 #4, 서열번호: 36으로 자극된 #5, 서열번호: 46으로 자극된 #3, 서열번호: 57로 자극된 #1, 서열번호: 60으로 자극된 #2 및 서열번호: 62로 자극된 #2의 세포는 증폭되어 CTL 라인을 확립하였다. 상기 CTL 라인의 CTL 활성은 IFN-감마 ELISA 분석에 의해 측정되었다(도 2a~i). 모든 CTL 라인이 펩티드 펄스 하지 않은 표적 세포에 비하여, 이에 상응하는 펩티드로 펄스된 표적 세포에 대하여 강력한 IFN-감마 생성을 나타내었다. 반면에, 상기 펩티드가 HLA-A*2402 또는 HLA-A*0201과 결합 활성을 가질 가능성이 있음에도 불구하고, 표 2 내지 4에서 나타낸 다른 펩티드를 이용한 자극에 의해서는 CTL 라인이 확립되지 않았다(결과는 보여주지 않음). 결과적으로, MELK로부터 유래된 92개의 후보 펩티드 중에서 9개의 펩티드만이 강력하게 CTL 라인을 유도하였다.

MELK 특이적 펩티드에 대한 CTL 클론의 확립

CTL 클론은 "재료 및 방법"에 기재된 CTL 라인으로부터 제한적인 희석에 의해 확립되었고, 펩티드가 펄스된 표적 세포에 대한 CTL 클론으로부터 IFN-감마의 생성은 IFN-감마 ELISA 분석에 의해 측정되었다. 강력한 IFN-감마 생성이 도 3에서 서열번호: 27로 자극된 CTL 클론으로부터 결정되었다.

MELK 및 HLA -A* 0201를 내인성으로 발현하는 상기 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대한 특이적 CTL 활성

이러한 펩티드에 대해 발생한 상기 확립된 CTL 라인을 MELK 및 HLA-A*0201 분자를 내인성으로 발현하는 후보 펩티드를 제시하는 표적 세포를 인식하는 그들의 능력에 대해 검사하였다. 전장의 MELK 및 HLA-A*0201 분자 유전자(MELK 및 HLA-A*0201 유전자를 발현하는 표적 세포에 대한 특이적 모델) 모두를 형질감염시킨 COS7 세포에 대한 특이적 CTL 활성은 상응하는 펩티드에 의해 발생된 CTL 라인을 이펙터 세포로 사용하여 시험하였다. 전장의 MELK 유전자 또는 HLA-A*0201 중 하나로 형질감염된 COS7 세포는 대조군으로써 제작되었다. 도 4에 있어서, 서열번호: 36(a) 및 서열번호: 57(b)로 자극된 CTLs은 MELK 및 HLA-A02를 모두 발현하는 COS7 세포에 대한 강력한 CTL 활성을 나타냈다. 반면에, 상기 대조군에 대해서는 유의적인 특이적 CTL 활성이 검출되지 않았다. 따라서, 이러한 데이터는 서열번호: 36 및 서열번호: 57의 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 HLA-A*0201 분자와 함께 표적 세포에서 자연적으로 제시되고 상기 CTLs에 의해 인식된다는 것을 명확하게 나타낸다. 상기 결과는 MELK로부터 유래된 이러한 두 개의 펩티드가 MELK가 발현되는 종양을 갖는 환자에 대한 암 백신으로 적용하기에 유용할 것임을 나타낸다.

