MX2011001194A - Peptidos de epitope melk y vacunas que contienen los mismos. - Google Patents
Peptidos de epitope melk y vacunas que contienen los mismos.Info
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Abstract
De acuerdo con la presente invención, se demostró que los péptidos que tienen una secuencia de aminoácido de las SEC ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62 tienen inducibilidad de linfocito T citotóxica (CTL). Por consiguiente, la presente invención proporciona un péptido que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada de entre las SEC ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62. El péptido puede incluir, una, dos o diversas sustituciones, eliminaciones, inserciones, o adiciones de aminoácidos siempre que se retenga su inducibilidad CTL. Además, la presente invención proporciona agentes farmacéuticos para el tratamiento y/o profilaxis de cánceres, y/o prevención de recurrencia post-operatoria de los mismos, en donde los agentes farmacéuticos contienen cualesquiera de estos péptidos. Los agentes farmacéuticos de la presente invención incluyen vacunas.
Description
PÉPTIDOS DE EPÍTOPE MELK Y VACUNAS QUE CONTIENEN
LOS MISMOS
Campo de la Invención
La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud
Provisional Norteamericana No. 61/085,663, presentada el 1 de Agosto de 2008, cuyos contenidos totales están incorporados a la presente invención como referencia.
La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de la terapia de cáncer. En particular, la presente invención se refiere a péptidos novedosos que son extremadamente efectivos como vacunas de cáncer, y fármacos para tratar y prevenir tumores.
Antecedentes de la Invención
Se ha demostrado que los CTLs positivos CD8 reconocen péptidos de epítope derivados de los antígenos asociados con tumor (TAAs) encontrados en moléculas clase I del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), y posteriormente aniquilan las células de tumor. Desde el descubrimiento de la familia del antígeno de melanoma (MAGE) como el primer ejemplo de TAAs, se han descubierto muchos otros TAAs, principalmente a través de métodos inmunológicos (Boon T, Int J Cáncer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Algunos de estos TAAs, están pasando actualmente por desarrollo clínico como objetivos
inmunoterapéuticos.
La identificación de nuevos TAAs con la capacidad de inducir potentes respuestas inmune antitumor y específicas, garantiza el desarrollo adicional y aplicación clínica de estrategias de vacunación de péptido para diversos tipos de cáncer (Harris CC, J Nati Cáncer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH y asociados, Cáncer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL y asociados, Cáncer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH y asociados, J Immunol 1996 Mayo 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F y asociados, Cáncer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T y asociados, Int J Cáncer 1999 Enero 18, 80(2): 169-72; Kikuchi y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): 459-66; Oiso M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): 387-94). Hasta la fecha, han habido diversos reportes de pruebas clínicas que utilizan estos péptidos derivados de antígeno asociados con tumor. Desafortunadamente, se ha observado únicamente un bajo rango de respuesta objetivo en estas pruebas de vacuna de cáncer (Belli F y asociados, J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG y asociados, Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA y asociados, Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).
Recientemente, se han desarrollado algoritmos para anticipar las secuencias de péptido de enlace HLA clase I (Journal of Immunological Methods, (1995), Vol.185, pp.181-
190, J. Immunol., (1994), Vol.152, pp.163-175, ciencia de proteína, (2000), Vol.9, pp.1838-1846). Sin embargo, es difícil estimar si un péptido de epítope anticipado puede ser procesado naturalmente en las células objetivo y expresarse en la superficie de la célula objetivo con la molécula HLA. Además, los algoritmos, por ejemplo BI AS
(httpJ/bi mas. dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) (Parker KC, y asociados, (1994) J Immunol. ; 152(1 ):163-75.; Kuzushima K, y asociados, (2001) Blood .; 98(6): 1872-81 )) pueden indicar menos que los péptidos de enlace riguroso de molécula HLA (Bachinsky MM, y asociados, Cáncer Immun. 2005 Mar 22;5:6.). Por lo tanto, permanece como un reto y difícil, la identificación de péptidos de epítope.
MELK, cinasa de cierre de leucina embriónica materna, fue identificada previamente como un nuevo elemento de la familia de cinasas de serina-treonina snfl/AMPK, que está implicada en el desarrollo embriónico de mamífero (Heyer BS y asociados, Dev Dyn. 1999 Ago 215(4):344-51 ). El gen mostró desempeñar un papel importante en la renovación de células madre (Nakano I y asociados, J Cell Biol. 2005 Ago 1, 170(3):413-27), progreso de ciclo celular (Blot J y asociados, Dev Biol. 2002 Ene 15, 241 (2):327-38; Seong HA y asociados, Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3):597-604) y división pre-mARN (Vulsteke V y asociados, J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279( 10):8642-7. Epub 2003 Dic 29). Además, a través del análisis de perfil de
expresión genética utilizando una microformación de cADN amplio-genoma que contiene 23,040 genes, MELK mostró recientemente ser activada en cáncer de mama (Lin ML y asociados, Breast Cáncer Res. 2Ó07; 9 (1):R17, WO2006/016525, WO2008/023841 ). De hecho, MELK se activa en diversas células de cáncer, por ejemplo células de cáncer de pulmón, de vejiga, linfoma y cervical (Ver Publicaciones Internacionales WO2004/031413, WO2007/013665, y WO2006/085684, cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. El análisis de manchado Northern en múltiples tejidos humanos y las líneas de células de cáncer demostraron que MELK se sobre-expresó en un nivel significativamente alto en la gran mayoría de los cánceres de mama y líneas celulares, pero no se expresó en órganos vitales normales (corazón, hígado, pulmón y riñon) (Publicación Internacional WO2006/016525). Además, la supresión de la expresión MELK mediante siARN mostró inhibir significativamente el crecimiento de célula de cáncer de mama humano. Por consiguiente, se considera MELK como un objetivo adecuado para inmunoterapia de cáncer y los péptidos de epítope derivados de los mismos se puede esperar que sirvan como inmunoterapéuticos de cáncer efectivos en el tratamiento de una amplia variedad de tipos de cáncer.
Breve Descripción de la Invención
La presente invención está basada en parte en el
descubrimiento de objetivos adecuados de inmunoterapia. Debido a que los TAAs son percibidos generalmente por el sistema inmune como "propios" y por consiguiente, con frecuencia no tienen inmunogenicidad innata, es de extrema importancia el descubrimiento de objetivos adecuados. El reconocimiento de que MELK ha sido identificada como activada en tejidos de cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, leucemia mieloide crónica (C L), cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer renal y cáncer de pulmón de célula pequeña (SCC), la presente invención dirige su proteína de cinasa de cierre de leucina embriónica materna (MELK) (SEC ID NO: 94) codificada por el Acceso GenBank No. NM_014791 (SEC ID NO: 93), para análisis adicional. En particular, los productos de gen MELK que contienen péptidos de epítope que provocan CTLs específicos para las moléculas correspondientes fueron seleccionados para estudio. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de donadores saludables fueron estimuladas utilizando péptidos candidatos de enlace HLA-A*2402 o HLA-A*0201 derivados de MELK. Se establecieron los CTLs que reconocen específicamente células objetivo positivas HLA-A24 o HLA-A02 dirigidas dentro de los péptidos candidatos
respectivos, y se identificaron péptidos de epítope restringidos por HLA-A24 o HLA-A02 que pueden inducir respuestas inmune potentes y específicas contra MELK expresada en la superficie de células de tumor. Estos resultados demuestran que MELK es fuertemente inmunogénica y los epítopes de la misma son objetivos efectivos para inmunoterapia de tumor.
Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar péptidos que tienen inducibilidad CTL así como una secuencia de aminoácido seleccionado del grupo de SEC ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62. Además, la presente invención contempla péptidos modificados, que tienen una secuencia de aminoácido de las SEC ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 ó 62, en donde se sustituyen, eliminan, incorporan y/o agregan 1, 2 o más aminoácidos, siempre que los péptidos modificados retengan la inducibilidad CTL original.
Cuando se administran a un sujeto, los péptidos de la presente invención se presentan en la superficie de células que expresan antígeno y posteriormente inducen CTLs que dirigen los péptidos respectivos. Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar células que presentan antígeno que presentan cualesquiera de los péptidos de la presente invención, así como métodos para inducir células que presentan antígeno. Se índice una respuesta inmune anti-tumor mediante la administración de los polipéptidos MELK de la presente invención o polinucleótidos que codifican los péptidos, así como
exosomas y células que presentan antígenos que presentan los polipéptidos MELK. Por consiguiente, es aún otro objeto de la presente invención proporcionar agentes o composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos o polinucleótidos que los codifican, así como los exosomas y células que presentan antígenos como sus ingredientes activos. Los agentes farmacéuticos de la presente invención tienen uso como vacunas.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos para el tratamiento y/o profilaxis (es decir prevención) de cánceres (tumores), y/o prevención de la recurrencia post-operatoria de los mismos, así como a métodos para inducir CTLs, para inducir una respuesta inmune contra endotelio asociado con tumor y también inmunidad anti-tumor, en donde los métodos incluyen el paso de administrar los polipéptidos MELK, polinucleótidos que codifican a los polipéptidos MELK, exosomas o células que presentan antígenos que presentan los polipéptidos MELK o los agentes farmacéuticos de la presente invención. Además, los CTLs de la presente invención también tienen uso como vacunas contra cáncer. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limita a cáncer de seno, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinomas colangiocelular, CML, cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de
próstata, carcinoma renal y SCC.
Quedará entendido que tanto la breve descripción anterior como la descripción detallada que se encuentra a continuación, son modalidades de ejemplo, y no restringen a la presente invención u otras modalidades alternativas de la misma.
Breve Descripción de las Figuras
Los expertos en la técnica podrán apreciar diversos aspectos y aplicaciones de la presente invención al momento de la consideración de la breve descripción de las figuras y la descripción detallada de la presente invención y sus modalidades preferidas las cuales se encuentran más adelante.
La figura 1, incluye una serie de fotografías, (a) - (i) que ilustran los resultados del ensayo ELISPOT CTLs en IFN-gamma que fueron inducidos con péptidos derivados de MELK. Los CTLs en el depósito #5 fue estimulado con MELK-A 24-9-326 (SEC ID NO: 14) (a), #3 con M ELK-A24-9-78 (SEC ID NO: 21) (b), #4 con MELK-A24-10-637 (SEC ID NO: 23) (c), #4 con MELK-A24-10-532 (SEC ID NO: 27) (d), #5 con MELK-A02-9-138 (SEC ID NO: 36) (e), #3 con M ELK-A02-9-193 (SEC ID NO: 46) (f), #1 con MELK-A02-9-171 (SEC ID NO: 57) (g), #2 con MELK-A02-9-71 (SEC ID NO: 60), (h) y #2 con MELK-A02-9-532 (SEC ID NO: 62) (i) mostraron potente producción IFN-gamma en comparación con el control, respectivamente. Las células en los depósitos indicados con un cuadro rectangular se expandieron para establecer líneas CTL. En las figuras, " + " indica que las
células objetivo en el depósito fueron pulsadas con el péptido adecuado, y "-" indica que las células objetivos no habían sido pulsadas con ningún péptido.
