ES2327229T3 - Presentacion del receptor de linfocitos t. - Google Patents

Abstract

Una partícula de fago que presenta en su superficie un polipéptido TCR de una cadena (scTCR) o un par polipeptídico de TCR dimérico (dTCR), en el que dicho scTCR está constituido por un primer segmento una secuencia del dominio variable de la cadena alfa o delta del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena alfa del TCR, un segundo segmento constituido por una secuencia del dominio variable de la cadena beta o gamma del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena beta del TCR, una secuencia espaciadora que liga el extremo C del primer segmento con el extremo N del segundo segmento, o viceversa, y un puente disulfuro entre los segmentos primero y segundo, en el que dicho puente disulfuro es uno que no tiene equivalente en los receptores de células T alfabeta o gammadelta nativos; en el que dicho par polipeptídico de dTCR está constituido por un primer polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena alfa o delta del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena alfa del TCR un segundo polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena Beta o gamma del TCR está fusionada con el extremo N de una secuencia correspondiente a la secuencia extracelular del dominio constante de la cadena beta del TCR, los polipéptidos primero y segundo, en el que están unidos por un puente disulfuro que no tiene equivalente en los receptores de células T alfabeta o gammadelta nativos, en el que dicho puente disulfuro entre los segmentos primero y segundo del scTCR, o entre los polipéptidos primero y segundo del dTCR, entre las cisternas sustituidas por los siguientes pares de residuos en el exón 1 de TRAC*01 para la cadena alfa del TCR y TRBC1*0 o TRBC2*01 para la cadena beta del TCR:

Description

Presentación del receptor de linfocitos T.

La presente invención se refiere a partículas proteináceas, por ejemplo partículas de fago o de ribosoma, que presentan receptores de células T (TCR) y diversas bibliotecas de las mismas.

Antecedentes de la invención TCR nativos

Como se describe en, por ejemplo, el documento WO99/60120, los TCR median el reconocimiento de complejos péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y, como tales, son esenciales para el funcionamiento de la rama celular del sistema inmunitario.

Los anticuerpos y los TCR son los únicos dos tipos de moléculas que reconocen los antígenos de un modo específico y, por tanto, el TCR es el único receptor para antígenos peptídicos concretos presentados en el MHC, a menudo siendo el péptido extraño el único signo de anomalía dentro de una célula. El reconocimiento de las células T se produce cuando una célula T y una célula presentadora de antígeno (CPA) están en contacto físico directo y se inicia mediante la unión de los TCR específicos del antígeno con los complejos pMHC.

El TCR nativo es una proteína heterodimérica de la superficie celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas que está asociada con proteínas invariables del complejo CD3 implicado en la mediación de la transducción de la señal. Los TCR existen en las formas \alpha\beta y \gamma\delta, que son estructuralmente similares pero tienen localizaciones anatómicas, y probablemente funciones, distintas. Los ligandos de clase I y clase II del MHC también son proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, pero están especializadas en la presentación del antígeno, con un sitio de unión peptídica altamente polimórfico que les permite presentar una gran diversidad de fragmentos peptídicos cortos en la superficie celular de las CPA.

Se sabe que otras dos clases de proteínas son capaces de funcionar como ligandos de los TCR. (1) los antígenos CD1 son moléculas relacionadas con el MHC de clase I cuyos genes se localizan en un cromosoma distinto al de los antígenos de clase I y clase II del MHC típicos. Las moléculas CD1 son capaces de presentar restos peptídicos y no peptídicos (p. ej., lípidos, glicolípidos) a las células T de un modo análogo al de los complejos péptido-MHC de clase I y de clase II convencionales. Véase, por ejemplo, (Barclay y col, (1997) The Leucocyte Antigen Factsbook 2 nd Edition, Academic Press) y (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373) (2) los superantígenos bacterianos son toxinas solubles que son capaces de unirse tanto a las moléculas del MHC de clase II como a una subpoblación de TCR (Fraser (1989) Nature 339 221-223). Muchos antígenos exhiben especificidad por uno o dos segmentos Vbeta, mientras que otros exhiben una unión más promiscua. En cualquier caso, los superantígenos son capaces de provocar una respuesta inmunitaria potenciada en virtud de su capacidad para estimular subpoblaciones de células T de un modo policlonal.

La porción extracelular de los TCR \alpha\beta y \gamma\delta heterodiméricos nativos consta de dos polipéptidos, cada uno de los cuales posee un dominio constante cerca de la membrana y un dominio variable lejos de la membrana. Cada uno de los dominios constante y variable incluye un puente disulfuro intracatenario. Los dominios variables contienen los bucles altamente polimórficos análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos. La CDR3 de los TCR \alpha\beta interacciona con el péptido presentado por el MHC, y las CDR3 1 y 2 de los TCR \alpha\beta interaccionan con el péptido y con el MHC. La diversidad de las secuencias del TCR se genera a través de la reorganización somática de los genes ligados de las regiones variables (V), diversidad (D), de acoplamiento (J) y constantes.

Los polipéptidos funcionales de las cadenas \alpha Y \gamma están formados por regiones V-J-C reorganizadas, mientras que las cadenas \beta y \delta están compuestas por regiones V-D-J-C. El dominio constante extracelular tiene una región proximal a la membrana y una región de inmunoglobulina. Existen dominios constantes de cadena sencilla \alpha y \delta, conocidos como TRAC y TRDC, respectivamente. El dominio constante de la cadena \beta está compuesto por uno de dos dominios constantes \beta diferentes, conocidos por TRBC1 y TRBC2 (nomenclatura del IMGT) Entre estos dominios constantes de \beta hay cuatro cambios aminoacídicos, tres de los cuales están dentro de los dominios usados para producir los TCR de cadena sencilla que se presentan en las partículas de fago de la presente invención. Todos estos cambios están dentro del exón 1 de TRBC1 y TRBC2: N4K5->K4N5 y F37->Y (numeración del IMGT, diferencias TRBC1->TRBC2), mientras que el cambio del aminoácido final entre las dos regiones constantes de la cadena \beta del tCR está en el exón 3 de TRBC1 y TRBC2: V1->E. El dominio constante de \gamma está compuesto por uno de TRGC1, TRGC2(2x) o TRGC2(3x). Los dos dominios constantes TRGC2 sólo difieren en el número de copias presentes de los aminoácidos codificados por el exón 2 de este gen.

La extensión de cada uno de los dominios extracelulares del TCR es algo variable. No obstante, un experto en la técnica puede determinar con facilidad la posición de los límites del dominio usando una referencia tal como The T Cell Receptor Facts Book, Lefranc & Lefranc, Publ Academic Press 2001.

TCR recombinantes

La producción de TCR recombinantes es beneficiosa porque proporcionan análogos solubles de TCR adecuados para los propósitos siguientes:

\bullet

Estudiar las interacciones TCR/Ligando (p. ej., pMHC por TCR \alpha\beta)

\bullet

Detección selectiva de inhibidores de interacciones asociadas con TCR

\bullet

Proporcionar la base de posibles terapéuticas

Hasta la fecha, se han concebido una serie de constructos para la producción de TCR recombinantes. Estos constructos caen dentro de dos clases amplias, TCR de cadena sencilla y TCR diméricos, la literatura relevante de estos constructos se resume más adelante.

Los TCR de cadena sencilla (scTCR) son constructos artificiales compuestos por una hebra sencilla de aminoácidos, que, como los TCR heterodiméricos nativos, se unen a complejos MHC-péptido. Por desgracia, los intentos de reducir TCR funcionales análogos de alfa/beta simplemente uniendo las cadenas alfa y beta de modo que se expresen ambas en un único marco de lectura abierto no han tenido éxito, probablemente por la inestabilidad natural del apareamiento del dominio soluble alfa-beta.

En consecuencia, para la producción de scTCR han sido necesarias técnicas especiales usando diversas fragmentaciones de una de las cadenas alfa y beta o de ambas. Estos formatos parecen ser aplicables únicamente a una gama muy limitada de secuencias de scTCR. Soo Hoo y col (1992) PNAS. 89 (10): 4759-63 comunican la expresión de un TCR de ratón en formato de cadena sencilla en el clon de células T 2C usando una cadena alfa y beta truncada unida con un espaciador de 25 aminoácidos y expresión periplásmica bacteriana (véase también Schodin y col (1996) Mol. Immunol. 33 (9): 819-29). Este diseño también forma la base del TCR de cadena sencilla m6 comunicado por Holler y col. (2000) PNAS. 97 (10): 5387-92, que deriva del scTCR 2C y se une al mismo aloepítopo restringido en H2-Ld. Shusta y col. (2000) Nature Biotechnology 18: 754-759 y en el documento de EE.UU. 6.423.538 comunican el uso de constructos murinos de TCR 2C de cadena sencilla en experimentos de presentación en levaduras, que produjeron TCR mutados con una estabilidad y térmica y solubilidad potenciadas. Este informe también demostró la capacidad de estos TCR 2C presentados para unirse de forma selectiva a células que expresan su pMHC conocido. Khandekar y col. (1997) J. Biol. Chem.. 272 (51): 32190-7 comunican un diseño similar para el TCR D10 murino, aunque este scTCR estaba fusionado con MBP y se expresó en el citoplasma bacteriano (véase también Hare y col. (1999) Nat. Struct. Biol. 6 (6): 574-81). Hilyard y col. (1994) PNAS. 91 (19): 9057-61 comunican un scTCR humano específico para la proteína de matriz del influenza HLA-A2 usando un diseño V\alpha-espaciador-V\beta y de expresión en el periplasma bacteriano.

Chung y col. (1994) PNAS. 91 (26) 12654-8 comunican la producción de un scTCR humano usando un diseño V\alpha-espaciador- V\beta-C\beta y expresión sobre la superficie de una línea celular de mamíferos. Este informe no incluye ninguna referencia a la unión específica péptido-HLA del scTCR. Plaksin y col (1997) J. Immunol. 158 (5): 2218-27 comunican un diseño V\alpha-espaciador-V\beta-C\beta similar para producir un scTCR murino específico para un epítopo gp120-H-2Dd del VIH. Este scTCR se expresa en forma de cuerpos de inclusión bacterianos y se repliega in vitro.

En una serie de artículos se describe la producción de heterodímeros de TCR que incluyen el puente disulfuro nativo, que conecta las respectivas subunidades (Garboczi, y col., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, y col., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang y col., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau y col., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden y col., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; patente de EE.UU. nº 6080840). No obstante, aunque dichos TCR se pueden reconocer mediante anticuerpos específicos de TCR, no se demostró que ninguno reconociera su ligando nativo aparte de a concentraciones relativamente altas y/o no eran estables.

En el documento WO 99/60120 se describe un TCR soluble que está correctamente plegado de modo que es capaz de reconocer a su ligando nativo, es estable durante un periodo de tiempo y puede producirse en cantidades razonables. Este TCR comprende un dominio extracelular de cadena \alpha o \gamma del TCR dimerizado con un dominio extracelular de cadena \beta o \delta del TCR, respectivamente, por medio de un par de péptidos de dimerización en el extremo C, como cremalleras de leucina. Esta estrategia de producir TCR suele ser aplicable a todos los TCR.

Reiter y col, Immunity, 1995, 2:281-287, detalla la construcción de una molécula soluble que comprende dominios variables de \alpha y \beta del TCR estabilizados con puentes disulfuro, uno de los cuales está unido a una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas (PE38). Una de las razones indicadas para producir esta molécula era para superar la inestabilidad inherente de los TCR de cadena sencilla. La posición del nuevo puente disulfuro en los dominios variables del TCR se identificó mediante homología con los dominios variables de los anticuerpos, en los que estos se han introducido previamente (por ejemplo, véase Brinkmann, y col. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7538-7542, y Reiter, y col. (1994) Biochemistry 33: 5451-5459). No obstante, dado que esta homología no existe entre los dominios variables del anticuerpo y del TCR, dicha técnica no se podía emplear para identificar los sitios adecuados para los nuevos puentes disulfuro entre cadenas entre los dominios constantes del TCR.

Como se ha mencionado en lo que antecede, Shusta y col. (2000) Nature Biotechnology 18: 754-759 comunican el uso de constructos de TCR 2C de cadena sencilla en experimentos de presentación en levaduras. El principio de presentación de scTCR sobre partículas de fago se ha tratado previamente. Por ejemplo, el documento WO 99/19129 detalla la producción de scTCR y resume un posible procedimiento para la producción de partículas de fago que presentan scTCR del formato V\alpha-Espaciador-V\beta C\beta. No obstante, esta aplicación no contiene ejemplos que demuestren la producción de dichas partículas de fago que presenten TCR. Sin embargo, la aplicación sí hace referencia a una solicitud pendiente de tramitación.

"En dicha solicitud de EE.UU. pendiente de tramitación nº 08/813-781 se ha descrito la construcción de vectores de ADN que incluyan un segmento de ADN que codifique una molécula de scTCR fusionada con una proteína de la cubierta del bacteriófago (gen II o gen VIII)".

Además, esta solicitud depende de la capacidad de los anticuerpos anti-TCR o de los complejos superantígeno MHC para reconocer los scTCR solubles no presentados en el fago para verificar su conformación correcta. Por tanto, no se ha demostrado de un modo concluyente la especificidad verdadera de la unión péptido-MHC de los scTCR en cualquier formato. Por último, en otro estudio (Onda y col., (1995) Molecular Immunology 32 (17-18) 1387-1397) se desvela la presentación en fagos de dos cadenas \alpha de TCR murino en ausencia de sus respectivas cadenas \beta. Este estudio demostró que las partículas de fago que presentan una de las cadenas \alpha del TCR (Derivada del hibridoma murino A.1.1) se unían preferentemente a los mismos péptidos inmovilizados en pocillos de microtitulación a los que el TCR completo respondería normalmente cuando fueran presentados por MHC de clase I-A^{d} murino.

Uso de la detección selectiva

Una serie de importantes interacciones celulares y respuestas celulares, incluida la sinapsis inmunitaria mediada por el TCR, son controladas por los contactos entre los receptores de la superficie celular y los ligandos presentados sobre las superficies de otras células. Estos tipos de contactos moleculares específicos son de crucial importancia para la correcta regulación bioquímica en el cuerpo humano y, por tanto, se están estudiando intensamente. En muchos casos, el objetivo de dichos estudios es concebir un medio de modular las respuestas celulares con el fin de prevenir o combatir la enfermedad.

Por tanto, los procedimientos con los que identificar compuestos que se unan con algún grado de especificidad a moléculas receptoras o ligandos humanos son importantes porque conducen al descubrimiento y desarrollo de nuevas terapéuticas para las enfermedades. En particular, los compuestos que interfieren con ciertas interacciones receptor-ligando poseen un potencial inmediato como agentes o portadores terapéuticos.

Los avances en química combinatoria que permiten la producción relativamente sencilla y rentable de bibliotecas de compuestos muy grandes han aumentado enormemente el ámbito de los análisis de compuestos. No obstante, las limitaciones de los programas de detección selectiva residen muy a menudo en la naturaleza de los ensayos que se pueden emplear, la producción de moléculas receptoras y ligandos adecuadas y lo bien que estos ensayos se pueden adaptar a los procedimientos de detección selectiva de alto rendimiento.

Procedimientos de presentación

A menudo es deseable presentar un péptido o polipéptido dado sobre la superficie de una partícula proteinácea. Dichas partículas pueden servir como ayudas de la purificación para el péptido o polipéptido (dado que las partículas portadoras del péptido o polipéptido pueden separarse de contaminantes no deseados mediante sedimentación u otros procedimientos). También pueden servir como vacunas particuladas, de modo que la respuesta inmunitaria al péptido o polipéptido presentado en la superficie está estimulada por la presentación particulada. La proteína p24 del retrotransposón de levaduras y la proteína de la cubierta de superficie de la hepatitis B son ejemplos de proteínas que se autoensamblan en partículas. La fusión del péptido o polipéptido de interés con estas proteínas formadoras de partículas es un modo reconocido de presentar el péptido o polipéptido sobre la superficie de las partículas resultantes.

No obstante, los procedimientos de presentación en partículas se han usado principalmente para identificar proteínas con propiedades deseables tales como rendimientos de expresión potenciada, unión y/o características de estabilidad. Estos procedimientos implican crear un grupo diverso o "biblioteca" de proteínas o polipéptidos expresados sobre la superficie de partículas proteináceas. Estas partículas tienen dos características clave, en primer lugar cada partícula presenta una única proteína variante o polipéptido y, en segundo lugar, el material genético que codifica la proteína o polipéptido expresado está asociado con el de la partícula. A continuación, esta biblioteca se somete a uno o más ciclos de selección. Por ejemplo, esto puede consistir en poner en contacto un ligando con una biblioteca de presentación en partículas de receptores mutados e identificar qué receptores mutados se unen al ligando con la mayor afinidad. Una vez que el proceso de selección se ha completado, se pueden aislar el receptor o receptores con las propiedades deseadas y el material genético se puede amplificar con el fin de poder secuenciar los receptores.

Estos procedimientos de presentación entran dentro de dos amplias categorías, presentación in-vitro e in-vivo.

Todos los procedimientos de presentación in vivo residen en una etapa en la que la biblioteca, normalmente codificada en o con el ácido nucleico de una partícula replicable tal como un plásmido o un fago, el replicón se transforma en las células para permitir la expresión de las proteínas o los polipéptidos. (Plückthun (2001) Adv Protein Chem 55 367-403). Existen numerosos sistemas de replicón/huésped que se ha probado que son adecuados para la presentación in vivo de proteínas o polipéptidos. Éstos incluyen los siguientes

Fago/células bacterianas

Plásmido/células CHO

Vectores basados en las células de levaduras/plásmido de 2 \mum de levaduras

Baculovirus/células de insecto

Plásmido/células bacterianas

Los procedimientos de presentación in vivo incluyen procedimientos de presentación en la superficie de la célula en los que un plásmido se introduce en la célula huésped que codifica una proteína de fusión consistente en la proteína o polipéptido de interés fusionado con una proteína o polipéptido de la superficie celular. La expresión de esta proteína de fusión conduce a la presentación de la proteína o polipéptido sobre la superficie de la célula. Las células que presentan estas proteínas o polipéptidos de interés pueden someterse después a un proceso de selección tal como FACS y se pueden aislar y secuenciar los plásmidos obtenidos de la célula o células seleccionadas. Se han concebido sistemas de presentación sobre la superficie celular para células de mamífero (Higuschi (1997) J Immunol. Methods 202 193-204), células de levadura (Shusta (1999) J Mol Biol 292 949-956) y células bacterianas (Sameulson (2002) J. Biotechnol 96 (2) 129-154).

Se han publicado numerosas revisiones de las diversas técnicas de presentación in vivo. Por ejemplo, (Hudson (2002) Expert Opin Biol Ther (2001) 1 (5) 845-55) y (Schmitz (2000) 21 (Supp A) S106-S112).

Los procedimientos de presentación in vitro se basan en el uso de ribosomas para traducir las bibliotecas de ARNm en una matriz diversa de variantes proteicas o polipeptídicas. La unión entre las proteínas o los polipéptidos formados y el ARNm que codifica estas moléculas se mantiene mediante uno de dos procedimientos. La presentación convencional en ribosoma utiliza secuencias de ARNm que codifican una secuencia de unión corta (normalmente de 40-100 aminoácidos) y la proteína o polipéptido que se van a presentar. La secuencia de unión permite que la proteína o polipéptido presentado tenga suficiente espacio para volver a plegarse sin que el ribosoma lo impida estéricamente. La secuencia de ARNm carece de un codón de "terminación", esto asegura que la proteína o polipéptido expresados y el ARN permanecen unidos a la partícula ribosómica. El procedimiento de presentación relacionado con el ARNm se basa en la preparación de las secuencias de ARNm que codifican la proteína o polipéptido de interés y los espaciadores de ADN que portan un resto de puromicina. En cuanto que el ribosoma alcanza la unión ARNm/ADN, la traducción se detiene y la puromicina forma un enlace covalente con el ribosoma. Para una revisión reciente de estos dos procedimientos de presentación in vitro relacionados véase (Amstutz (2001) Curr Opin Biotechnol 12 400-405).

Particularmente preferida es la técnica de presentación en fago que se basa en la capacidad de las partículas de bacteriófago para expresar un péptido o polipéptido heterólogo fusionado con sus proteínas de superficie. (Smith (1985) Science 217 1315-1317). El procedimiento es bastante general y bien entendido en la técnica para la presentación de monómeros polipeptídicos. No obstante, en el caso de los polipéptidos que en su forma nativa se asocian en forma de dímeros, sólo la presentación en fago de anticuerpos parece haber sido investigada exhaustivamente.

Para la presentación de polipéptido monomérico hay dos procedimientos principales:

En primer lugar (Procedimiento A) mediante la inserción en un vector (fagemido) de ADN que codifica el péptido o polipéptido heterólogo fusionado al ADN que codifica una proteína de recubrimiento del bacteriófago. A continuación se lleva a cabo la expresión de partículas de fago que presentan el péptido o polipéptido heterólogo mediante la transfección de células bacterianas con el fagemido y, después, la infección de las células transformadas con un "fago colaborador". El fago colaborador actúa como fuente de las proteínas del fago no codificadas por el fagemido requerido para producir una partícula de fago funcional.

En segundo lugar (Procedimiento B) mediante la inserción de ADN que codifica el péptido o polipéptido heterólogo en un genoma de fago completo fusionado al ADN que codifica una proteína de recubrimiento del bacteriófago. A continuación se lleva a cabo la expresión de partículas de fago que presentan el péptido o polipéptido heterólogo mediante la infección de células bacterianas con el genoma del fago. Este procedimiento posee la ventaja del primer procedimiento de ser un procedimiento de "una sola etapa". No obstante, se reduce el tamaño de la secuencia de ADN heterólogo que se puede empaquetar con éxito en las partículas de fago resultantes. M13, T7 y Lambda son ejemplos de fagos adecuados para este procedimiento.

Una variación del (Procedimiento B) implica añadir una secuencia de ADN que codifica un dominio de unión nucleotídica al ADN en el genoma del fago, que codifica el péptido heterólogo a presentar, y añadir además el correspondiente sitio de unión nucleotídica al genoma del fago. Esto hace que el péptido heterólogo se una directamente al genoma del fago. Este complejo péptido/genoma se empaqueta después en una partícula de fago que presenta el péptido heterólogo. Este procedimiento se describe completamente en el documento WO 99/11785.

Las partículas de fago se pueden recuperar después y usar para estudiar las características de unión del péptido o polipéptido heterólogo. Una vez aislado, el ADN del fagemido o fago se puede recuperar de la partícula de fago que presenta el péptido o polipéptido, y este ADN se puede replicar mediante PCR. El producto de la PCR se puede usar para secuenciar el péptido o polipéptido heterólogo presentado por una partícula de fago dada.

