KR100734643B1

KR100734643B1 - 알파-글리코실세라미드를 이용한 세포 면역원성 증강법

Info

Publication number: KR100734643B1
Application number: KR1020007002999A
Authority: KR
Inventors: 모토키가쥬히로
Original assignee: 기린 비루 가부시키가이샤
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2007-07-02
Also published as: ES2256955T3; CN100352918C; DE69833260D1; AU9096098A; KR20010030649A; AU749277B2; EP1018548B1; TW575420B; US6555372B1; CN1279713A; DE69833260T2; CA2304378A1; WO1999015627A1; EP1018548A1; EP1018548A4; ATE316134T1

Abstract

α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물, 그의 염 또는 용매화물을 함유하는, 종양세포 또는 병원체-감염 세포의 면역원성 증강용 조성물. α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물에 의해 증강된 면역원성을 갖는 종양세포는 종양요법(암 왁친 요법)에 유용하다.

Description

알파-글리코실세라미드를 이용한 세포 면역원성 증강법{A METHOD OF ENHANCING CELLULAR IMMUNOGENICITY USING α-GLYCOSYLCERAMIDE}

본 발명은 α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물에 의한 종양세포 및 병원체-감염 세포의 면역원성의 증강법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 면역원성이 증강된 종양세포를 사용한 종양요법에 관한 것이다.

화합요법제나 방사선조사에 의해 사멸시킨 자기 또는 비자기 종양세포를 암환자에 접종함으로써, 암을 갖는 숙주에 종양특이적인 면역을 유도하여 암치료에 역할하도록한 종양요법(Tumor Therapy)이 멜라노마(melanoma)(Mitchell, M. S. et al., J. Clin. Oncol., 8.409 (1990)), 신장염(Neidart., J. A. et al., Cancer, 46, 1128 (1980)), 난소암(Freedman, R. S. et al., Gynecol. Oncol., 29, 337 (1988)), 대장염(Hoover, H. C., Cancer, 55,1236 (1985))등의 암환자에 시험되어 왔었다. 그러나, 종양세포는, 세균과 같은 생체로서 이물(異物)과는 다르고, 원래 숙주의 세포에 의해 형질전환하여 발생한 세포이기 때문에 면역원성이 낮다. 따라서, 기대한 만큼의 효과가 얻어지지 않고, 멜라노마나 신장염 등의 비교적 면역원성이 높은 암종류에만 다소의 효과를 인정하기에 지나지 않는 것이 밝혀졌다(Mullen, C. A. et al., in Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, eds. Pinedo, H. M. et al., (Elsevier Science B.V.), pp285-294 (1996)).

근년에 이르러, 분자생물학, 유전자공학의 발전에 따라서, 유전자도입이 가능하게 되고, 유전자도입법에 의해 암관련 항원 유전자를 도입한 종양세포를 사용한 종양요법이 시도되어 왔었다. 즉, 자기 또는 그것이 곤란한 경우는 비자기의 종양세포에 종양관련 항원 유전자를 도입하여, 원래의 종양세포에 의해 면역원성을 높인 종양세포를 종양요법에 응용한 시도가 행해져 왔었다. 그러나, 이와 같은 시도는, 종양관련 항원으로서 동정되어 있는 항원이 극히 적기 때문에, 극한된 암종류밖에 실시되지 않는 실정이다(Conry, R. M., et al., Cancer Res., 54, 1164 (1994)). 또한, 암을 갖는 숙주의 면역은, 종양세포가 생산하는 인자 등에 의해 현저히 피폐(疲弊)하고 있는 것이 많기 때문에, 종양세포의 항원성을 높인 것 만으로는, 치료효과가 기대한 만큼 얻어지지 않고, 오히려 암을 갖는 숙주측의 면역을 수복하는 것이 중요한 것이 명확하게 되어 왔었다. 그 때문에, 현상에 있어서는, 사이토카인 유전자나 주요조직 적합 항원 유전자, costimulatory molecule 등을 도입한 세포를 접종함으로써, 암을 갖는 숙주의 피폐한 면역을 개선하여 치료효과를 높이도록한 검토가 주로 시도되고 있다. 예를 들면, IL-2(Connor, J. et al., J. Exp. Med., 177, 1127 (1993)), IL-4(Golumbek, P. T. et al., Science, 254, 713 (1991)), IL-6(Porgador, A. et al., Cancer Res., 52, 3679 (1992)), IFN-g(Belldegrun, A. et al., J. Natl. Cancer Inst., 85, 207 (1993)), GM-CSF(Dranoff, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3539 (1993)), IL-12(Tahara, H. et al., Gene Therapy, 2, 96 (1995))등의 사이토카인 유전자를 도입한 종양세포, 또는 MHC class Ⅱ 및 B7-1 유전자를 도입한 종양세포(Travis, J. et al., Science, 259, 310 (1993); Basker, S. et al., J. Exp. Med, 181, 619 (1995))를 사용하는 방법이 보고되어 있다.

이와 같이, 유전자 도입에 의해 수식한 종양세포를 사용한 종양요접은, 현재 세계중에서 그의 임상응용이 시도되고 있다(Roth, J. A., et al., J. Natl. Cancer lnst. 89,21 (1997)). 그러나, 이 방법은 유전자 조작이 번잡하고 (Pardoll, D. M., 1mmunol. Today, 14, 310 (1993)), 또한, 치료효과를 만족하는 충분한 유전자도입효율을 가져오는 벡타도 얻어지지 않아서, 상기 종양요법에 의해 일층 개선이 요구되고 있다(Mullen, C. A. et al., in Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, eds. Pinedo, H. M. et al.(Elsevier Science B.V.), pp 285-294 (1996)).

여기서, 생체내에는 여러 가지의 당이 세라미드와 β결합해 있는 β-글리코실세라미드가 존재하고 있다(Svennerholm, L. et al., Biochem. Biophys. Acta, 280, 626 (1972); Karlsson, K. et al., Biochem. Biophys. Acta, 316, 317 (1973)).