La figura 2, incluye una serie de gráficas de líneas, (a) -(i), que ilustran la producción IFN-gamma de líneas CTL estimuladas con SEC ID NO: 14 (a), SEC ID NO: 21 (b), SEC ID NO: 23 (c), SEC ID NO: 27 (d), SEC ID NO: 36 (e), SEC ID NO: 46 (f), SEC ID NO: 57 (g), SEC ID NO: 60 (h) y SEC ID NO: 62 (i) con el ensayo ELISA IFN-gamma. Las líneas CTL establecidas mediante estimulación con cada péptido mostraron potente producción IFN-gamma en comparación con el control. En las figuras, " + " indica que las células objetivo fueron pulsadas con el péptido adecuado y "-" indica que las células objetivo no han sido pulsadas con ningún péptido.
La figura 3, ilustra la producción IFN-gamma del clon CTL establecida mediante dilución limitante de la línea CTL estimulada con SEC ID NO: 27. Los resultados aquí ilustrados demuestran que el clon CTL establecido mediante estimulación con SEC ID NO: 27, mostró una potente producción IFN-gamma en comparación con el control. En la figura, " + " indica que las células objetivo fueron pulsadas con SEC ID NO: 27 y "-" indica que las células objetivo no habían sido pulsadas con ningún péptido.
La figura 4, está compuesta de líneas de gráficas (a) y (b) que ilustran la actividad CTL específica de los clones CTL
establecidos con MELK-A02-9-138 (SEC ID NO:36) (a) o MELK-A02-9-171 (SEC ID NO: 57) (b) contra células objetivo que expresan en forma exógena MELK y HLA-A*0201. Las células objetivo fueron preparadas co-transfectando células COS7 con la longitud total tanto del MELK como del gen de molécula HLA-A*0201 (-rombo cerrado -), y las células objetivo de control fueron para transfectar las células COS7 células con el gen de la molécula HLA-A*0201 y pulsando con un péptido no adecuado que es diferente a los péptidos con los cuales los clones CTL fueron establecidos (-triángulo abierto-), o transf ectando célula COS7 con el gen MELK (-círculo abierto-). El clon CTL establecido con MELK -A02-9-138 (SEC ID NO: 36) (a) y MELK -A02-9-171 (SEC ID NO: 57) (b) mostró potente producción IFN-gamma contra células COS7 transfectadas tanto con MELK como con HLA-A*0201 (-rombo cerrado-) en comparación con los controles (-triángulo abierto-, -círculo abierto-).
Descripción Detallada de la Invención
Aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos en la práctica o elaboración de pruebas de las modalidades de la presente invención, a continuación se describirán los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Sin embargo, antes de que se describan los materiales y métodos de la presente invención, quedará entendido que la presente invención no se limita a los tamaños, formas, dimensiones, materiales, metodologías,
protocolos, etc. particulares aquí descritos, ya que estos pueden variar de acuerdo con la experimentación y la optimización de rutina. También quedará entendido que la terminología utilizada en la descripción es con el propósito de describir las versiones o modalidades particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, el cual será limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
La descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente mencionada en la presente especificación, se incorpora en su totalidad de manera específica como referencia en la presente invención. Sin embargo, nada de lo que se encuentra en la presente invención será construido como una admisión de que la presente invención no tiene título para anteceder dicha descripción en virtud de la invención anterior.
En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo las definiciones, tomará el control. Además los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
I. Definiciones
Las palabras "un", "uno, una", y "el, la" tal como se utiliza en la presente invención, significan "al menos uno" a menos que se especifique de otra manera.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos
se aplican a polímeros de aminoácido en donde uno o más residuos de aminoácido es un residuo modificado, o un residuo que no ocurre naturalmente, tal como un mimético químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, así como polímeros de aminoácido que ocurren naturalmente.
El término "aminoácido" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a aminoácidos sintéticos que ocurren naturalmente, así como a análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan similarmente a los aminoácidos que ocurren naturalmente. Los aminoácidos que ocurren naturalmente son los codificados por el código genético, así como los modificados después de la traducción en células (por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina). La frase "análogo de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un alfacarbono enlazado a un hidrógeno, un grupo carboxi, un grupo amino, y un grupo R) como un aminoácido que ocurre naturalmente, pero que tiene un grupo R modificado o esqueletos modificados (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, sulfonio de metil de metionina). La frase "mimético de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen diferentes estructuras, aunque funciones similares a las de los aminoácidos generales.
Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente
invención por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB.
Los términos "gen", "polinucleótidos", "nucleótidos" y "ácido nucleico" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, y a menos que se especifique de otra manera, son referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
A menos que se defina lo contrario, el término "cáncer" se refiere a los cánceres que sobre-expresan el gen MELK, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limita a, cáncer de seno, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, leucemia mieloide crónica (CML), cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), linfoma, osteosárcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y cáncer de pulmón de célula pequeña (SCC)s.
A menos que se defina de otra manera, el término "linfocito T citotóxico", "célula T citotóxica" y "CTL" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, y a menos que se especifique lo contrario, se refieren a un sub-grupo de linfocitos T que tienen la capacidad de reconocer células no propias (por ejemplo, células de tumor, células infectadas con virus) e inducir la muerte de dichas células.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen los mismos significados a los comúnmente comprendidos por los expertos en la técnica a la cual pertenece la presente invención.
II. Péptidos
Para demostrar que los péptidos derivados de MELK funcionan como un antígeno reconocido por linfocitos T citotóxicos (CTLs), se analizaron los péptidos derivados de MELK (SEC ID NO: 93) para determinar si fueron epítopes de antígeno restringidos por HLA-A24 o HLA-A02 los cuales son alelos HLA comúnmente encontrados (Date Y y asociados, Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A y asociados, J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT y asociados, J Immunol 152: 3913-24, 1994). Los candidatos de péptidos de enlace HLA-A24 o HLA-A02 derivados de MELK, fueron identificados con base en sus afinidades de enlace a HLA-A24 o HLA-A02. Después de estimulación in vitro de T-células mediante células dendríticas (DCs) cargadas con estos péptidos, los CTLs fueron establecidos exitosamente utilizando los siguientes péptidos:
MELK- A24-9-326 (SEC ID NO: 14),
MELK-A24-9-78 (SEC ID NO: 21),
MELK-A24-10-637 (SEC ID NO: 23),
MELK-A24-10- 532 (SEC ID NO: 27),
MELK-A02-9-138 (SEC ID NO: 36),
MELK-A02-9-193 (SEC ID NO: 46),
MELK-A02-9-171 (SEC ID NO: 57),
MELK-A02-9-71 (SEC ID NO: 60),
y
MELK-A02-9-532 (SEC ID NO: 62),
Estos CTLs establecidos mostraron potente actividad CTL específica contra células objetivo pulsadas con péptidos respectivos. Los resultados aquí presentados demuestran que MELK es un antígeno reconocido por CTL y que los péptidos pueden ser péptidos de epítope de MELK restringida por HLA-A24 o HLA-A02.
Ya que el gen MELK se sobreexpresa en la mayor parte de los tejidos de cáncer, tal como, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gásrico, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y SCC, es un buen objetivo para inmunoterapia. Por lo tanto, la presente invención proporciona nanopéptidos (péptidos que consisten en nueve residuos de aminoácido) y decapéptidos (péptidos que consisten en diez residuos de aminoácido) que corresponden a epítopes reconocidos-CTL de MELK. Los ejemplos particularmente preferidos de nanopéptidos y decapéptidos de la presente invención incluyen los péptidos que consisten en la secuencia de aminoácido seleccionada de entre las SEQ ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62.
Generalmente, los programas de software actualmente disponibles en la Internet, tal como los descritos en la Publicación de Parker KC y asociados, J Immunol 1994 Ene 1, 152(1): 163-75, se pueden utilizar para calcular las afinidades de enlace entre diversos péptidos y antígenos HLA en sílice. La afinidad de enlace con antígenos HLA se puede medir tal como se describe, por ejemplo, en la Publicación de Parker KC y asociados, J Immunol 1994 Ene 1, 152(1): 163-75; y Kuzushima K y asociados, Blood 2001, 98(6): 1872-81. Los métodos para determinar la afinidad de enlace se describen por ejemplo en la Publicación de Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190 y Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Por lo tanto, la presente invención comprende péptidos de MELK que enlazan con antígenos HLA identificados utilizando los programas conocidos.
Los nanopéptidos y decapéptidos de la presente invención pueden ser flanqueados con residuos de aminoácido adicionales, siempre que el péptido resultante retenga su inducibilidad CTL. Dichos péptidos que tienen inducibilidad CTL normalmente son menores aproximadamente a 40 aminoácidos, con frecuencia menores a aproximadamente 20 aminoácidos, normalmente menores a aproximadamente 15 aminoácidos. Las secuencias de aminoácido particulares que flanquean los nanopéptidos y decapéptidos de la presente invención (por ejemplo, péptidos que consisten en la secuencia de aminoácido
seleccionada de entre SEQ ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62) no están limitadas y pueden estar compuestas de cualquier clase de aminoácidos, siempre que no dañen la inducibilidad de CTL del péptido original. Por lo tanto, la presente invención también proporciona péptidos que tienen inducibilidad CTL y una secuencia de aminoácido seleccionada de entre las SEQ ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62.
En general, la modificación de uno, dos o más aminoácidos en la proteína, no influenciará la función de la proteína, y en algunos casos incluso aumentará la función deseada de la proteína original. De hecho, los péptidos modificados (por ejemplo, péptidos compuestos de la secuencia de aminoácido en donde una, dos o diversos residuos de aminoácido han sido modificados) (por ejemplo, sustituidos, agregados, eliminados o insertados) en comparación con una secuencia de referencia original) han sido conocidos por retener la actividad biológica del péptido original (Mark y asociados, Proc Nati Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller y Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland y asociados, Proc Nati Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Por lo tanto, en una modalidad, los péptidos de la presente invención pueden tener tanto inducibilidad CTL, una secuencia de aminoácido seleccionada de entre las SEQ ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62, en donde uno, dos o incluso más aminoácidos son insertados, agregados, eliminados y/o
sustituidos.
Los expertos en la técnica reconocerán que las adiciones o sustituciones individuales a una secuencia de aminoácido que alteran un aminoácido simple o un pequeño porcentaje de aminoácido, tienden a dar como resultado la conservación dé las propiedades de la cadena lateral del aminoácido original. Por lo tanto, con frecuencia son referidos como "sustituciones conservadoras" o "modificaciones conservadoras", en donde la alteración de una proteína da como resultado una proteína modificada que tiene una función análoga a la proteína original. Las tablas de sustitución conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son conocidas en lá técnica. Los ejemplos de las características de las cadenas laterales del aminoácido que se desean conservar incluyen, por ejemplo, aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene un ácido carboxílico y una amida (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un aromático (H, F, Y, W). Además, los siguientes ocho grupos cada uno contienen aminoácidos que son aceptados en la técnica como
sustituciones conservadoras una por otra:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Aspargina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Usina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver por ejemplo la Publicación de Creighton, Proteins 1984).