La presentación en fago de anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de los mismos se ha convertido en un medio de rutina para estudiar las características de unión de estos polipéptidos. Se dispone de numerosos libros que revisan las técnicas de presentación en fagos y la biología del bacteriófago. (Véase, por ejemplo, Phage Display - A Laboratory Manual, Barbas y col., (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Un tercer procedimiento de presentación en fago (Procedimiento C) depende del hecho de que los polipéptidos heterólogos que tienen un residuo de cisteína en una localización deseada se pueden expresar en una forma soluble a través del genoma de un fagemido o un fago, y se pueden asociad con una proteína modificada de la superficie del fago que también posea un residuo de cisteína en una posición expuesta en la superficie, a través de la formación de un puente disulfuro entre las dos cisteínas. El documento WO 01/05950 detalla el uso de este procedimiento de unión alternativo para la expresión de péptidos derivados de anticuerpos de cadena sencilla.

Breve descripción de la invención

Los TCR nativos son heterodímeros que poseen dominios transmembrana de gran longitud que son esenciales para mantener su estabilidad como dímeros funcionales. Como se ha tratado en lo que antecede, los TCR son útiles para fines de investigación y terapéuticos en sus formas solubles, por lo que su presentación en la forma nativa insoluble tiene poca utilidad. Por otro lado, se ha probado que las formas estables solubles de los TCR son difíciles de diseñar y, dado que la mayoría de los procedimientos de presentación parecen haber sido descritos únicamente para péptidos monoméricos y polipéptidos, los procedimientos de presentación adecuados para los TCR diméricos solubles no se han investigado. Es más, dado que la funcionalidad de los TCR presentados depende de la asociación adecuada de los dominios variables del dímero de TCR, la presentación con éxito de un TCR dimérico funcional no es trivial.

El documento 99/18129 contiene la afirmación: "Los constructos de ADN que codifican las proteínas de fusión de scTCR se pueden usar para fabricar una biblioteca de presentación en bacteriófagos de acuerdo con procedimientos descritos en la solicitud de EE.UU. pendiente de tramitación nº de serie 08/813.781 concedida el 7 de marzo de 1997, cuya descripción se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia", pero en esta solicitud no se incluye ninguna descripción real de tal presentación. No obstante, los inventores de esta solicitud publicaron un artículo (Weidanz (1998) J Immunol Methods 221 59-76) que demuestra la presentación de dos scTCR murinos sobre las partículas de fago.

El documento WO 01/62908 desvela procedimientos para la presentación en el fago de scTCR y scTCR/proteínas de fusión con Ig. No obstante, no se ha evaluado la funcionalidad (unión específica a pMHC) de los constructos descritos.

Por último, se ha demostrado un procedimiento mediado por retrovirus para la presentación de diversas bibliotecas de TCR sobre la superficie de células T inmaduras para un TCR murino. La biblioteca de TCR mutados presentados en la superficie de las células T inmaduras se sometió a detección selectiva mediante citometría de flujo usando tetrámeros de pMHC, lo que condujo a la identificación de variantes de TCR que era específico para el pMHC conocido, o una variante del mismo. (Helmut y col., (2000) PNAS 97 (26) 14578-14583).

La presente invención se basa en parte en el hallazgo de que TCR de cadena sencilla y diméricos se pueden expresar como fusiones de superficie en las partículas de fago y permite la disposición de partículas de fago que presentan constructos de scTCR análogos de alfa/beta y análogos de gamma/delta y de dTCR. Dichos TCR presentados sobre partículas de fago son útiles para la purificación y detección selectiva, particularmente como una biblioteca diversa de TCR presentados en fagos para biopaning para identificar TCR con características deseables tales como afinidad elevada por el complejo MHC-péptido diana. En la última relación, los scTCR presentados sobre fagos pueden ser útiles para la identificación del TCR deseado, pero dicha información se puede aplicar mejor a la construcción de TCR diméricos análogos para su uso último en terapias. La invención también incluye TCR de alta afinidad identificables mediante estos procedimientos.

Descripción detallada de la invención

En un amplio aspecto, la presente invención proporciona una partícula de fago que presenta en su superficie un TCR polipeptídico de cadena sencilla (scTCR) o un par polipeptídico de TCR (dTCR), en el que dicho scTCR polipeptídico está constituido por

un primer segmento constituido por una secuencia del dominio variable de la cadena \alpha o \delta del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \alpha del TCR.

un segundo segmento constituido por una secuencia del dominio variable de la cadena \beta o \gamma del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \beta del TCR.

una secuencia espaciadora que liga el extremo C del primer segmento con el extremo N del segundo segmento, o viceversa, y

un puente disulfuro entre los segmentos primero y segundo, en el que dicho puente disulfuro es uno que no tiene equivalente en los receptores de células T \alpha\beta o \gamma\delta nativos.

en el que dicho par polipeptídico de dTCR está constituido por

un primer polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena \alpha o \delta del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \alpha del TCR, y

un segundo polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena \beta o \gamma del TCR está fusionada con el extremo N de una secuencia correspondiente a un dominio constante de la cadena \beta del TCR.

Los polipéptidos primero y segundo, que están unidos por un puente disulfuro que no tiene equivalente en los receptores de células T \alpha\beta o \gamma\delta nativos, en el que dicho puente disulfuro entre los segmentos primero y segundo del scTCR o entre los polipéptidos primero y segundo del dTCR entre cisternas están sustituidos por los siguientes pares de residuos en el exón 1 de TRAC*01 para la cadena \alpha del TCR y de TRBC1*01 o TRBC2*01 para la cadena \beta del TCR.

1

Las secuencias del dominio variable del par polipeptídico del dTCR o del polipéptido del scTCR están mutuamente orientadas sustancialmente como en los TCR nativos y el puente disulfuro entre los segmentos primero y segundo del scTCR o entre los polipéptidos primero y segundo del dTCR no tiene equivalente en los receptores nativos de las células T.

En el caso de los scTCR o dTCR \alpha\beta presentados de acuerdo con la invención, el hecho de que las secuencias del dominio variable de los segmentos o polipéptidos \alpha y \beta están mutuamente orientados sustancialmente como en los receptores de células T \alpha\beta nativos implica que los TCR son funcionales, lo que se puede analizar confirmando que la molécula se une al ligando relevante del TCR (complejo pMHC, complejo CD1-antígeno, superantígeno o complejo superantígeno/pMHC), si se une se cumple el requisito. Las interacciones con complejos pMHC se pueden medir usando un instrumento Biacore 3000^{TM} o Biacore 2000^{TM}. El documento WO99/6120 proporciona descripciones detalladas de los procedimientos requeridos para analizar la unión del TCR a los complejos MHC-péptido. Estos procedimientos son igualmente aplicables al estudio de las interacciones TCR/CD1 y TCR/superantígeno. Con el fin de aplicar estos procedimientos al estudio de las interacciones TCR/CD1 se requieren las formas solubles de CD, cuya producción se describe en (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373). En el caso de los TCR \gamma\delta de la presente invención, los ligandos conocidos para estas moléculas son desconocidos, por lo que se puede emplear medios secundarios de verificación de su conformación, tales como reconocimiento mediante anticuerpos.

El anticuerpo monoclonal MCA991T (disponible en Serotec), específico de la región variable de la cadena \delta, es un ejemplo de un anticuerpo adecuado para esta tarea.

Los scTCR o dTCR de la presente invención se pueden presentar sobre partículas de fago, preferentemente partículas de fago filamentoso, mediante, por ejemplo, los dos medios siguientes:

(i) el extremo C de un miembro del par polipeptídico de dTCR, o el extremo C del polipéptido de scTCR, o el extremo C de un espaciador peptídico corto unido al extremo C de cualquiera de ellos, se puede unir directamente mediante un enlace peptídico a un residuo expuesto en la superficie de la partícula de fago. Por ejemplo, dicho residuo expuesto en la superficie está, preferentemente, en el extremo N del producto génico del gen III o el gen VIII del bacteriófago; y

(ii) El extremo C de un miembro del par polipeptídico de dTCR, o el extremo C del polipéptido de scTCR, o el extremo C de un espaciador peptídico corto unido al extremo C de cualquiera de ellos, está unido mediante un puente disulfuro a un residuo de cisteína expuesto en la superficie de la partícula de fago a través de un residuo de cisteína introducido. Por ejemplo, dicho residuo expuesto en la superficie está, de nuevo preferentemente, en el extremo N del producto génico del gen III o el gen VIII del bacteriófago.

Se prefiere el procedimiento (i) anterior. En el caso de un scTCR, el ácido nucleico que codifica el TCR puede estar fusionado con el ácido nucleico que codifica el fago. En el caso de un dTCR, el ácido nucleico que codifica una cadena del TCR puede estar fusionado con el ácido nucleico que codifica el fago, y la segunda cadena del par polipeptídico de TCR puede poder asociarse con la partícula resultante expresada que presenta la primera cadena. La asociación funcional adecuada de las dos cadenas está asistida por la presencia de las cisternas introducidas en el dominio constante de las dos cadenas, que son capaces de formar un puente disulfuro entre cadenas, como se trata completamente más adelante.

Par polipeptídico del dTCR y polipéptido de scTCR

Las secuencias extracelulares del dominio constante presentes en los scTCR o dTCR corresponden, preferentemente, a las de un TCR humano, como también lo hacen las secuencias del dominio variable. No obstante, la correspondencia entre dichas secuencias no ha de ser de 1:1 a nivel de aminoácido. La fragmentación en N o C y/o la deleción y/o sustitución de aminoácidos en relación con las correspondientes secuencias de TCR humano es aceptable. En particular, dado que las secuencias extracelulares del dominio constante presentes en los segmentos primero y segundo no están directamente implicadas en los contactos con el ligando al que se unen los scTCR o dTCR, pueden se mas cortos, o pueden contener sustituciones o deleciones en relación con ellas, que las secuencias del dominio constante extracelular de los TCR nativos.

La secuencia extracelular del dominio constante presente en uno del par polipeptídico del dTCR, o en el primer segmento de un polipéptido de scTCR, puede incluir una secuencia correspondiente al dominio constante extracelular de Ig de la cadena \alpha de un TCR, y/o la secuencia extracelular del dominio constante presente en el otro miembro del par o segundo segmento puede incluir una secuencia correspondiente al dominio Ig constante extracelular de la cadena \beta de un TCR.

En una forma de realización de la invención, un miembro del par polipeptídico del dTCR, o el primer segmento del polipéptido de scTCR, corresponde a sustancialmente todo el dominio variable de una cadena \alpha de TCR fusionado con el extremo N de sustancialmente todo el dominio extracelular del dominio constante de una cadena \alpha del TCR; y/o el otro miembro del par o del segundo segmento corresponde a sustancialmente todo el dominio variable de una cadena \beta del TCR fusionada con el extremo N de sustancialmente todo el dominio extracelular del dominio constante de una cadena \beta del TCR. En otra forma de realización, las secuencias extracelulares del dominio constante presente en el par polipeptídico del dTCR, o los segmentos primero y segundo del polipéptido de scTCR, corresponden a los dominios constantes de las cadenas \alpha y \beta de un TCR nativo truncado por su extremo C de modo que los residuos de cisteína que forman el puente disulfuro nativo entre cadenas del TCR quedan excluidos. Como alternativa, dichos residuos de cisteína pueden estar sustituidos por otro residuo de aminoácido tal como serina o alanina, de modo que se deleciona el puente disulfuro nativo. Además, la cadena \beta del TCR nativo contiene un residuo de cisteína no pareado y ese residuo puede eliminarse, o sustituirse por un residuo distinto a cisteína, en la secuencia \beta del scTCR de la invención.

En una forma de realización concreta de la invención, las secuencias del dominio variable de la cadena \alpha y \beta del TCR presentes en el par polipeptídico del dTCR, o los segmentos primero y segundo del polipéptido de scTCR, pueden juntas corresponder al dominio variable funcional de un primer TCR, y las secuencias extracelulares del dominio constante de la cadena \alpha y \beta del TCR presentes en el par polipeptídico del dTCR o los segmentos primero y segundo del polipéptido de scTCR, pueden corresponder a las de un segundo TCR, siendo los TCR primero y segundo de la misma especie. Por tanto, las secuencias del dominio variable de la cadena \alpha y \beta presentes en el par polipeptídico del dTCR, o los segmentos primero y segundo del polipéptido de scTCR, pueden corresponder a las de un primer TCR humano, y las secuencias extracelulares del dominio constante de la cadena \alpha y \beta pueden corresponder a las de un segundo TCR humano. Por ejemplo, las secuencias extracelulares del dominio constante del sTCR A6 Tax se pueden usar como estructura sobre la que se pueden fusionar los dominios variables heterólogos de \alpha y \beta.

En otra forma de realización de la invención, las secuencias del dominio variable de la cadena \delta y \gamma del TCR presentes en el par polipeptídico del dTCR, o los segmentos primero y segundo del polipéptido de scTCR respectivamente, pueden juntas corresponder al dominio variable funcional de un primer TCR, y las secuencias extracelulares del dominio constante de la cadena \alpha y \beta del TCR presentes en el par polipeptídico del dTCR o los segmentos primero y segundo del polipéptido de scTCR respectivamente, pueden corresponder a las de un segundo TCR, siendo los TCR primero y segundo de la misma especie: Por tanto, las secuencias del dominio variable de la cadena \delta y \gamma presentes en el par polipeptídico del dTCR o los segmentos primero y segundo del polipéptido del scTCR pueden corresponder a las de un primer TCR humano, y las secuencias extracelulares del dominio constante de cadena \alpha y \beta pueden corresponder a las de un segundo TCR humano. Por ejemplo, las secuencias extracelulares del dominio constante del sTCR A6 Tax se pueden usar como estructura sobre la que se pueden fusionar los dominios variables heterólogos de \gamma y \delta.

En una forma de realización concreta de la invención, las secuencias del dominio variable de cadena \alpha y \beta, o \delta y \gamma presentes en el par polipeptídico del dTCR o los segmentos primero y segundo del polipéptido del scTCR pueden juntas corresponder al dominio variable funcional de un primer TCR humano, y las secuencias extracelulares del dominio constante de cadena \alpha y \beta del TCR presentes en el par polipeptídico del dTCR o los segmentos primero y segundo del polipéptido del scTCR pueden corresponder a las de un segundo TCR no humano. Por tanto, las secuencias del dominio variable de cadena \alpha y \beta, o \delta y \gamma presentes en el par polipeptídico del dTCR o los segmentos primero y segundo del polipéptido del scTCR pueden corresponder a las de un primer TCR humano y las secuencias extracelulares del dominio constante de cadena \alpha y \beta pueden corresponder a las de un segundo TCR no humano. Por ejemplo, las secuencias extracelulares del dominio constante del TCR murino se pueden usar como estructura sobre la que se pueden fusionar los dominios variables heterólogos de \alpha y \beta de TCR humano.

Espaciador en el polipéptido scTCR

Para las partículas de fago que presentan scTCR de la presente invención, una secuencia espaciadora une los segmentos primero y segundo del TCR para formar una hebra polipeptídica sencilla. La secuencia espaciadora puede, por ejemplo, tener la fórmula -P-AA-P, en la que P es prolina y AA representa una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos son glicina y serina.

Para el scTCR presentado por partículas de fago de la presente invención para unirse a un ligando, el complejo MHC-péptido en el caso del los TCR \alpha\beta, los segmentos primero y segundo se acoplan de modo que las secuencias del dominio variable están orientados para dicha unión. Por tanto, el espaciador debería tener suficiente longitud para extender la distancia entre el extremo C del primer segmento y el extremo N del segundo segmento, o viceversa. Por otro lado, preferentemente se evitará una longitud excesiva del espaciador, en caso de que el extremo del espaciador en la secuencia del dominio variable del extremo N bloquee o reduzca la unión del scTCR al ligando diana.

Por ejemplo, en el caso en el que las secuencias extracelulares del dominio constante presentes en los segmentos primero y segundo correspondan a los dominios constantes de las cadenas \alpha y \beta de un TCR nativo truncado en su extremo C de modo que los residuos de cisteína que forman el puente disulfuro nativo entre cadenas del CR. quedan excluidos, y la secuencia espaciadora une el extremo C del primer segmento con el extremo N del segundo segmento, la secuencia espaciadora puede constar de, por ejemplo, de 26 a 41 aminoácidos, preferentemente 29, 30, 31 ó 32 aminoácidos, o 33, 34, 35 ó 36 aminoácidos. Espaciadores concretos tienen la fórmula PGGG-(SGGGG)_{5}-P- y -PGGG-(SGGGG)_{6}-P-, en la que P es prolina, G es glicina y S es serina.

Puente disulfuro entre cadenas

Un rasgo principal característico de los dTCR y scTCR preferidos presentados por partículas de fago de la presente invención es el puente disulfuro específico introducid entre las secuencias extracelulares del dominio constante del par polipeptídico del dTCR o de los segmentos primero y segundo del polipéptido del scTCR. Dicho enlace no posee homólogo en los TCR nativos, está incorporado específicamente entre cisternas en las secuencias extracelulares del dominio constante del par polipeptídico del dTCR o los segmentos primero y segundo del polipéptido del scTCR. En algunos casos puede ser deseable un puente disulfuro nativo y uno no nativo.

El puente disulfuro puede formarse mediante mutación de residuos distintos a cisteína sobre los segmentos primero y segundo en cisteína y haciendo que se forme el enlace entre los residuos mutados. Los residuos sustituidos por cisteína son aquéllos cuyos respectivos carbonos \beta están separados por aproximadamente 6 \ring{A} (0,6 RUN) o menos, y, preferentemente, en el intervalo de 3,5 \ring{A} (0,35 nm) a 5,9 \ring{A} (0,59 nm) en el TCR nativo. El puente disulfuro está entre los residuos en el dominio constante de la inmunoglobulina. Los puntos en los que se van a introducid las cisternas para formar el puente disulfuro son los residuos siguientes en el exón 1 del TRAC*01 para la cadena \alpha del TCR y TRBC *01 o TRBC2*01 para la cadena \beta del TCR.

2

Los motivos siguientes en las respectivas cadenas de TCR humano se pueden usar para identificar el residuo que se va a mutar (el residuo sombreado es el residuo para la mutación a una cisteína).

Cadena \alpha Thr 48:

3

Cadena \alpha Thr 45:

4

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Cadena \alpha Tyr 10:

5

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Cadena \alpha Ser 15:

6

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Cadena \beta Ser 57:

7

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Cadena \beta Ser 77:

8

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Cadena \beta Ser 17:

9

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Cadena \beta Asp 59:

10

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Cadena \beta Glu 15:

11

En otras especies, las cadenas del TCR pueden no tener una región que tenga una identidad del 100% con los motivos anteriores. No obstante, el experto en la técnica podrá usar los motivos anteriores para identificar la parte equivalente de la cadena \alpha o \beta del TCR y, por tanto, el residuo que se va a mutar a cisteína. A este respecto se pueden usar técnicas de alineación. Por ejemplo, se puede usar ClustalW, disponible en el sitio web del European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/index.html) para comparar los motivos anteriores con una secuencia concreta de la cadena del TCR con el fin de localizar la parte relevante de la secuencia del TCR para detectar mutaciones.

La presente invención incluye dentro de su ámbito scTCR análogos de \alpha\beta y \gamma\delta presentados sobre la partícula de fago, así como los de otros mamíferos, incluidos, entre otros, ratón, rata, cerdo, cabra y oveja. Como se ha mencionado en lo que antecede, el experto en la técnica será capaz de determinar sitios equivalentes a los sitios humanos descritos en lo que antecede en los que se pueden introducir residuos de cisteína para formar un puente disulfuro entre cadenas. Por ejemplo, a continuación se muestran las secuencias de aminoácidos de los dominios solubles C\alpha y C\beta de ratón, junto con motivos que muestran los residuos murinos equivalentes a los residuos humanos mencionados en lo que antecede que se pueden mutar a cisteínas para formar un puente disulfuro entre cadenas del TCR (en las que los residuos relevantes están sombreados).

Dominio soluble C\alpha de ratón:

12

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Dominio soluble C\beta de ratón:

13

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Equivalente murino de la Thr 48 de la cadena \alpha humana:

ESGTFITDKTVLDMKAMDSK

(SEC ID 12)

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Equivalente murino de la Thr 45 de la cadena \alpha humana:

KTMESGTFITDKTVLDMKAM

(SEC ID 13)

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Equivalente murino de la Tyr 10 de la cadena \alpha humana:

ESGTFITDKTVLDMKAMDSK

(SEC ID 14)

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Equivalente murino de la Ser 15 de la cadena \alpha humana:

AVYQLKDPRSQDSTLCLFTD

(SEC ID 15)

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Equivalente murino de la Ser 57 de la cadena \beta humana:

NGREVHSGVSTDPQA YKESN

(SEC ID 16)

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Equivalente murino de la Ser 77 de la cadena \beta humana:

KESNYSYCLSSRLRVSATFW

(SEC ID 17)

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Equivalente murino de la Ser 17 de la cadena \beta humana:

PPKV SLFEPSKAEIANKQKA

(SEC ID 18)

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Equivalente murino del Asp 59 de la cadena \beta humana:

REVHSGVSTDPQAYKESNYS

(SEC ID 19)

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Equivalente murino del Glu 15 de la cadena \beta humana:

VTPPKVSLFEPSKAEIANKQ

(SEC ID 20)

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Como se ha tratado en lo que antecede, los dominios constantes extracelulares de sTCR A6 Tax pueden usarse como estructura sobre la que se pueden fusionar los dominios variables heterólogos. Se prefiere que las secuencias del dominio variable heterólogo estén unidas a las secuencias del dominio constante en algún punto entre el puente disulfuro y el extremo N de las secuencias del dominio constante. En el caso de las secuencias del dominio constante \alpha y \beta del TCR A6 Tax, el puente disulfuro se puede formar entre los residuos de cisteína introducidos en los residuos de aminoácidos 158 y 172, respectivamente. Por tanto, se prefiere que los puntos de unión en la secuencia del dominio variable de la cadena \alpha y \beta heterólogo estén entre los residuos 159 o 173 y el extremo N de las secuencias del dominio constante \alpha o \beta, respectivamente.

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Presentación del TCR

El procedimiento de presentación del TCR in vivo para biopanning para identificar TCR que poseen propiedades deseables tales como afinidad alta por un complejo péptido-MHC diana es la presentación en fago.