한편, α-글리코실세라미드가 현저한 면역부활작용 및 항종양작용을 갖는 것(Morita, M. et al, J. Med. Chem. 38, 2176 (1995)) 및 α-글리코실세라미드의 이들의 작용은, β-글리코실세라미드의 작용보다도 훨씬 강력한 것(Motoki, K. et al., Biol. Pharm. Bull., 18, 1487 (1995))으로 알려져 있다.

또한, α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물은, 항원제시 세포활성화작용을 갖고, α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물에 의해 활성화한 항원제시 세포를 사용한 항원제시 세포요법이 암치료에 극히 유용한 것도 알려져 있다(Yamaguchi, Y. et al., Oncol. Res., 8, 399 (1997)). 또한, α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물은, 생체내에 투여한 경우에, 방사선 방호작용(Motoki, K. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 2413 (1995)), 및 혈소판수나 백혈구수를 증가시키는 것도 알려져 있다(Motoki, K. et al., Biol. Pharm. Bull., 19, 952 (1996)).

그러나, α-글리코실세라미드에 의해 처리된 종양세포가 종양요법에 유용한 것은 물론이고, α-글리코실세라미드가 종양세포의 면역원성을 증감하는 것에 대해서도 본 발명자가 아는 한 보고되어 있지 않다.

본 발명자는, 금반 α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물을 함유하는 배지로 생체외(in vitro) 배양한 종양세포가 높은 면역원성을 갖는 것, 이 세포 또는 이 세포에 방사선 조사한 것을 암을 갖는 동물에 투여하면 현저한 항종양효과가 얻어지는 것, 그리고 이 종양세포는 종양발생을 소실하고 있기 때문에 종양요법에 있어서, 안전성도 우수한 것을 발견했다. 본 발명은 이 발전에 기초한 것이다.

본 발명은, 종양요법에 유효한 종양세포를 간편하게 조제할 수 있는 종양세포의 면역원성을 증강하기 위한 조성물, 감염증 등의 치료에 유효한 병원체-감염 세포를 간편하게 조제할 수 있는 병원체-감염 세포의 면역원성을 증강하기 위한 조성물, 세포의 면역원성을 증강하는 방법, α-글리코실세라미드에 의해 면역원성이 증강된 세포, 상기 세포를 포함하는 그의 세포에 기인하는 질환, 특히 종양의 치료용 의약 조성물, 상기 의약 조성물을 제조하기 위한 상기 세포의 사용, 및 상기 세포에 기인하는 질환, 특히 종양의 치료방법을 제공하는 것을 그의 목적으로 한다.

그리고, 본 발명에 의한 세포 면역원성 증강용 조성물은, 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물을 함유하는 것으로 되는 것이다.

상기 식 중에서,
R¹은 H 또는 OH이고, X는 7∼27 중 어느 정수이고,

R²는 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고(여기서, Y는 5∼17 중 어느 정수임:

(a) -CH₂(CH₂)_YCH₃

(b) -CH(OH)(CH₂)_YCH₃

(c) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)₂

(d) -CH=CH(CH₂)_YCH₃

(e) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)CH₂CH₃, 및
R³는 R⁹은 하기 i) 또는 ii) 중 어느 것으로 정의되는 치환기이고:

삭제

i) R³, R⁶ 및 R⁸이 H일 경우,

R⁴는 H, OH, NH₂, NHCOCH₃, 또는 하기 (A)∼(D)기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고,

R⁵는 OH, 또는 하기 (E) 및 (F)기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고,

R⁷은 OH 또는 하기 (A)∼(D)기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고,

R⁹는 H, CH₃, CH₂OH 또는 하기 (A')∼(D)'기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고;

ii) R³, R⁶, 및 R⁷이 H일 경우,

R⁴는 H, OH, NH₂, NHCOCH₃, 또는 하기 (A)∼(D)기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고,

R⁵는 OH 또는 하기 (E) 및 (F)기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고,

R⁸은 OH, 또는 하기 (A)∼(D) 기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고,

R⁹는 H, CH₃, CH₂OH 또는 하기 (A')∼(D') 기 :

로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이다.

도 1은 종양세포의 면역원성에 대한 α-글리코실세라미드의 효과를 나타낸 그래프이다. 면역원성은 마우스 비장세포의 세포상해활성을 지표로 했다. ○:콘트롤, ●:EL-4/V, □:EL-4/KRN, △:EL-4/583.

도 2는, EL-4간전이 모델 마우스에 대한 α-글리코실세라미드 처리 종양세포의 효과를 나타낸 그래프이다. ○:콘트롤, ●:EL-4/V, □:EL-4/KRN, △:EL-4/583.

도 3은 B16 멜라노마 폐전이 모델 마우스에 대한 α-글리코실세라미드 처리종양세포의 효과를 나타낸 그래프이다. ○:콘트롤, ●:B16/V, □:B16/KRN.

도 4는 종양세포의 종양발생에 대한 α-글리코실세라미드의 효과를 나타낸 그래프이다. ○:무처치 종양세포, ●:비히클로 처치한 종양세포, ■:KRN7000으로 처치한 종양세포.

도 5는 B16 폐전이 모델에 대한 α-글리코실세라미드처리 방사선 조사 및 무조사 종양세포의 효과를 나타낸 그래프이다. ○:콘트롤, △:방사선 무조사 B16/V, □:방사선 조사 B16/V, ▲:방사선 무조사 B16/K, ■:방사선 조사 B16/K.

도 6은, 본 발명에서 사용하는 α-글리코실세라미드 화합물의 대표예 (KRN7000)의 합성반응경로를 나타낸 개략도이다. 반응경로 중, pyr는 피리딘, BrPPh₃(CH₂)₁₂CH₃는 트리데칸트리페닐포스포늄브로마이드, n-BuLi는 n-부틸리튬, MsCl은 염화메탄술포닐, BnBr는 브롬화 벤질, 1-PrOH는 프로필알콜을 나타낸다.

도 7은, 도 6에 계속한 합성반응경로를 나타낸 개략도이다. 반응경로 중, WSC-HCl은 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드. 염산염, MS4A는 분자체 4A, Hex4NBr는 테트라헥실암모늄브로마이드이다.

도 8은 실시예 1~3의 화합물의 화학식을 나타낸 것이다.