Dichos péptidos modificados en forma conservadora también son considerados como péptidos de la presente invención. Sin embargo, los péptidos de la presente invención no se restringen a los mismos y pueden incluir modificaciones no conservadoras, siempre que el péptido modificado retenga la inducibilidad CTL del péptido original. Además, los péptidos modificados no deben excluir los péptidos inducibles por CTL de las variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de MELK.
Para retener la inducibilidad CTL de requisito se puede modificar (insertar, agregar, eliminar y/o sustituir) un pequeño número (por ejemplo, 1, 2 o diversos) o un pequeño porcentaje de aminoácidos. Aquí, el término "varios" significa 5 o menos aminoácidos, por ejemplo, 4 ó 3 ó menos. El porcentaje de aminoácidos que serán modificados es preferentemente del 20%
o menos, más preferentemente, 15% o menos, incluso más preferentemente 10% o menos o de 1 a 5%.
El análisis de homología de los péptidos preferidos de la presente invención, M ELK-A24-9-326 (SEC ID NO:14), MELK-A24-9-78 (SEC ID NO:21), M ELK-A24-10-637 (SEC ID NO: 23), MELK-A24-10-532 (SEC ID NO: 27), M ELK-A02-9-138 (SEC ID NO: 36), MELK-A02-9-193 (SEC ID NO: 46), MEL-A02-9-171 (SEC ID NO: 57), MELK-A02-9-71 (SEC ID NO: 60) Y MELK-A02-9-532 (SEC ID NO: 62), confirmaron que estos péptidos no tienen homología significativa con péptidos derivados de cualesquiera de otros productos de gen humano conocidos. Por lo tanto, la posibilidad de estos péptidos de generar respuestas inmune desconocidas o indeseadas, cuando se utilizan para inmunoterapia, se disminuye en forma significativa. Por consiguiente, se espera que estos péptidos sean altamente útiles para provocar inmunidad en pacientes con tumor contra MELK en células de cáncer, tal como cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteo'sarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y SCC.
Cuando se utilizan dentro del contexto de inmunoterapia, los péptidos de la presente invención deben presentarse en la superficie de una célula o exosoma, preferentemente como un
complejo con un antígeno HLA. Por consiguiente, es preferible seleccionar péptidos que no únicamente inducen CTLs sino también poseen alta afinidad de enlace con el antígeno HLA-Para este fin, los péptidos pueden ser modificados mediante sustitución, inserción, eliminación y/o adición de los residuos de aminoácido, para producir un péptido modificado que tiene afinidad de enlace mejorada. Además de los péptidos que son naturalmente desplegados, ya que la regularidad de las secuencias de péptidos desplegadas mediante enlace a antígenos HLA ya es conocida (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), se pueden introducir modificaciones con base en dicha regularidad en especies inmunogénicas de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable sustituir el segundo aminoácido del N-término con fenilalanina, tirosina, metionina o triptofan y/o el aminoácido en el C-término con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofan o metionina, con el objeto de incrementar la afinidad de enlace HLA-A24. Por lo tanto, los péptidos que tienen las secuencias de aminoácido seleccionadas de entre las SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23 Y SEC ID NO: 27, en donde el segundo aminoácido del N-término de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NOs: se sustituye con fenilalanina, tirosina, metionina o triptofan y/o en donde el C-término de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID Nos: se sustituye con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofan o
metionina, están comprendidos en la presente invención. Por otra parte, los péptidos que poseen alta afinidad de enlace HLA-A02, tienen su segundo aminoácido del N-término, sustituido con leucina o metionina, y/o el aminoácido en el C-termino sustituido con valina o leucina. Por lo tanto, los péptidos que tienen las secuencias de aminoácido seleccionadas de entre las SEC ID NO: 36, SEC ID NO: 46, SEC ID NO: 57, SEC ID NO: 60 Y SEC ID NO: 62, en donde el segundo aminoácido del N-término es sustituido con leucina o metionina, y/o en donde el C-término es sustituido con valina o leucina están comprendidos por la presente invención. Se pueden introducir sustituciones no únicamente como los aminoácidos terminales, sino también en la posición del reconocimiento TCR potencial de los péptidos. Diversos estudios han demostrado que las sustituciones de aminoácido en un péptido pueden ser iguales o mejores al original, por ejemplo CAP1, p53(264-272). Her-2/neu(369-377) o gp100(2o9-2i7) (Zaremba y asociados. Cáncer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann y asociados. J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3):1338-47., S. O. Dionne y asociados. Cáncer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 y S. O. Dionne y asociados. Cáncer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
La presente invención también contempla la adición de uno a dos aminoácidos al N y/o C-término de los péptidos descritos. Dichos péptidos modificados que tienen alta afinidad
de enlace de antígeno HLA y una inducibilidad CTL retenida, también están incluidos en la presente invención.
Sin embargo, cuando la secuencia de péptidos es idéntica a una parte de la secuencia de aminoácido de una proteína endógena o exógena que tiene una diferente función, se pueden inducir efectos secundarios tales como trastornos autoinmune y/o síntomas alérgicos contra sustancias específicas. Por consiguiente es preferible llevar a cabo primero las búsquedas de homología utilizando las bases de datos disponibles para evitar situaciones en las cuales la secuencia del péptido sea compatible con la secuencia de aminoácido de otra proteína. Cuando queda claro a partir de las búsquedas de homología que no existe incluso un péptido con 1 6 2 diferencias dé aminoácido en comparación con el péptido objetivo, el péptido objetivo puede ser modificado con el objeto de incrementar su afinidad de enlace con los antígenos HLA y/o incrementar su inducibilidad CTL sin peligro alguno de dichos efectos secundarios.
Aunque los péptidos que tienen alta afinidad de enlace con los antígenos HLA, tal como se describe anteriormente, se espera que sean altamente efectivos, los péptidos candidatos, los cuales se seleccionan de acuerdo con la presencia de una alta afinidad de enlace como un indicador, se revisan en forma adicional para la presencia de inducibilidad CTL. Aquí, la frase "inducibilidad" indica la capacidad del péptido para inducir
linfocitos citotóxicos (CTLs) cuando se presentan en células que presentan antígenos. Además, la "inducibilidad CTL" incluye la capacidad que tiene el péptido de inducir la activación CTL, proliferación CTL, promover la lisis de CTL de células objetivo y de incrementar la producción IFN-gamma CTL.
La confirmación de inducibilidad CTL se logra induciendo células que presentan antígenos que llevan antígenos que llevan antígenos HC humanos (por ejemplo, linfocitos B, macrófagos, y células dendríticas (DCs)) estimulando con péptidos, mezclando las células que presentan antígenos inducidas con células positivas-CD8, y posteriormente midiendo el IFN-gamma producido y liberado mediante CTL contra las células objetivo. Preferentemente, las células que presentan antígenos son DCs derivadas de leucocitos mononucleares de sangre periférica humana. Como el sistema de reacción, se pueden utilizar animales transgénicos que han sido producidos para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, los descritos en las Publicaciones de BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Ago, 61(8): 764-79, Artículos Relacionados, Libros, Inducción sin Acoplamiento de respuesta CTL a través de una vacuna de epítope mínima en ratones transgénicos HLA A*0201/DR1: dependencia de respuesta T(H) restringida por HLA clase II). Por ejemplo, las células objetivo pueden ser
radioetiquetadas con Cr y similares, y se puede calcular la actividad citotoxica a partir de la radioactividad liberada de las células objetivo. Como alternativa, se puede evaluar la inducibilidad CTL midiendo IFN-gamma producido y liberado mediante CTL en la presencia de células que presentan antígenos (APCs) que llevan péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición en el medio utilizando anticuerpos monoclonales anti-l FN-gamma.
Como resultado de la revisión de la inducibilidad CTL de los péptidos tal como se describió anteriormente, se descubrió que los que tienen alta afinidad de enlace con el antígeno HLA no tienen necesariamente una alta inducibilidad. Sin embargo, de los péptidos identificados y evaluados, los nanopéptidos y decapéptidos que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62 se descubrió que exhiben una inducibilidad CTL particularmente alta. Por lo tanto, estos péptidos son ejemplificados como modalidades preferidas de la presente invención.
Además de las modificaciones antes descritas, los péptidos de la presente invención también se pueden enlazar a otras sustancias, siempre que el péptido enlazado resultante retenga la inducibilidad CTL de requisito del péptido original. Los ejemplos de sustancias adecuadas, incluyen por ejemplo: péptidos, lípidos, azúcares y cadenas de azúcar, grupos acetilo, polímeros naturales y sintéticos, etc. Los péptidos pueden
contener modificaciones tales como glucosilación, oxidación de cadena lateral o fosforilación, etc., siempre que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Estos tipos de modificaciones se pueden llevar a cabo para conferir funciones adicionales (por ejemplo, función de dirección y función de suministro) o para estabilizar el polipéptido.
Por ejemplo, para incrementar la estabilidad in vivo de un polipéptido, es conocido en la técnica la introducción de D-aminoácidos, miméticos de aminoácido o aminoácidos no naturales; este concepto también puede adaptarse a los polipéptidos de la presente invención. La estabilidad de un polipéptido se puede ensayar en una cantidad de formas. Por ejemplo, las peptidasas y diversos medios biológicos tales como plasma y suero humano, se pueden utilizar para probar la estabilidad (ver, por ejemplo, la Publicación de Verhoef y asociados, Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).
Además, los péptidos de la presente invención pueden ser enlazados a otros péptidos a través de espaciadores o enlazadores. Los ejemplos de otros péptidos incluyen pero no se limitan a, péptidos inducibles por CTL derivados de otros TAAs. Como alternativa, se pueden enlazar a través de espaciadores o enlazadores dos o más péptidos de la presente invención. Los péptidos enlazados a través de espaciadores o enlazadores pueden ser los mismos o diferentes entre sí. Los
espaciadores o enlazadores no están limitados específicamente, pero son preferentemente péptidos, más preferentemente péptidos que tienen uno o más sitios de disociación los cuales tienen la capacidad de ser disociados mediante enzimas tales como peptidasas, proteasas y proteasomas. Los ejemplos de enlazadores o espaciadores incluyen, pero no se limitan a: AAY (P. . Daftarian y asociados, J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller y asociados, J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) o, uno a varios residuos de lisina (S. Ota y asociados, Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura y asociados, J Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Los péptidos de la presente invención comprenden los péptidos enlazados a otros péptidos a través de espaciadores o enlazadores.
Los péptidos de la presente invención se presentan en la superficie de una célula que transporta antígenos MHC humanos (por ejemplo, células que presentan antígenos) o un exosoma como complejos en combinación con moléculas MHC y posteriormente inducen CTLs. Las células y los exosomas pueden prepararse a través de métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, las células se pueden preparar contactando con los péptidos de la presente invención, y los exosomas se pueden preparar recolectando una fracción que contiene exosoma de las células contactadas con los péptidos de la presente invención (ver por ejemplo, las Publicaciones Kohyo de Solicitud de Patente Japonesa Nos. Hei 11-510507 y
WO99/03499). El péptido de la presente invención comprende los péptidos que existieron en la superficie de una célula o un exosoma como complejos en combinación con moléculas MHC.