En primer lugar, se construye una biblioteca de ADN que codifica una matriz diversa de scTCR o dTCR mutados. Esta biblioteca se construye usando ADN que codifica un TCR nativo como molde para la amplificación. Existen numerosos procedimientos adecuados, conocidos por los expertos en la técnica, para la introducción de las mutaciones deseadas en el ADN del TCR y, por tanto, la proteína del TCR expresada finalmente. Por ejemplo, la PCR dirigida por error (EP-TCR), técnicas lanzadera de ADN y el uso de cepas bacterianas mutadas tales como XL-1-Red son medios convenientes de introducción de mutaciones en las secuencias del TCR. Es particularmente preferido que estas mutaciones se introduzcan en el dominio definido de los TCR. Por ejemplo, es probable que las mutaciones en el dominio variable, particularmente las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y/o regiones estructurales sean los sitios más adecuados para la introducción de mutaciones que conduzcan a la producción de una biblioteca diversa de TCR para la producción de TCR con propiedades potenciadas de unión al ligando. La EP-PCR es un ejemplo de procedimiento por el cual tales mutaciones "específicas de región" se pueden introducir en los TCR. Se usan cebadores de EP-PCR que sean complementarios a las secuencias de ADN que limitan la región que se va a mutar para amplificar múltiples copias de esta región del ADN del TCR que contiene un nivel controlable de mutaciones aleatorias. Estas secuencias de ADN que codifican regiones mutadas se insertan en las secuencias de ADN, que codifican las secciones no mutageneizadas del TCR, mediante PCR de ligamiento n o superposición. El ADN que codifica el TCR con región mutada puede unirse después al ADN que codifica un polipéptido heterólogo con el fin de producir una proteína de fusión adecuada para la presentación. En el caso de la presentación en fago, el vector de expresión utilizado es un fagemido o un vector con genoma de fago en el que se pueda ligar el ADN del TCR al ADN que codifica una proteína de superficie, preferentemente la proteína de superficie gIII o gVIII. En el caso de un scTCR, tal unión se realiza como para la presentación en fago de cualquier péptido monomérico o polipéptido. En el caso de los dTCR, sólo una de las cadenas del TCR se liga del modo indicado en lo que antecede. La otra cadena está codificada en ácido nucleico para la co-expresión con ácido nucleico del fagemido o del fago colaborador, de modo que la segunda cadena expresada encuentra y se asocia con el fago expresado con la primera cadena presentada en la superficie. En ambos casos, como se ha tratado con más detalle en lo que antecede, las cisteínas adecuadamente colocadas en los dominios constantes son útiles para que los dominios variables del TCR adopten sus posiciones funcionales, a través de la formación de un puente disulfuro mediante dichas cisteínas.

Para expresión, un vector que comprende (a) ácido nucleico que codifica una cadena de un par polipeptídico del dTCR y (b) la otra cadena de un par polipeptídico de dTCR fusionado con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína formadora de partícula o una proteína de superficie celular, el par dTCR, o una composición que comprende un primer vector que comprende ácido nucleico (a) y un segundo vector que comprende ácido nucleico (b), se ponen en contacto con células huésped capaces de causar la expresión del material genético codificado en condiciones adecuadas para permitir la transformación de dichas células. Tales vectores de expresión, sistemas de expresión que comprenden vectores de fagemido o de genoma de fago que codifican dTCR y scTCR, y células huésped que los aojan forman aspectos adicionales de la presente invención. En una forma de realización preferida de la invención, los vectores de fagemido o de genoma de fago derivan de un fago filamentoso.

A continuación, las células transformadas se incuban para permitir la expresión de las partículas de fago que presentan el TCR. Estas partículas pueden usarse después para detección selectiva o en ensayos para identificar variantes de TCR con características específicas potenciadas. A continuación se pueden aislar todas las partículas que posean las características potenciadas en investigación. El ADN que codifica estos TCR se puede amplificar después mediante PCR y se puede determinar la secuencia.

Se sabe que niveles de expresión elevados de un polipéptido exógeno pueden ser tóxicos pata la célula huésped.

En tales casos debe encontrarse una cepa huésped que sea más tolerante al polipéptido exógeno o los niveles de expresión en la célula huésped deben limitarse a un nivel que se tolere. Por ejemplo, (Beekwilder y col., (1999) Gene 228 (1-2) 23-31) comunican que sólo las formas mutadas de un inhibidor de la proteasa de patata (PI2) que contenían deleciones o codones de terminación ámbar se podrían seleccionar con éxito en una biblioteca de presentación de fagos. En este caso, una observación en el curso del trabajo comunicado en los Ejemplos de la presente memoria descriptiva sugiere que puede ser deseable limitar los niveles de expresión de TCR presentados sobre partículas de la invención, al menos en algunas cepas de E. coli. Por tanto, se mostró que el TCR A6 seleccionado en el Ejemplo 2 después de repetidos ciclos de cultivo derivaba de células en las que el fagemido había mutado con respecto al introducido al principio. La mutación había creado un codón de terminación "ópalo" en la cadena \beta del TCR. Este codón se "lee" con frecuencia baja en los ribosomas de la cepa de E. coli utilizada y Tiene como resultado la inserción de un residuo de triptófano en este sitio y un nivel global muy reducido de la expresión de la cadena \beta de longitud completa.

Existen varias estrategias para limitar los niveles de expresión de un polipéptido exógeno en un sistema de expresión dado en un huésped, que puede ser adecuado pata limitar los niveles de expresión de un scTCR, o una o ambas cadenas del TCR de un dTCR. Por ejemplo:

Uso de una secuencia promotor débil- El nivel de expresión obtenido para un producto génico dado, tal como la cadena \alpha o \beta del TCR, se puede ajustar usando secuencias promotoras de varias fuerzas. El promotor PRM del fago lamdba es un ejemplo de un promotor débil.

Sitios de unión al ribosoma mutados (RBS)- La mutación de un ácido nucleico sencillo en los RIBS asociada con un producto génico, tal como la cadena \alpha o \beta del TCR, puede tener como resultado una reducción del nivel de expresión. Por ejemplo, la mutación de una secuencia AGGA salvaje a AGGG.

"Codones de iniciación" mutados- La mutación de un ácido nucleico sencillo en el codón de iniciación asociada con un producto génico, tal como la cadena \alpha o \beta del TCR, también puede tener como resultado una reducción del nivel de expresión. Por ejemplo, la mutación de un codón de iniciación AUG salvaje a GUG.

Mutaciones supresoras de sentido erróneo- Éstas se insertan dentro de las regiones codificadoras de la cadena \beta del TCR. Entre los ejemplos se incluyen el codón de terminación "ópalo" (UGA), este codón de terminación "con fugas" tiene como resultado la frecuencia baja de inserción de un aminoácido triptófano y la lectura del resto de la secuencia de codificación.

Modificación mediada por metabolitos de la fuerza del promotor- El nivel de expresión de un producto génico, tal como la cadena \alpha o \beta del TCR, bajo el control de ciertos promotores, se puede regular por disminución mediante la adición de un metabolito relevante para las células que contienen el promotor. Por ejemplo, se pueden usar las adiciones de glucosa para regular por disminución la expresión de un producto génico bajo el control de un promotor Lac.

Uso del codón- Las células bacterianas y, por ejemplo, las células de mamífero tienen diferentes "preferencias" con respecto a los codones que usan para codificar ciertos aminoácidos. Por ejemplo, las células bacterianas usan con más frecuencia el codón CGU para codificar arginina, mientras que las células eucarióticas usan con más frecuencia AGA. Es posible reducir el nivel de expresión de un producto génico, tal como la cadena \alpha o \beta del TCR mediante la utilización de secuencias de ADN que contienen una serie de codones menos preferidos mediante el sistema de expresión que se esté utilizando.

Los detalles relacionados con los medios anteriores de regulación por disminución de la expresión del producto génico se pueden encontrar en (Glass (1982) Gene Function - E. coli and its heritable elements, Croom Helm) y (Rezinoff (1980) The Operon 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory).

También se sabe que suministrando cultivos bacterianos con una concentración relativamente alta de un azúcar tal como sacarosa se puede incrementar los niveles de expresión periplásmica de proteínas solubles. (Véase, por ejemplo, (Sawyer y col., (1994) Protein Engineering 7 (11) 1401-1406)). Tras la expresión, el correcto apareamiento de las secuencias del dominio variable del polipéptido del scTCR está asistido, preferentemente, por la introducción de un puente disulfuro en el dominio constante extracelular del scTCR. Sin desear limitarse por la teoría, se cree que el nuevo puente disulfuro proporciona una estabilidad adicional al scTCR durante el proceso de plegamiento y, de este modo, se facilita el correcto apareamiento de los segmentos primero y segundo.

También como se ha mencionado en lo que antecede, para la presentación del dTCR en fago, uno de los pares polipeptídicos del dTCR se expresa como si, en última instancia, se fuera a presentar como un polipéptido monomérico sobre el fago, y el otro del par polipeptídico del dTCR se co-expresa en la misma célula huésped. Dado que la partícula de fago se autoensambla, los dos polipéptidos se autoasocian para su presentación como dímero sobre el fago. De nuevo, en la forma de realización preferida de este aspecto de la invención, el correcto plegamiento durante la asociación del par polipeptídico está asistido por un puente disulfuro entre las secuencias constantes, como se ha tratado en lo que antecede. Otros detalles de un procedimiento para la presentación en fago de un dTCR que tiene un puente disulfuro entre cadenas aparecen en los Ejemplos en la presente memoria descriptiva.

Como alternativa, el fago que presenta la primera cadena del dTCR puede expresarse primero y la segunda cadena polipeptídica puede ponerse en contacto con el fago expresado en una etapa posterior, para su asociación como dTCR funcional en la superficie del fago.

El procedimiento de presentación del TCR in vitro preferido para biopanning para identificar TCR que poseen propiedades deseables tales como afinidad alta por un complejo péptido-MHC diana es la presentación en ribosoma. En primer lugar, se construye una biblioteca de ADN que codifica una matriz diversa de polipéptidos de scTCR o dTCR mutados usando las técnicas que se han tratado en lo que antecede.

A continuación, la biblioteca de ADN se pone en contacto con ARN polimerasa con el fin de producir una biblioteca de ARNm complementario. Opcionalmente, para las técnicas de presentación de ARNm, las secuencias de ARNm pueden unirse a una secuencia de ADN que comprende un sitio de unión a puromicina. Estos constructos genéticos se ponen en contacto después con ribosomas in vitro bajo condiciones que permitan la traducción del polipéptido de scTCR o el primer polipéptido del par de dTCR. En el caso del dTCR, el segundo de los pares polipeptídicos se expresa por separado y se pone en contacto con el primer polipéptido presentado por ribosomas, para la asociación entre los dos, asistida preferentemente por la formación del puente disulfuro entre los dominios constantes. Como alternativa, los ARNm que codifican ambas cadenas del TCR pueden ponerse en contacto con los ribosomas in vitro en condiciones que permitan la traducción de las cadenas de TCR de modo que se forme un ribosoma que presente un dTCR. Estos ribosomas que presentan scTCR o dTCR pueden usarse después para detección selectiva o en ensayos para identificar variantes de TCR con características específicas potenciadas. A continuación se pueden aislar todas las partículas que posean las características potenciadas en investigación. El ARNm que codifica estos TCR puede convertirse después en las secuencias de ADN complementarias usando la transcriptasa inversa. Este ADN se puede amplificar después mediante PCR y se puede determinar la secuencia.

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Aspectos adicionales

Una partícula de fago que presenta un scTCR o dTCR (que preferentemente está constituido por secuencias constantes y variables correspondientes a secuencias humanas) de la presente invención se puede proporcionar en forma sustancialmente pura o en forma de preparación purificada o aislada. Por ejemplo, se puede proporcionar en una forma que esté sustancialmente libre de otras proteínas.

Una partícula de fago que presenta una pluralidad de scTCR o dTCR de la presente invención se puede proporcionar un complejo multivalente. Por tanto, la presente invención proporciona, en un aspecto, un completo del receptor de células T multivalente, que comprende una partícula de fago que presenta una pluralidad de scTCR o dTCR tal y como se describe en la presente memoria descriptiva.

Cada uno de la pluralidad de dichos scTCR o dTCR es, preferentemente, idéntico.

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Aislamiento de variantes de TCR con características potenciadas

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la identificación de TCR con una característica específica, en el que dicho procedimiento comprende someter una biblioteca diversa de TCR presentados sobre partículas de fago a un proceso de selección que selecciona según dicha característica, y aislar partículas de fago que presentan un TCR que posee dicha característica, y, opcionalmente, a un procedimiento de amplificación para multiplicar las partículas aisladas y/o un proceso de detección selectiva que mide dicha característica, identificando las partículas de fago que presentan un TCR con la característica deseada y aislar estas partículas de fago y, opcionalmente, a un procedimiento de amplificación para multiplica las partículas aisladas.

Las secuencias de ADN que codifican los TCR variantes se pueden obtener después y amplificar mediante PCR para permitir la determinación de las secuencias. Las características que se pueden potenciar incluyen, entre otras, la afinidad de unión por el ligando y la estabilidad del constructo.

Uso de la detección selectiva

Las partículas de fago que presentan TCR de la presente invención pueden utilizarse en procedimientos de detección selectiva diseñadas para identificar moduladores, incluidos inhibidores, de la sinapsis inmunitaria celular mediada por TCR.

Como los expertos en la técnica conocen, hay numerosos formatos de ensayo que proporcionan una base adecuada para la detección selectiva de interacciones proteína-proteína de este tipo.

Los sistemas de Ensayo de Proximidad Luminiscente Homogéneo con Amplificación, tales como el
AlphaScreen^{TM}, dependen del uso de perlas "Donante" y "Aceptor" que están recubiertas con una capa de hidrogel a las que se pueden unir las proteínas receptor y ligandos. La interacción entre estas moléculas receptor y ligando acerca las perlas entre sí. Cuando estas perlas se someten a una luz láser, un fotosensibilizador en la perla "Donante" convierte el oxígeno ambiente en un estado de singlete más excitado. Las moléculas de oxígeno del estado de singlete difunden de un extremo a otro para reaccionar con una sustancia quimioluminiscente en la perla "Aceptor" que activa aún más los fluoróforos contenidos dentro de la misma perla. Los fluoróforos posteriormente emiten luz a 520-620 nm, esto señala que se ha producido la interacción receptor-ligando. La presencia de un inhibidor de la interacción receptor-ligando hace que esta señal disminuya.

La resonancia de plasmón de superficie (RPS) es un ensayo óptico interfacial, en el que una pareja de unión (normalmente el receptor) se inmoviliza en un "chip" (la superficie del sensor) y se detecta la unión de la otra pareja de unión (normalmente el ligando), que es soluble y se hace que fluya sobre el chip. La unión del ligando tiene como resultado un incremento en la concentración de proteína cerca de la superficie del chip, lo que produce un cambio en el índice de refracción en dicha región. La superficie del sensor está comprimida de modo que el cambio en el índice de refracción se puede detectar mediante resonancia de plasmón de superficie, un fenómeno óptico a través del cual la luz a un cierto ángulo de incidencia sobre una película metálica fina produce un haz reflejado de intensidad reducida debido a la excitación resonante de ondas de densidad de carga superficial oscilatoria (plasmones de superficie). La resonancia es muy sensible a los cambios en el índice de refracción en el lado distal de la película metálica y es esta señal la que se usa para detectar la unión entre las proteínas inmovilizadas y solubles. Comercialmente se dispone de sistemas que permiten el uso conveniente de detección por RPS de las interacciones moleculares y análisis de datos. Ejemplos son las máquinas Iasys^{TM} (Fisons) y las máquinas Biacore^{TM}.

Otros ensayos ópticos interfaciales incluyen fluorescencia reflectante interna total (TIRF), espejo de resonancia (RM) y sensor acoplador de rejilla óptica (GCS) y se tratan con más detalle en Woodbury and Venton (J. Chromatog. B. 725 113-137 (1999)). El ensayo de proximidad por centelleo (SPA) se ha usado para la detección selectiva en bibliotecas de compuestos de inhibidores de la interacción de baja afinidad entre CD28 y B7 (K_{d} probablemente en la región de 4 \muM (Van der Merwe y col. J. Exp. Med. 185:393-403 (1997), Jenh y col., Anal Biochem 165(2) 287-93 (1998)). El SPA es un ensayo radioactivo que usa la emisión de partículas beta por parte de ciertos isótopos radioactivos que transfiere energía a una sustancia centelleante inmovilizada sobre la superficie indicadora. El corto intervalo de las partículas beta en solución garantiza que el centelleo se produzca sólo cuando las partículas beta se emiten en estrecha proximidad con la sustancia centelleante. Cuando se aplica para la detección de interacciones proteína-proteína, una pareja de la interacción se marca con el radioisótopo, mientras que la otra se une a las perlas que contienen la sustancia de centelleo o recubren una superficie junto con la sustancia de centelleo. Si el ensayo se puede configurar de forma óptima, el radioisótopo se acercará lo suficiente a la sustancia de centelleo como para que se active la emisión de fotones únicamente cuando se produzca la unión entre las dos proteínas.

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TCR de alta afinidad

La presente invención permite la identificación de TCR mutados específicos de un ligando de TCR dado con mayor afinidad por dicho ligando de TCR que el ECR de tipo salvaje. Cabe esperar que estos TCR de alta afinidad sean particularmente útiles para el diagnostico y tratamiento de la enfermedad.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "TCR de alta afinidad" se refiere a un scTCR o d TCR mutado que interacciona con un ligando específico del TCR y o tiene una Kd para dicho ligando del TCR inferior a la correspondiente a un TCR nativo medida mediante Resonancia de plasmón superficial o tiene una constante de velocidad (k_{off}) para dicho ligando del TCR inferior a la del correspondiente de un TCR nativo medida mediante resonancia de plasmón superficial.

Los scTCR o dTCR de alta afinidad permitidos por la presente invención están mutados, preferentemente, con respecto al TCR nativo en al menos una región determinante de la complementariedad y/o regiones estructurales.

En un aspecto, el ligando del TCR para el cual es específico un TCR de alta afinidad dado es un complejo péptido-MHC (pMHC).

En otro aspecto, el ligando del TCR para el cual es específico un TCR de alta afinidad dado es un tipo o tipos de MHC.

En otro aspecto más, el ligando del TCR para el cual es específico un TCR de alta afinidad dado es el complejo HLA-A2-péptido tax (LLFGYPVYV) (SEC ID 21).

En otro aspecto más, el ligando del TCR para el cual es específico un TCR de alta afinidad dado es el complejo HLA-A2-NY-péptido ESO (SLLMITQC) (SEC ID 22).

Un scTCR de alta afinidad o una o las dos cadenas del dTCR de alta afinidad pueden marcarse con un compuesto de imagen, por ejemplo un marcador que sea adecuado para propósitos diagnósticos. Tales TCR de alta afinidad marcados son útiles en un procedimiento para detectar un ligando de TCR seleccionado de complejos CD1-antígeno, superantígenos bacterianos y complejos MHC-péptido/superantígeno, en el que el procedimiento comprende poner en contacto el ligando del TCR con un TCR de alta afinidad (o un complejo de TCR de alta afinidad multimérico) que sea específico del ligando del TCR; y para detectar la unión al ligando del TCR. En los complejos de TCR de alta afinidad tetraméricos (formados, por ejemplo, usando heterodímeros biotinilados) se puede usar estreptavidina fluorescente (comercialmente disponible) para proporcionar un marcador detectable. Un tetrámero marcado con fluorescencia es adecuado para usar en el análisis FACS para, por ejemplo, detectar células presentadoras de antígeno que portan el péptido para el que es específico el TCR de alta afinidad.

Otro modo por el que se pueden detectar los TCR de alta afinidad solubles permitidos por la presente invención es mediante el uso de anticuerpos específicos de TCR, en particular anticuerpos monoclonales. Hay muchos anticuerpos anti-TCR comercialmente disponibles, tales como \alphaF1 y \betaF1, que reconocen los dominios constantes de las cadenas \alpha y \beta, respectivamente.

Un TCR de alta afinidad (o un complejo multivalente del mismo) permitido por la presente invención puede asociarse, como alternativa o adicionalmente) con un agente terapéutico (p. ej., de forma covalente o mediante otro tipo de enlace) que puede ser, por ejemplo, un resto tóxico para usar para matar células, o un agente inmunoestimulante tales como una interleucina o una citocina. Un complejo de TCR multivalente de alta afinidad puede poseer una capacidad de unión potenciada por un ligando de TCR en comparación con un receptor de células T no multimérico o heterodimérico salvaje o de alta afinidad. Por tanto, los complejos de TCR multivalentes de alta afinidad son particularmente útiles para el seguimiento u orientación de células que presentan antígenos particulares in vitro o in vivo, y también son útiles como intermediarios para la producción de otros complejos multivalentes de TCR de alta afinidad que tienen tales usos. El TCR de alta afinidad o el complejo multivalente de TCR de alta afinidad puede, por tanto, proporcionarse en una formulación farmacéuticamente aceptable para usar in vivo.

Se puede administrar un agente terapéutico a una célula diana poniendo en contacto posibles células diana con un TCR de alta afinidad o un complejo multivalente de TCR de alta afinidad en condiciones que permitan la unión del TCR de alta afinidad o del complejo multivalente de TCR de alta afinidad con la célula diana, en el que dicho TCR de alta afinidad o complejo multivalente de TCR de alta afinidad es específico del ligando del TCR y que tiene asociado el agente terapéutico.

En particular, el TCR soluble de alta afinidad o el complejo multivalente de TCR de alta afinidad se pueden usar para administrar agentes terapéuticos en la localización de células que presentan un antígeno concreto. Esto sería útil en muchas situaciones y, en particular, frente a tumores. Se podría liberar un agente terapéutico de modo que ejerciera su efecto localmente, pero no sólo sobre la célula a la que se une. Por tanto, una estrategia concreta prevé moléculas anti-tumorales unidas a receptores de células T de alta afinidad o a complejos multivalentes de TCR de alta afinidad específicos para antígenos tumorales.

Muchos agentes terapéuticos podrían emplearse para este uso, por ejemplo compuestos radiactivos, enzimas (perforina, por ejemplo) o agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, cisplatino). Para garantizar que los efectos tóxicos se ejercen en la localización deseada, la toxina podría estar dentro de un liposoma unido a estreptavidina de modo que el compuesto se libere lentamente. Esto evitará que se produzcan efectos dañinos durante el transporte en el cuerpo y asegurará que la toxina tenga el efecto máximo después de la unión del TCR a las células presentadoras de antígeno relevantes.