도 9는 실시예 1~3의 화합물의 화학식을 나타낸 것이다. 도 8의 계속이다.

화학식 1의 화합물

상기 화학식 1의 화합물 중, 세라미드 부분의 X는 바람직하기로는 11~25의 정수이다.

R²에 있어서, Y는 바람직하기로는 9~17의 정수, 더욱 바람직하기로는 11~15이다.

화학식 1의 세라미드 부분에 있어서 X 및 R²의 바람직한 조합은, X가 21~25의 정수이고, R²가 치환기(b)식 중, Y는 11~15임)를 나타내는 화합물이다.

화학식 1의 당부분에 있어서 R³~R⁹의 바람직한 조합은, R³ 및 R⁶가 H를 나타내고, R⁴가 OH 또는 (A)~(D)기 중 어느 치환기를 나타내고, R⁵가 OH 또는 기 (E) 또는 (F)의 치환기를 나타내고, R⁷ 및 R⁸이 각각 H 또는 OH 중 어느 것을 나타내고(단, R⁷ 및 R⁸의 양쪽이 동일한 기를 나타내는 것은 아님), R⁹이 CH₂OH, CH₃, H 또는 (A')~(D') 중 어느 치환기를 나타내는 화합물이다.

또한, 바람직한 조합으로서는, R³ 및 R⁶가 H이고, R⁴ 및 R⁵가 OH이고, R⁷ 및 R⁸이 각각 H 또는 OH 중 어느 것을 나타내고(단, R⁷ 및 R⁸의 양쪽이 동일한 기를 나타내는 것은 아님), 또한 R⁹이 CH₂OH 또는 기 (A')~(D') 중 어느 치환기를 나타내는 화합물, 및 R³,R⁶ 및 R⁸이 H이고, R⁴,R⁵ 및 R⁷이 OH이고, 또한 R⁹이 CH₂OH인 화합물을 들 수 있다.

화학식 1의 화합물의 바람직한 예로서는,

X가 21~25의 정수이고,

R²가 치환기(b) 식 중, Y는 11~15의 정수)이고,

R³ 및 R⁶가 H이고,

R⁴가 OH 또는 기 (A)~(D)로부터 되는 군에서 선택되는 기이고,

R⁵가 0H 또는 기 (E) 및 (F)로부터 되는 군에서 선택되는 기이고,

R⁷ 및 R⁸이 각각 H 또는 OH이고(단, 양쪽이 동일한 기를 나타내지 않음),

R⁹이 CH₂OH 또는 기 (A')~(D')기로부터 되는 군에서 선택되는 화합물,

X가 21~25의 정수이고,

R²가 치환기 (b)식 중, Y는 11~15의 정수임)이고,

R³ 및 R⁶가 H이고,

R⁴ 및 R⁵가 0H이고,

R⁹가 CH₂0H 또는 기 (A')~(D')로부터 되는 군에서 선택되는 기인 화합물, 및

X가 21~25의 정수이고,

R²가 치환기(b) 식 중, Y는 11~15의 정수임)이고,

R³,R⁶ 및 R⁸이 H이고,

R⁴,R⁵ 및 R⁷가 OH이고,

R⁹가 CH₂OH인 화합물을 들 수 있다.

세포의 면역원성을 증강하는 화합물로서 바람직한 화합물은, (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실옥시)-2-헥사코사노일아미노-3,4-옥타데칸디올(KRN 7000)이다.

화학식 1의 화합물은 약학상 허용되는 비독성염일 수 있다. 화학식 1의 화합물의 염으로서는, 산부가염, 예를 들면 무기산(예를 들면, 염산, 황산, 질산, 인산)과의 염, 또는 유기산(예를 들면, 아세트산, 프로피온산, 말레산, 올레산, 팔미트산, 구연산, 호박산, 주석산, 푸마르산, 글루타민산, 판토텐산, 라우릴술폰산, 메탄술폰산 및 프탈산)과의 염을 들 수 있다.

화학식 1의 화합물은 용매화물(예를 들면, 수화물)일 수 있다. 화학식 1의 화합물은 α-글리코실세라미드를 합성하기 위한 합목적적인 임의의 방법에 의해 제 조할 수 있다.

우선, D-릭소스를 출발물질로 해서 세라미드 부분을 합성하고, 이어서, 이 세라미드에 당을 도입함으로써 화학식 1의 화합물을 조제할 수 있다. 이와 같은 α-글리코실세라미드의 일반적인 합성방법에 대해서는, 예를 들면 WO93/5055호, W094/2168호, W094/9020호, WO94/24142호를 참조할 수 있다.

또한, 화학식 1의 화합물은 자연계(생물 등)에서 칼럼 크로마토그라피 등에 의해서 단리, 정제할 수도 있다.

세포 면역원성 증강용 조성물

화학식 1의 화합물은 세포 면역원성의 증강에 유용한 것으로 나타났다(약리시험예 1~5). 여기서, 「면역원성」이라 함은 세포가 생체에 면역응답을 일으키는 활성 및 그 결과 유도되는 면역 시스템에 의해 인식되는 활성을 말한다.

본 발명에 의한 면역원성 증강용 조성물은, 면역원성을 증강하는 것이 의도되는 세포와 생체외(in vitro)에서 접촉시킴으로써 사용된다. 예를 들면, 세포의 배양배지에 본 발명에 의한 면역원성 증강용 조성물을, 화학식 1의 화합물의 최종농도가 0.1~10,000ng/㎖(바람직하기로는 1~1,000ng/㎖)가 되도록 참가하고, 이 세포를 30분~4일동안(바람직하기로는 3시간~2일간)배양함으로써, 세포의 면역원성을 증강할 수 있다. 세포의 배양조건 및 사용되는 배지는 관용기술에 따라서 선택할 수 있다.

본 발명에 의한 세포 면역원성 증강용 조성물은, 용액, 현탁제, 유탁액의 형태로 면역원성을 증강하는 것이 의도되는 세포의 배양액에 첨가할 수 있다.