Aquí, los péptidos de la presente invención también se pueden describir como "péptido(s) MELK" o "polipéptido(s) MELK".
III. Preparación de péptidos MELK
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar en forma sintética, utilizando tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar en forma individual o como polipéptidos más largos, compuestos de dos o más péptidos. Los péptidos posteriormente se pueden aislar, por ejemplo, purificar, para estar sustancialmente libres de otras proteínas de célula huésped que ocurren naturalmente y fragmentos de las mismas, o cualesquier otras sustancias químicas.
Un péptido de la presente invención se puede obtener a través de síntesis química con base en la secuencia de aminoácido seleccionada. Los ejemplos de métodos de síntesis de péptido convencional que se pueden adaptar para la síntesis incluyen:
(i) Síntesis de Péptidos, Interscience, Nueva York, 1966; (i¡) Proteínas, Volumen 2, Academic Press, Nueva York,
1976;
(iii) Síntesis de Péptido (en Japonés), Maruzen Co., 1975;
(iv) Bases y Experimentos de Síntesis de Péptidos (en Japonés), Maruzen Co., 1985;
(v) Desarrollo de Farmacéuticos (segundo volumen) (en
Japonés), Vol. 14 (síntesis de péptido), Hirokawa, 1991;
(vi) W099/67288; y
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Volumen 2, "Síntesis de Péptido de Fase Sólida", Academic Press, Nueva York, 1980, 100-118.
Como alternativa, los péptidos de la presente invención se pueden obtener adaptando cualesquiera métodos de construcción genética conocidos para producir péptidos (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Métodos en Enzimología (eds. Wu y asociados) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, primero, se prepara un vector adecuado que contiene un polinucleótido que codifica el péptido objetivo en una forma expresible (por ejemplo, corriente descendente de una secuencia reguladora que corresponde a una secuencia promotora) y se transforma en una célula huésped adecuada. Posteriormente la célula huésped se cultiva para producir el péptido de interés. El péptido también se puede producir in vitro adoptando un sistema de traducción in vitro.
IV. Polinucleótidos
La presente también proporciona un polinucleótido que codifica cualesquiera de los péptidos antes mencionados de la presente invención. Estos incluyen polinucleótidos derivados del gen MELK que ocurre naturalmente (Acceso GenBank No. NM_014791 (SEQ ID NO: 93)) así como los que tienen una secuencia de nucleótido modificada en forma conservadora del mismo. Aquí la frase "secuencia de nucleótido modificada en forma conservadora" se refiere a secuencias que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos, codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en donde una alanina que es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualesquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silentes", las cuales son una especie de variación modificada en forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente invención que codifica un péptido también describe cada posible variación silente del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el único codón para metionina y TGG, el cual ordinariamente
es el único codón para triptofan) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silente de un ácido nucleico que codifica un péptido, se describe en forma implícita en cada secuencia descrita.
El polinucleótido de la presente invención puede estar compuesto de ADN, ARN y derivados de los mismos. Un ADN está compuesto en forma adecuada de bases tales como A, T, C y G y T se reemplaza por U en un ARN.
El polinucleótido de la presente invención puede codificar múltiples péptidos de la presente invención, con o sin secuencias de aminoácido de intervención entre ellos. Por ejemplo, las secuencias de aminoácido de intervención pueden proporcionar un sitio de disociación (por ejemplo, secuencia de reconocimiento de enzima) del polinucleótido o los péptidos traducidos. Además, el polinucleótido puede incluir cualesquiera secuencias adicionales para la secuencia de codificación que codifica el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye secuencias reguladoras requeridas para la expresión de un péptido o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores y similares. En general, dichos polinucleótidos recombinantes pueden prepararse mediante la manipulación de polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales utilizando, por
ejemplo, polimerasas y endonucleasas.
Se pueden utilizar técnicas de síntesis tanto recombinante, como química para producir los polínucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido puede producirse mediante inserción en un vector adecuado, el cual se puede expresar cuando se transfecta en una célula competente. Como alternativa, un polinucleótido puede ser amplificado utilizando técnicas PCR o expresión en receptores adecuados (ver, por ejemplo, la Publicación de Sambrook y asociados, Clonación Molecular: Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989). Como alternativa, se puede sintetizar un polinucleótido utilizando las técnicas de fase sólida, tal como se describe en la Publicación de Beaucage SL & lyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes y asociados, EMBO J 1984, 3: 801-5.
Los vectores que contienen el polinucleótido de la presente invención y las células huésped que contiene los vectores también están incluidos en la presente invención.
V. Exosomas
La presente invención proporciona además vesículas intracelulares denominadas exosomas, las cuales presentan complejos formados entre los péptidos de la presente invención y los antígenos HLA en su superficie. Los exosomas pueden ser preparados, por ejemplo, utilizando los métodos detallados en las Publicaciones Kohyo de la Solicitud Patente Japonesa Nos.
Hei 11-510507 y WO99/03499, y se pueden preparar utilizando APCs obtenidas de pacientes que son sometidos a tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención se pueden inocular como vacunas, en una forma similar a los péptidos de la presente invención.
El tipo de antígenos HLA contenidos en los complejos, debe coincidir con el del sujeto que requiere tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población Japonesa, HLA-A24, particularmente HLA-A2402, prevalece y por consiguiente puede ser adecuado para el tratamiento de un paciente Japonés. El uso del tipo A24 o el tipo A02 que es altamente expresado entre Japoneses y Caucásicos es favorable para obtener resultados efectivos, y también tienen uso los subtipos tales como A2402 o A0201. Normalmente, en la clínica, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiere tratamiento se investigue por adelante, o lo cual permite la selección adecuada de péptidos que tiene altos niveles de afinidad de enlace con el antígeno particular, o que tienen CTL inducibilidad mediante presentación de antígenos. Además, con el objeto de obtener péptidos que tienen tanto alta afinidad de enlace como inducibilidad CTL, se puede llevar a cabo la sustitución, inserción y/o adición de 1, 2, o diversos aminoácidos con base en la secuencia de aminoácido del péptido parcial MELK que ocurre naturalmente.
Cuando se utiliza un exosoma incluyendo el antígeno HLA tipo A24, los péptidos que tienen las secuencias de
aminoácidos seleccionadas de entre las SEC ID NOs: 14, 21, 23 y 27 son útiles. Por otra parte, cuando se utiliza un exosoma que incluye el antígeno HLA tipo A02, los péptidos que tienen la secuencia seleccionada de entre SEC ID NO: 36, 46, 57, 60 y 62 son los preferidos.
VI. Células que presentan antígenos (APCs)
La presente invención también proporciona células que presentan antígenos (APCs) que presentan complejos formados entre antígenos HLA y los péptidos de la presente invención en su superficie. Las APCs que se pueden obtener contactando los polipéptidos de la presente invención, o introduciendo los nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención en una forma expresible, se pueden derivar de pacientes quienes son sometidos a tratamiento y/o prevención y se pueden administrar como vacunas por sí mismas o en combinación con otros fármacos, incluyendo los péptidos de la presente invención, exosomas o células T citotóxicas.
Las APCs no se limitan a una clase particular de células e incluyen células dendríticas (DCs), células de Langerhans, macrófagos, células B y células T activadas, las cuales son conocidas por presentar antígenos proteináceos en su superficie celular, para ser reconocidos por los linfocitos. Ya que DC es una APC representativa que tiene una acción de inducción CTL más fuerte entre las APCs, DCs tiene uso como las APCs de la presente invención.
Por ejemplo, una APC puede obtenerse induciendo DCs dé monocitos de sangre periférica y posteriormente contactándolas (estimulándolas) con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente invención se administran a los sujetos, las APCs que presentan los péptidos de la presente invención se inducen en el cuerpo del sujeto. La frase "APC de inducción" incluye contactar (estimular) una célula con los péptidos de la presente invención, o nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención para presentar complejos formados entre los antígenos HLA y los péptidos de la presente invención en la superficie de una célula. Como alternativa, después de introducir los péptidos de la presente invención a las APCs para permitir que las APCs presenten el péptido, las APCs pueden administrarse al sujeto como una vacuna. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir los pasos de:
a: recolectar APCs de un primer sujeto;
b: contactar con las APCs del paso a, con el péptido y c: administrar la APCs cargadas con péptido a un segundo sujeto.
El primer sujeto y el segundo sujeto pueden ser el mismo individuo, o pueden ser diferentes individuos. Como alternativa, de acuerdo con la presente invención, se proporciona el uso de los péptidos de la presente invención para fabricar una composición farmacéutica que induce células que presentan
antígenos. Además, la presente invención proporciona un método o proceso para fabricar una composición farmacéutica que induce células que presentan antígenos. Además, la presente también proporciona los péptidos de la presente invención para inducir células que presentan antígenos. Las APCs obtenidas del paso (b) se pueden administrar al sujeto como una vacuna.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, las APCs de la presente invención tiene un alto nivel de inducibilidad CTL. En el término de "alto nivel de inducibilidad CTL", el alto nivel es relativo al nivel del mismo, contactando APC con péptidos o no péptidos que pueden no inducir el CTL. Las APCs que tienen un alto nivel de inducibilidad CTL se pueden preparar a través de un método que incluye el paso de transferir genes que contienen polinucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención a APCs in vitro. Los genes introducidos pueden estar en la forma de ADNs o ARNs. Los ejemplos de métodos para introducción incluyen, sin limitación particular, varios métodos llevados a cabo convencionalmente en este campo, tal como lipofección, electroporación, y un método de fosfato de calcio. Más específicamente, se puede llevar a cabo tal como se describe en la Publicación de Cáncer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; Traducción Japonesa Publicada de la Publicación Internacional
No. 2000-509281. Al transferir el gen en las APCs, el gen pasa por transcripción, traducción, y similares en la célula, y posteriormente la proteína obtenida es procesada mediante MHC Clase I o Clase II, y procede a través de una trayectoria de presentación para presentar péptidos parciales.
VII. Células T citotóxicas (CTLs)
Una célula T citotóxico inducida contra cualesquiera de los péptidos de la presente invención, refuerza la respuesta inmune que se dirige al endotelio asociado con tumor in vivo y por lo tanto se puede utilizar como vacuna, en una forma similar a los péptidos per se. Por lo tanto, la presente invención también proporciona células T citotóxicas aisladas que son inducidas en forma específica o activadas a través de cualesquiera de los péptidos de la presente invención.
Dichas células T citotóxicas se pueden obtener mediante
(1) administración a un sujeto o (2) contactar (estimular) las APCs derivadas del sujeto y las células positivas-CD8, o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con los péptidos de la presente invención y posteriormente aislando células T citotóxicas.