Otros agentes terapéuticos adecuados incluyen:

\bullet

agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir, compuestos con la capacidad de matar células de mamífero que tienen un peso molecular inferior a 700 dalton. Tales compuestos podrían también contener metales tóxicos capaces de tener un efecto citotóxico. Además, debe entenderse que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen pro-fármacos, es decir, compuestos que se degradan o convierten en condiciones fisiológicas para liberar los agentes citotóxicos. Ejemplos de dichos agentes incluyen cisplatino, derivados de maytansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecán, melfalán, mitoxantrona, sorfimer sodiofotofrina II, temozolmida, topotecán, trimetreato glucuronato, auristatin E vincristina y doxorubicina;

\bullet

Citotoxinas peptídicas, es decir proteínas o fragmentos de las mismas con la capacidad de matar células de mamífero. Entre los ejemplos se incluyen ricino, toxina diftérica, exotoxina A de la bacteria pseudomonas, ADNasa y ARNasa;

\bullet

Radionúclidos, es decir isótopos inestables de elementos que se degradan con la emisión simultánea de una o más partículas \alpha o \beta, o rayos \gamma. Entre los ejemplos se incluyen yodo 131, renio 186, indio 111, ytrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astatina 213; se pueden usar agentes quelantes para facilitar la asociación de estos radionúclidos con los TCR de alta afinidad, o multímeros de los mismos;

\bullet

Profármacos, tales como profármacos enzimáticos dirigidos por anticuerpos.

\bullet

Inmunoestimulantes, es decir restos que estimulan la respuesta inmunitaria. Entre los ejemplos se incluyen citocinas tales como IL-2, quimiocinas tales como IL-8, factor plaquetario 4, proteína estimuladora del crecimiento de melanoma, etc., anticuerpos o fragmentos de los mismos, activadores del complemento, dominios de proteína xenogeneica, dominios de proteína alogeneica, dominios de proteína viral/bacteriana y péptidos virales/bacterianos.

Los TCR solubles de alta afinidad o complejos multivalentes de TCR de alta afinidad permitidos por la invención pueden unirse a una enzima capaz de convertir un profármaco en un fármaco. Esto permite que el profármaco se convierta en el fármaco únicamente en el sitio en el que es necesario (es decir, dirigido por el sTCR).

Potencialmente se pueden potenciar una multitud de tratamientos de enfermedad localizando el fármaco mediante la especificidad de los TCR solubles de alta afinidad. Por ejemplo, cabe esperar que los TCR de alta afinidad específico de HLA-A2-tax (LLFGYPVYV), (SEC ID 21) que se describen en la presente memoria descriptiva se pueden usar en procedimientos para el diagnóstico y tratamiento del HTLV-1 y que el TCR NY-ESO de alta afinidad específico de HLA-A2-NY-ESO (SLLMITQC) (SEC ID 22) descrito en la presente memoria descriptiva se puede usar en procedimientos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer.

Enfermedades virales para las que existen fármacos, por ejemplo VIH, VIS, EBV, CMV, se beneficiarían de la liberación o activación del fármaco en las proximidades de las células infectadas. Para el cáncer, la localización en las proximidades de tumores o metástasis potenciaría el efecto de toxinas o inmunoestimulantes. En enfermedades autoinmunitarias, los fármacos inmunosupresores podrían liberarse lentamente y tendrían un efecto más local en un periodo de tiempo más prolongado afectando de un modo mínimo a la capacidad inmunitaria global del sujeto. En la prevención del rechazo de injertos, el efecto de los fármacos inmunosupresores podría optimizarse del mismo modo. Para la administración de vacunas, el antígeno vacunal podría localizarse en las proximidades de las células presentadoras de antígeno, lo que potencia la eficacia del antígeno. El procedimiento también se puede aplicar con fines de imagen.

Los TCR solubles de alta afinidad permitidos por la presente invención se pueden usar para modular la activación de las células T uniéndose al ligando específico de TCR y, de este modo, inhibiendo la activación de las células T. Las enfermedades autoinmunitarias que implican inflamación mediada por células T y/o daño tisular serían susceptibles a este enfoque, por ejemplo la diabetes de tipo I. Para este uso se requiere conocer el epítopo peptídico específico presentado por el pMHC relevante.

Normalmente, los TCR de alta afinidad terapéuticos o para imagen permitidos por la invención se suministrarán como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada (Dependiendo del procedimiento deseado de administración a un paciente). Puede proporcionarse en forma de dosificación unitaria, generalmente se proporcionarán en un envase sellado y puede proporcionarse como parte de un kit. Normalmente (aunque no necesariamente), tal kit incluiría instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitaria.

La composición farmacéutica puede adaptarse para su administración por cualquier vía adecuada, por ejemplo por vía parenteral, transdérmica o inhalación, preferentemente por vía parenteral (incluidas las vías subcutánea, intramuscular o, más preferentemente, intravenosa). Dichas composiciones pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo mezclando el ingrediente activo con el(los) portador(es) o excipien-
te(s) en condiciones estériles.

Las dosis de los sustratos de la presente invención pueden variar entre amplios límites, en función de la enfermedad o trastorno a tratar, la edad y el estado del individuo que se va a tratar etc., y, en última instancia, será un médico el que determine las dosis adecuadas que se habrán de usar.

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Ejemplos

La invención se describe más en los ejemplos siguientes, que no limitan el ámbito de la invención de ningún modo.

A continuación se hace referencia a las figuras adjuntas, en las que:

Las Figuras 1a y 1b muestran, respectivamente, las secuencias de ácido nucleico de las cadenas \alpha y \beta de un TCR A6 soluble, mutadas de modo que se ha introducido un codón de cisteína. El sombreado indica los codones de cisteína introducidos.

La figura 2a muestra la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la cadena \alpha del TCR A6, que incluye la mutación T_{48}\rightarrowC (subrayada) usada para produce el nuevo puente disulfuro entre cadenas, y la figura 2b muestra la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la cadena \beta del TCR A6, que incluye la mutación S_{57}\rightarrowC (subrayada) usada para produce el nuevo puente disulfuro entre cadenas.

La figura 3 es un esquema de la clonación de las cadenas \alpha y \beta de TCR en vectores fagemido. El diagrama describe un vector de presentación en fago. RSB es el sitio de unión al ribosoma. S1 o S2 son péptidos señal para la secreción de proteínas en el periplasma de E. coli. El * indica el codón de terminación de la traducción. Cualquiera de las cadenas, cadena \alpha o \beta del TCR se puede fusionar con la proteína de la cubierta del fago, aunque en este diagrama solo la cadena \beta del TCR está fusionada con la proteína de la cubierta del fago.

La figura 4 detalla la secuencia de ADN del fagemido pEX746:A6.

La figura 5 es la expresión de fusiones de partículas de fago de la proteína de la cubierta bacteriana y TCR A6 heterodimérico en E. coli. Las proteínas de fusión del TCR A6 heterodimérico::gIII se detectan usando transferencia de tipo western. Las partículas de fago se preparan a partir de E. coli XL-1-Blue y se concentran con PEG/NaCl. Las muestras se cargan en tampones de la muestra reductores o no reductores. La calle 1 es la muestra del clon 7 que contiene la secuencia correcta y la calle 2 es la muestra del clon 14 que contiene una deleción en el gen que codifica la cadena \alpha. La proteína de fusión TCR A6 heterodimérico:gIII se detectó a 125 kDa.

La figura 6 ilustra la detección mediante ELISA de la actividad de unión del complejo peptídico pMHC de un TCR A6 heterodimérico presentado sobre el fago. El clon 7 se une específicamente al complejo HLA A2-Tax. El clon 14 no se puede unir a ningún pMHC, ya que ningún TCR está unido a las partículas de fago.

La Figura 7a es una ilustración esquemática del constructo de presentación en ribosoma del ADN monocatenario de TCR A6-C-Kappa.

Las Figuras 7b y 7c detallan la hebra completa de ADN codificado y la secuencia de aminoácidos del constructo de presentación en ribosoma del ADN monocatenario de TCR A6-C-Kappa codificados en pUC19 respectivamente.

La figura 8 detalla la secuencia de ADN del pUC19-T7.

La Figura 9 detalla la secuencia de ADN del constructo de presentación en ribosoma del TCR monocatenario A6-C-Kappa que se clonó en pUC19-t7.

La figura 10 es una transferencia de tipo western que muestra la detección del TCR monocatenario A6-C-Kappa traducido in vitro usando lisados de reticulocitos de conejo Ambion.

La Figura 11 es una RT-PCR del ARNm del TCR monocatenario A6-C-Kappa en perlas rescatadas de las reacciones de presentación en ribosoma.

La figura 12a detalla la secuencia de ADN de la cadena \beta mutada del clon 9 de TCR A6; el ácido nucleico mutado se indica en negrita.

La figura 12b detalla la secuencia de aminoácidos de la cadena \beta mutada del clon 9 de TCR A6, la posición correspondiente al codón de terminación ópalo introducido se indica con un *.

La figura 13 detalla la secuencia de ADN de la cadena \beta mutada del clon 49 de TCR A6; el ácido nucleico mutado se indica en negrita. Dado que esta es una mutación "silenciosa", con esta mutación no se introduce ningún cambio en la secuencia de aminoácidos resultante.

La figura 14a detalla la secuencia de ADN de la cadena \beta mutada del clon 134 de TCR A6; los ácidos nucleicos mutados se indican en negrita.

La figura 14b detalla la secuencia de aminoácidos de la cadena \beta mutada del clon 134 de TCR A6 como se analiza mediante el ensayo BIAcore; los aminoácidos mutados se indican en negrita.

La figura 14c detalla la secuencia de aminoácidos de la cadena \beta mutada del clon 134 de TCR A6 como se analiza mediante ELISA del fago; los aminoácidos mutados se indican en negrita.

La figura 15 son datos de BIAcore para la unión del clon 134 del TCR A6 a HLA-A2 Tax y HLA-A2 NY-ESO.

La figura 16 son los datos de BIAcore usados para determinar la T_{OFF} para la unión del clon 134 del TCR A6 a HLA-A2 Tax.

Las figuras 17a y 17b muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y \beta mutadas del TCR NY-ESO respectivamente.

Las figuras 18a y 18b muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas \alpha y \beta mutadas del TCR NY-ESO respectivamente.

Las figuras 19a y 19b detallan la secuencia de ADN y de aminoácidos de la cadena \beta del TCR NY ESO incorporada en el fagemido pEX746:NY-ESO respectivamente.

La figura 20 muestra la unión específica de las partículas de fago que presentan el TCR NY-ESO a HLA-A2-NY-ESO en un ensayo ELISA del fago.

La Figura 21 muestra la secuencia de ADN de la cadena DR1\alpha que incorpora codones que codifican el péptido de dimerización Fos unido al extremo 3' de la secuencia DRA0101.

El sombreado indica los codones Fos y los codones de marcaje de biotinilación están indicados en texto en
negrita.

La figura 22 muestra la secuencia de ADN del vector bi-cistrónico pAcAB3 usado para la expresión de complejos péptido-HLA de clase II en células de insecto Sf9. El sitio de restricción BgI II (AGATCT) usado para insertar la cadena \alpha de HLA y el sitio de restricción BamHI (GGATCC) usado para insertar la cadena \beta de HLA están indicados mediante sombreado.

La figura 23 muestra la secuencia de ADN de la cadena \beta de DR1 que incorpora los codones que codifican el péptido de dimerización Jun unido al extremo 3' de la secuencia de DRB0401 y los codones que codifican un péptido cargado con HLA unido al extremo 5' de la secuencia de DRB0401. El sombreado indica los codones Jun y los codones del péptido Flu Ha cargado con HLA están subrayados.

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La figura 24 muestra una traza BIAcore de la unión del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad a células de flujo recubiertas del siguiente modo:

Célula de flujo 1	(CF-1)- Blanco
Célula de flujo 2	(CF-2)- HLA-A2 (LLGRNSFEV)	(SEC ID 23)
Célula de flujo 3	(CF-3)- HLA-A2 (KLVALGINAV)	(SEC ID 24)
Célula de flujo 4	(CF 4)- HLA-A2 (LLGDLFGV)	(SEC ID 25)

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La figura 25 muestra una traza BIAcore de la unión del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad a células de flujo recubiertas del siguiente modo:

Célula de flujo 1	(CF-1)- Blanco
Célula de flujo 2	(CF 2)- HLA-B8 (FLRGRAYGL)	(SEC ID 26)
Célula de flujo 3	(CF-3)- HLA-B27 (HRCQAIRKK)	(SEC ID 27)
Célula de flujo 4	(CF 4)- HLA-Cw6 (YRSGIIAVV)	(SEC ID 28)

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La figura 26 muestra una traza BIAcore de la unión del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad a células de flujo recubiertas del siguiente modo:

Célula de flujo 1	(CF-1)- Blanco
Célula de flujo 2	(CF 2)- HLA-A24 (VYGFVRACL)	(SEC ID 29)
Célula de flujo 3	(CF-3)- HLA-A2 (ILAKFLHWL)	(SEC ID 30)
Célula de flujo 4	(CF 4)- HLA-A2 (LTLGEFLKL)	(SEC ID 31)

\newpage

La figura 27 muestra una traza BIAcore de la unión del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad a células de flujo recubiertas del siguiente modo:

Célula de flujo 1	(CF-1)- Blanco
Célula de flujo 2	(CF 2)- HLA-DR1 (PKYVKQNTLKLA)	(SEC ID 32)
Célula de flujo 3	(CF-3)- HLA-A2 (GILGFVFTL)	(SEC ID 33)
Célula de flujo 4	(CF 4)- HLA-A2 (SLYNTVATL)	(SEC ID 34)

La figura 28 muestra una traza BIAcore de la unión del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad a células de flujo recubiertas del siguiente modo:

Célula de flujo 1	(CF-1)- Blanco
Célula de flujo 4	(CF 4)- HLA-A2 (LLFGYPVYV)	(SEC ID 21)

Las figuras 29a y 29b muestran gráficos Biacore de la interacción entre el TCR NY-ESO soluble de alta afinidad y HLAA2 NY-ESO.

Las figuras 30a y 30b muestran gráficos Biacore de la interacción entre el TCR NY-ESO soluble "de tipo salvaje" y HLAA2 NY-ESO.

Las figuras 31a y 31b muestran gráficos Biacore de la interacción entre un TCR A6 soluble mutante (clon 1) y HLAA2 Tax.

Las figuras 32a y 32b muestran gráficos Biacore de la interacción entre un TCR A6 soluble mutante (clon 111) y HLAA2 Tax.

Las figuras 33a y 33b muestran gráficos Biacore de la interacción entre un TCR A6 soluble mutante (clon 89) y HLAA2 Tax.

La figura 34 muestra un gráfico Biacore de la interacción entre un TCR A6 soluble mutante (que contiene mutaciones del clon 71 y el clon 134) y HLAA2 Tax.

La figura 35 muestra un gráfico Biacore de la interacción entre un TCR A6 soluble mutante (que contiene mutaciones en el clon 71 y el clon land \betaG102\rightarrowA) y HLAA2 Tax.

Las figuras 36a a 36c muestran gráficos Biacore de la interacción entre un TCR A6 soluble mutante (que contiene mutaciones del clon 89 y el clon 134) y HLAA2 Tax.

Las figuras 37a y 37b muestran gráficos Biacore de la interacción entre un TCR A6 soluble mutante (que contiene mutaciones del clon 71 y el clon 89) y HLAA2 Tax.

La figura 38 detalla las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena \beta de los siguientes clones de TCR A6: 38a - salvaje, 38b - Clon 134, 38c - Clon 89, 38d - Clon 1 y 38e - Clon 111.

Los residuos mutados se muestran en negrita, los residuos entre corchetes son residuos alternativos que pueden estar presentes en un sitio concreto.

Figuras 39A y 39B I

Ejemplo 1

Diseño de cebadores y mutagénesis de las cadenas \alpha y \beta del TCR A6 Tax para introducir los residuos de cisteína requeridos para la formación de un nuevo puente disulfuro entre cadenas

Para producir la mutación de treonina 49 del A6 Tax del exón 1 en TRAC*01 a cisteína se diseñaron los siguientes cebadores (la mutación se muestra en minúsculas)

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Para producir la mutación de la serina 57 del A6 Tax del exón 1 en TRBC1*01 y TRBC2*01 a cisteína se diseñaron los siguientes cebadores (la mutación se muestra en minúsculas);

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Mutagénesis por PCR

Los plásmidos de expresión que contienen los genes para la cadena \alpha o \beta del TCR A6 Tax se mutaron usando los cebadores de la cadena \alpha o los cebadores de la cadena \beta respectivamente, del siguiente modo. Se mezclaron 100 ng de plásmido con 5 \mul de dNTP 10 mM, 25 \mul de 10x tampón Pfu (Stratagene), 10 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene) y el volumen final se ajustó hasta 240 \mul con H_{2}O. 48 ml de esta mezcla se suplementaron con cebadores diluidos para dar una concentración final de 0,2 \muM en un volumen de reacción final de 50 \mul. Tras una etapa de desnaturalización inicial de 30 segundos a 95ºC, la mezcla de reacción se sometió a 15 ciclos de desnaturalización (95ºC, 30 s), renaturalización (55ºC, 60 s) y elongación (73ºC, 8 min) en una máquina de PCR Hybaid PCR express. A continuación el producto se digirió durante 5 horas a 37ºC con 10 unidades de la enzima de restricción DpnI (New England Biolabs). 10 ml de la reacción digerida se transformaron en bacterias XL1-Blue competentes y se cultivaron durante 18 horas a 37ºC. Se escogió una única colonia y se cultivó durante la noche en 5 ml de TYP + ampicilina (16 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 2,5 g/l de K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El ADN plasmídico se purificó en columna mini-prep Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en el centro de secuenciación del Departamento de Bioquímica, Universidad de Oxford. Las secuencias mutadas de ácido nucleico y de aminoácidos se muestran en las Figuras 1a y 2a para la cadena \alpha y las figuras 1b y 2 b para la cadena \beta.

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Ejemplo 2

Construcción de vectores de presentación en fago y clonación de las cadenas \alpha y \beta del TCR A6 en los vectores fagemido

Con el fin de presentar un TCR A6 heterodimérico que contenga un puente disulfuro no nativo entre cadenas sobre las partículas de fago filamentoso, se construyeron vectores fagemido para la expresión de proteínas de fusión que comprenden el TCR A6 heterodimérico que contiene un puente disulfuro no nativo entre cadenas con una proteína de la cubierta del fago. Estos vectores contienen un origen Puc19, un origen M13, un gen bla (de resistencia a ampicilina), promotor/operador Lac y un sitio de unión CAP. El diseño de estos vectores se resume en la Figura 3, que describe vectores que codifican las proteínas de fusión gp3-cadena \beta de TCR A6 o gp8-cadena \beta de TCR A6 además de la cadena \alpha del TCR A6 soluble. Los vectores de expresión que contienen las secuencias de ADN de las cadenas \alpha y \beta mutadas del TCR A6 que incorporan los residuos de cisteína adicionales requeridos para la formación de un nuevo puente disulfuro entre cadenas preparado en el Ejemplo 1 y, como se muestra en las figuras 1a y 1b, se usaron como la fuente de las cadenas \alpha y \beta del CTR A6 para la producción de un fagemido que codifica este TCR. La secuencia completa de ADN del constructo del fagemido (pEX746) utilizado se indica en la figura 4.

Los procedimientos de clonación molecular para construir los vectores se describe en "Molecular cloning: A laboratory manual, by J. Sambrook y D. W. Russell".

Los cebadores enumerados en la tabla 1 se usan para la construcción de los vectores. Un ejemplo del programa de la PCR es 1 ciclo de 94ºC durante 2 minutos, seguido por 25 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 53ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 90 segundos, seguido por 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos, y después mantener a 4ºC. La ADN polimerasa Expand hifidelity Taq se adquiere en Roche.

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TABLA 1 Cebadores usados para la construcción de los vectores de presentación en fago de TCR A6

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Ejemplo 3

Expresión de fusiones de la proteína de la cubierta bacteriana y el TCR A6 heterodimérico en E. coli

Con el fin de validar el constructor del Ejemplo 2 se prepararon partículas de fago que presentan el TCR A6 heterodimérico que contiene un puente disulfuro no nativo entre cadenas usando los procedimientos descritos anteriormente para la generación de partículas de fago que presentan scFv de anticuerpo (Li y col., 2000, Journal of Immunological Methods 236: 133-146) con las modificaciones siguientes. Se usaron células E. coli XL-1-Blue que contienen fagemido pEX746:A6 (es decir, el fagemido que codifica la cadena \alpha del TCR A6 soluble y una cadena \beta d el TCR A6 fusionada con la proteína gIII del fago producida por se ha descrito en el Ejemplo 2) para inocular 5 ml de Lbatg (caldo Lennox L que contiene 100 mg/ml de ampicilina, 12,5 \mug/ml de tetraciclina y 2% de glucosa) y, después, el cultivo se incubó con agitación a 37ºC durante la noche (16 horas). Se usaron 50 \mul del cultivo durante la noche para inocular 5 ml de TYPatg (TYP es 16 g/l de peptona, 16 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 2,5 g/l de K_{2}HPO_{4}) y, después, el cultivo se incubó con agitación a 37ºC hasta DO_{600nm}= 0,8. Al cultivo se añadió el fago colaborador M13 K07 hasta la concentración final de 5 x 10^{9} ufp/ml. A continuación, el cultivo se incubó a 37ºC sin variar durante treinta minutos y, después, con agitación a 200 rpm durante otros 30 minutos. A continuación, el medio del cultivo anterior se cambió a TYPak (TYP que contiene 100 mg/ml de ampicilina, 25 mg/ml de kanamicina), después el cultivo se incubó a 25ºC con agitación a 250 rpm durante 36 horas a 48 horas. Después, el cultivo se centrifugó a 4ºC durante 30 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 \mum y se almacenó a 4ºC para su posterior concentración o análisis.

La proteína de fusión de la proteína de la cubierta filamentosa y el TCR A6 heterodimérico que contiene un puente disulfuro no nativo entre cadenas se detectó en el sobrenadante mediante transferencia de tipo western. En cada calle de un gel de SDS-PAGE se cargaron aproximadamente 10^{11} ufc de partículas de fago en tampón de carga tanto reductor como no reductor. Las proteínas separadas se sondaron con anticuerpo primario con un AcMo de anti M13 gIII, seguido por un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP). La actividad de HRP se detectó después con un kit de sustrato Opti-4CN de Bio-Rad (Figura 5). Estos datos indicaron que el TCR A6 con puente disulfuro del clon 1 está fusionado con la proteína de la cubierta del fago filamentoso, la proteína gIII.

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Ejemplo 4

Detección de TCR A6 heterodimérico funcional que contiene un puente disulfuro no nativo entre cadenas sobre las partículas de fago filamentoso

La presencia de TCR A6 funcional (unión a HLA-A2-tax) presentado sobre las partículas de fago se detectó usando un método de ELISA para fagos.