항원 펩티드의 상동성 분석

MELK-A24-9-326(서열번호: 14), MELK-A24-9-78(서열번호: 21), MELK-A24-10-637(서열번호: 23), MELK-A24-10-532(서열번호: 27), MELK-A02-9-138(서열번호: 36), MELK-A02-9-193(서열번호: 46), MELK-A02-9-171(서열번호: 57), MELK-A02-9-71(서열번호: 60) 및 MELK-A02-9-532(서열번호: 62)으로 자극된 CTLs은 유의적이고 특이적인 CTL 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 MELK-A24-9-326(서열번호: 14), MELK-A24-9-78(서열번호: 21), MELK-A24-10-637(서열번호: 23), MELK-A24-10-532(서열번호: 27), MELK-A02-9-138(서열번호: 36), MELK-A02-9-193(서열번호: 46), MELK-A02-9-171(서열번호: 57), MELK-A02-9-71(서열번호: 60) 및 MELK-A02-9-532(서열번호: 62)의 서열이 인간 면역 체계를 민감하게 하는 것으로 알려진 다른 분자로부터 유래된 펩티드와 상동적인 사실 때문일 수 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위하여, 상동성 분석은 이러한 펩티드 서열에 대하여 유의한 상동성을 가진 서열이 없다는 것을 밝힌 BLAST 알고리즘(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)을 쿼리(query)로 사용하여 수행하였다. 이러한 상동성 분석의 결과는 MELK-A24-9-326(서열번호: 14), MELK-A24-9-78(서열번호: 21), MELK-A24-10-637(서열번호: 23), MELK-A24-10-532(서열번호: 27), MELK-A02-9-138(서열번호: 36), MELK-A02-9-193(서열번호: 46), MELK-A02-9-171(서열번호: 57), MELK-A02-9-71(서열번호: 60) 및 MELK-A02-9-532(서열번호: 62)의 서열은 유일하고, 따라서 본 출원인이 아는바, 이러한 분자들은 몇몇의 관련되지 않은 분자들에 대한 의도하지 않은 면역 반응을 유발할 가능성이 거의 없다는 것을 의미한다.

결과적으로, MELK로부터 유래된 신규한 HLA-A24 및 HLA-A02 에피토프 펩티드가 동정되었으며, 암 면역 치료법으로서 활용될 수 있다는 것을 증명하였다.

본 발명은 신규한 TAAs에 대해서 기술하고 있으며, 구체적으로 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도하고 다양한 암 형태에 적용가능한 MELK로부터 유래한 TAAs에 대해서 기술하고 있다. 이러한 TAAs는 또한 예를 들면, 암, 보다 구체적으로, 유방암, 방광암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, CML, 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, NSCLC, 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 SCC와 같은, MELK와 관련된 질환에 대한 펩티드 백신으로서 개발을 정당화한다.