Las células T citotóxicas, las cuales han sido inducidas mediante estimulación a partir de las APCs que presentan los péptidos de la presente invención, se pueden derivar de pacientes quienes son sometidos a tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar por sí mismas o en combinación con
otros fármacos, incluyendo los péptidos de la presente invención o exosomas con el propósito de efectos de regulación. Las células T citotóxicas obtenidas actúan en forma específica con tres células objetivo que presentan los péptidos de la presente invención, o por ejemplo, los mismos péptidos utilizados para inducción. Por otra parte, las células T citotóxicas pueden reconocer (por ejemplo enlazar) un complejo formado entre un antígeno HLA y el péptido de la presente invención en la superficie de una célula objetivo con el receptor de la célula T, y posteriormente atacar la célula objetivo para inducir la muerte de la misma. Las células objetivo pueden ser células que expresan en forma endógena MELK, o células que son transfectadas con el gen MELK; y células que presentan un péptido de la presente invención en la superficie celular debido a estimulación a través del péptido y también pueden servir como objetivos de ataque CTL activado. VIII. Receptor de célula T (TCR)
La presente invención también proporciona una composición que contiene una secuencia ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que tienen la capacidad de formar una subunidad de un receptor de célula T (TCR), y métodos para utilizar los mismos. Las subunidades TCR tienen la capacidad de formar TCRs que confieren especificidad a células T contra células de tumor que presentan MELK. Al utilizar los métodos conocidos en la técnica, se pueden identificar los
ácidos nucleicos de las cadenas alfa y beta como las subunidades TCR del CTL inducido con uno o más péptidos de la presente invención (WO2007/032255 y Morgan y asociados, J Immunol, 171, 3288 (2003)). Las TCRs derivadas pueden enlazar células objetivo desplegando el péptido MELK con alta avidez, y transmitir opcionalmente la aniquilación eficiente de células objetivo que presentan el péptido MELK in vivo e in vitro.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica las subunidades TCR pueden incorporarse en vectores adecuados, por ejemplo, vectores retrovirales. Estos vectores son bien conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos y los vectores que los contienen, pueden ser transferidos en forma útil en una célula T, por ejemplo, una célula T de un paciente. En forma conveniente, la presente invención proporciona una composición fuera del anaquel, que permite una rápida modificación de las propias células T del paciente (o las de otro mamífero) para producir en forma rápida y fácil células T modificadas que tienen excelentes propiedades de aniquilación de células de cáncer.
Asimismo, la presente invención proporciona CTLs que se preparan mediante transducción con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de subunidades TCR que enlazan al péptido MELK, por ejemplo SEQ ID NO: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62 dentro del contexto de HLA-A24 o HLA-A02. Los
CTLs transducidos tienen la capacidad de alojar las células ¡n vivo, y se pueden expandir a través de métodos de cultivo in vitro bien conocidos (por ejemplo, Kawakami y asociados, J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Las células T de la presente invención se pueden utilizar para formar una composición inmunogénica útil para tratar o prevenir cáncer en un paciente que necesita de terapia o protección (WO2006/031221 ).
IX. Agentes y Composiciones Farmacéuticas
La prevención y profilaxis incluyen cualquier actividad que reduzca la carga de mortalidad o morbididad por la enfermedad. La prevención y profilaxis pueden ocurrir "en niveles de prevención primarios, secundarios y terciarios". Aunque la prevención y profilaxis primaria evitan la evolución de la enfermedad, los niveles de prevención y profilaxis secundarios y terciarios comprenden actividades dirigidas a la prevención y profilaxis del progreso de una enfermedad y al surgimiento de síntomas, así como a la reducción del impacto negativo de una enfermedad ya establecida, restaurando la función y reduciendo las complicaciones relacionadas con la enfermedad. Como alternativa, la prevención y profilaxis incluyen un amplio rango de terapias profilácticas dirigidas al alivio de la severidad del trastorno particular, por ejemplo, reduciendo la proliferación y metástasis de tumores.
El tratamiento y/o la profilaxis de cáncer, o, y/o la prevención de la recurrencia post-operatoria del mismo, incluye
cualesquiera de los siguientes pasos, tal como la eliminación quirúrgica de células de cáncer, inhibición del crecimiento de células cancerígenas, involución o regresión de un tumor, inducción de remisión y supresión del surgimiento de cáncer, regresión del tumor y reducción o inhibición de metástasis. El tratamiento y/o la profilaxis en forma efectiva del cáncer, disminuye la mortalidad y mejora el pronóstico de los individuos que tienen cáncer, disminuye los niveles de marcadores de tumor en la sangre, y alivian los síntomas detectables que acompañan el cáncer. Por ejemplo, la reducción o mejoría de los síntomas que constituyen el tratamiento y/o la profilaxis efectiva, incluyen 10%, 20%, 30% o más reducción, o una enfermedad estable.
Ya que la expresión MELK se activa en diversos cánceres, en comparación con tejido normal, los péptidos de la presente invención o los polinucleotidos que codifican los péptidos, se pueden utilizar para tratamiento y/o para la profilaxis de cáncer, o tumor y/o la prevención de la recurrencia post-operatoria del mismo. Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente o composición farmacéutica para el tratamiento y/o profilaxis de cáncer o tumor, y/o para la prevención ó recurrencia post-operatoria del mismo, que incluye uno o más de los péptidos de la presente invención, o polinucleotidos que codifican los péptidos en la forma de un ingrediente activo. Como alternativa, los péptidos de la presente invención se
pueden expresar en la superficie de cualesquiera de los exosomas o células anteriores, tal como APCs para el uso como agentes o composiciones farmacéuticas. Además, las células T citotóxicas antes mencionadas que dirigen cualesquiera de los péptidos de la presente invención, también se pueden utilizar como el ingrediente activo de los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención. Dentro del contexto de la presente invención, la frase "que dirige un péptido", se refiere a reconocer (es decir, enlazar a) un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido en la superficie de una célula objetivo con el receptor de célula T, y posteriormente atacar la célula objetivo para inducir la muerte de la misma.
En otra modalidad, la presente invención también proporciona el uso de un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica un péptido tal como se describe en la presente invención en una forma expresable,
(c) un APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención en la fabricación de una composición o agente farmacéutico para el tratamiento cáncer o tumor.
Como alternativa, la presente invención proporciona además un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido tal como aquí se describe en una forma expresible,
(c) un APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención para utilizarse en el tratamiento de cáncer o tumor.
Como alternativa, la presente invención proporciona además un método o proceso para fabricar una composición o agente farmacéutico para tratamiento de cáncer, en donde el método o proceso incluye el paso de formular un transportador farmacéutica o fisiológicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido tal como aquí se describe en una forma expresible,
(c) un APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención en la forma de ingredientes activos.
En otra modalidad, la presente invención también proporciona un método o proceso para fabricar una composición o agente farmacéutico para el tratamiento de cáncer, en donde el método o proceso incluye el paso de mezclar en adiciones un ingrediente activo con el transportador farmacéutica o
fisiológicamente aceptable, en donde el ingrediente activo se selecciona de entre:
(a) un péptido de la presente invención,
(b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido tal como aquí se describe en una forma expresable,
(c) un APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie, y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención
Como alternativa, la composición o agente farmacéutico de la presente invención se puede utilizar ya sea para cualquiera de, o, tanto para la profilaxis de cáncer o tumor, como para la prevención de la recurrencia post-operatoria del mismo.
Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen uso como una vacuna. Dentro del contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (también referida como "composición inmunogénica") se refiere a una sustancia que tiene la función de inducir inmunidad anti-tumor al momento de la inoculación en animales.
Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para tratar y/o prevenir cánceres o tumores, y/o para prevención de la recurrencia post-operatoria del mismo en sujetos o pacientes, incluyendo humanos y cualquier otro mamífero incluyendo pero sin limitarse a, ratón, rata, cerdo de guinea, conejo, gato, perro, oveja, cabra, cerdo, ganado, caballo, mono, mandril y chimpancé, particularmente un
animal comercialmente importante o un animal doméstico.
De acuerdo con presente invención, los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionada de entre las SEC ID NOs: 14, 21, 23 y 27 o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido seleccionadas de entre las SEC ID NOs: 36, 46, 57, 60 y 62 se han encontrado como péptidos de epítope o candidatos restringidos por HLA-A24 o HLA-A02, respectivamente, que pueden inducir una respuesta inmune potente y específica. Por consiguiente, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención que incluyen cualesquiera de estos polipéptidos que tienen la secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre las SEC ID NOs: 14, 21, 23 y 27 son particularmente adecuados para la administración a sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A24. Por una parte, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención que contienen cualesquiera de estos polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de SEC ID NOs: 36, 46, 57, 60 y 62 son particularmente adecuadas para la administración a los sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A02. Lo mismo aplica para agentes farmacéuticos que incluyen polinucleótidos que codifican cualesquiera de estos polipéptidos.
Los cánceres o tumores que serán tratados mediante agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención no están limitados e incluyen todos los tipos de
cánceres o tumores en donde está implicado MELK, incluyendo por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y SCC.
Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener además de los ingredientes activos antes mencionados, otros péptidos que tienen la capacidad dé inducir CTLs contra células cancerígenas, otros polinucleótidos que codifican los otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos y similares. Aquí, los otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTLs contra células cancerígenas, son ejemplificados mediante antígenos específicos de cáncer (por ejemplo, TAAs identificados), pero no se limitan a los mismos.
Si es necesario, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras sustancias terapéuticas como un ingrediente activo, siempre que la sustancia no inhiba el efecto anti-tumoral del ingrediente activo, por ejemplo, cualesquiera de los péptidos de la presente invención. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir agentes o composiciones antiinflamatorias, exterminadores de dolor, quimioterapéuticos y similares. Además de incluir otras sustancias terapéuticas en el
propio medicamento, los medicamentos de la presente invención también pueden administrarse en secuencias o en forma concurrente con el uno o más de otros agentes o composiciones farmacéuticas. Las cantidades de medicamento y agente o composición farmacológica dependen, por ejemplo, de qué tipo de agente(s) o composición(s) farmacológica se utiliza, la enfermedad que esté siendo tratada y el programa y rutas de administración.
Deberá quedar entendido que, además de los ingredientes mencionados de manera particular en la presente invención, los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención pueden incluir otros agentes o composiciones convencionales en la técnica, que tienen aspectos relacionados con el tipo de formulación en cuestión.
En una modalidad de la presente invención, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden incluir en artículos de fabricación y equipos que contienen materiales útiles para tratar las condiciones patológicas de la enfermedad que será tratada, por ejemplo cáncer.
El artículo de fabricación puede incluir un contenedor de cualesquiera de los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención, con una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen botellas, frascos y tubos de prueba. Los contenedores pueden ser formados de una variedad de
materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta en el contenedor debe indicar el agente o composiciones que se utilizan para el tratamiento o prevención de una o más condiciones de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar direcciones para administración y similares.