이들의 각종 용액은, 약학상 허용되는 담체, 또는 희석제 등의 첨가제, 구체적으로는 용제(예를 들면, 물, 생리식염수), 가용화제(예를 들면, 에탄올, 폴리솔베이트제), 등장화제, 보존제, 항산화제, 부형제(예를 들면, 유당, 전분, 결정성 셀룰로스, 만니톨, 말토스, 인산수소칼슘, 연질 무수규산, 탄산칼슘), 결합제(예를 들면, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로스, 에틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 아라비아고무), 안정제(예를 들면, 유당, 만니톨, 말토스, 폴리솔베이트류, 마크로골류, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유), 붕해제(예를 들면, 전분, 카르복시메틸셀룰로스칼슘), 윤활제(예를 들면, 스테아르산마그네슘, 탈크, 경화유)등을 함유할 수 있다.

또한, 필요에 따라서, 글리세린, 디메틸아세트아미드, 70%유산나트륨, 계면활성제, 염기성 물질(예를 들면, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 탄산나트륨, 알기닌, 메글루민, 트리스아미노메탄)을 첨가할 수도 있다.

화학식 1의 화합물과 접촉시킨 종양세포를 마우스에 투여하면, 그의 종양세포에 대한 면역(세포상해활성)이 유도된다. 또한, 이외에도, 그의 종양세포 이외의 종양세포에 대해서도 면역(세포상해활성)이 유도된다(약리시험예 1 참조).

면역원성을 증강하는 것이 의도되는 세포로서는, 종양세포나 병원체-감염 세포를 들 수 있다. 이들은 종양을 갖는 환자나 병원체에 감염한 환자로부터 단리된 것이어도, 생체외(in vitro)에서 인위적으로 제작된 것이어도 좋다.

면역원성을 증강하는 것이 의도되는 종양세포로서는, 기본적으로는 멜라노마, 신장암, 자궁암, 췌장암, 뇌종양, 신경글리아아세포종, 대장암, 폐암, 간장암, 임파종, 백혈병, 섬유육종 등을 포함한 모든 암종양을 들 수 있고, 특히 멜로마 및 신장암이 바람직하다.

또한, 병원체-감염 세포로서는, 바이러스감염세포를 들 수 있다.

또한, 여기서 말하는 「병원체」라 함은 클라미디아(Chlamydiae), 리켓치아(Rickettsiae), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 리슈마니아(Leishmaniae), 토리바노소마(Trypanosomas) 및 프리온 단백질(prion proteins)과 같은 병원인자를 포함한다.

본 발명에 의하면, 세포를 화학식 1의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물과 접촉시키는 것을 포함하는 세포 면역원성 증강법이 제공된다. 세포와 화학식 1의 화합물과의 접촉은 상기한 것과 동일하게 해서 실시할 수 있다.

면역원성 증강 세포

본 발명에 의한 면역원성 증강 세포는, 화학식 1의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물과 생체외에서 면역원성을 증강하는 것이 의도되는 세포와 접촉시킴으로서 얻을 수 있다. 면역원성 증강 세포의 조제는 상기 조건에 따라서 실시할 수 있다.

면역원성이 증강된 세포를 항원으로서 포유류에 투여하면, 그의 세포에 대한 면역이 강력히 유도되어, 이 세포에 기인하는 질환을 치료할 수 있다.

따라서, 본 발명에 의하면, 화학식 1의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물과 생체외에서 접촉시킴으로서 얻을 수 있는 세포를 포함해서, 그의 세포에 기인하는 질환의 치료제가 제공된다. 본 명세서에 있어서, 「치료」라 함은 「예방」을 포함하는 의미로 사용되는 것이다.

또한, 본 발명에 의하면, 화학식 1의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물과 생체외에서 접촉시킴으로서 얻을 수 있는 세포를 투여하는 것을 포함해서, 그의 세포에 기인하는 질환의 치료법이 제공된다.

유효성분으로서 면역원성이 증강된 어떤 종류의 종양세포를 사용한 경우, 그의 종양을 치료할 수 있고, 유효성분으로서 면역원성이 증강된 병원체 세포를 사용한 경우, 그의 감염증을 치료할 수 있다.

화학식 1의 화합물에 의해 그의 면역원성이 증강된 종양세포를 생체에 투여하면, 종양세포에 대한 강함 면역이 유도되고, 그 결과로서, 생체내의 면역계에 의해 종양이 공격을 받아, 종양을 퇴축 또는 소멸시킬 수 있다. 본 발명에 의한 종양세포는, 멜라노마와 같은 면역원성이 높아지게 되는 종양만이 아니고, T임파종에 대해서도 강한 면역을 유도했다(약리시험예 2 및 3참조).

따라서, 본 발명에 의하면, 화학식 1의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물과 생체외에서 접촉시킴으로서 얻을 수 있는 종양세포(면역원성 증강 종양세포)를 포함하는 종양치료용 의약 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 면역원성 증강 종양세포를 투여하는 것을 포함하는 종양의 치료법이 제공된다.

본 명세서에 있어서, 「종양」은 멜라노마, 신장암, 자궁암, 췌장암, 뇌종양, 신경글리아아세포종, 대장암, 폐암, 간장암, 임파종, 백혈병, 선유육종 등의 암을 포함한다.

또한, 본 명세서에 있어서, 「종양치료용 의약 조성물」은 간왁친이나 간세포 왁친과 같은 간치료제를 포함한다.