본 발명은 명세서에서 상세하고, 이의 특이적인 실시예를 참조로 기재되어 있으나, 앞서 기술한 설명은 본질적으로 예시 및 설명이며, 본 발명과 이의 바람직한 실시예를 예시하는 바로 이해될 수 있다. 일반적인 실험을 통해, 당업자는 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있으며, 본 발명의 목적 및 한계는 첨부된 청구항에 의해서 정의된다는 것을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> MELK EPITOPE PEPTIDES AND VACCINES CONTAINING THE SAME <130> 11fpi-01-03 <150> US 61/085,663 <151> 2008-08-01 <150> PCT/JP2009/003630 <151> 2009-07-30 <160> 94 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 1 Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 2 Asp Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 3 His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 4 Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 5 Lys Tyr Tyr Glu Leu His Glu Thr Ile 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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Asn Pro Phe Ile 1 5 10 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 91 Trp Val Tyr Lys Arg Leu Val Glu Asp Ile 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide <400> 92 Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr Thr Thr 1 5 10 <210> 93 <211> 2501 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (139)..(2091) <400> 93 cgaaaagatt cttaggaacg ccgtaccagc cgcgtctctc aggacagcag gcccctgtcc 60 ttctgtcggg cgccgctcag ccgtgccctc cgcccctcag gttctttttc taattccaaa 120 taaacttgca agaggact atg aaa gat tat gat gaa ctt ctc aaa tat tat 171 Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr 1 5 10 gaa tta cat gaa act att ggg aca ggt ggc ttt gca aag gtc aaa ctt 219 Glu Leu His Glu Thr Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu 15 20 25 gcc tgc cat atc ctt act gga gag atg gta gct ata aaa atc atg gat 267 Ala Cys His Ile Leu Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp 30 35 40 aaa aac aca cta ggg agt gat ttg ccc cgg atc aaa acg gag att gag 315 Lys Asn Thr Leu Gly Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu 45 50 55 gcc ttg aag aac ctg aga cat cag cat ata tgt caa ctc tac cat gtg 363 Ala Leu Lys Asn Leu Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val 60 65 70 75 cta gag aca gcc aac aaa ata ttc atg gtt ctt gag tac tgc cct gga 411 Leu Glu Thr Ala Asn Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly 80 85 90 gga gag ctg ttt gac tat ata att tcc cag gat cgc ctg tca gaa gag 459 Gly Glu Leu Phe Asp Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu 95 100 105 gag acc cgg gtt gtc ttc cgt cag ata gta tct gct gtt gct tat gtg 507 Glu Thr Arg Val Val Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val 110 115 120 cac agc cag ggc tat gct cac agg gac ctc aag cca gaa aat ttg ctg 555 His Ser Gln Gly Tyr Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu 125 130 135 ttt gat gaa tat cat aaa tta aag ctg att gac ttt ggt ctc tgt gca 603 Phe Asp Glu Tyr His Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala 140 145 150 155 aaa ccc aag ggt aac aag gat tac cat cta cag aca tgc tgt ggg agt 651 Lys Pro Lys Gly Asn Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser 160 165 170 ctg gct tat gca gca cct gag tta ata caa ggc aaa tca tat ctt gga 699 Leu Ala Tyr Ala Ala Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly 175 180 185 tca gag gca gat gtt tgg agc atg ggc ata ctg tta tat gtt ctt atg 747 Ser Glu Ala Asp Val Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met 190 195 200 tgt gga ttt cta cca ttt gat gat gat aat gta atg gct tta tac aag 795 Cys Gly Phe Leu Pro Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys 205 210 215 aag att atg aga gga aaa tat gat gtt ccc aag tgg ctc tct ccc agt 843 Lys Ile Met Arg Gly Lys Tyr Asp Val Pro Lys Trp Leu Ser Pro Ser 220 225 230 235 agc att ctg ctt ctt caa caa atg ctg cag gtg gac cca aag aaa cgg 891 Ser Ile Leu Leu Leu Gln Gln Met Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Arg 240 245 250 att tct atg aaa aat cta ttg aac cat ccc tgg atc atg caa gat tac 939 Ile Ser Met Lys Asn Leu Leu Asn His Pro Trp Ile Met Gln Asp Tyr 255 260 265 aac tat cct gtt gag tgg caa agc aag aat cct ttt att cac ctc gat 987 Asn Tyr Pro Val Glu Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe Ile His Leu Asp 270 275 280 gat gat tgc gta aca gaa ctt tct gta cat cac aga aac aac agg caa 1035 Asp Asp Cys Val Thr Glu Leu Ser Val His His Arg Asn Asn Arg Gln 285 290 295 aca atg gag gat tta att tca ctg tgg cag tat gat cac ctc acg gct 1083 Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp His Leu Thr Ala 300 305 310 315 acc tat ctt ctg ctt cta gcc aag aag gct cgg gga aaa cca gtt cgt 1131 Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly Lys Pro Val Arg 320 325 330 tta agg ctt tct tct ttc tcc tgt gga caa gcc agt gct acc cca ttc 1179 Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe 335 340 345 aca gac atc aag tca aat aat tgg agt ctg gaa gat gtg acc gca agt 1227 Thr Asp Ile Lys Ser Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser 350 355 360 gat aaa aat tat gtg gcg gga tta ata gac tat gat tgg tgt gaa gat 1275 Asp Lys Asn Tyr Val Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp 365 370 375 gat tta tca aca ggt gct gct act ccc cga aca tca cag ttt acc aag 1323 Asp Leu Ser Thr Gly Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys 380 385 390 395 tac tgg aca gaa tca aat ggg gtg gaa tct aaa tca tta act cca gcc 1371 Tyr Trp Thr Glu Ser Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala 400 405 410 tta tgc aga aca cct gca aat aaa tta aag aac aaa gaa aat gta tat 1419 Leu Cys Arg Thr Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr 415 420 425 act cct aag tct gct gta aag aat gaa gag tac ttt atg ttt cct gag 1467 Thr Pro Lys Ser Ala Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu 430 435 440 cca aag act cca gtt aat aag aac cag cat aag aga gaa ata ctc