Además del contenedor descrito anteriormente, un equipo que incluye un agente o composición farmacéutica de lá presente invención, puede incluir opcionalmente en forma adicional un segundo contenedor que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, i agujas, jeringas e insertos de paquete con instrucciones para uso .
Los agentes o la composición farmacéutica, si se desea, puede presentarse en un paquete o aparato de abastecimiento que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. El paquete, por ejemplo, puede incluir una lámina de metal o plástico, tal como un paquete de burbuja de plástico. El paquete o aparato de abastecimiento puede estar acompañado de instrucciones para administración.
(1) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos como el ingrediente activo.
Los péptidos de la presente invención se pueden
administrar directamente como un agente o composición farmacéutica, o si es necesario, que hayan sido formulados mediante métodos de formulación convencionales. En el último caso, además de los péptidos de la presente invención, se pueden incluir transportadores, excipientes y similares que sean utilizados normalmente para fármacos, según sea lo indicado sin limitaciones particulares. Los ejemplos de dichos transportadores son agua esterilizada, solución salina fisiológica, amortiguador de fosfato, un fluido de cultivo y similares. Además, los agentes y composiciones farmacéuticas pueden contener, según sea necesario, estabilizadores, suspensiones, conservadores, tensoactivos y similares. Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar con propósitos anti-cáncer.
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar como una combinación compuesta de dos o más péptidos de la presente invención para inducir CTL in vivo. La combinación de péptidos puede tomar la forma de un cocktail o se puede conjugar entre sí utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos pueden ser enlazados o expresados en forma química como una secuencia de polipéptido de fusión simple. Los péptidos en la combinación pueden ser los mismos o diferentes. Al administrar los péptidos de la presente invención, los péptidos se presentan en una alta densidad a través de los antígenos HLA en APCs, posteriormente, se inducen los CTLs
que reaccionan específicamente hacia el complejo formado entre el péptido desplegado y el antígeno HLA. Como alternativa, las APCs que presentan cualesquiera de los péptidos de la presente invención en su superficie celular se obtienen eliminando APCs (por ejemplo, DCs) de los sujetos, los cuales son estimulados a través de los péptidos de la presente invención, CTL se induce en los sujetos mediante readministración de estas APCs (por ejemplo, DCs) a los sujetos, y como resultado, se puede incrementar la agresividad hacia las células de cáncer, tal como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y células SCC.
Los agentes o composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o prevención de cáncer o tumor, que incluyen un péptido de la presente invención como el ingrediente activo, también puede incluir un adyuvante conocido por establecer en forma efectiva inmunidad celular. Como alternativa, los agentes o composiciones farmacéuticas se pueden administrar con otros ingredientes activos o administrarse mediante formulación en gránulos. Un adyuvante se refiere a un compuesto que mejora la respuesta inmune contra la proteína cuando se administran juntos (o en forma sucesiva) con la proteína que tiene actividad
inmunológica. Los adyuvantes contemplados en la presente invención incluyen los descritos en la literatura (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Los ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen pero no se limitan a fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alum, toxina de cólera, toxina de salmonela, y similares, pero no se limitan a éstos.
Además, las formulaciones de liposomas, formulaciones granulares en las cuales el péptido es enlazado a cuentas con diámetro de algunos micrómetros, y las formulaciones en las cuales son lípidos enlazado al péptido, se pueden utilizar de manera conveniente.
En algunas modalidades, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención puede incluir además un componente que imprima CTL. Se han identificado lípidos como agentes o composiciones con la capacidad de imprimar CTL in vivo contra antígenos virales. Por ejemplo, los residuos de ácido palmítico pueden ser adheridos a los grupos amino épsilon y alfa de un residuo de Usina y posteriormente enlazarse a un péptido de la presente invención. Posteriormente el péptido lipidado puede administrarse ya sea directamente en una micela o partícula, incorporarse en un liposoma o emulsificarse en un adyuvante. Como otro ejemplo de un lípido que imprima las respuestas CTL, se pueden utilizar lipoproteínas E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) para imprimar CTL cuando
se adhieren en forma covalente a un péptido adecuado (ver por ejemplo, la Publicación de Deres y asociados, Nature 1989, 342: 561-4).
El método de administración puede ser oral, inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similares, y administración sistémica o administración local en los alrededores de los sitios dirigidos. La administración se puede llevar a cabo mediante administración simple o reportarse a través de múltiples administraciones. La dosis de péptidos de la presente invención se puede ajustar en forma adecuada de acuerdo con la enfermedad que será tratada, la edad del paciente, el peso, el método de administración y similares, y normalmente es de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.1 mg a 10 mg, y se puede administrar una vez en algunos días hasta unos cuantos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar en forma adecuada una dosis apropiada.
(2) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo.
Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención, también pueden contener ácido nucleicos que codifican los péptidos aquí descritos en una forma expresable. Aquí, la frase "en una forma expresable" significa que el polinucleótido, cuando se introduce en una célula, será expresado in vivo como un polipéptido que induce inmunidad
anti-tumor. En una modalidad ejemplificada, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés, incluye elementos reguladores necesarios para la expresión del polinucleótido. El polinucleótido(s) se puede equipar para lograr la inserción estable en un genoma de la célula objetivo (ver por ejemplo, la Publicación de Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 para una descripción de vectores de cartucho de recombinación homologa). Ver la Publicación de Wolff y asociados, Science 1990, 247: 1465-8; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; y la Publicación Internacional WO 98/04720. Los ejemplos de tecnologías de suministro a base de ADN incluyen "ADN descubiertos", suministro facilitado (transmitido a través, de bupivacaína, polímeros, péptidos), complejos de lípidos catiónicos y suministro transmitido por partículas ("pistola genética") o transmitido por presión (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,922,687).
Los péptidos de la presente invención también se pueden expresar a través de vectores virales o bacterianos. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen receptores virales atenuados tales como vacunas o viruela de aves. Este método implica el uso de virus de vacuna, por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótido que codifican el péptido. Al momento de la introducción en un huésped, el virus de vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de
esta forma provoca una respuesta inmune. Los vectores de vacuna y métodos útiles en protocolo de inmunización se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 4,722,848. Otros vectores BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en la Publicación de Stover y asociados, Nature 1991, 351: 456-60. Se podrán apreciar una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización, por ejemplo, vectores de virus adeno y adenoasociados, vectores retrovirales, vectores de tipo Salmonela, vectores de toxina de ántrax desintoxicada y similares. Ver por ejemplo las Publicaciones de Shata y asociados, Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock y asociados, J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp y asociados, In Vivo 2000, 14: 571-85.
El suministro de un polinucleótido en un paciente puede ser ya sea directo, en cuyo caso el paciente es expuesto directamente a un vector que lleva un polinucleótido, o indirecto, en cuyo caso, las células se transforman primero con el polinucleótido de interés in vitro, posteriormente las células se trasplantan en el paciente. Estos dos métodos son conocidos, respectivamente, como terapias de gen in vivo y ex vivo.
Para revisiones generales de los métodos de terapia genética, ver las Publicaciones de Goldspiel y asociados, Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu y Wu, Biotherapy
1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends en Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que también se pueden utilizar para la presente invención, se describen en la Publicación de eds. Ausubel y asociados, Protocolos Actuales en Biología Molecular, John Wiley & Sons, NY, 1993; y Krieger, Transferencia y Expresión Genética, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990.
El método de administración puede ser oral, inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa o similares, y administración sistémica o administración local en los alrededores de los sitios objetivo. La administración se puede llevar a cabo a través de administración simple o reforzarse a través de múltiples administraciones. Las dosis de polinucleotido en el transportador adecuado o células transformadas con el polinucleotido que codifica los péptidos de la presente invención, se pueden ajusfar en forma adecuada de acuerdo con la enfermedad que será tratada, la edad el paciente, peso, método de administración y similares, o es ordinariamente de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, 0.1 mg a 10 mg, y se puede administrar una vez cada unos cuantos días hasta una vez cada unos cuantos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar en
forma adecuada la dosis apropiada.
IX. Métodos que utilizan péptidos, exosomas, APCs y CTLs Los péptidos de la presente invención y los polinucleótidos que codifican dichos péptidos se pueden utilizar para inducir APCs y CTLs. Los exosomas y APCs de la presente invención también se pueden utilizar para inducir CTLs. Los péptidos, polinucleótidos, exosomas y APCs se pueden utilizar en combinación con cualesquiera otros compuestos, siempre que los compuestos no inhiban su inducibilidad CTL. Por lo tanto, cualesquiera de los agentes farmacéuticos antes mencionados de la presente invención, se pueden utilizar para inducir CTLs, y además de esto, los que incluyen los péptidos y polinucleótidos también se pueden utilizar para inducir APCs tal como se describe más adelante.
(1) Método para inducir células que presentan antígenos
(APCs)
La presente invención proporciona métodos para inducir APCs utilizando los péptidos de la presente invención o los polinucleótidos que codifican los péptidos. La inducción de APCs puede llevarse a cabo tal como se describió anteriormente en la sección de "VI. Células que presentan antígeno". La presente invención también proporciona un método para inducir APCs que tienen un alto nivel de inducibilidad CTL, cuya inducción también ha sido mencionada en la sección de "VI. Células que presentan antígeno", supra
Preferentemente, los métodos para inducir APCs incluyen al menos un paso seleccionado de entre:
a: contactar las APCs con los péptidos de la presente invención, y
b: introducir los péptidos de la presente invención en una forma expresable en APCs.
Dichos métodos para inducir APCs son llevados a cabo preferentemente in vitro o ex vivo. Cuando los métodos son llevados a cabo in vitro o ex vivo, se pueden obtener las APCs que serán inducidas de un sujeto que será tratado u otros cuyos antígenos HLA son los mismos a los del sujeto.
(2) Método para inducir CTLs
Además, la presente invención proporciona métodos para inducir CTLs utilizando los péptidos de la presente invención, polinucleótidos que codifican los péptidos, o exosomas o APCs que presentan los péptidos.
La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs utilizando un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de formar una sub-unidad de receptor de célula T que reconoce (TCR) (es decir, enlaza a) un complejo de los péptidos de la presente invención y antígenos HLA en una superficie celular. Preferentemente, los métodos para inducir CTLs incluyen al menos un paso seleccionado de entre:
a: contactar una ce T positiva-CD8 con una célula que
presenta antígenos y/o un exosoma que presenta en su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención, y
b: introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de formar una subunidad TCR qué reconoce un complejo de un péptido de la presente invención y un antígeno HLA en una célula T positiva CD8.