본 발명에 있어서, 면역원성 증강 세포는, 합목적적인 임의의 투여경로에 의해서, 구체적으로는 복강내 투여, 피하 투여, 정맥 또는 동맥으로의 혈관내 투여, 주사에 의한 국소 투여 등의 방법에 의해서 투여가능하다. 또한, 인간의 경우에는, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 주사에 의한 국소 투여, 복강 또는 흉강으로의 투여, 피하 투여, 근육내 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 정맥내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서, 면역원성 증강 세포는, 통상의 방법에 기초해서, 주사제, 현탁제, 유화제 등의 형태로 투여할 수 있고, 필요에 따라서, 세포의 면역원성을 더욱 증강할 목적으로 프로인드 완전 보조약 등의 보조약에 현탁하든가, 또는 BCG와 같은 보조약 활성을 갖는 물질과 함께 투여하는 것도 가능하다. 본 발명에 의한 종양 치료용 의약 조성물은, 상기와 같은 약학상 허용되는 담체나 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명에 의한 의약 조성물에 있어서 각 유효성분은, 개개의 상황에 따라서 연속적 또는 간헐적으로 투여할 수 있다. 구체적인 투여량은 투여방법, 환자의 제조건, 예를 들면, 연령, 체중, 성별, 감수성, 투여시간, 병용 약제 등에 의해 변화한다. 예를 들면, 면역원성 증강 종양세포의 활성 발현에 필요한 투여량은, 예를 들면, 정맥내 투여에서는 인간 성인에 대해서 1일당 1×10⁵~ 1×10⁹세포수/체중(㎏)정도이지만, 1×10⁶~ 5×10⁸세포수/체중(㎏)이 바람직하다. 면역원성 증강세포는, 주사제로 하는 것이 바람직하고, 미리 소정 농도로 조절된 것을 그대로 투여하던가, 또는 투여 직전에 주사용 생리식염수 등으로 소정농도로 희석해서 투여할 수 있다.

본 발명에 의한 면역원성 증강 세포는 환자에 투여에 앞서 방사선 또는 세포독성을 갖는 약제로 처치함으로써 사멸시켜도(증식능을 잃게해도) 좋다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

화합물의 합성 및 단리·정제

실시예 1. (2S,3S,4R)-1-(α-D-갈락토피라노실옥시)-2-헥사코사노일아미노-3,4-옥타데칸디올(KRN 7000)의 합성

표제 화합물의 합성공정은 도6 및 도7에 나타낸 바와 같다.

(1) 화합물 G1의 합성

D-릭소스(200g, 1.33mol)에 염화칼슘으로 건조한 아세톤용액(3.0ℓ)에 황산(0.5㎖)을 첨가하고, 18시간 동안 실온에서 교반했다. 분자체 4A의 분말(100g)을 첨가하고, 반응액을 중화시킨 후, 셀라이트 여과하고, 잔류물을 아세톤으로 세정했다. 여액과 세액을 합쳐서 감압농축하여 G1의 조생성물을 얻었다. 수득량 240g(95%). 이 이상의 정제를 행하지 않고, 다음과 같은 공정에 사용했다. 분석용의 샘플은 헥산:아세톤(9:1)을 용출용매로 해서 실리카겔 크로마토그라피에 의해 정제했다.

(2) 화합물 G2의 합성

화합물 G1(239g, 약 1.26m㏖)의 염화메틸렌용액(168㎖)에, 피리딘(10㎖), 염화트리틸(39.09)을 첨가하고, 32℃에서 4시간 동안 교반했다. 에탄올(8㎖)을 적하하고, 실온에서 2시간 동안 교반했다. 포화 암모늄수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 식염수로 세정후, 감압농축했다. 잔류물은 아세트산 에틸에 용해하고, 0℃로 냉각해서 결정화했다. 수득량 501g(D-릭소스로부터 87%).

(3) 화합물 G3의 합성

트리데칸트리페닐포스포늄브로마이드(962g, 1.16㏖;1-브로모트리데칸, 트리페닐포스핀을 4.5시간, 140℃로 가열해서 조제했다)의 THF용액(1500㎖)에, 아르곤 분위기하에, n-부틸리늄의 2.5M 헥산용액(462㎖;366mmol)을 0℃에서 적하했다. 적하 종료 후, 15분간 교반하고, 화합물 G2(250g, 579mmol)의 THF용액(450㎖)을 적하했다. 실온까지, 서서히 온도를 올리면서 18시간 동안 교반했다.

반응액을 감압농축하고, 잔류물에 헥산:메탄올:물(10:7:3, 1000㎖)의 혼액을 첨가하고, 포화 염화암모늄 수용액으로 세정했다. 수층(水層)은 헥산(500㎖)으로 추출하고, 모든 유기층을 합해서 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하여, G3의 조생성물을 얻었다. 이 이상의 정제를 행하지 않고, 다음 공정에 사용했다. 수득량 339g(98%). 분석용의 샘플은, 헥산:아세트산에틸(9:1)을 용출용매로 해서 실리카겔 크로마토그라피에 의해 정제했다.

(4) 화합물 G4의 합성

화합물 G3(338g, 약565m㏖)의 염화메틸렌용액(1500㎖)에 피리딘(500㎖)을 첨가하고, 염화메탄술포닐(49㎖, 633m㏖)을 적하하고, 31℃에서 24시간 교반했다. 에탄올(40㎖)을 적하하고, 실온에서 1시간 동안 교반했다. 감압농축 후, 잔류물에 헥산:메탄올:물(10:7:3, 1000㎖)의 혼액을 첨가하고, 분액했다. 수층은 헥산(200㎖)으로 3회 추출하고, 모든 유기층을 합해서 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하여, G4의 조생성물을 얻었다.

이 이상의 정제를 행하지 않고, 다음 공정에 사용했다. 수득량 363g(95%). 분석용의 샘플은 헥산:아세트산에틸(9:1)을 용출용매로 해서 실리카겔 크로마토그라피에 의해 정제했다.

(5) 화합물 G5의 합성

화합물 G4(362g, 약 536m㏖)의 염화메틸렌 용액(1500㎖)에 메탄올(350㎖)을 첨가하고, 여기에 농염산(200㎖)을 적하하고, 5시간 동안 실온에서 교반했다. 반응액에 탄산수소나트륨을 첨가해서 중화 후, 여과했다. 여액을 감압농축하고, 잔류물에 아세트산에틸을 첨가하고, 식염수로 세정했다. 수층은 아세트산 에틸로 추출하고, 모든 유기층을 합해서 무수황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축했다. 헥산으로 결정화했다. 수득량 161g(G2로부터 70%).

(6) 화합물 G6의 합성

화합물 G5(160g, 405mmol)의 THF용액(780㎖)에 5% 팔라듐-황산바륨(16 g)을 첨가하고, 반응용기를 수소가스로 치환 후, 실온에서 20시간 동안 교반했다. 반응액을 셀라이트 여과 후, 클로로포름:메탄올의 혼액(1:1)으로 세정했다. 여액과 세액을 합하고, 감압농축했다. 잔류물은 아세트산에틸로 결정화했다. 수득량 146g(91%).