ELISA fago-TCR

La unión de las partículas de fago que presentan TCR A6 a péptido-MHC inmovilizado en el ELISA se detecta con antisuero primario anti-fd de conejo (SIGMA), seguido por Ac anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina (FA) (Sigma). Los sitios de unión a proteína no específicos en las placas se puede bloquear con 2% de MPBS o 3% de BSA-PBS.

Materiales y reactivos

1.

Tampón de recubrimiento, PBS

2.

PBS: NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, KH_{2}PO_{4} 2 mM

3.

MPBS, 3% marvel-PBS

4.

PBS-Tween: PBS, 0,1% Tween-20

5.

Solución sustrato, Sigma FAST pNPP, nº de cat. N2770

Procedimiento

1.

Aclarar los pocillos revestidos con neutravidina dos veces con PBS.

2.

Añadir 25 \mul de biotina-HLA-A2 Tax o biotina-HLA-A2 NYESO en PBS a una concentración de 10 \mug/ml e incubar a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos.

3.

Aclarar los pocillos dos veces con PBS

4.

Añadir 300 \mul de 3% Marvel-PBS e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Mezclar la suspensión TCR-Fago con 1 volumen de 3% de marvel-PBS e incubar a temperatura ambiente.

5.

Aclarar los pocillos dos veces con PBS

6.

Añadir 25 \mul de la mezcla de fago-TCR A6/Marvel-PBS, incubar en hielo durante 1 hora

7.

Aclarar los pocillos tres veces con PBS-Tween helado y tres veces con PBS helado.

8.

Añadir 25 \mul de anticuerpo anti-fd de conejo helado diluido a 1:1000 en Marvel PBS e incubar en hielo durante 1 hora

9.

Aclarar los pocillos tres veces con PBS-Tween helado y tres veces con PBS helado.

10.

Añadir 25 \mul de conjugado de FA-AcMo anti-conejo helado diluido a 1:50.000 en Marvel PBS e incubar en hielo durante 1 hora

11.

Aclarar los pocillos tres veces con PBS-Tween helado y tres veces con PBS helado.

12.

Añadir a cada pocillo 150 \mul de fosfatasa alcalina amarilla y leer la señal a 405 nm.

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Los resultados presentados en la figura 6 indican que el clon 1 producía una partícula de fago que presentaba un TCR A6 que puede unirse específicamente a su pMHC conocido. (HLA-A2 Tax).

El análisis de la secuencia de ADN de este TCR A6 presentado reveló la presencia de un codón de terminación "ópalo" en la cadena \beta del TCR no presente en la correspondiente secuencia del constructo del vector de expresión del ejemplo 2. Este codón es "leído" por los ribosomas de la cepa de E. coli utilizada con una frecuencia baja y tiene como resultado la inserción de un residuo de triptófano en este punto y un nivel total muy reducido de la expresión de la cadena \beta de longitud completa. A partir de esta observación se ha deducido que sólo las células que expresaban esta secuencia del TCR A6 mutado habían sobrevivido a los ciclos de cultivo del ejemplo 3 y que, por tanto, los niveles elevados de expresión de TCR A6 que se habían predicho en el vector de expresión original eran tóxicos para las células huésped.

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Ejemplo 5

Presentación al ribosoma de TCR de cadena sencilla (scTCR) Construcción de vectores para scTCR de presentación al ribosoma para usar en la generación de moldes para PCR de presentación al ribosoma

Los constructos de presentación al ribosoma se clonaron en el plásmido de ADN fácilmente disponible Puc19, con el fin de generar un molde para PCR de ADN sin errores y estable a partir del cual realizar los siguientes experimentos de presentación al ribosoma. La construcción del vector se llevó a cabo en dos etapas para evitar el uso de cebadores oligonucleotídicos granes (con sus problemas de error asociados). El constructo final de presentación al ribosoma ADN scTCR A6-Kappa se muestra en forma esquemática en la figura 7a y las secuencias de ADN y proteica se muestran en la Figura 7b. Este constructo puede escindirse de pUC19 como un digerido doble con Pst1/EcoR1.

Los procedimientos de clonación molecular para construir los vectores se describe en "Molecular cloning: A laboratory manual, by J. Sambrook y D. W. Russell". Los cebadores enumerados en la tabla 2 se usan para la construcción de los vectores. El programa de la PCR utilizado fue el siguiente -1 1 ciclo de 94ºC durante 2 minutos, seguido por 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 20 segundos y 72ºC durante 120 segundos, seguido por 1 ciclo de 72ºC durante 5 minutos, y después mantener a 4ºC. La ADN polimerasa Pfu se adquiere en Stratagene. Los cebadores oligonucleotídicos se describen en la tabla 2.

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Construcción de pUC19-T7- Etapa 1

La construcción de pUC19-T7 se describe más adelante, la construcción tiene como resultado un vector pUC19-T7 que contiene una región promotora de T7 seguida por una región espaciadora corta y una secuencia eucariótica óptima Kozak. Esto es parte esencial del constructo de presentación al ribosoma, tal como se requiere para el inicio de la transcripción de cualquier secuencia unida en lisados de reticulocitos de conejo. Las secuencias para la presentación al ribosoma como el scTCR A6-Ckappa se pueden ligar en el vector pUC19-T7 entre los sitios de restricción Nco1 y EcoR1.

Cantidades equimolares del cebador Rev-link y For-link se hibridaron mediante calentamiento hasta 94ºC durante 10 minutos y enfriamiento lento de la reacción hasta la temperatura ambiente. Esto tiene como resultado la formación de un complejo de ADN bicatenario que se puede ver más adelante.

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19

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La región 5' contiene un extremo adherente en bisagra y complementario a un sitio de restricción HindIII, mientras que el extremo 3' contiene un extremo adherente que es complementario a un sitio de restricción BamH1. Los oligonucleótidos hibridados se ligaron en el Puc19 sometido a digestión doble con Hind III/BamHI, que se habías purificado mediante electroforesis en gel de agarosa, fragmentado y purificados después con el kit de extracción en gel Qiagen.

Las uniones se transformaron en E. coli XL1-BLUE. Los clones de Puc19-T7 individuales se secuenciaron para confirmar la presencia de la secuencia correcta.

La secuencia se muestra en la figura 8.

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Construcción del vector Kappa-C-scTCR A6- Etapa 2

La construcción de la secuencia de ADN monocatenario de scTCR A6-c-Kappa requiere la generación de tres fragmentos de PCR que, después, deben ensamblarse en un fragmento de scTCR A6-C-Kappa. Los fragmentos constan de (a) la región variable de la cadena alfa del TCR A6 flanqueada por un sitio Nco1 en la región 5' y una sección de espaciador de glicina serina en la región 3' flanqueada por un sitio de restricción BamH1. Este producto se generó mediante una PCR estándar del vector pEX202 con los cebadores 45 y 50 (véase la Tabla 2). Fragmento (b) región constante y variable de beta del TCR A6 flaqueada por un sitio de restricción BamHI en la región 5', seguida por una sección de espaciador de glicina serina. Este producto se generó mediante una PCR estándar del vector pEX207 con los cebadores 72 y 73 (véase la Tabla 2). Fragmento (c). Porción de una región kappa-C humana generada por una PCR estándar del vector p147 con los cebadores 61-60 (véase la Tabla 2). Todos los productos de la PCR se pasaron en un gel de agarosa TBE al 1,6% y las bandas de ADN del tamaño correcto se escindieron y purificaron usando el kit de extracción en gel Qiagen. Los fragmentos (b) y (c) se fusionaron mediante PCR de superposición estándar a través de la complementariedad en sus secuencias de cebadores 73 y 61 (véase la tabla 2). La PCR se llevó a cabo a través de los cebadores 72 y 60 (véase la tabla 2). Los productos de la PCR se pasaron en un gel de agarosa TBE al 1,6% y las bandas de ADN del tamaño correcto se escindieron y purificaron usando el kit de extracción en gel
Qiagen.

Este fragmento se denomina (d).

El fragmento (a) se sometió a digestión doble con Nco1 y BamH1, mientras que el fragmento (d) se sometió a digestión doble con BamH1 y EcoR1. pUC19-T7 se sometió a digestión doble con Nco1 y EcoR1. Todos los productos de ADN digeridos se pasaron en un gel de agarosa TBE al 1,2% y las bandas de ADN del tamaño correcto se escindieron y purificaron usando el kit de extracción en gel Qiagen. El pUC19-T7 digerido, los fragmentos (a) y (d) se ligaron y transformaron en E. coli XL1-BLUE. Los transformantes se secuenciaron para confirmar la secuencia correcta. La secuencia del constructo de presentación al ribosoma TCR A6-C Kappa que se clonó en pUC19 se muestra en la figura 9 flanqueada por sus sitios Pst1 y EcoR1.

TABLA 2

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Demostración de la producción de scTCR A6-C-Kappa mediante transcripción y traducción in vitro Preparación del producto de la PCR de scTCR A6-C-Kappa para la transcripción y traducción in vitro

En el presente documento, los inventores describen la síntesis de scTCR A6-C-Kappa mediante transcripción y traducción in vitro en presencia de lisina biotinilada y su posterior detección mediante transferencia de tipo western y detección con estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina.

El producto de la PCR de scTCR A6-C-Kappa se preparó en una reacción de PCR estándar usando el vector de scTCR A6-Kappa como molde y los cebadores de PCR 71 y 60. El cebador 60 contiene un codón de terminación para permitir la liberación del scTCR desde el ribosoma. La Pfu polimerasa (Stratagene) se usó para incrementar la fidelidad durante la síntesis en PCR. Los productos de la PCR se pasaron en un gel de agarosa TBE al 1,6% y las bandas de ADN del tamaño correcto se escindieron y purificaron usando el kit de extracción en gel Qiagen. Las reacciones de transcripción y traducción se llevaron a cabo usando el kit de transcripción traducción Ambion PROTEINscript II Linked nº de catálogo 12080-1287 con 300 ng del producto de la PCr descrito en lo que antecede. Se establecieron tres reacciones de transcripción traducción de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una modificación fue la adición de lisina biotinilada del sistema de detección no radioactiva de la traducción Transcend^{TM}.

Reacción 1 scTCR A6-C-Kappa 300 ng con 2 \mul de lisina biotinilada

Reacción 2 scTCR A6-C-Kappa 300 ng sin 2 \mul de lisina biotinilada

Reacción 3 No control de ADN con 2 \mul de lisina biotinilada.

Dos microlitros de cada reacción se pasaron en un gel de SDS-PAGE de gradiente 4-20% Novex (Invitrogen). Además, también se pasaron una serie de diluciones de un TCR biotinilado control. El gel se transfirió y las proteínas se detectaron con fosfatas alcalina con estreptavidina y, posteriormente, se desarrolló colorimétricamente con sustrato estabilizado Western Blue® para fosfatasa alcalina tal y como se describe en el protocolo del sistema de detección no radioactiva de la traducción Transcend^{TM}. La transferencia de tipo western se muestra en la figura 10.

En el control sin ADN y la reacción de scTCR A6-C-Kappa sin lisina biotinilada no se puede ver ninguna banda de aproximadamente el tamaño correcto como cabía esperar, mientras que el la reacción de scTCR A6-C-Kappa en presencia de lisina biotinilada se puede ver una banda de aproximadamente el tamaño correcto. Esto demuestra la síntesis del scTCR A6-C-Kappa mediante transcripción y traducción in vitro.

Preparación del producto de la PCR de presentación en ribosoma de scTCR A6-C-Kappa

El producto de la PCR de scTCR A6-C-Kappa se preparó en una reacción de PCR estándar usando el vector scTCRA6-Kappa como molde y los cebadores para PCR 71 y 75 (véase la tabla 2). El cebador 75 no contiene un codón de terminación. La Pfu polimerasa (Stratagene) se usó para aumentar la fidelidad durante la síntesis en PCR.

Los productos de la PCR se pasaron en un gel de agarosa TBE al 1,6% y las bandas de ADN del tamaño correcto se escindieron y purificaron usando el kit de extracción en gel Qiagen.

Procedimiento de presentación en ribosoma Transcripción y traducción de scTCR A6-G-Kappa

Las reacciones de transcripción/traducción se llevaron a cabo usando el kit de transcripción traducción Ambion PROTEINscript II Linked (número de catálogo 1280-1287).

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Reacciones de transcripción

Las siguientes reacciones de transcripción se establecieron en tubos no adherentes Ambion de 0,5 ml (nº de catálogo 12350).

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23

Los tubos se incubaron a 30ºC durante 60 minutos en un bloque de PCR sin la tapa caliente.

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Reacciones de traducción

Las reacciones de traducción siguientes se realizaron en tubos no adherentes Ambion de 0,5 ml.

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Cada tubo contiene suficiente para 3x50 \mul selecciones. Los tubos se mezclaron e incubaron a 30ºC durante 60 minutos en un bloque de PCR sin la tapa caliente. Tras 30 minutos se añadieron 3 unidades de RQ1 ADNasa sin ARNasa (Promega) para destruir el molde de ADN original en el tubo 1 y 3 unidades de RQ1 ADNasa sin ARNasa (Promega) en el tubo 2. Tras 60 minutos, se añadieron 18 \mul de solución de heparina a la reacción de traducción 2 y 18 \mul de solución de heparina a la reacción de traducción 1. Las muestras se almacenaron en hielo listas para la selección frente a las perlas recubiertas con HLA.

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Recubrimiento de las perlas magnéticas

20 \mul de partículas magnéticas con estreptavidina resuspendidas (Roche nº de catálogo 1641778) se transfirieron a un tubo de eppendorf estéril de 1,5 ml sin ARNasa. Las perlas se inmovilizaron con un Separador de partículas magnéticas (Roche, nº de catálogo 1641794) y se eliminó el sobrenadante. A continuación, las perlas se lavaron con 100 \mul de 1 X PBS sin ARNasa (10 x PBS Ambion nº catálogo 9624, Ambion H_{2}O nº catálogo 9930). Las perlas se inmovilizaron y el sobrenadante se eliminó.

Se llevaron a cabo un total de 3 lavados con PBS. Las perlas se resuspendieron en 20 \mul de PBS y el contenido se repartió de forma uniforme entre dos tubos (10 \mul en cada uno). Un tubo se usará para producir perlas bloqueadas de control y los otros tubos se usaron para producir perlas recubiertas con HLA-A2-Tax.

Al tubo con las perlas control se añadieron 80 \mul de solución de BSA/Biotina y se mezcló. La solución de BSA/Biotina se preparó del siguiente modo. A 990 \mul de PBS 0,1% de BSA (Ambion Ultrapure nº de catálogo 2616) se añadieron 10 \mul de una solución con base Tris 0,2M y biotina 0,1M. Asimismo, se añadieron 20 \mul de solución de heparina (138 mg/ml de heparina (Sigma H-3393) en 1 x PBS y la solución se mezcló. Las perlas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con mezclado intermitente. A continuación, las perlas se lavaron tres veces con 100 \mul de PBS y se resuspendieron en 10 \mul de PBS, 0,1% de BSA.

Las perlas recubiertas con HLA-TAX se prepararon del siguiente modo. A los 10 \mul de las perlas se añadieron 40 \mul de HLA-A2 Tax (1,15 mg/ml preparados como se describe en el documento WO99/60120) y se mezclaron. Las perlas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se añadieron 20 \mul de BSA 50 mg/ml Ambion nº de catálogo 2616 y 20 \mul de solución de heparina (véase en lo que antecede) y se mezclaron. Las perlas se incubaron durante otros 45 minutos y después se añadieron 20 \mul de solución de BSA/biotina. A continuación, las perlas se lavaron tres veces con 100 \mul de PBS y se resuspendieron en 10 \mul de PBS, 0,1% de BSA.

Panning con perlas magnéticas

La reacción de traducción de scTCR A6 se dividió en tres alícuotas de 50 \mul y cada alícuota recibió bien 2 \mul de las perlas siguientes:

Control (sin HLA)

HLA-A2-Tax

HLA-A2-Tax más 10 \mug de scTCR A6 soluble

También se realizó una reacción de traducción control y se dividió en tres alícuotas de 50 \mul y cada alícuota recibió bien 2 \mul de las perlas siguientes

Control (sin HLA)

HLA-A2-Tax

HLA-A2-Tax más 10 \mug de scTCR A6 soluble

Esto dio un total de seis tubos. Los tubos se incubaron en un bloque de PCR a 5ºC durante 60 minutos con mezclado intermitente. A continuación, las perlas se lavaron tres veces con 100 \mul de tampón helado (PBS, acetato de Mag 5 mM, 0,2% de Tween 20 (Sigma sin ARNasa). Cada alícuota de perlas se resuspendió después en 50 \mul de 1 x RQ1 tampón de digestión ADNasa que contiene 1 \mul (40 U) de superasen y 1 \mul (1 U) de RQ1 ADNasa. Las perlas se incubaron en un bloque de PCR durante 30 minutos a 30ºC.

A continuación, las perlas se lavaron tres veces con 100 \mul de tampón helado (PBS, acetato de Mag 5 mM, 0,2% de Tween 20) y una vez con H_{2}O helada. Las perlas se resuspendieron en 10 \mul de H_{2}O sin ARNasa. Después, las perlas se congelaron listas para la RT-PCR.

RT-PCR del ARNm del scTCR A6-C-Kappa en perlas rescatadas de las reacciones de presentación en ribosoma

Las reacciones de RT-PCR en las perlas se llevaron a cabo usando el kit Titan de un tubo para RT-PCR, catálogo 855476, como se describe en los protocolos de los fabricantes. Dos microlitros de perlas se añadieron a cada reacción de RT-PCR junto con los cebadores 45 y 7 y 0,3 \mul de Superasen inhibidor de la ARNasa. Para cada reacción de RT-PCR se estableció una segunda PCR que difirió únicamente por el hecho de que no había presencia de transcriptasa inversa, sólo la polimerasa de alta fidelidad de Roche. Esta segunda reacción sirvió como control para la contaminación de ADN. Además, se estableció un control positivo de la RT-PCR usando 1 ng del vector scTCR A6-C-Kappa.

Las reacciones se ciclaron del siguiente modo. Se llevó a cabo una etapa de RT-PCR mediante incubación de las muestras a 50ºC durante 30 minutos, seguida por la inactivación de la transcriptasa inversa mediante incubación a 94ºC durante 3 minutos en un bloque de PCR. Las reacciones fueron ciclos de PCR del siguiente modo, para un total de 38 ciclos:

94ºC 30 segundos

55ºC 20 segundos

68ºC 130 segundos

La reacción de PCR se terminó mediante incubación a 72ºC durante 4 minutos.

Durante todas las etapas de presentación al ribosoma se tomaron grandes precauciones para evitar la contaminación con ARNasa. Las reacciones de Rt-PCR y de CPR se realizaron en un gel de agarosa con TBE al 1,6% que se puede ver en la figura 11. El análisis del gel muestra que no hay contaminación con ADN y que todos los productos de la PCR derivan de ARNm. La banda de ADN del tamaño correcto en la calle 2 demuestra que el scTCR A6-C-Kappa presentado en el ribosoma se seleccionó mediante perlas recubiertas con HLA-A2-Tax. La calle 3 muestra que los inventores pueden inhibir esta selección específica de scTCR A6-C-Kappa presentado en el ribosoma mediante la adición de scTCRA6 soluble. La reducción significativa en la intensidad de la banda de la calle 3 respecto a la muestra sin inhibir de la calle 2 lo demuestra. No se pudo mostrar ninguna unión de scTCRA6-C-Kappa presentado en el ribosoma frente a las perlas control no recubiertas con HLA.

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Ejemplo 6

Análisis de la secuencia de clones de TCR A6 presentados sobre partículas de fago y procedimientos para mejorar las características de presentación

Tras la construcción de vectores para presentar TCR A6 sobre fago mediante PCR y clonación molecular, los clones bacterianos que pueden producir partículas de fago que presenten TCR A6 se sometieron a detección selectiva por medio de ELISA para fagos tal y como se describe en el ejemplo 4. Se identificaron tres clones diferentes que dieron unión específica a HLA-A2-tax en el ensayo de unión ELISA. Todos estos clones contenían mutaciones en el ADN de TCR A6 "de tipo salvaje" o en las secuencias reguladoras asociadas, que se describen en la tabla siguiente:

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Clones funcionales de la detección selectiva de TCR A6 presentado sobre fago

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Todos estos clones contenían mutaciones que probablemente sean la causa de una reducción en los niveles de expresión de la cadena \beta del TCR A6. Se dedujo que los clones de expresión baja eran seleccionados sobre los clones de expresión alta como resultado de la toxicidad celular causada por los niveles elevados de expresión del TCR.

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Ejemplo 7

Mutagénesis de las regiones CDR3 del CTR A6

Las regiones CDR3 del TCR A6 eran la diana para la introducción de mutaciones para investigar la posibilidad de generar mutantes de alta afinidad.

Se usó la PCR con solapamiento para modificar la secuencia de las regiones CDR3 de \alpha y \beta para introducir dos sitios de restricción únicos, HindIII para la cadena\alpha, con oligos de YOL54, 5'CAGCTGGGGGAAGCTTCAGTTTG
GAGCAG3' (SEC ID 64) y YOL55, 5'CTGCTCCAAACTGAAGCTTCCCCCAGCTG3' (SEC ID 65), y Xho I para la cadena \beta, con oligos de YOL56 5'GTACTTCTGTGCCTCGAGGCCGGGACTAG3' (SEC ID 66) y YOL57 5'CTAGTCCCGGCCTCGAGGCACAGAAGTAC3' (SEC ID 67).

La PCR se usó para introducir mutaciones para la madurez de la afinidad. El clon 9 del TCR A6 (que incorpora un codón ópalo introducido en la secuencia de la CDR3 de la cadena \beta) se usó como fuente del ADN molde, y las cadenas del TCR se amplificaron con los cebadores de la mutación (que se detallan en la tabla siguiente) y YOL22 5'CATTTTCAGGGATAGCAAGC3' (SEC ID 68) (cadena \beta) o YOL13 5'TCACACAGGAAACAGCTATG3' (SEC ID 69)(cadenas \alpha).

Cebadores para la introducción de la mutación en CDR3 de la cadena \beta y la cadena \alpha de A6

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27

29

Los fragmentos de la cadena \alpha se digirieron con Nco I y HindIII y se volvieron a purificar usando un kit Qiagen y el vector se preparó mediante digestión del clon 9 con Nco I y HindIII, seguido por purificación en gel usando un kit Qiagen.