Cuando los péptidos de la presente invención se administran a un sujeto, los CTLs se inducen en el cuerpo del sujeto, y se mejora la resistencia de la respuesta inmune que dirige el endotelio asociado con el tumor. Como alternativa, los péptidos y polinucleótidos que codifican los péptidos se pueden utilizar para un método terapéutico ex vivo, en donde las APCs y las células positivas-CD8 derivadas' del sujeto, o los leucocitos mononucleares de sangre periférica son contactados (estimulados) con los péptidos de la presente invención in vitro, y después de inducir CTLs, las células CTL activadas son regresadas al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir los pasos de:
a: recolectar los APCs del sujeto,
b: contactar con las APCs del paso a, con el péptido, c: mezclar las APCs del paso b con las células T CD8+, y co-cultivar juntas para inducir CTLs, y
d: recolectar células T del CD8+ del co-cultivo del paso c. Como alternativa, de acuerdo con la presente invención,
se proporciona el uso de los péptidos de la presente invención para fabricar un agente o composición farmacéutica que induce CTLs. Además, la presente invención proporciona un método o proceso para fabricar un agente o composición farmacéutica que induce CTLs, en donde el método incluye el paso de mezclar en adiciones o formular el péptido de la presente invención con un transportador farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención también proporciona el péptido de la presente invención para inducir los CTLs. Las células T CD8+ que tienen actividad citotóxica obtenida mediante el paso d, se pueden administrar al sujeto como una vacuna. Las APCs que serán mezcladas con las células T CD8+ en el paso c anterior, también se pueden preparar transfiriendo genes que codifican los péptidos de la presente invención en las APCs tal como se detalla anteriormente en la sección "VI. Células que presentan antígenos"; pero no se limitan a las mismas. Por consiguiente, cualesquiera APCs o exosomas que presenten en forma efectiva los péptidos de la presente invención a las células T, se pueden utilizar para el presente método.
Se presentan los siguientes ejemplos para ilustrar la presente invención y para ayudar a un experto en la técnica a realizar y utilizar la misma. Los ejemplos no están proyectados en forma alguna para limitar de otra manera el alcance de la presente invención.
Ejemplos
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
Se estableció la línea de célula linfoblastoide A24 (A24LCL) mediante transformación con virus de Epstein-bar eh linfocito B humano positivo HLA-A24. T2 (HLA-A2), la línea de célula linfoblastoide-B humana, y COS7 se compraron en ATCC. Selección candidata de péptidos derivados de MELK
Se anticiparon péptidos 9-mer y 10-mer derivados de MELK que enlazan a HLA-A*2402, utilizando el software de predicción de enlace "BIMAS" (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind), cuyos algoritmos han sido descritos por Parker KC y asociados, (J Immunol 1994, 152(1 ): 163-75) y Kuzushima K y asociados, (Blood 2001 , 98(6): 1872-81 ). Estos péptidos fueron sintetizados por Sigma (Sapporo, Japón) de acuerdo con un método de síntesis de fase sólida estándar y se purificaron mediante cromatografía de líquida de alto desempeño de fase inversa (HPLC). La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos se determinaron mediante HPLC analítico, y análisis de espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) en 20 mg/ml y se almacenaron en -80 grados C.
Inducción CTL in vitro
Se utilizaron células dendríticas derivadas de monocitos
(DCs) como células que presentan antígenos (APCs) para inducir respuestas de linfocito T citotóxicas (CTL) contra péptidos presentados en antígeno de leucocito humano (HLA). Las DCs se generaron in vitro tal como se describieron en cualquier parte (Nakahara S y asociados, Cáncer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8). En forma específica, se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aislada de un voluntario normal (positive HLA-A*2402) mediante solución de Ficoll-Plaque (Pharmacia), mediante la adherencia a un plato de cultivo de tejido de plástico (Becton Dickinson) para enriquecerlas de esta forma como la fracción de monocito. Se cultivó la población enriquecida con monocito en la presencia de 1000 U/ml del factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) (R&D System) y 1000 U/ml de interleucina ( I L )-4 (R&D System) en un Medio AIM-V (Invitrogen) que contiene 2% de suero autólogo desactivado por calor (AS). Después de 7 días de cultivo, las DCs inducidas por citocina se pulsaron con 20 mcg/ml de cada uno de los péptidos sintetizados en la presencia de 3 mcg/ml de beta2-microglobulina durante 3 horas a una temperatura de 37°C en un Medio AIM-V. Las células generadas parecieron expresar moléculas asociadas con DC, tal como CD80, CD83, CD86 y Clase II HLA, en sus superficies celulares (datos no mostrados). Estas DCs pulsadas con péptido fueron desactivadas posteriormente mediante Mitomicina C (MMC) (30
mcg/ml durante 30 min) y mezcladas en una proporción de 1:20 con células T CD8+ autólogas, obtenidas mediante selección positiva con el Equipo de Aislamiento Positivo CD8 (Dynal). Estos cultivos se establecieron en placas de 48 depósitos (Corning); cada depósito contenía 1.5 x 104 DCs pulsadas con péptido, 3 x 105 de células T CD8+ y 10 ng/ml de IL-7 (R&D System) en 0.5 mi de un medio AIM-V/2% AS. Tres días después, estos cultivos fueron suplementados con IL-2 (CHIRON) a una concentración final de 20 lU/ml. El día 7 y 14, las T células fueron estimuladas en forma adicional con las DCs pulsadas con péptido autólogas. Las DCs se prepararon cada vez de igual manera a la descrita anteriormente. La CTL se probó contra células A24LCL o células T2 pulsadas con péptido después de la 3o vuelta de estimulación con péptido el día 21 (Tanaka H y asociados, Br J Cáncer 2001 Ene 5, 84(1 ): 94-9; Umano Y y asociados, Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): 8577-86; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Ago, 96(8): 498-506).
Procedimiento de expansión CTL
Se expandieron CTLs en cultivo utilizando el método similar al descrito por Riddell y asociados, (Walter EA y asociados, N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44; Riddell SR y asociados, Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23). Se
suspendieron un total de 5 x 104 CTLs en 25 mi de un medio AIM-V/5% AS con 2 clases de líneas de célula B-linfoblastoide humanas, desactivadas mediante MMC, en la presencia de 40 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). El día después del inicio los cultivos, se agregaron 120 lU/ml de IL-2 a los cultivos. Los cultivos se alimentaron con un medio AIM-V/5% AS fresco que contiene 30 lU/ml de IL-2 los días 5, 8 y 11 (Tanaka H y asociados, Br J Cáncer 2001 Ene 5, 84(1): 94-9; Umano Y y asociados, Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): 8577-86; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Ago, 96(8): 498-506).
Establecimiento de clones CTL
Las diluciones se realizaron para tener 0.3, 1, y 3
CTLs/depósito en una placa de microtitulación de fondo redondo de 96 depósitos (Nalge Nunc International). Los CTLs se cultivaron con 1 x 10" células/depósito de 2 tipos de líneas de células linfoblastoide-B humana, se agregaron 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2 en un total de 150 microlitros/depósito de Medio AIM-V que contiene 5%AS. Se agregaron 50 microlitros/depósito de IL-2 al medio 10 días después, para alcanzar una concentración final de 125 U/ml IL-2. Se probó la actividad CTL al 14° día, y se expandieron los clones CTL utilizando el mismo método al descrito
anteriormente (Uchida N y asociados, Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): 8577-86; Suda T y asociados, Cáncer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T y asociados, Cáncer Sci 2005 Ago, 96(8): 498-506).
Actividad CTL específica
Para revisar la actividad CTL específica, se llevó a cabo un ensayo de inmunomanchado enlazado por enzimas (ELISPOT) (IFN)-gamma y un ensayo monoabsorbente enlazado por enzimas IFN-gamma (ELISA). Específicamente, se preparó A24LCL o T2 pulsado-péptido (1 x 104/depósito) como células estimuladoras. Las células cultivadas en 48 depósitos se utilizaron como células que responde. El ensayo ELISPOT IFN-gamma y el ensayo ELISA IFN-gamma se llevaron a cabo mediante el procedimiento de fabricación.
Resultados
Sobre-expresión en cánceres
Los datos del perfil de expresión del gen global obtenido de diversos cánceres utilizando micro-formación cADN revelaron que se elevó la expresión MELK (Acceso GenBank No. NM_014791; SEC ID No.93). La expresión MELK se elevó en forma válida en 29 de 29 cáncer de vejiga, 31 de 34 cáncer de mama, 14 de 15 cáncer cervical, 11 de 11 carcinoma colangiocelular, 10 de 13 CML, 12 de 15 cáncer colorectal, 2 de 2 endometriosis, 19 de 42 cáncer de esófago, 5 de 6 cáncer gástrico, 4 de 4 cáncer de hígado, 11 de 11 NSCLC, 13 de 14
linfoma, 14 de 18 osteosarcoma, 3 de 6 cáncer de ovario, 2 de 2 cáncer pancreático, 18 de 21 cáncer de próstata, 5 de 6 carcinoma renal y 15 de 15 cáncer de pulmón de célula pequeña en comparación con tejido normal correspondiente. (Tabla 1). Tabla 1
Proporción de casos de activación observada en MELK en tejido cancerígeno, en comparación con tejido normal correspondiente.
Anticipación de péptidos de enlace HLA-A24 y HLA-A2 derivados de MELK
La tabla 2 muestra los péptidos de enlace HLA-A24 y HLA-A2 de MELK con el objeto de la más alta afinidad de enlace. Se seleccionaron un total de 34 péptidos con una capacidad de enlace HLA-A24 potencial, y se revisaron para determinar los péptidos de epítope (tabla 2a), y se seleccionaron en forma similar un total de 58 péptidos que tienen la capacidad de enlace HLA-A2 potencial y se revisaron para determinar los péptidos de epítope (Tabla 2b y c).
Tabla 2a
Péptidos 9mer y 10mer de enlace HLA-A24 derivados de MELK
Tabla 2b
Péptidos 9mer de enlace HLA-A24 derivados de MELK
Tabla 2b
Péptidos 10mer de enlace HLA-A24 derivados de MELK
La posición de inicio indica el número de residuo de aminoácido del N-terminal de MELK.
La calificación de enlace se deriva de "BIMAS"
Inducción CTL con los péptidos anticipados de MELK restringido con HLA-A*2402 o HLA-A*0201 y establecimiento para líneas CTL estimuladas con péptidos derivados de MELK
Los CTLs para péptidos derivados de MELK, fueron generados de acuerdo con los protocolos tal como se describe en la sección de "Materiales y Métodos". Se determinó la
actividad CTL específica del péptido mediante ensayo ELISPOT IFN-gamma (figura 1a-¡). se demostró que #5 estimulado con MELK-A24-9-326 (SEC ID NO: 14) (a), #3 estimulado con MELK-A24-9-78 (SEC ID NO: 21) (b), #4 con M ELK-A24-10-637 (SEC ID NO: 23) (c), #4 con M ELK-A24-10-532 (SEC ID NO: 27) (d), #5 con ELK-A02-9-138 (SEC ID NO: 36) (e), #3 con MELK-A02-9-193 (SEC ID NO: 46) (f), #1 con MELK-A02-9-171 (SEC ID NO: 57) (g), #2 con M ELK-A02-9-71 (SEC ID NO: 60) (h) y #2 con MELK-A02-9-532 (SEC ID NO: 62) (i) demostraron potente producción IFN-gamma en comparación con los depósitos de control. Además, las células en el número de depósito positivo #5 estimulado con SEC ID NO: 14, #3 con SEC ID NO: 21, #4 con SEC ID NO: 23, #4 con SEC ID NO: 27, #5 con SEC ID NO: 36, #3 con SEC ID NO: 46, #1 con SEC ID NO: 57, #2 con SEC ID NO: 60 y #2 con SEC ID NO: 62 fueron expandidas y establecieron líneas CTL. La actividad CTL de dichas líneas CTL fue determinada mediante ensayo ELISA IFN-gamma (figura 2a-i). Todas las líneas CTL demostraron potente producción IFN-gamma contra las células objetivo pulsadas con el péptido correspondiente en comparación con células objetivo sin pulsación de péptido. Por otra parte, no se pueden establecer líneas CTL mediante estimulación con otros péptidos mostrados en la tabla 2, a pesar de que los péptidos tuvieron una posible actividad de enlace con HLA-A*2402 o HLA-A*0201 (datos no mostrados). En consecuencia, únicamente no había péptidos de
los 92 péptidos candidatos derivados de MELK, pueden inducir líneas CTL potente.