(7) 화합물 G7의 합성

화합물 G6(145g, 365m㏖)의 DMF용액(1000㎖)에 아지화나트륨(47g, 730m㏖)을 첨가하고, 95℃에서 4시간 동안 교반했다. 반응액을 농축하고, 잔류물에 아세트산에틸(450㎖)을 첨가하고, 수세했다. 수층은 아세트산에틸로 다시 추출했다. 모든 유기층을 합해서 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조한 후, 감압농축하여 G7의 조생성물을 얻었다. 수득량 122g(97%). 이 이상의 정제를 행하지 않고 다음 공정에 사용했다. 수득량 126g(95%). 분석용의 샘플은 헥산:아세트산에틸(9:1)을 용출용매로해서 실리카겔 크로마토그라피에 의해 정제했다.

(8) 화합물 G8의 합성

화합물 G7(121g, 약352m㏖)의 염화메틸렌 용액(750㎖)에 피리딘(250㎖), 염화트리틸(124g, 445m㏖)을 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반했다. 에탄올(30㎖)을 적하하고, 실온에서 30분간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 염화암모늄 수용액, 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 감압농축했다. 잔류물은 헥산:아세트산에틸(10:1)을 용출용매로 해서 실리카겔 크로마토그라피에 의해 정제했다. 수득량 34.4g (G6로부터 52%).

(9) 화합물 G9의 합성

화합물 G8(33.5g, 57.3m㏖)의 DMF용액(300㎖)에 60% 수소화나트륨(5.5g, NaH로서 약 138mmol)을 첨가하고, 실온에서 40분간 교반했다. 반응액을 0℃로 냉각하고, 브롬화벤질(15㎖, 120mmol)을 적하했다. 실온까지 서서히 온도를 올리면서 18시간 동안 교반했다. 반응액에 빙수(100㎖)를 첨가하여 반응을 정지한 후, 아세트산에틸을 사용해서 추출했다. 추출액은 식염수로 3회 세정하고, 모든 유기층을 합해서 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하여 G9의 조생성물을 얻었다. 이 이상의 정제를 행하지 않고 다음의 공정에 사용했다. 수득량 42.2g(96%). 분석용의 샘플은 헥산:아세트산에틸(100:1)을 용출용매로 해서 실리카겔 크로마토그라피에 의해 정제했다.

(10) 화합물 G10 및 G11의 합성

화합물 G9(41.2g, 약 54m㏖)의 1-프로판올 용액(250㎖)에 메탄올(30㎖)을 첨가하고, 또한 5% 팔라듐탄소(4.1g), 개미산 암모늄(27.1g, 4.3㏖)을 첨가했다. 실온에서 16시간 동안 교반 후, 아세트산에틸로 희석하고, 셀라이트 여과했다. 여액을 감압농축하고, 아세트산 에틸로 용해 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 식염수로 3회 세정하고, 모든 유기층을 합해서 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축해서 G10의 조생성물을 얻었다. 수득량 38.9g(98%). 얻어진 G10은 이 이상의 정제를 하지 않고, 다음의 공정에 사용했다.

화합물 G10의 염화메틸렌 용액(300㎖)에 헥사코사산(22.4g, 56.5m㏖), WSC염산염(12.6g, 64.6m㏖)을 첨가하고, 2시간 동안 가열환류했다. 실온까지 냉각 후, 감압농축했다. 잔류물에 아세트산에틸(500㎖)을 첨가하고, 0.5M염산수용액, 식염수, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 또한 식염수로 세정했다. 모든 유기층을 합해서 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축해서 G11의 조생성물을 얻었다. 수득량 53.2g(88%). 얻어진 G11은 이 이상의 정제를 행하지 않고 다음의 공정에 사용했다. 분석용의 샘플은 헥산:아세트산에틸(100:1)을 용출용매로 해서 실리카겔 크로마토그라피에 의해 정제했다.

(11) 화합물 G12의 합성

화합물 G11(52.5g, 약 47m㏖)의 염화메틸렌 용액(180㎖)에 메탄올(36㎖)을 첨가하고, 이어서 10% 염산메탄올용액(3.0㎖)을 적하하고, 실온에서 2시간 동안 교반했다. 반응액은 분말상의 탄산수소나트륨(18g)으로 중화하고, 셀라이트 여과했다. 잔류물은 염화메틸렌으로 세정했다. 여액과 세액을 합하고, 식염수로 세정하고, 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조후, 감압농축했다. 잔류물을 아세톤 중에서 가열용해하고, 0℃로 냉각해서 침전화에 의해 정제했다. 수득량 38.6g (G9로부터 77%)

(12) 화합물 G13의 합성

1) 2,3,4,6-테트라-O-벤질-D-갈락토피라노실아세테이트(79.8g)를 톨루엔(160㎖) 및 이소프로필에테르(520㎖)의 혼액에 용해하고, -10~0℃로 냉각했다. 여기에, 2.0 등량의 HBr를 함유하는 이소프로필에테르용액을 첨가했다(2.8m㏖/㎖, 약100㎖). -10~0℃에서 약 90분간 교반 후, 반응액에 5% 탄산수소나트륨 수용액을 주입하고, 교반해서 과잉의 HBr를 중화했다. 전량을 분리 깔때기에 옮겨서 분획 후, 수성층을 폐기하고, 10% 염화나트륨 수용액으로 2회 세정했다. 감압농축해서 2,3,4,6-테트라-O-벤질-α-D-갈락토피라노실 브로마이드 (GaLBr)의 시럽을 얻었다.

2)화합물 G12(60.0g, 68.6m㏖), 테트라헥실암모늄브로마이드(89.4g, 206m㏖), 분자체 4A(60g)의 톨루엔 용액(420㎖)에, DMF(140㎖), 이어서 GalBr(약 137m㏖)의 톨루엔용액(250㎖)을 첨가하고, 실온에서 72시간 동안 교반했다. 반응액에 메탄올(12㎖)을 첨가하고, 2시간 동안 교반했다. 셀라이트 여과 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 식염수로 세정 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하고, 감압농축했다. 잔류물에 아세토니트릴을 첨가하고, 2시간 동안 교반해서 침전을 얻었다. 얻어진 침전을 감압건조하여, 건조분말을 얻었다. 이것을 헥산:아세트산에틸(8:1)을 용출용매로 해서 실리카 겔 크로마토그라피에 의해 정제했다. 수득량 70.9g(74%).