Los fragmentos de la cadena \beta se digirieron con Xho I y Not I y se volvieron a purificar usando un kit Qiagen y el vector se preparó mediante digestión del clon 9 con Xho I y Not I, seguido por purificación en gel usando un kit Qiagen. Los insertos y vectores purificados en una proporción molar de 3:1 se mezclaron con tampón de ligasa T4, ligasa T4 y agua sin nucleasa. Las uniones se llevaron a cabo en baño de agua a 16ºC durante la noche. Para cada biblioteca de mutaciones, un total de 0,5 a 1 \mug de productos ligados purificados se sometieron a electroporación en E. coli TG1 en una proporción de 0,2 \mug de ADN por 40 \mul de células competentes en electroporación (Stratagen) siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante. Tras la electroporación, las células se resuspendieron inmediatamente con 960 \mul de medio SOC a 37ºC y se sembraron en placas de cultivo tisular de 244 mm x 244 mm que contienen YTE (15 g de Bacto-Agar, 8 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura en 1 litro) suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina y 2% de glucosa. La placa se incubó a 30ºC durante la noche. A continuación, las células se rasparon de las placas con 5 ml de DYT (16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl en 1 litro, en autoclave a 125ºC durante 15 minutos) suplementado con glicerol al 15%.

Con el fin de fabricar partículas de fago que presenten el TCR A6, se inocularon 500 ml de DYTag (DYT que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y 2% de glucosa) con de 500 a 1000 \mul de las reservas en la biblioteca. El cultivo se hizo crecer hasta que la DO (600 nm) alcanzó 0,5. 100 ml del cultivo se infectaron con el fago colaborador (M13 K07 (Invitrogen), o HYPER PHAGE (Progen Biotechnik, GmbH 69123 Heidelberg), y se incubó en baño de agua a 37ºC durante 30 minutos. El medio se reemplazó con 100 ml de DYTak (DYT que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de kanamicina). A continuación el cultivo se incubó con agitación a 300 rpm y 25ºC durante de 20 a 36 horas.

Ejemplo 8

Aislamiento de mutantes de TCR A6 de alta afinidad

El aislamiento de mutantes de TCR A6 de alta afinidad se llevó a cabo usando dos procedimientos diferentes.

El primer procedimiento implica seleccionar partículas de fago que presentan TCR A6 mutantes capaces de unirse al complejo HLA-A2 Tax usando inmunotubos Maxisorp (Invitrogen). Los inmunotubos estaban revestidos por de 1 a 2 ml de estreptavidina 10 \mug/ml en PBS durante la noche a temperatura ambiente.

Los tubos se lavaron dos veces con PBS y después se añadió 1 ml del complejo HLAA2 Tax biotinilado a 5 \mug/ml en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. El resto del protocolo para la selección de ligantes de alta afinidad es como se ha descrito anteriormente (Li y col. (2000) Journal of Immunological Methods 236: 133-146), a excepción de por las modificaciones siguientes. La selección se realizó en tres o cuatro rondas. Las concentraciones del complejo HLA-A2 Tax biotinilado fueron 5 \mug/ml para la primera ronda de selección, 0,5 \mug/ml para la segunda, 0,05 \mug/ml para la tercera y 0,005 \mug/ml para la cuarta ronda de selección. Los fagos colaboradores M13 K07 se usaron en las rondas una y dos, y el hiperfago se usó en las rondas de selección posteriores.

El segundo procedimiento utilizado fue la selección de partículas de fago que presentan TCR A6 mutantes capaces de unirse al complejo HLA-A2 Tax en solución. Las perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal M280) se pre-lavaron de acuerdo con los protocolos del fabricante. Las partículas de fago, que presentan TCR A6 mutado a una concentración de 10^{12} a 10^{13} ufc, se pre-mezclaron con el complejo HLA-A2 Tax biotinilado a concentraciones de 2 x 10^{-8}M, 2x10^{-9}M y 2x10^{-11}M para la primera, segunda, tercera y cuarta ronda de selecciones, respectivamente. La mezcla de partículas de fago que presentan TCR A6 y complejo HLA-A2 Tax se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con rotación suave, y las partículas de fago que presentan TCR A6 unidas al complejo HLA-A2 Tax biotinilado se capturaron usando 200 \mul (ronda 1) o 50 \mul (rodas 2, 3 y 4) de perlas magnéticas M280 recubiertas con estreptavidina. Tras la captura de las partículas de fago, las perlas se lavaron un total de diez veces (tres veces en PBS Tween 20, dos veces en PBS Tween 20 que contiene 2% de leche desgrasada en polvo, dos veces en PBS, una vez en PBS que contiene 2% de leche desgrasada en polvo y dos veces en PBS) usando un concentrador de partículas magnéticas Dynal. Tras un último lavado, las perlas se resuspendieron en 1 ml de trietilamina 100 mM recién preparada a pH 11,5 y se incubaron durante de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente con rotación suave. Las partículas de fago eluidas desde las perlas se neutralizaron inmediatamente con 300 \mul de Tris-HCl 1M a pH 7,0. La mitad del eluato se usó para infectar 10 ml de E. coli TG1 a una DO (600 nm)= 0,5 recién preparado para la amplificación de las partículas de fago seleccionadas de acuerdo con los procedimientos previamente descritos (Li y col., (2000) Journal of Immunological Methods 236: 133-146).

Tras una tercera o cuarta ronda de selección se escogieron 95 colonias de las placas y se usaron para inocular 100 \mul de DYTag en una placa de microtitulación de 96 pocillos. El cultivo se incubó a 37ºC con agitación durante la noche. 100 \mul de DYTag se subinocularon después con de 2 a 5 \mul de los cultivos durante la noche y se incubaron a 37ºC con agitación durante de 2 a 3 horas o hasta que el cultivo apareció turbio. Para infectar las células con el fago colaborador, se infectó el cultivo con 25 \mul de DYTag que contiene 5 x 109 fagos colaboradores pfu y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos.

El medio se reemplazó con DYTak. Las placas se incubaron a 25ºC durante de 20 a 36 horas con agitación a 300 rpm. Las células se precipitaron mediante centrifugación a 3000 g durante 10 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se usaron para la detección selectiva de mutantes de TCR A6 de alta afinidad mediante ELISA de fagos competitivo del siguiente modo.

Los pocillos Nunc-Immuno Maxisorp revestidos con estreptavidina se aclararon dos veces con PBS. A cada pocillo se añadieron 25 \mul de complejo HLA-A2-Tax biotinilado 5 \mug/ml y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos y fueron seguidos por dos lavados con PBS.

Los sitios de unión a proteínas no específicos en los pocillos se bloquearon mediante la adición de 300 \mul de 3% de leche desgrasada en PBS, seguido por incubación a temperatura ambiente durante 2 horas. Con el fin de preparar partículas de fago que presenten el TCR A6 heterodimérico, las partículas de fago se mezclaron con 3% de leche desgrasada en PBS, que contiene HLA-A2-Tax 0, 20 y 200 nM, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. El fago se añade a los pocillos revestidos con HLA-A2-Tax y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, seguida por 3 lavados con PBS que contiene 0,1% de Tween 20 y después 3 lavados con PBS. Las partículas de fago que presentan TCR unido se detectan con un anticuerpo anti-fd (Sigma) como se describe en el ejemplo 4.

Se identificaron varios mutantes de TCR A6 putativos de alta afinidad y las secuencias de CDR_{3} se enumeran en las dos tablas siguientes junto con las correspondientes secuencias de tipo salvaje. Los codones de terminación ámbar (X) se encontraron en todos los mutantes de la cadena \beta y en un mutante de la cadena \alpha.

Mutantes de la cadena \beta del TCR A6

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Mutantes de la cadena \alpha del TCR A6

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Ejemplo 9

Producción de TCR A6 heterodimérico soluble con puente disulfuro no nativo entre las regiones constantes que contienen mutaciones en CDR3

El ADN del fagemido que codifica los mutantes de TCR A6 de alta afinidad identificados en el ejemplo 6 se aisló de las células de E. coli relevantes usando un kit Mini-Prep (Quiagen, Reino unido).

Para amplificar las secuencias de ADN de las cadenas \alpha y \beta del TCR se usa amplificación por PCR usando el ADN del fagemido como diana y los siguientes cebadores.

Para amplificar las secuencias de ADN de las cadenas \alpha y \beta del TCR se usa amplificación por PCR usando el ADN del fagemido como diana y los siguientes cebadores.

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Cebador directo para la cadena alfa del TCR A6

ggaattc \underline{atcgatg} cagaaggaagtggagcag

(SEC ID 129)

(El sitio de restricción ClaI está subrayado)

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Cebador inverso de la cadena alfa del TCR universal

gtacacggcc\underline{ggccg}ggttctggatatac

(SEC ID 130)

(El sitio de restricción EagI está subrayado)

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Cebador directo para la cadena beta de A6

Tctctc\underline{attaat}gaatgctggtgtcactcagacccc

(SEC ID 131)

(El sitio de restricción AseI está subrayado)

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Cebador inverso de la cadena beta universal

Tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc

(SEC ID 132)

(El sitio de restricción AgeI está subrayado)

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En el caso de la cadena \beta del TCR se llevó a cabo otro punto de PCR para reemplazar el codón de terminación ámbar en la región CDR3 con un codón codificador de ácido glutámico. Cuando se suprime un codón de terminación ámbar se suprime en E. coli, normalmente se introduce un residuo de glutamina en lugar de detenerse la traducción. Por tanto, cuando el TCR que contiene el codón ámbar se presenta en la superficie del fago, contiene un residuo de glutamina en esta posición. No obstante, cuando el gen de la cadena \beta del TCR se transfirió al plásmido de expresión, se usó un residuo de ácido glutámico como alternativa a la glutamina. Los cebadores usadas para estos puntos de PCR fueron los siguientes:

34

La secuencia de ADN de la cadena \beta del TCR A6 soluble mutada se verificó mediante secuenciación automática (véase la figura 14 a para la secuencia de ADN de la cadena \beta del TCR A6 mutado y 14b para la secuencia de aminoácidos codificada). La figura 14c muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena \beta del TCR A6 sin sustitución de glutamina en ácido glutámico, es decir, la secuencia que estaba presente en el clon 134 se aísla mediante ELISA del fago.

A continuación, estas secuencias de ADN de \alpha y \beta del TCR A6 se usaron para producir un TCR A6 soluble tal y como se describe en el documento WO 03/020763. Brevemente, las dos cadenas se expresan como cuerpos de inclusión en cultivos de E. coli distintos. Después, los cuerpos de inclusión se aíslan, desnaturalizan y vuelven a plegar juntos in vitro.

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Ejemplo 10

Caracterización mediante plasmón superficial BIAcore de una unión de alta afinidad del TCR A6 a HLA-A2 Tax

Para analizar la unión del clon de alta afinidad 134 del TCR A6 (véanse las firmas 15a y 15b de las secuencias completas de ADN y de aminoácidos de la cadena \beta del TCR mutado, respectivamente) al ligando HLA-A2 se usó un biosensor de resonancia de plasmón superficial (BIAcore 3000^{TM}). Esto se facilitó produciendo complejos de pMHC (que se describen más adelante) que se inmovilizaron en una superficie de unión recubierta con estreptavidina de un modo semiorientado, lo que permite un análisis eficiente de la unión de un receptor soluble de células T con hasta cuatro pMHC diferentes (inmovilizados en diferentes células de flujo) de forma simultánea. La inyección manual del complejo HLA permite el nivel preciso de moléculas de clase I inmovilizadas para su fácil manipula-
ción.

Los complejos biotinilados de HLA de clase I-A2 se volvieron a plegar in vitro a partir de cuerpos de inclusión expresados en bacterias, que contienen las subunidades proteicas constituyentes y el péptido sintético, seguido por purificación y biotinilación in vitro (O'Callaghan y col. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). La cadena pesada del HLS se expresó con un indicador de biotinilación en el extremo C, que sustituye a los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína en un constructo adecuado. Se obtuvieron niveles de expresión del cuerpo de inclusión de 75 mg/litro de cultivo bacteriano. La cadena ligera del HLA o \beta2-microglobulina también se expresó en forma de cuerpos de inclusión en E. coli a partir de un constructo adecuado, a un nivel de 500 mg/litro de cultivo
bacteriano.

Las células de E. coli se lisaron y los cuerpos de inclusión se purificaron hasta una pureza de aproximadamente un 80%. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnaturalizó en guanidina-HCl 6M, Tris 50 mM a pH 8,1, NaCl 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM, y se volvió a plegar a una concentración de 30 mg/litro la cadena pesada, 30 mg/litro la \beta2m en L-Arginina-HCl 0,4M, Tris mM a pH 8,1, cistamina 3,7 mM, cisteamina mM, 4 mg/ml de péptido (p. ej., tax 11-19) mediante la adición de un único pulso de proteína desnaturalizada en tampón de replegamiento a <5ºC. Se dejó que el replegamiento alcanzara el final a 4ºC durante al menos 1 hora.

El tampón se intercambió mediante diálisis en 10 volúmenes de Tris 10 mM a pH 8,1.

Fueron necesarios dos cambios de tampón para reducir lo suficiente la fuerza iónica de la solución. A continuación se filtró la solución proteica a través de un filtro de acetato de celulosa de 1,5 \mum y se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ (8 ml de volumen de lecho). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM. El complejo HLA-A2-péptido eluyó a aproximadamente NaCl 250 mM y se recogieron las fracciones de los picos, se añadió un cóctel de inhibidores de la proteasa (Calbiochem) y las fracciones se enfriaron en
hielo.

Se cambió el tampón de los complejos HLA-A2 marcados con biotinilación a Tris 10 mM a pH de 8,1, NaCl 5 mM usando una columna de desalación rápida de Pharmacia equilibrada en el mismo tampón. Inmediatamente después de la elución, las fracciones que contenían proteína se enfriaron en hielo y se añadió el cóctel de inhibidor de la proteasa (Calbiochem). Después se añadieron los reactivos de biotinilación: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado hasta un pH de 8), MgCl_{2} 7,5 mM y enzima BirA 5 mg/ml (purificado de acuerdo con O'Callaghan y col. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Después se dejó incubar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche.

Los complejos HLA-A2 biotinilados se purificaron usando cromatografía de filtración en gel. Una columna Pharmacia Superdex 75 HR 10/30 se pre-equilibró con PBS filtrado y se cargó 1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación y la columna se desarrolló con PBS a 0,5 ml/min. Los complejos HLA-A2 biotinilados eluyeron en forma de un único pico a aproximadamente 15 ml. Las fracciones que contenían proteína se agruparon, enfriaron en hielo y se añadió el cóctel de inhibidor de la proteasa. La concentración de proteína se determinó usando un ensayo de unión con Coomassie (PerBio) y alícuotas de complejos HLA-A2 biotinilados se almacenaron congelados a -20ºC. La estreptavidina se inmovilizó mediante procedimientos estándar de acoplamiento de amina.

Las interacciones entre el TCR A6 Tax de alta afinidad que contiene un enlace entre cadenas nuevo y el complejo HLA-A2 Tax o una combinación irrelevante de HLA-A2 NY-ESO, cuya producción se ha descrito en lo que antecede, se analizaron en un biosensor de resonancia en plasmón superficial (RPS) BIAcore3000^{TM}. La RPS mide los cambios del índice de refracción expresados en unidades de respuesta (UR) cerca de la superficie de un sensor dentro de una célula de flujo pequeña, un principio que se puede usar para detectar interacciones entre receptor y ligando y para analizar sus parámetros de afinidad y cinéticos. Las células de flujo sonda se prepararon mediante inmovilización de los complejos peptídicos HLA-A2 individuales en células de flujo aparte mediante la unión entre la biotina reticulada en \beta2m y estreptavidina que han sido reticuladas químicamente con la superficie activada de las células de flujo. Después se realizó el ensayo pasado el sTCR sobre las superficies de diferentes células de flujo a un caudal constante y midiendo la respuesta en RPS al hacerlo. Inicialmente, la especificidad de la interacción se verificó pasando el TCR A6 soluble a un caudal constante de 5 \mul min-1 sobre cuatro superficies diferentes; una recubierta con \sim1000 RU del complejo HLA-A2 Tax, la segunda recubierta con \sim1000 RU del complejo HLA-A2 NY-ESO y dos células de flujo en blanco recubiertas sólo con estreptavidina (véase la figura 15).

La mayor afinidad del TCR A6 soluble mutado dificultó el cálculo de la kd para la interacción de este resto con el complejo HLA-A2 Tax. No obstante, se calculó una semivida (t_{1/2}) para la interacción de 51,6 minutos (véase la figura 6), que se compara con una t_{1/2} para la interacción de tipo salvaje de 7,2 segundos.

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Ejemplo 11

Producción del vector que codifica un TCR soluble de NY-ESO TCR que contiene un puente disulfuro nuevo

La cadena \beta del TCR A6 soluble preparado en el Ejemplo 1 contiene en la secuencia nativa un sitio de restricción BgIII (AAGCTT) adecuado para usar como sitio de unión.

La mutagénesis por PCR se llevó a cabo como se detalla más adelante para introducir un sitio de restricción BamH1 (GGATCC) en la cadena \alpha del TCR A6 soluble, extremo 5' del nuevo codón de cisteína. La secuencia descrita en la Figura 2a se usó como molde para esta mutagénesis. Se usaron los cebadores siguientes:

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Se mezclaron 100 ng de plásmido con 5 \mul de dNTP 10 mM, 25 \mul de 10x tampón Pfu (Stratagene), 10 unidades de Pfu polimerasa (Stratagene) y el volumen final se ajustó hasta 240 \mul con H_{2}O. 48 ml de esta mezcla se suplementaron con cebadores diluidos para dar una concentración final de 0,2 \muM en un volumen de reacción final de 50 \mul. Tras una etapa de desnaturalización inicial de 30 segundos a 95ºC, la mezcla de reacción se sometió a 15 ciclos de desnaturalización (95ºC, 30 s), renaturalización (55ºC, 60 s) y elongación (73ºC, 8 min) en una máquina de PCR Hybaid PCR express. A continuación el producto se digirió durante 5 horas a 37ºC con 10 unidades de la enzima de restricción DpnI (New England Biolabs). 10 ml de la reacción digerida se transformaron en bacterias XL1-Blue competentes y se cultivaron durante 18 horas a 37ºC. Se escogió una única colonia y se cultivó durante la noche en 5 ml de TYP + ampicilina (16 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 2,5 g/l de K_{2}HPO_{4}, 100 mg/l de ampicilina). El ADN plasmídico se purificó en columna mini-prep Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la secuencia se verificó mediante secuenciación automática en el centro de secuenciación del Departamento de Bioquímica, Universidad de Oxford. El ADNc que codifica el TCR de NY-ESO se aisló de las células T según técnicas conocidas. El ADNc que codifica el TCR de NY-ESO se produjo mediante tratamiento del ARNm con transcriptasa inversa.

Con el fin de producir vectores que codifiquen un TCR soluble de NY-ESO que incorpore un puente disulfuro nuevo se usaron como moldes los plásmidos con TCR. A6 que contienen los sitios de restricción BamHI de la cadena \alpha y BglII de la cadena \beta. Se usaron los cebadores siguientes:

36

360

Los constructos de cadena \alpha y \beta del TCR de NY-ESO se obtuvieron mediante clonación por PCR del siguiente modo. Las reacciones de PCR se realizaron usando los cebadores tal como se ha mostrado en lo que antecede y los moldes que contienen las cadenas nativas del TCR de NY-ESO. Los productos de la PCR se digirieron con enzimas de restricción con las enzimas de restricción relevantes y se clonaron en pGMT7 para obtener plásmidos de expresión. La secuencia de los insertos plasmídicos se confirmó mediante secuenciación del ADN. Las figuras 17a y 17b muestran la secuencia de ADN de las cadenas \alpha y \beta, respectivamente, del TCR de NY-ESO mutado y las figuras 18ª y 18b muestran las secuencias de aminoácidos resultantes.

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Ejemplo 12

Construcción de vectores de presentación en fago y clonación de ADN que codifica las cadenas \alpha y \beta del TCR de NY-ESO en los vectores fagemido

El ADN que codifica las cadenas \alpha y \beta del TCR de NY-ESO que incorpore nuevos codones de cisteína para facilitar la formación de un puente disulfuro no nativo entre cadenas producido como se ha descrito en el ejemplo 11 se incorporó en el vector fagemido pEX746 del siguiente modo.

Los ADN que codifica las dos cadenas del TCR de NY-ESO se sometieron individualmente a PCR con el fin de introducir sitios de clonación compatibles con el vector fagemido pEX746 (que contiene ADN que codifica el clon 7 del TCR A6) usando los cebadores siguientes:

Para la cadena alfa del TCR de NY-ESO

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Para la cadena beta del TCR de NY-ESO

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Los procedimientos de clonación molecular para construir los vectores se describe en "Molecular cloning: A laboratory manual, by J. Sambrook y D. W. Russell". Los cebadores enumerados en la tabla 1 se usan para la construcción de los vectores. Un ejemplo del programa de la PCR es 1 ciclo de 94ºC durante 2 minutos, seguido por 25 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 53ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 90 segundos, seguido por 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos, y después mantener a 4ºC. La ADN polimerasa Expand hifidelity Taq se adquiere en Roche. El ADN que codifica el clon 7 de la cadena \beta del TCR A6 se eliminó del pEX746 mediante digestión con las enzimas de restricción BssHII y BglII. El ADN digerido mediante PCR de forma correspondiente que codifica la cadena \beta del NY-ESO se sustituyó después en el fagemido mediante ligado. La secuencia del producto de clonación se verificó mediante secuenciación automática.

De igual forma, el ADN que codifica el clon 7 de la cadena \alpha del TCR A6 se eliminó del pEX746 mediante digestión con las enzimas de restricción NcoI y AvrII. El ADN digerido mediante PCR de forma correspondiente que codifica la cadena \alpha del NY-ESO se sustituyó después en el fagemido que ya contenía el ADN codificador de la cadena \beta del TCR de NY-ESO mediante ligado. La secuencia del producto de clonación se verificó mediante secuenciación automática. Las figuras 19a y 19b detallan, respectivamente, la secuencia de ADN y de aminoácidos de las cadenas \alpha y \beta del TCR de NY-ESO, así como la secuencia relevante adyacente incorporada en el fagemido (pEX746:NY-ESO). La secuencia precedente al sitio NcoI es la misma que en pEX746.