Establecimiento de clones CTL contra péptidos específicos MELK
Los clones CTL fueron establecidos limitando la dilución de las líneas CTL tal como se describe en la sección de "Materiales y Métodos", y la producción IFN-gamma de los clones CTL contra péptido pulsado con células objetivo se determinó mediante ensayo ELISA IFN-gamma. Se determinaron producciones IFN-gamma potentes de clones CTL estimulados con SEC ID NO: 27 en a figura 3.
Actividad CTL específica contra células objetivo que presentan el péptido procesado en forma endógena a partir de MELK con HLA-A*0201
Las líneas CTL establecidas que surgieron contra estos péptidos fueron revisadas con respecto a su capacidad de reconocer células objetivo que presentan el péptido candidato procesado en forma endógena a partir de MELK con la molécula HLA-A*0201. Se probó la actividad CTL específica contra células COS7 las cuales se transfectaron tanto con la longitud total de MELK como del gen de la molécula HLA-A*0201 (un modelo específico para las células objetivos que expresa MELK y el gen HLA-A*0201), utilizando líneas CTL que surgieron mediante el péptido correspondiente como las células efectoras. Las células COS7 transfectadas ya sea con la longitud total de
los genes MELK o HLA-A*0201 se prepararon como control. En la figura 4, los CTLs estimulados con SEC ID NO: 36 (a) y SEC ID NO: 57 (b) mostraron potente actividad CTL contra células COS7 que expresan tanto MELK como HLA-A02. Por otra parte, no se detectó actividad CTL específica significativa contra los controles. Por lo tanto, estos datos demuestran claramente que los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 36 y SEC ID NO: 57 se presentan naturalmente en las células objetivo con la molécula HLA-A*0201 y son reconocidos por los CTLs. Estos resultados indicaron que estos dos péptidos derivados de MELK pueden estar disponibles para aplicar las vacunas de cáncer a pacientes con tumores que expresan MELK.
Análisis de homología para péptidos de antíqeno
Los CTLs estimulados con M ELK-A24-9-326 (SEC ID NO:
14), MELK-A24-9-78 (SEC ID NO: 21), M ELK-A24-10-637 (SEC ID NO: 23), M ELK-A24- 10-532 (SEC ID NO: 27), MELK-A02-9-138 (SEC ID NO: 36), M ELK-A02-9-193 (SEC ID NO: 46), MELK-A02-9-171 (SEC ID NO: 57), M ELK-A02-9-71 (SEC ID NO: 60) y MELK-A02-9-532 (SEC ID NO: 62) mostraron actividad CTL significativa y específica. Este resultado puede ser debido al hecho de que las secuencias de MELK-A24-9-326 (SEC ID NO: 14), MELK-A24-9-78 (SEC ID NO: 21), MELK-A24-10-637 (SEC ID NO: 23), M ELK-A24-10-532 (SEC ID NO: 27), MELK-A02-9- 138 (SEC ID NO: 36), M ELK-A02-9-193 (SEC ID NO: 46), MELK-
A02-9-171 (SEC ID NO: 57), M E LK-A02-9-71 (SEC ID NO: 60) y MELK-A02-9-532 (SEC ID NO: 62) son homologas para los péptidos derivados de otras moléculas que son conocidas por sensibilizar el sistema inmune humano. Para excluir esta posibilidad, se llevaron a cabo análisis de homología para estas secuencias de péptido utilizando como consultas del algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi) el cual reveló que no hay secuencia con homología significativa. Los resultados de los análisis de homología indican que las secuencias de MELK-A24-9-326 (SEC ID NO: 14), MELK-A24-9-78 (SEC ID NO: 21), MELK-A24-10-637 (SEC ID NO: 23), MELK-A24-10-532 (SEC ID NO: 27), M ELK-A02-9-138 (SEC ID NO: 36), MELK-A02-9-193 (SEC ID NO: 46), ELK-A02-9-171 (SEC ID NO: 57), MELK-A02-9-71 (SEC ID NO: 60) y MELK-A02-9-532 (SEC ID NO: 62) son únicas y por lo tanto, existe poca posibilidad, hasta nuestro mejor conocimiento, de que estas moléculas eleven respuestas inmunológicas no proyectadas para algunas moléculas no relacionadas.
En conclusión, los péptidos de epítope HLA-A24 y HLA-A02 novedosos derivados de MELK fueron identificados y demostraron ser aplicables parar inmunoterapia de cáncer.
Aplicabilidad Industrial
La presente invención describe nuevos TAAs, particularmente los derivados de MELK inducen respuestas inmune anti-tumor potentes y específicas y tienen aplicabilidad
para una amplia variedad de tipos de cáncer. Dichos TAAs garantizan el desarrollo adicional como vacunas de péptidos contra enfermedades asociadas con MELK, por ejemplo, cánceres tales como cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y SCC.
Aunque la presente invención se describe con detalle en lá presente invención, y con referencia a modalidades específicas de la misma, quedará entendido que la descripción anterior tiene naturaleza de ejemplo y explicatoria y está proyectada para ilustrar la presente invención y sus modalidades preferidas. A través de la experimentación de rutina, un experto en la técnica reconocerá fácilmente que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones en la misma sin apartarse de su espíritu y alcance, cuyas asignaciones y límites están definidas a través de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (23)
1. Un péptido aislado derivado de SEC ID NO: 94, caracterizado porque el péptido comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEC ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62; y (b) SEC ID NOs: 14, 21, 23, 27, 36, 46, 57, 60 y 62, en donde 1, 2, o más aminoácidos son sustituidos, insertados, eliminados y/o agregados, y tiene inducibilidad de linfocito T citotóxica (CTL).
2. El péptido tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido consiste de menos 15 residuos de aminoácido.
3. El péptido tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque el péptido es un nonapéptido o un decapéptido.
4. El péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 3, caracterizado porque el péptido, que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 14, 21, 23 y 27, tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido del N-término es seleccionado del grupo de fenilalanina, tirosina, metionina y triptofan, y (b) el aminoácido C-terminal es seleccionado del grupo de fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofan y metionina.
5. El péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 3, caracterizado porque el péptido, que comprende la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NOs: 36, 46, 57, 60 y 62, tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido del N-término es seleccionado del grupo de leucina o metionina, y (b) el aminoácido C-terminal es seleccionado del grupo de valina o leucina.
6. Un polinucleótido aislado que codifica un péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5.
7. Un agente farmacéutico para el tratamiento y/o profilaxis de cáncer, y/o la prevención de una recurrencia post-operatoria del mismo, en donde el agente comprende un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste en: (a) uno o más péptidos tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5; (b) uno o más polinucleótidos que codifican el péptido en una forma expresable; (c) una o más células que presentan antígenos y/o exosomas, en donde las células que presentan antígenos y los exosomas presentan un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5 en su superficie; (d) uno o más CTLs inducidos contra un péptido tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 6; y (e) combinaciones de los mismos.
8. El agente farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 7, formulado para la administración a un sujeto cuyo antígeno es HLA es HLA-A24 o HLA-A02.
9. El agente farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 7, formulado para el tratamiento de cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, leucemia mieloide crónica (CML), cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y cáncer de pulmón de célula pequeña.
10. El agente farmacéutico tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el agente se formula como una vacuna.
11. Un método para inducir una célula que presenta antígenos con alta inducibilidad CTL, caracterizado porque el método comprende el paso de contactar una célula que presenta antígenos con un péptido tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5, o el paso de introducir un polinucleótido que codifica el péptido en una forma expresable en una célula que presenta antígenos.
12. Un método para inducir CTL utilizando un péptido tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5.
13. El método para inducir CTL, caracterizado porque el método comprende el paso seleccionado del grupo que consiste en: (a) contactar una célula t positiva CD 8 con una célula que presenta antígeno y/o un exosoma, el cual presenta un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5 en su superficie; y (b) introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido el cual tiene la capacidad de formar una subunidad TCR que reconoce un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5 en una célula T positiva CD8.
14. Un CTL aislado que dirige cualesquiera de los péptidos tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5.
15. Un CTL aislado el cual se induce a través de un péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5.
16. El CTL tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 14 ó 15, caracterizado porque el CTL tiene la capacidad de reconocer un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5 en una célula.
17. Una célula que presenta antígenos aislados que presenta un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5 en su superficie.
18. La célula que presenta antígeno tal como se describe en la reivindicación 17, caracterizada porque es inducida a través del método tal como se describe en la reivindicación 11.
19. La célula que presenta antígenos tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 17 o 18, caracterizado porque el antígeno HLA es HLA-A24 o HLA-A02.
20. Un agente para inducir una respuesta inmune contra un cáncer en un sujeto, caracterizado porque el agente comprende un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste en: (a) uno o más péptidos tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5; (b) uno o más polinucleótidos que codifican el péptido en una forma expresable; (c) una o más células que presentan antígenos y/o exosomas, caracterizada porque las células que presentan antígenos y los exosomas presentan un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido tal como se establece en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5 en su superficie; (d) uno o más CTLs inducidos contra un péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 6; y (e) combinaciones de los mismos.
21. Un método para inducir una respuesta inmune contra un cáncer en un sujeto, caracterizado porque el método comprende el paso de administrar al sujeto, un agente que comprende un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste en: (a) uno o más péptidos tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5; (b) uno o más polinucleótidos que codifican el péptido en una forma expresable; (c) una o más células que presentan antígeno y/o exosomas, caracterizado porque las células que presentan antígeno y los exosomas presentan un complejo formado entre un antígeno HLA y un péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 5 en su superficie; (d) uno o más CTLs inducidos contra un péptido tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a 6; y (e) combinaciones de los mismos.
22. El método tal como se describe en la reivindicación 21, caracterizado porque cáncer es seleccionado del grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer de seno, cáncer cervical, carcinoma colangiocelular, CML, cáncer colorectal, endometriosis, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de hígado, NSCLC, linfoma, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma renal y cáncer de pulmón de célula pequeña.
23. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, caracterizado porque el sujeto tiene HLA-A24 o HLA-A02.
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