(13) 화합물 KRN 7000의 합성

화합물 G13(60.0g, 42.9m㏖)을 에탄올(960㎖)에 첨가해서 현탁시키고, 여기에 20% 수산화 팔라듐(6.0g)의 에탄올 현탁액을 첨가했다. 또한, 수소원으로 되는 4-메틸시클로헥센(120㎖, 93.5m㏖)을 첨가하고, 4시간 동안 가열환류한 후, 여과하고, 촉매를 제거했다. 잔류물은 가온한 에탄올로 세정했다. 여액을 실온에서 방치함으로써 얻은 백색침전을 여과, 감압건조했다. 얻어진 분체를 에탄올:물(92:8, 3.5ℓ)에 현탁하고, 교반하면서 가열 용해 후, 실온에서 방치함으로써 재침전화했다. 침전액을 여과하고, 여과해서 얻은 케이크를 감압 건조해서 백색분말을 얻었다. 수득량 35.0g(95%).

실시예 2. O-α-D-갈락토피라노실-(1→2)-O-α-D-갈락토피라노실-(1→1)-(2S,3S,4R)-2-아미노-N-[(R)-2-히드록시테트라코사노일]-1,3,4-옥타데칸트로올(S1140B-9)의 단리 및 정제

오끼나와껭 구미지마(久米島)의 해저수심 15~25m에서 채취한 해면을, 동결건조한 분말 447.1g을 클로로포름과 메탄올의 혼액으로 추출하고, 추출액을 감압하 농축해서 51.28g의 추출물을 얻었다. 이것을 아세트산에틸과 물로 분배 후, 상층과 중간층을 무수 황산나트륨으로 건조 후, 감압농축해서 각각 18.37g과 9.44g의 분획물을 얻었다. 상층에서 얻은 분획물을 10% 수성 메탄올과 n-헥산으로 분배한 알콜층과 중간층에서 얻은 분회물을 합해서 농축시킨 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 되풀이해서 정상 TLC상에서 단일의 활성성분 169.9㎎을 얻었다. 또한, ODS-AM칼럼(YMC제, 직경 250mm×20mm, 메탄올, 9.0㎖/분)을 사용한 역상 HPLC로 정제하여 (보존시간:30.3분), 순수한 표제 화합물(S1140B-9) 10.2㎎을 얻었다. 또한, 표제화합물은 F. Cafieri et al., Liebigs Ann. Chem. 1995, 1477-1481을 참조하여, 단리, 정제할 수도 있다.

실시예 3. 하기 왼쪽에 기재된 화합물은 그의 오른쪽 문헌에 기재된 방법에 따라서 합성했다.

화학식 1의 화합물과 상기 실시예에 기재된 화합물(AGL 583을 제외)과의 대응은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

표 1

생화학적 시험

약리시험 1 : 종양세포의 면역원성에 대한 α-글리코실세라미드의 효과

일본 SLC 주식회사에서 구입한 C57BL/6 마우스를 사용해서 실험을 행했다. α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물의 대표로서, 실시예1에서 합성한 KRN 7000을 이하의 실험에 사용했다. 또, 음성대조로서, 실시예 3에서 합성한 β-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물인 AGL-583을 사용했다.

우선, 비히클, KRN 7000 및 AGL-583의 종양세포의 면역원성에 대한 효과에 대해서 검토를 행했다. 종양세포에는 마우스 T임파종 EL-4세포(大日本製藥株式會社)를 사용하고, 10% FCS(소태아혈청), 글루타민 및 항생물질을 함유하는 RPMI 1640배지에 부유시켜서 생체외에서 배양을 행했다. 각 약제로 처리를 개시할 때에, EL-4 세포를 회수하여, 신선한 배지에 다시 현탁시킨 직후에 생체외에서 비히클(0.1% DMSO), KRN 7000 (100ng/㎖), 또는 AGL-583(100ng/㎖)을 첨가해서 1일간 배양했다. 1일 후에, 비히클, KRN 7000 또는 AGL-583 공존하에서 배양한 EL-4/V, EL-4/KRN 또는 EL-4/583의 3종류의 종양세포를 회수하여, 배지에서 2회 세정한 후에 신선한 배지에 다시 현탁하고, C57BL/6 마우스(8주령, 암컷)에 5×10⁵ 세포수/마우스의 비율로 꼬리정맥에서 접종했다. 3일 후에, (1)어떠한 것도 접종하지 않았던 건강한 마우스(콘트롤)의 비장세포, (2)EL-4/V를 접종한 마우스의 비장세포, (3)EL-4/KRN을 접종한 마우스의 비장세포, 또는 (4)EL-4/583을 접종한 마우스의 비장세포를 각각 이펙터 세포로서 조제했다. 또, 타게트 세포에는, ⁵¹Cr로 표지한 YAC-1(大日本製藥株式會社) 및 EL-4 마우스 종양세포를 사용하고, 이펙터 세포 및 타게트 세포를 E/T(이펙터/타게트)비가 25:1, 50:1, 및 100:1이 되도록 플레이트에 뿌리고, 4시간 배양 후에, ⁵¹Cr의 유리량을 γ-카운터로 측정하여, 각각의 마우스의 비장세포의 세포장해활성을 이하의 식으로 산출했다.

삭제

여기서, 최대유리는 HCl을 첨가해서 배양했을 때의 ⁵¹Cr 유리량을, 자연유리는 어떤 것도 첨가하지 않고서 배양했을 때의 ⁵¹Cr 유리량을, 그리고 실험유리는 각 비장세포를 첨가했을 때의 ⁵¹Cr 유리량을 각각 나타낸다. 결과를 도1에 나타냈다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, EL-4/V 및 EL-4/583을 접종한 마우스의 비장세포의 YAC-1에 대한 세포장해활성은, 어떠한 것도 접종하지 않은 건강한 마우스의 활성과 거의 변하지 않았다. 이것에 대해서, EL-4/KRN을 접종한 마우스의 비장세포는 대단히 현저한 세포장해활성을 나타냈다.