act 1515 Pro Lys Thr Pro Val Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr 445 450 455 acg cca aat cgt tac act aca ccc tca aaa gct aga aac cag tgc ctg 1563 Thr Pro Asn Arg Tyr Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu 460 465 470 475 aaa gaa act cca att aaa ata cca gta aat tca aca gga aca gac aag 1611 Lys Glu Thr Pro Ile Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys 480 485 490 tta atg aca ggt gtc att agc cct gag agg cgg tgc cgc tca gtg gaa 1659 Leu Met Thr Gly Val Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu 495 500 505 ttg gat ctc aac caa gca cat atg gag gag act cca aaa aga aag gga 1707 Leu Asp Leu Asn Gln Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly 510 515 520 gcc aaa gtg ttt ggg agc ctt gaa agg ggg ttg gat aag gtt atc act 1755 Ala Lys Val Phe Gly Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr 525 530 535 gtg ctc acc agg agc aaa agg aag ggt tct gcc aga gac ggg ccc aga 1803 Val Leu Thr Arg Ser Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg 540 545 550 555 aga cta aag ctt cac tat aat gtg act aca act aga tta gtg aat cca 1851 Arg Leu Lys Leu His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro 560 565 570 gat caa ctg ttg aat gaa ata atg tct att ctt cca aag aag cat gtt 1899 Asp Gln Leu Leu Asn Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val 575 580 585 gac ttt gta caa aag ggt tat aca ctg aag tgt caa aca cag tca gat 1947 Asp Phe Val Gln Lys Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp 590 595 600 ttt ggg aaa gtg aca atg caa ttt gaa tta gaa gtg tgc cag ctt caa 1995 Phe Gly Lys Val Thr Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln 605 610 615 aaa ccc gat gtg gtg ggt atc agg agg cag cgg ctt aag ggc gat gcc 2043 Lys Pro Asp Val Val Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala 620 625 630 635 tgg gtt tac aaa aga tta gtg gaa gac atc cta tct agc tgc aag gta 2091 Trp Val Tyr Lys Arg Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val 640 645 650 taattgatg gattcttcca tcctgccgga tgagtgtggg tgtgatacag cctacataaa 2150 gactgttatg atcgctttga ttttaaagtt cattggaact accaacttgt ttctaaagag 2210 ctatcttaag accaatatct ctttgttttt aaacaaaaga tattattttg tgtatgaatc 2270 taaatcaagc ccatctgtca ttatgttact gtctttttta atcatgtggt tttgtatatt 2330 aataattgtt gactttctta gattcacttc catatgtgaa tgtaagctct taactatgtc 2390 tctttgtaat gtgtaatttc tttctgaaat aaaaccattt gtgaatataa aaaaaaaaaa 2450 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2501 <210> 94 <211> 651 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr Glu Leu His Glu Thr 1 5 10 15 Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Cys His Ile Leu 20 25 30 Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asn Thr Leu Gly 35 40 45 Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Asn Leu 50 55 60 Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val Leu Glu Thr Ala Asn 65 70 75 80 Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly Gly Glu Leu Phe Asp 85 90 95 Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu Glu Thr Arg Val Val 100 105 110 Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val His Ser Gln Gly Tyr 115 120 125 Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Asp Glu Tyr His 130 135 140 Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala Lys Pro Lys Gly Asn 145 150 155 160 Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser Leu Ala Tyr Ala Ala 165 170 175 Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ala Asp Val 180 185 190 Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe Leu Pro 195 200 205 Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Met Arg Gly 210 215 220 Lys Tyr Asp Val Pro Lys Trp Leu Ser Pro Ser Ser Ile Leu Leu Leu 225 230 235 240 Gln Gln Met Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Arg Ile Ser Met Lys Asn 245 250 255 Leu Leu Asn His Pro Trp Ile Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val Glu 260 265 270 Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val Thr 275 280 285 Glu Leu Ser Val His His Arg Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp Leu 290 295 300 Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu 305 310 315 320 Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser Ser 325 330 335 Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser 340 345 350 Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr Val 355 360 365 Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr Gly 370 375 380 Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu Ser 385 390 395 400 Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr Pro 405 410 415 Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser Ala 420 425 430 Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro Val 435 440 445 Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr 450 455 460 Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro Ile 465 470 475 480 Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly Val 485 490 495 Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn Gln 500 505 510 Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe Gly 515 520 525 Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg Ser 530 535 540 Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu His 545 550 555 560 Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu Asn 565 570 575 Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln Lys 580 585 590 Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp Phe Gly Lys Val Thr 595 600 605 Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln Lys Pro Asp Val Val 610 615 620 Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala Trp Val Tyr Lys Arg 625 630 635 640 Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val 645 650