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Ejemplo 13

Expresión de fusiones de la proteína de la cubierta bacteriana y el TCR de NY-ESO heterodimérico en E. coli

Las partículas de fago que presentan el TCR de NY-ESO heterodimérico que contiene un puente disulfuro no nativo entre cadenas se prepararon usando procedimientos descritos anteriormente para la generación de partículas de fago que presentan scFvs de anticuerpo (Li y col., 2000, Journal of Immunological Methods 236: 133-146) con las modificaciones siguientes. Se usaron células E. coli TG1 que contienen fagemido pEX746:NY-ESO (es decir, el fagemido que codifica la cadena \alpha del TCR de NY-ESO soluble y una cadena \beta d el TCR de NY-ESO fusionada con la proteína gIII del fago producida como se ha descrito en el Ejemplo 12) se usaron para inocular 10 ml de 2xTY (que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y 2% de glucosa) y, después, el cultivo se incubó con agitación a 37ºC durante la noche (16 horas). 50 \mul del cultivo durante la noche se usó para inocular 10 ml de 2xTY (que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y 2% de glucosa) y, después, el cultivo se incubó con agitación a 37ºC hasta una DO_{600nm}= 0,8. Al cultivo se añadió el fago colaborador HYPERPHAGE hasta la concentración final de 5 x 10^{9} ufp/ml. A continuación, el cultivo se incubó a 37ºC sin variar durante treinta minutos y, después, con agitación a 200 rpm durante otros 30 minutos. El medio del cultivo anterior se pasó a 50 ml con 2xTY (que contiene 100 \mug/ml de ampicilina y 25 mg/ml de kanamicina), después el cultivo se incubó a 25ºC con agitación a 250 rpm durante 36 horas a 48 horas. Después, el cultivo se centrifugó a 4ºC durante 30 minutos a 4000 rpm. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 \mum y se almacenó a 4ºC para su posterior concentración. Después, el sobrenadante se concentró mediante precipitación en PEG y se resuspendió en PBS al 10% del volumen original almacenado.

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Ejemplo 14

Detección de TCR de NY-ESO heterodimérico funcional que contiene un puente disulfuro no nativo entre cadenas sobre las partículas de fago filamentoso

La presencia de TCR de NY-ESO funcional (unión HLA-A2-NY-ESO) presentado sobre las partículas de fago en la suspensión concentrada preparada en el Ejemplo 13 se detectó usando los métodos de ELISA para fagos descritos en el Ejemplo 4. La figura 20 muestra la unión específica de las partículas de fago que presentan el TCR de NY-ESO a HLA-A2-NY-ESO en un ensayo ELISA para fagos.

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Ejemplo 15

Construcción de plásmidos para la expresión celular de los genes HLA-DRA

Las secuencias de ADN que codifican la porción extracelular de las cadenas de HLA-DRA se amplifican a partir del ADNc aislado de la sangre de un sujeto humano sano, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con los pares de cebadores sintéticos para ADN que se han diseñado de modo que incluyan un sitio de restricción Bgl II.

A continuación se usa la mutagénesis por PCR para añadir ADN que codifica la cremallera de Fos leucina en el extremo 3' de la secuencia amplificada.

Las manipulaciones y clonación de ADN descritas en lo que antecede se llevan a cabo tal y como se ha descrito en Sambrook, J y col.; (1989). Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE.UU.

La figura 21 proporciona la secuencia de ADN de la cadena \beta de HLA-DR lista para su inserción en el vector de expresión bicistrónico. Esta figura indica la posición de los codones que codifican el péptido cremallera Fos leucina y el marcador de biotinilación.

La numeración de los aminoácidos se basa en la secuencia de ratón Kabat, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, US Dept of Health & Human Services, Public Health Service, NIH, Bethesda, MD 1-1137).

Esta secuencia de ADN se inserta después en un vector baculovirus bicistrónico pAcAB3 (véase la Figura 22 para la secuencia de este vector) junto con ADN que codifica la correspondiente cadena \beta de HLA de clase II para la expresión en células Sf9 de insecto. Este vector se puede usar para expresar cualquier complejo péptido-HLA de clase II en células de insecto.

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Ejemplo 16

Construcción de plásmidos para la expresión celular de los genes HLA-DRB de tipo salvaje y mutantes

Las secuencias de ADN que codifican la porción extracelular de las cadenas de HLA-DRB se amplifican a partir del ADNc aislado de la sangre de un sujeto humano sano, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con los pares de cebadores sintéticos para ADN que se han diseñado de modo que incluyan un sitio de restricción BamH1.

A continuación se usa la mutagénesis por PCR para añadir ADN que codifica la cremallera de Jun leucina en el extremo 3' de la secuencia amplificada y el ADN que codifica el péptido Flu HA cargado por la molécula HLA-DR1 en el extremo 5' de la secuencia.

Las manipulaciones y clonación de ADN descritas en lo que antecede se llevan a cabo tal y como se ha descrito en Sambrook, J y col.; (1989). Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Segunda edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, EE.UU.

La figura 23 proporciona la secuencia de ADN de la cadena \beta de HLA-DR lista para su inserción en el vector de expresión bicistrónico. Esta figura indica la posición de los codones que codifican la cremallera Jun leucina y el péptido Flu Ha.

La numeración de los aminoácidos se basa en la secuencia de ratón Kabat, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, US Dept of Health & Human Services, Public Health Service, NIH, Bethesda, MD 1-1137).

Esta secuencia de ADN se inserta después en un vector baculovirus bicistrónico pAcAB3 (véase la Figura 22 para la secuencia de este vector) junto con ADN que codifica la correspondiente cadena \alpha de HLA de clase II para la expresión en células Sf9 de insecto. Este vector se puede usar para expresar cualquier complejo péptido-HLA de clase II en células de insecto.

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Ejemplo 17

Expresión y replegamiento de los complejos HLA de clase II-DR1-Flu HA

La expresión de MHC de clase II se lleva a cabo usando los vectores de expresión bicistrónicos producidos como se ha descrito en los ejemplos 15 y 16, que contienen las cadenas \alpha y \beta de HLA-DR1 de clase II y el péptido Flu HA. Los procedimientos de expresión y purificación usados son como se describe en Gauthier (1998) PNAS USA 95 p1 1828-118333). Brevemente, el HLADR1 soluble se expresa en el sistema de baculovirus reemplazando las regiones transmembrana hidrofóbicas y los segmentos citoplasmáticos de las cadenas \alpha y \beta de DR con los dominios de dimerización de la cremallera de leucina de los factores de transcripción Fos y Jun.

En el constructo de expresión, la secuencia peptídica de Flu HA cargada con MHC de clase está covalentemente unida al extremo N de la cadena \beta del Dr. maduro y la cadena \alpha de DR contiene una secuencia indicadora de biotinilación para facilitar la formación de ligando bifuncional utilizando la metodología de multimerización con biotina/estreptavidina. La proteína recombinante es secretada por las células Sf9 infectadas con el baculovirus recombinante y se purifica mediante cromatografía de afinidad. La proteína se purifica más mediante HPLC de intercambio aniónico.

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Ejemplo 18

Construcción de moléculas de HLA-péptido soluble de clase I

Con el fin de investigar más la especificidad del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad se produjeron las siguientes moléculas de HLA-péptido de clase I solubles.

HLA-A2 - péptido (LLGRNSFEV)	(SEC ID 23)
HLA-A2 - péptido (KLVALGINAV)	(SEC ID 24)
HLA-A2 - péptido (LLGDLFGV)	(SEC ID 25)
HLA-B8 - péptido (FLRGRAYGL)	(SEC ID 26)
HLA-B27 - péptido (HRCQAIRKK)	(SEC ID 27)

HLA-Cw6 - péptido (YRSGIIAVV)	(SEC ID 28)
HLA-A24 - péptido (VYGFVRACL)	(SEC ID 29)
HLA-A2 - péptido (ILAKFLHWL)	(SEC ID 30)
HLA-A2 - péptido (LTLGEFLKL)	(SEC ID 31)
HLA-A2 - péptido (GILGFVFTL)	(SEC ID 33)
HLA-A2 - péptido (SLYNTVATL)	(SEC ID 34)

Estos péptido-HLA solubles se produjeron usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 10.

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Ejemplo 19

Medición mediante resonancia de plasmón superficial BIAcore de la especificada de la unión del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad con e péptido-HLA

Para analizar la especificidad de unión del clon 134 de TCR A6 de alta afinidad se usó un biosensor de resonancia de plasmón superficial (BIAcore 3000^{TM}). (Véanse las Figuras 15a & 15b para las secuencias completas de ADN y de aminoácidos de la cadena \beta del TCR mutado). Esto se llevó a cabo usando el péptido HLA de clase II-DR1 producido como se describe en los Ejemplos 15-17 y los complejos péptido de Clase I-HLA enumerados en el ejemplo 18, producido usando los procedimientos detallados en el ejemplo 10. La tabla siguiente enumera los complejos péptido-HLA utilizados:

1.	HLA-A2 - péptido (LLGRNSFEV)	(SEC ID 23)
2.	HLA-A2 - péptido (KLVALGINAV)	(SEC ID 24)
3.	HLA-A2 - péptido (LLGDLFGV)	(SEC ID 25)
4.	HLA-B8 - péptido (FLRGRAYGL)	(SEC ID 26)
5.	HLA-B27 - péptido (HRCQAIRKK)	(SEC ID 27)
6.	HLA-Cw6 - péptido (YRSGIIAVV)	(SEC ID 28)
7.	HLA-A24 - péptido (VYGFVRACL)	(SEC ID 29)
8.	HLA-A2 - péptido (ILAKFLHWL)	(SEC ID 30)
9.	HLA-A2 - péptido (LTLGEFLKL)	(SEC ID 31)
10.	HLA-DR - péptido (PKYVKQNTLKLA)	(SEC ID 32)
11.	HLA-A2 - péptido (GILGFVFTL)	(SEC ID 33)
12.	HLA-A2 - péptido (SLYNTVATL)	(SEC ID 34)

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Los HLA péptido anteriores se inmovilizaron en superficies de unión recubiertas con estreptavidina de las células de flujo de un BIAcore 3000^{TM} de un modo semi-orientado.

El BIAcore 3000^{TM} permite el análisis de la unión del receptor soluble de células T a hasta cuatro pMHC diferentes (inmovilizados en células de flujo diferentes) de forma simultánea. Para este experimento se inmovilizaron tres HLA-péptidos diferentes en las células de flujo 2-4 y la célula de flujo 1 se dejó en blanco como control. La inyección manual de los complejos HLA-péptido permitió el nivel preciso de moléculas inmovilizadas para su manipulación.

Después de evaluar la capacidad del clon 134 del TCR A6 de ata afinidad de unión a los primeros 3 complejos HLA-péptido de la lista anterior, los siguientes tres se inmovilizaron sobre estas células de flujo directamente en la parte superior de los previos. Este procedimiento continuó hasta que se hubo evaluado la unión del clon 134 del tCR A6 de alta afinidad a los 12 complejos HLA-péptido.

Diez inyecciones de 5 \mul del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad se pasaron sobre cada célula de flujo a 5 \mul/min a concentraciones variables de 4,1 ng/ml a 2,1 mg/ml. (Véanse las figuras 24-28). Como control final, el clon 134 del TCR A6 de alta afinidad se pasó sobre una célula de flujo que contiene HLA-A2 Tax inmovilizado (LLFGYPVYV) (SEC ID 21), el ligando conocido de este TCR.

La unión específica del clon 134 del TCR A6 de alta afinidad sólo se observó con su ligando conocido. (HLA-A2 Tax (LLFGYPVYV) (SEQ ID 21)) Estos datos demuestran además la especificidad del lon 134 del TCR A6 de alta afinidad. (Véanse las figuras 24-).

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Ejemplo 20

Mutagénesis de las regiones CDR3 del TCR de NY-ESO

Las regiones CDR3 del TCR de NY-ESO eran la diana para la introducción de mutaciones para investigar la posibilidad de generar mutantes de alta afinidad. Esto se consiguió usando cebadores de PCR específicos del TCR de NY-ESO en combinación con procedimientos sustancialmente iguales a los detallados en el ejemplo 7.

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Ejemplo 21

Aislamiento de mutantes de TCR A6 de alta afinidad

El aislamiento de mutantes de TCR de NY-ESO de alta afinidad se llevó a cabo usando el primero de los dos procedimientos descritos en el ejemplo 8.

Se identificó un único mutante del TCR de NY-ESO de alta afinidad.

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Ejemplo 22

Producción de TCR de NY-ESO heterodimérico soluble de alta afinidad con puente disulfuro no nativo entre las regiones constantes que contienen mutaciones en la región variable

El ADN del fagemido que codifica los mutantes de TCR de NY-ESO de alta afinidad identificados en el ejemplo 21 se aisló de las células de E. coli relevantes usando un kit Mini-Prep (Quiagen, Reino unido).

Para amplificar la secuencia de ADN de la región variable de la cadena \beta del TCR de NY-ESO soluble mutada se usó amplificación por PCR usando el ADN del fagemido como diana y los siguientes cebadores.

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Cebador directo de la cadena beta de NY-ESO

Tctctc\underline{attaat}gaatgctggtgtcactcagacccc

(SEC ID 145)

(El sitio de restricción AseI está subrayado)

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Cebador inverso de la cadena beta universal

Tagaaa\underline{ccggt}ggccaggcacaccagtgtgg

(SEC ID 146)

(El sitio de restricción AgeI está subrayado)

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El producto de la PCR se digirió con AgeI/AseI y se clonó en pEX821 (producido como se ha descrito en el ejemplo 11) cortado con Nde/AgeI.

La secuencia de ADN de la cadena \beta del TCR de NY-ESO mutado amplificada como se ha descrito en lo que antecede y la cadena \alpha del TCR de NY-ESO producida como se ha descrito en el ejemplo 11 se usaron después para producir un TCR de NY-ESO de alta afinidad soluble como se describe en el documento WO 03/020763. Brevemente, las dos cadenas se expresan como cuerpos de inclusión en distintos cultivos de E. coli. Después, los cuerpos de inclusión se aíslan, desnaturalizan y vuelven a plegar juntos in vitro.

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Ejemplo 23

Caracterización mediante plasmón superficial BIAcore de una unión de alta afinidad del TCR de NY-ESO a HLA-A2 NY-ESO

Para analizar la unión del TCR de NY-ESO de alta afinidad al ligando HLA-A2 NY-ESO se usó un biosensor de resonancia de plasmón superficial (Biacore 3000^{TM}). Esto se facilitó produciendo complejos de pMHC (como se describe en el ejemplo 10) que se inmovilizaron en una superficie de unión recubierta con estreptavidina de un modo semiorientado, lo que permite un análisis eficiente de la unión de un receptor soluble de células T con hasta cuatro pMHC diferentes (inmovilizados en diferentes células de flujo) de forma simultánea.

La inyección manual del complejo HLA permite el nivel preciso de moléculas de clase I inmovilizadas para su fácil manipulación.

Las interacciones entre el TCR de NY-ESO de alta afinidad que contiene un nuevo enlace entre cadenas y el complejo HLA-A2 NY-ESO o una combinación irrelevante de HLA-A2 Tax, cuya producción se describe en el ejemplo 10, se analizaron en un biosensor de resonancia en plasmón superficial (RPS) Biacore 3000^{TM}, de nuevo como se describe en el ejemplo 10.

Se calculó que la kd de la interacción del NY-ESO soluble de alta afinidad con HLA-A2 NY-ESO era de 4,1 \mum (véanse las figuras 29a y 29b), que se compara con una kd de 15,7 \mum para la interacción de tipo salvaje. (Véanse las figuras 30a y 30b).

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Ejemplo 24

Producción y análisis de otros TCR A6 de alta afinidad

Usando los procedimientos detallados en el ejemplo 9 se produjeron TCR solubles que contienen las mutaciones siguientes correspondientes a las identificadas en los clones 89, 1, 111 y 71 (véase el ejemplo 8). La unión de estos TCR solubles a HLAA2 Tax se evaluó después usando el ensayo Biacore detallado en el Ejemplo 10.

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Mutantes de la cadena \beta de TCR A6

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39

Mutantes de la cadena \alpha de TCR A6

40

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Mutaciones combinadas usadas como base para la producción de TCR A6 solubles mutados

Mutaciones del clon 89 + mutaciones del clon 134

Mutaciones del clon 71 + mutaciones del clon 134

Mutaciones del clon 71 + mutaciones del clon 89

Mutaciones del clon 1 + mutación \betaG102\rightarrowA

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Resultados

La tabla siguiente compara la afinidad por HLA-A2 Tax de los TCR A6 solubles mutados anteriores con la obtenida usando un TCR A6 soluble que contiene regiones variables no mutadas. Obsérvese que la afinidad de los mutantes de mayor afinidad se expresa como la semivida para la interacción. (T_{1/2}) Estos TCR A6 solubles mutantes exhibieron mayor afinidad por HLA-A2 Tax que el TCR A6 soluble no mutado como queda demostrado por su menor kd o mayor T_{1/2} para la interacción.

Las figuras 31-37 muestran las trazas Biacore usadas para calcular la afinidad por HLA-A2 Tax de estos TCR solubles mutados. Las figuras 38a-e muestran la secuencia de aminoácidos de las cadenas del TCR A6 mutado.

41

\newpage

Ejemplo 25

Tinción celular usando tetrámeros y monómeros de TCR A6 de alta afinidad

Las células presentadoras de antígeno T2 se incubaron con \beta2m (3 \mug/ml) pulsado con péptido Tax a un intervalo de concentraciones (10^{-5} - 10^{-9}M) durante 90 minutos a 37ºC. Los controles, también usando células T2 incubadas con \beta2m (3 \mug/ml) se pulsaron con péptido Flu 10^{-5}M o se incubaron sin péptido (sin pulsar).

Después de pulsar, las células se lavaron en RPMI sin suero y 2x105 células se incubaron con el clon 134 del TCR A6 tetramérico de alta afinidad unido a estreptavidina marcado con ficoeritrina (PE). Molecular probes, Países Bajos) (10 \mug/ml) o clon 134 de monómeros de TCR A6 de alta afinidad marcados con Alexa 488 (Molecular probes, Países Bajos) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las células, la unión de los tetrámeros y los monómeros de TCR marcados se analizó mediante citometría de flujo usando un FACSVantage SE (Becton Dickinson).

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Resultados

Como se ilustra en la Figura 39a, se podía observar la tinción específica de las células T2 por los tetrámeros de TCR A6 de alta afinidad a las concentraciones del péptido Tax inferiores a 10^{-9}M.

Como se ilustra en la Figura 39b, se podía observar la tinción específica de las células T2 por los monómeros de TCR A6 de alta afinidad a las concentraciones del péptido Tax inferiores a 10^{-8}M.

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Organización solicitante

Calle: 57C Milton Park

Ciudad: Abingdon

Estado: Oxfordshire

País: Inglaterra

Código postal: OX14 4RX

Número de teléfono: +44 1235 438600

Número de fax: +44 1235 438601

Dirección de email: martin.green@avidex.com

<110> Nombre de la organización: Avidex Ltd

\vskip1.000000\baselineskip

Solicitante individual

Calle: Avidex Ltd, 57C Milton Park

Ciudad: Abingdon

Estado: Oxfordshire

País: Inglaterra

Código postal: OX14 4RX

Número de teléfono: +44 1235 438600

Número de fax: +44 1235 438601

Dirección de email: bent.jakobsen@avidex.com

<110> Apellido: Jakobsen

<110> Nombre: Bent

<110> Inicial del segundo nombre: K

<110> Título: Dr.

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Solicitante individual

Calle: Avidex Ltd, 57C Milton Park

Ciudad: Abingdon

Estado: Oxfordshire

País: Inglaterra

Código postal: OX14 4RX

Número de teléfono: +44 1235 438600

Número de fax: +44 1235 438601

Dirección de email: torben.andersen@avidex.com

<110> Apellido: Andersen

<110> Nombre: Torben

<110> Inicial del segundo nombre: B

<110> Título: Dr.

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Solicitante individual

Calle: Avidex Ltd, 57C Milton Park

Ciudad: Abingdon

Estado: Oxfordshire

País: Inglaterra

Código postal: OX14 4RX

Número de teléfono: +44 1235 438600

Número de fax: +44 1235 438601

Dirección de email: peter.molloy@avidex.com

<110> Apellido: Molloy

<110> Nombre: Peter

<110> Inicial del segundo nombre: E

<110> Título: Dr.

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Solicitante individual

Calle: Avidex Ltd, 57C Milton Park

Ciudad: Abingdon

Estado: Oxfordshire

País: Inglaterra

Código postal: OX14 4RX

Número de teléfono: +44 1235 438600

Número de fax: +44 1235 438601

Dirección de email: jonathan.boulter@avidex.com

<110> Apellido: Boulter

<110> Nombre: Jonathan

<110> Inicial del segundo nombre: M

<110> Título: Dr

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Solicitante individual

Calle: Avidex Ltd, 57C Milton Park

Ciudad: Abingdon

Estado: Oxfordshire

País: Inglaterra

Código postal: OX14 4RX

Número de teléfono: +44 1235 438600

Número de fax: +44 1235 438601

Dirección de email: yi.li@avidex.com

<110> Apellido: Li

<110> Nombre: Yi

<110> Inicial del segundo nombre:

<110> Título: Dr.