Claims

서열번호: 36, 46, 57, 60 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 세포독성 T 림프구(CTL) 유도성을 갖는 15 개 아미노산 미만의 분리된 펩티드.
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서열번호: 36, 46, 57, 60 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 세포독성 T 림프구(CTL) 유도성을 갖는 15 개 아미노산 미만의 분리된 펩티드에 있어서, 상기 펩티드는 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 가지는 것을 특징으로 하는 펩티드:
(a) 서열번호: 36, 46, 57, 60 또는 62의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 류신(leucine) 또는 메티오닌(methionine)으로 치환, 및
(b) 서열번호: 36, 46, 57, 60 또는 62의 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 발린(valine) 또는 류신(leucine)으로 치환.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호: 36, 46, 57, 60 및 62로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 활성 성분을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술후 재발의 예방용 약학적 조성물:
(a) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 하나 이상의 펩티드;
(b) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 펩티드를 발현가능한 형태로 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드;
(c) HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는, 하나 이상의 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜;
(d) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드에 대해 유도된 하나 이상의 CTL ; 및
(e) 이의 조합.
제 8항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 HLA 항원이 HLA-A02인 개체에 투여하기 위해 제형화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, 만성 골수성 백혈병(CML), 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, 비소세포폐암 (NSCLC), 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 치료를 위해 제형화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 백신으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드와 항원-제시 세포를 접촉하는 단계, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현가능한 형태로 항원-제시 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro)에서 높은 CTL 유도성을 갖는 항원-제시 세포를 유도하는 방법.
제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드를 이용하여 시험관 내에서 CTL을 유도하는 방법.
하기로 구성된 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 시험관 내에서 CTL을 유도하는 방법:
(a) HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜을 CD8-양성 T 세포에 접촉시키는 단계; 및
(b) HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 인지하는 TCR 써브유닛(subunit)을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8-양성 T 세포내로 도입하는 단계.
제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 펩티드를 표적화하는 분리된 CTL.
제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드에 의해 유도되는 분리된 CTL.
제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 펩티드를 표적하거나, 또는 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드에 의해 유도되는 CTL로서, 상기 CTL은 세포에서 HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 인식하는 CTL.
제 16항에 있어서, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 방법에 의해 유도되는, CTL:
(a) CD8-양성 T 세포를 HLA 항원과 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드의 복합체를 그 표면에 제시하는 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜과 접촉시키는 단계; 및
(b) HLA 항원과 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 인식하는 TCR 서브유닛을 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계.
HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면으로 제시하는 분리된 항원-제시 세포.
HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면으로 제시하는 분리된 항원-제시 세포로서, 상기 항원-제시 세포는 상기 펩티드와 항원-제시 세포를 접촉시키는 단계, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현가능한 형태로 항원-제시 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro)에서 높은 CTL 유도성을 갖는 항원-제시 세포를 유도하는 방법에 의해 유도된 것인 항원-제시 세포.
제 19항에 있어서, 상기 항원-제시 세포는 HLA 항원이 HLA-A02인 것을 특징으로 하는 항원-제시 세포.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 활성 성분을 개체 내 암에 대한 면역 반응 유도용 조성물의 제조에 이용하는 방법:
(a) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 하나 이상의 펩티드;
(b) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 펩티드를 발현가능한 형태로 암호화하는 하나 또는 다수의 폴리뉴클레오티드;
(c) HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는, 하나 이상의 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜;
(d) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나로 기재되는 펩티드에 대해 유도된 하나 또는 다수의 CTL; 및
(e) 이의 조합.
제 22항에 있어서, 상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관세포성 암종, CML, 대장암, 자궁내막증, 식도암, 위암, 간암, NSCLC, 림프종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 암종 및 소세포폐암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 개체는 HLA-A02를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 활성 성분을 포함하는, 시험관내에서 CTL을 유도하기 위한 조성물:
(a) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 하나 이상의 펩티드;
(b) 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드를 발현가능한 형태로 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드;
(c) HLA 항원 및 제 1항, 제 5항 또는 제 6항의 어느 하나의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는, 하나 이상의 다수의 항원-제시 세포 및/또는 엑소솜.