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Proyecto de la solicitud

<120> Título: sustancias

<130> Referencia: Caso nº 19

<140> Número de aplicación anterior: GB 0226227.7

<141> Fecha actual de presentación: 2002-11-09

\vskip1.000000\baselineskip

Solicitudes anteriores

<150> Número de solicitud previa: GB0226227.7

<151> Fecha de archivo previa: 2002-11-09

\vskip1.000000\baselineskip

Solicitudes anteriores

<150> Número de solicitud previa: GB 0301814.0

<151> Fecha de archivo previa: 2003-01-25

\vskip1.000000\baselineskip

Solicitudes anteriores

<150> Número de solicitud previa GB 0304067.2

<151> Fecha de archivo previa: 2003-02-22

\vskip1.000000\baselineskip

Solicitudes anteriores

<150> Número de solicitud previa: GB 0311397.4

<151> Fecha de archivo previa: 2003-05-16

\vskip1.000000\baselineskip

Solicitudes anteriores

<150> Número de solicitud previa: GB 0316356.5

<151> Fecha de archivo previa: 2003-07-11

\vskip1.000000\baselineskip

Solicitudes anteriores

<150> Número de solicitud previa: documento US 60/436.323

<151> Fecha de archivo previa: 2003-04-16

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

DSDVYITDKT VLDMRSMDFK 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 1

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

QSKDSDVYIT DKTVLDMRSM 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 2

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

DIQNPDPAVY QLRDSKSSDK 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 3

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Presecuenciación:

DPAVYQLRDS KSSDKSVCLF 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 4

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

NGKEVHSGVS TDPQPLKEQP 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 5

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Presecuenciación:

ALNDSRYALS SRLRVSATFW 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 6

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

PPEVAVFEPS EAEISHTQKA 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 7

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

KEVHSGVSTD PQPLKEQPAL 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 8

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

VFPPEVAVFE PSEAEISHTQ 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 9

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

42

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 91

Nombre de la secuencia: SEC ID 10

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

43

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 126

Nombre de la secuencia: SEC ID 11

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ESGTFITDKT VLDMKAMDSK 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 12

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

KTMESGTFIT DKTVLDMKAM 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 13

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

YIQNPEPAVY QLKDPRSQDS 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 14

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVYQLKDPRS QDSTLCLFTD 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 15

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

NGREVHSGVS TDPQAYKESN 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 16

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

KESNYSYCLS SRLRVSATFW 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 17

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

PPKVSLFEPS KAEIANKQKA 20

<212> Tipo: PRT

\newpage

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 18

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

REVHSGVSTD PQAYKESNYS 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 19

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

VTPPKVSLFE PSKAEIANKQ 20

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 20

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

LLFGYPVYV 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 21

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

SLLMITQC 8

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 8

Nombre de la secuencia: SEC ID 22

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

LLGRNSFEV 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 23

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

KLVALGINAV 10

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 10

Nombre de la secuencia: SEC ID 24

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

LLGDLFGV 8

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 8

Nombre de la secuencia: SEC ID 25

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

FLRGRAYGL 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 26

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

HRCQAIRKK 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 27

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

YRSGIIAVV 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 28

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

VYGFVRACL 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 29

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ILAKFLHWL 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 30

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

LTLGEFLKL 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 31

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

PKYVKQNTLK LA 12

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 12

Nombre de la secuencia: SEC ID 32

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

GILGFVFTL 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia SEC ID 33

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

SLYNTVATL 9

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 9

Nombre de la secuencia: SEC ID 34

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cacagacaaa tgtgtgctag acat 24

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 24

Nombre de la secuencia: SEC ID 35

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 35

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

atgtctagca cacatttgtc tgtg 24

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 24

Nombre de la secuencia: SEC ID 36

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 36

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cagtggggtc tgcacagacc c 21

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 21

Nombre de la secuencia: SEC ID 37

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 37

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gggtctgtgc agaccccact g 21

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 21

Nombre de la secuencia: SEC ID 38

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 38

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

taataatacg tataataata ttctatttca aggagacagt c 41

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 41

Nombre de la secuencia: SEC ID 39

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 39

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

caatccagcg gctgccgtag gcaataggta tttcattatg actgtctcct tgaaatag 58

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 58

Nombre de la secuencia: SEC ID 40

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 40

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ctacggcagc cgctggattg ttattactcg cggcccagcc ggccatggcc cag 53

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 53

Nombre de la secuencia: SEC ID 41

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 41

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gttctgctcc acttccttct gggccatggc cggctgggcc g 41

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 41

Nombre de la secuencia: SEC ID 42

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 42

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cagaaggaag tggagcagaa c 21

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 21

Nombre de la secuencia: SEC ID 43

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 43

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cttcttaaag aattcttaat taacctaggt tattaggaac tttctgggct ggggaag 57

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 57

Nombre de la secuencia: SEC ID 44

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 44

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gttaattaag aattctttaa gaaggagata tacatatgaa aaaattatta ttcgcaattc 60

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 60

Nombre de la secuencia: SEC ID 45

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 45

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cgcgctgtga gaatagaaag gaacaactaa aggaattgcg aataataatt ttttcatatg 60

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 60

Nombre de la secuencia: SEC ID 46

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 46

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ctttctattc tcacagcgcg caggctggtg tcactcagac 40

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 40

Nombre de la secuencia: SEC ID 47

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 47

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

atgatgtcta gatgcggccg cgtctgctct accccaggcc tc 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 48

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 48

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcatctagac atcatcacca tcatcactag actgttgaaa gttgtttagc aaaac 55

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 55

Nombre de la secuencia: SEC ID 49

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 49

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ctagagggta ccttattaag actccttatt acgcagtatg 40

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 40

Nombre de la secuencia: SEC ID 50

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 50

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

44

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 86

Nombre de la secuencia: SEC ID 51

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 51

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gatcccatgg tggcctgttc ctatagtgag tcgtattagc tgc 43

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 43

Nombre de la secuencia: SEC ID 52

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 52

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

agctgcagct aatacgactc actataggaa caggccacca tgg 43

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 43

Nombre de la secuencia: SEC ID 53

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 53

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ccaccatggg ccagaaggaa gtggagcaga actc 34

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 34

Nombre de la secuencia: SEC ID 54

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 54

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cgagagcccg tagaactgga cttg 24

<212> Tipos de ADN

<211> Longitud: 24

Nombre de la secuencia: SEC ID 55

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 55

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gtggatccgg cggtggcggg tcgaacgctg gtgtcactca gacccc 46

<212> Tipos de ADN

<211> Longitud: 46

Nombre de la secuencia: SEC ID 56

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 56

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ccggatccac ctccgcctga accgcctcca ccggtgacca caacctgggt ccctg 55

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 55

Nombre de la secuencia: SEC ID 57

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 57

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ctgagaattc ttatgactct ccgcggttga agctc 35

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 35

Nombre de la secuencia: SEC ID 58

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 58

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgacgaattc tgactctccg cggttgaagc tc 32

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 32

Nombre de la secuencia: SEC ID 59

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 59

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

agctgcagct aatacgactc actatagg 28

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 28

Nombre de la secuencia: SEC ID 60

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 60

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ggccaccatg ggcaacgctg gtgtcactca gacccc 36

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 36

Nombre de la secuencia: SEC ID 61

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 61

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgaaccgcct ccaccgtctg ctctacccca ggcctcggcg 40

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 40

Nombre de la secuencia: SEC ID 62

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 62

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgactctccg cggttgaagc tc 22

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 22

Nombre de la secuencia: SEC ID 63

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 63

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cagctggggg aagcttcagt ttggagcag 29

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 29

Nombre de la secuencia: SEC ID 64

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 64

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ctgctccaaa ctgaagcttc ccccagctg 29

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 29

Nombre de la secuencia: SEC ID 65

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 65

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gtacttctgt gcctcgaggc cgggactag 29

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 29

Nombre de la secuencia: SEC ID 66

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 66

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ctagtcccgg cctcgaggca cagaagtac 29

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 29

Nombre de la secuencia: SEC ID 67

Descripción de la secuencia:

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 67

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cattttcagg gatagcaagc 20

<212>Tipo: ADN

<211> Longitud: 20

Nombre de la secuencia: SEC ID 68

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 68

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tcacacagga aacagctatg tcacacagga aacagctatg 40

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 40

Nombre de la secuencia: SEC ID 69

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 69

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgtgcctcga ggnnknnknn knnknnknnk cgaccagagc agtacttcg 49

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 49

Nombre de la secuencia: SEC ID 70

Descripción de la secuencia:

\newpage

Característica

Secuencia: SEC ID 70

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 49

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 70

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgtgcctcga ggccgnnknn knnknnknnk nnkccagagc agtacttcgg gc 52

<212> Tipos de ADN

<211> Longitud: 52

Nombre de la secuencia: SEC ID 71

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 71

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 71

<221> FeatureKey: masc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 52

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 71

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgtgcctcga ggccgnnknn knnknnknnk nnkcgaccag agcagtactt cg 52

<212> Tipo ADN

<211> Longitud: 52

Nombre de la secuencia: SEC ID 72

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 72

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 52

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSioin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 72

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra Presecuencia:

tgtgcctcga ggccgnnknn knnknnknnk nnkggagggc gaccagagca g 51

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 51

Nombre de la secuencia: SEC ID 73

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 73

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

\newpage

<222> Localización a: 51

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 73

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Presecuenciación:

tgtgcctcga ggccgggann knnknnknnk nnknnkgggc gaccagagca gtac 54

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 54

Nombre de la secuencia: SEC ID 74

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 74

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 74

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 54

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 74

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgtgcctcga ggnnknnknn knnknnknnk ccagagcagt acttcgggc 49

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 49

Nombre de la secuencia: SEC ID 75

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 75

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 75

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 49

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 75

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgtgcctcga ggnnknnknn knnknnknnk gagcagtact tcgggccg 48

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 48

Nombre de la secuencia: SEC ID 76

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 76

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 48

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 76

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgtgcctcga ggnnknnknn knnknnknnk cagtacttcg ggccgggc 48

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 48

Nombre de la secuencia: SEC ID 77

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 77

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 48

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 77

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tgtgcctcga ggccgnnknn knnknnkggg cgaccagagc agtacttcg 49

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 49

Nombre de la secuencia: SEC ID 78

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 78

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 78

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 49

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 78

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

aaactgaagc ttmnnmnnmn nmnnmnntgt aacggcacag aggtag 46

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 46

Nombre de la secuencia: SEC ID 79

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 79

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 46

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\newpage

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 79

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

aaactgaagc ttmnnmnngc tgtcmnntgt aacggcacag aggtag 46

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 46

Nombre de la secuencia: SEC ID 80

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 80

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 46

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 80

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

aaactgaagc ttmnnmnnmn ngctgtcmnn tgtaacggca cagaggtag 49

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 49

Nombre de la secuencia: SEC ID 81

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 81

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de:

\newpage

<222> Localización a:

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 81

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 49

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 81

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

aaactgaagc ttmnnmnngc tgtcmnnaac ggcacagagg tag 43

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 43

Nombre de la secuencia: SEC ID 82

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de la secuencia:

Característica

Secuencia: SEC ID 82

<221> FeatureKey: misc_feature

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 43

Otra información: m is a or c; n is a or t or g or c; k is g o t

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 82

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggactagc gggagggcga ccagagcagt ag 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 83

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 83

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLAGGR PEQY 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 84

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cggggctgat gagtgcgtag ccagagcagt ac 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 85

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 85

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLMSAX PEQY 14

<212> Tipo: PRT

\newpage

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 86

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 86

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cggggctgag gtcggcgtag ccagagcagt ac 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 87

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 87

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLRSAX PEQY 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 88

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 88

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información sobre el codón: x indica un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggactagc gggagggcga ccagaggcgt ag 42

<212> Tipos de ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 89

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 89

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLAGGR PEAX 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 90

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 90

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 90

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: NO

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggactagc gggagggcga ccagaggatt ag 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 91

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 91

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLAGGR PEDX 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 92

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 92

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: NO

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggactagc gggagggcga ccagatcagt ag 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 93

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 93

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLAGGR PDQX 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 94

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 94

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 94

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggtctgta ggctgggcga ccagagcagt ac 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 95

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 95

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLXAGR PEQY 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 96

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 96

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 96

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cggggctggt tccggggcga ccagagcagt ag 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 97

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 97

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLVPGR PEQX 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 98

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 98

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 98

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cggggcttgt gtctgcttag ccagagcagt ac 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 99

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 99

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLVSAX PEQY 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 100

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 100

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggactagc gggagggcga ccacatccgt ag 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 101

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 101

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLAGGR PHPX 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 102

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 102

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 102

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: NO

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggactagc gggagggcga ccagatgcgt ag 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 103

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 103

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLAGGR PDAX 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC 104

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC 104

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gcctcgaggc cgggtctgat tagtgcttag ccagagcagt ac 42

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 42

Nombre de la secuencia: SEC ID 105

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 105

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ASRPGLISAX PEQY 14

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 14

Nombre de la secuencia: SEC ID 106

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 106:

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 14

Otra información sobre el codón: x indica un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggaagctt cag 33

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 107

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 107

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGKL Q 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 108

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggccgctt cag 33

<212> Tipo: ADN

\newpage

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 109

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 109

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGPL Q 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 110

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggaagatg cag 33

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 111

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 111

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGKM Q 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 112

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggaagttg cat 33

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 113

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 113

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGKL H 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 114

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggtagctt cat 33

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 115

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 115

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGXL H 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 116

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 116

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de:

<222> Localización a:

Otra información: x incida un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 116

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 11

Otra información sobre el codón: x indica un residuo de aminoácido codificado por un codón ámbar

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg gggggagctt cat 33

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 117

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 117

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGEL H 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 118

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg gggggagctt cat 33

<212> Tipo: ADN 33

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 119

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 119

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGRL H 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 120

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggcagctt cat 33

<212> Tipos de ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 121

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 121

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGQL H 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 122

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggaaggtt cat 33

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 123

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 123

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGKV H 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 124

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggaaggtg aat 33

<212> Tipo: ADN

\newpage

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 125

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 125

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGKV N 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 126

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gccgttacaa ctgacagctg ggggaagctt ctg 33

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 33

Nombre de la secuencia: SEC ID 127

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 127

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

AVTTDSWGKL L 11

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: SEC ID 128

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ggaattcatc gatgcagaag gaagtggagc ag 32

<212> Tipos de ADN

<211> Longitud: 32

Nombre de la secuencia: SEC ID 129

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 129

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gtacacggcc gggtcagggt tctggatata c 31

<212> Tipo: ADN 31

<211> Longitud: 31

Nombre de la secuencia: SEC ID 130

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 130

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tctctcatta atgaatgctg gtgtcactca gacccc 36

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 36

Nombre de la secuencia: SEC ID 131

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 131

\newpage

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tagaaaccgg tggccaggca caccagtgtg gc 32

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 32

Nombre de la secuencia: SEC ID 132

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 132

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ctgctctggt tccgcactc 19

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 19

Nombre de la secuencia: SEC ID 133

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 133

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

gagtgcggaa ccagagcag 19

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 19

Nombre de la secuencia: SEC ID 134

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 134

\newpage

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

atatccagaa cccggatcct gccgtgta 28

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 28

Nombre de la secuencia: SEC ID 135

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 135

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tacacggcag gaatccgggt tctggatat 29

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 29

Nombre de la secuencia: SEC ID 136

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 136

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ggagatatac atatgcagga ggtgacacag 30

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 30

Nombre de la secuencia: SEC ID 137

Descripción de la secuencia:

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 137

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tacacggcag gatccgggtt ctggatatt 29

<212>Tipo: ADN

<211> Longitud: 29

Nombre de la secuencia: SEC ID 138

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 138

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

ggagatatac atatgggtgt cactcagacc 30

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 30

Nombre de la secuencia: SEC ID 139

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 139

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cccaagctta gtctgctcta ccccaggcct cggc 34

<212>Tipo: ADN

<211> Longitud: 34

Nombre de la secuencia: SEC ID 140

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 140

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

gccggccatg gccaaacagg aggtgacgca gattcct 37

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 37

Nombre de la secuencia: SEC ID 141

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 141

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

cttcttaaag aattcttaat taacctaggt tattaggaac tttctgggct ggggaag 57

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 57

Nombre de la secuencia: SEC ID 142

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 142

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tcacagcgcg caggctggtg tcactcagac cccaaa 36

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 36

Nombre de la secuencia: SEC ID 143

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 143

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

cgagagcccg tagaactgga cttg 24

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 24

Nombre de la secuencia: SEC ID 144

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 144

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tctctcatta atgaatgctg gtgtcactca gacccc 36

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 36

Nombre de la secuencia: SEC ID 145

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 145

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

tagaaaccgg tggccaggca caccagtgtg g 31

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 31

Nombre de la secuencia: SEC ID 146

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 146

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

45

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 621

Nombre de la secuencia: SEC ID 147

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 147

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

46

\newpage

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 741

Nombre de la secuencia: SEC ID 148

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 148

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

47

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 206

Nombre de la secuencia: SEC ID 149

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

48

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 246

Nombre de la secuencia: SEC ID 150

Descripción de la secuencia:

\newpage

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

49

50

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 5495

Nombre de la secuencia: SEC ID 151

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 151

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

53

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 1303

Nombre de la secuencia: SEC ID 152

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 152

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

54

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 416

Nombre de la secuencia: SEC ID 153

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

55

56

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 2699

Nombre de la secuencia: SEC ID 154

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 154

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

58

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 1262

Nombre de la secuencia: SEC ID 155

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 155

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

59

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 732

Nombre de la secuencia: SEC ID 156

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 156

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

60

<212> Tipos de ADN

<211> Longitud: 244

Nombre de la secuencia: SEC ID 157

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 157

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 244

Otra información: X indica un residuo de aminoácido codificado por un codón ópalo, que normalmente se traduce a triptófano

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

61

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 732

Nombre de la secuencia: SEC ID 158

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 158

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

\newpage

<400> Hebra pre-secuencia:

62

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 745

Nombre de la secuencia: SEC ID 159

Descripción de la secuencia:

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 159

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

63

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 246

Nombre de la secuencia: SEC ID 160

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

64

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 244

Nombre de la secuencia: SEC ID 161

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

65

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 627

Nombre de la secuencia: SEC ID 162

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 162

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

66

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 729

Nombre de la secuencia: SEC ID 163

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 163

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

67

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 208

Nombre de la secuencia: SEC ID 164

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

68

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 242

Nombre de la secuencia: SEC ID 165

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

69

70

<212> Type: DNA

<211> Longitud: 3466

Nombre de la secuencia: SEC ID 166

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 166

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

71

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 494

Nombre de la secuencia: SEC ID 167

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

72

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 854

Nombre de la secuencia: SEC ID 168

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 168

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

73

74

75

76

77

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

\newpage

<211> Longitud: 10096

Nombre de la secuencia: SEC ID 169

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 169

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

79

\vskip1.000000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

<211> Longitud: 941

Nombre de la secuencia: SEC ID 170

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Codón preparado

Nombre de la secuencia: SEC ID 170

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

80

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 116

Nombre de la secuencia: SEC ID 171

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

81

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 116

Nombre de la secuencia: SEC ID 172

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Característica

Secuencia: SEC ID 172

<221> FeatureKey: MISC_FEATURE

<222> Localización de: 1

<222> Localización a: 116

Otra información: Donde x es e, q o r

CDSJoin: No

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

82

<212> Tipo: PRT

\newpage

<211> Longitud: 117

Nombre de la secuencia: SEC ID 173

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

83

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 116

Nombre de la secuencia: SEC ID 174

Descripción de la secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia

<213> Nombre del organismo: Secuencia sintética

<400> Hebra pre-secuencia:

84

<212> Tipo: PRT

<211> Longitud: 116

Nombre de la secuencia: SEC ID 175

Descripción de la secuencia:

Claims (13)

1. Una partícula de fago que presenta en su superficie un polipéptido TCR de una cadena (scTCR) o un par polipeptídico de TCR dimérico (dTCR), en el que dicho scTCR está constituido por un primer segmento una secuencia del dominio variable de la cadena \alpha o \delta del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \alpha del TCR, un segundo segmento constituido por una secuencia del dominio variable de la cadena \beta o \gamma del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \beta del TCR, una secuencia espaciadora que liga el extremo C del primer segmento con el extremo N del segundo segmento, o viceversa, y

un puente disulfuro entre los segmentos primero y segundo, en el que dicho puente disulfuro es uno que no tiene equivalente en los receptores de células T \alpha\beta o \gamma\delta nativos; en el que dicho par polipeptídico de dTCR está constituido por un primer polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena \alpha o \delta del TCR fusionada con el extremo N de una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \alpha del TCR

un segundo polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena \beta o \gamma del TCR está fusionada con el extremo N de una secuencia correspondiente a la secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \beta del TCR, los polipéptidos primero y segundo, en el que están unidos por un puente disulfuro que no tiene equivalente en los receptores de células T \alpha\beta o \gamma\delta nativos, en el que dicho puente disulfuro entre los segmentos primero y segundo del scTCR, o entre los polipéptidos primero y segundo del dTCR, entre las cisternas sustituidas por los siguientes pares de residuos en el exón 1 de TRAC*01 para la cadena \alpha del TCR y TRBC1*0 o TRBC2*01 para la cadena \beta del TCR:

85

2. Una partícula de fago según la reivindicación 1, que es una partícula de fago filamentoso.

3. Una partícula de fago según la reivindicación 1 o 2, en la que el extremo C de un miembro del par polipeptídico del dTCR, o el extremo C del polipéptido scTCR, está unido mediante un enlace peptídico a un residuo expuesto en la superficie de la partícula de fago.

4. Una partícula de fago según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el polipeptídico scTCR o el polipéptido dTCR es humano y dicho puente disulfuro está entre los residuos de cisteína sustituidos por Thr48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.

5. Una partícula de fago según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polipeptídico del scTCR o el polipeptídico dTCR es de mamífero aparte de humano y dicho puente disulfuro está entre los residuos de cisteína sustituidos por los equivalentes mamíferos relevantes de Thr48 del exón 1 de TPAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01 de los TCR humanos.

6. Una partícula de fago según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el TCR está truncado por el extremo C en el caso de un dTCR, o en extremo C en el caso de un scTCR, con respecto a dichos receptores de células T nativos de modo que los residuos de cisteína que forman el puente disulfuro entre cadenas del TCR nativo están excluidas.

7. Una partícula de fago según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los residuos de cisteína que forman el puente disulfuro entre cadenas nativo están sustituidos por residuos que no son cisteína.

8. Una partícula de fago según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que los dTCR o scTCR presentados no presentan residuo de cisteína no apareado correspondientes a un residuo de cisteína no apareado presente en el TCR nativo.

9. Una partícula de fago según la reivindicación 1, que es una partícula de fago filamentoso que presenta en su superficie un par polipeptídico receptor de células T dimérico (dTCR), en que dicho par está constituido por un primer polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena \alpha del TCR está fusionada con el extremo N de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \alpha del TCR, y un segundo polipéptido en el que una secuencia del dominio variable de la cadena \beta del TCR está fusionada con el extremo N correspondiente a una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena \beta del TCR, en los que los polipéptidos primero y segundo están unidos por un puente disulfuro entre los residuos de cisteína sustituidos por Thr48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01, el extremo C de un miembro del par polipeptídico dTCR está unido mediante un enlace peptídico a una proteína de la cubierta del fago.

10. Una biblioteca diversa de partículas de fago según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

11. Una biblioteca diversa según la reivindicación 10, en la que la diversidad reside en el(los) dominio(s) variables del par polipeptídico dTCR o polipéptido scTCR.

12. Un procedimiento para la identificación de TCR con una característica específica, en el que dicho procedimiento comprende someter una biblioteca diversa de TCR presentados sobre partículas de fago según la reivindicación 10 o la reivindicación 11 a un proceso de selección que selecciona según dicha característica, y aislar partículas de fago que presentan un TCR que posee dicha característica, y, opcionalmente, a un procedimiento de amplificación para multiplicar las partículas aisladas y/o un proceso de detección selectiva que mide dicha característica, identificando las partículas de fago que presentan un TCR con la característica deseada y aislar estas partículas de fago y, opcionalmente, a un procedimiento de amplificación para multiplica las partículas aisladas.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que la característica específica es la mayor afinidad por un ligando del TCR.