한편, EL-4에 대해서는, 도 1B에 나타낸 바와 같이, EL-4/V 및 EL-4/583을 접종한 마우스의 비장세포에서도, 건강한 마우스의 비장세포 보다도 높은 세포장해활성이 인식되었지만, EL-4/KRN을 접종한 마우스의 비장세포에서는 더욱 더 높은 세포장해활성이 인식되었다.

이상의 결과로부터, α-글리코실세라미드를 첨가해서 종양세포를 배양함으로써, 종양세포의 면역원성이 증가하는 결과, 이것을 접종한 마우스에는 대단히 강력한 종양면역이 유도되는 것이 판명되었다. 또한, EL-4/V 및 EL-4/583을 접종한 마우스의 비장세포에서는, EL-4에 대한 면역, 즉 종양특이적인 항종양면역만이 약간 유도되어 있는 것이 지나지 아니했지만, EL-4/KRN을 접종한 마우스에 있어서는, EL-4만 아니라 NK 감수성 세포인 YAC-1에 대해서도 대단히 강력한 종양면역이 유도되었다. 따라서, 특이적인 면역만 아니라, 비특이적인 면역도 유도되는 것이 밝혀졌다.

약리시험 2 : α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포의 EL-4 간전이 모델 마우스에 대한 치료효과

약리시험 1의 결과로부터, α-글리코실세라미드가 종양세포의 면역원성을 증강하는데 유용한 것이 명백해졌기 때문에, 다음에 α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포를 접종함으로써, 원래 부터 존재한 종양에 대한 항종양효과가 인식되는가 아닌가, 즉 면역원성이 증강된 종양세포의 접종이 실제로 종양요법(Tumor therapy)에 유효한가 아닌가를 검토했다.

즉, BDF1 마우스(6주령, 암컷)(일본 SLC 주식회사)를 1군에 6마리로 하고, 마우스T임파종 EL-4 세포 4×10⁵ 세포스/마우스를 꼬리 정맥으로부터 이식함으로써 암을 갖는 마우스를 제작하고, 이식일을 0일째로 했다. 또, 한편으로, 동일에, 상기 약리시험 1에 나타낸 방법에 따라서, 신선한 배지에 접종한 EL-4 세포에, 비히클(0.1% DMSO), KRN 7000(100ng/㎖), 또는 AGL-583(100ng/㎖)를 첨가했다. 배양개시 1일 후에, 비히클, KRN 7000 또는 AGL-583 공존하에 배양한 EL-40/V, EL-4/KRN, 또는 EL-4/583을 회수하고, 배지로 2회 세정한 후, 각각 1×10⁵ 세포수/마우스의 비율로 암을 갖는 마우스의 꼬리정맥으로부터 접종하여, 각각의 항종양효과의 비교검토를 실시했다.

또한, EL-4를 이식한 마우스에는, 간장을 주로한 장기에 종양이 형성되고, 마우스는 30일 전후에 사망했다. 따라서, 암을 갖는 숙주의 생존기간을 관찰함으로써 항종양효과의 판정을 행했다. 결과를 도 2에 나타냈다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 비히클 또는 AGL-583으로 자극한 종양세포를 암을 갖는 마우스에 접종한 군에서는, 종양을 이식한 만큼의 콘트롤군과 비교해서, 그의 생존기간은 전혀 연장하지 않고, 명확한 항종양효과가 인정되지 아니했다. 이것에 대해, KRN 7000으로 자극한 종양세포를 접종한 군에서는, 그의 생존기간이 현저하게 연장하고, 33.3%의 마우스가 장기간에 걸쳐서 생존했다.

이상의 결과로부터, 비히클 또는 β-글리세릴세라미드 구조를 갖는 화합물인 AGL-583으로 처리한 종양세포를 종양요법에 응용하여도, 전혀 효과가 얻어지지 않는 것에 대해서, α-글리코실세라미드 구조를 갖는 화합물인 KRN 7000을 첨가해서 배양한 종양세포를 종양요법에 응용함으로서 현저한 종양효과가 얻어졌다. 따라서, α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포가 종양요법에 유효한 것이 밝혀졌다.

약리시험 3 : α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포의 B16 멜라노마 폐전이 모델마우스에 대한 치료효과

또한, 약리시험 2와는 별개의 종양세포인 B16 멜라노마(大日本製藥株式會社)를, α-글리코실세라미드로 처리하고, 이 종양세포가 종양요법에 유효한가 아닌가를 검토했다.

즉, BDF1 마우스(6주령, 암컷)을 1군에 6마리로하고, 마우스 B16 멜라노마 세포 4×10⁵ 세포수/마우스를 꼬리정맥으로부터 이식함으로써 암을 갖는 마우스를 제작하고 이식일을 제 0일째로 한다. 약리시험 2에 따라서, 같은 날에 생체외에서 비히클(0.1% DMSO) 또는 KRN 7000(100ng/㎖)을 첨가해서 B16의 배양을 개시했다. 제 1일 째에, 비히클 또는 KRN 7000 공존하에서 1일 배양한 B16/V 또는 B16/KRN을 회수하여 배지에서 2회 세정한 후, 상기 암을 갖는 마우스의 꼬리정맥으로부터 1×10⁵ 세포수/마우스의 비율로 접종하여, 각각의 항종양효과를 비교했다.

또한, B16을 이식한 마우스에서는 종양이 폐에 형성되어, 최종적으로 30일 내지 60일에 치사했다. 따라서, 그의 생존기간을 관찰함으로써, 항종양효과를 판정했다. 그 결과를 도 3에 나타냈다.

도 3에 나타낸 바와 같이, B16/V를 접종한 무리에서는 종양을 이식한 만큼의 콘트롤군과 비교해서, 전혀 항종양효과가 인지되지 않고, 오히려 생존기간이 콘트롤군보다는 단축하는 경향이 인지되었다. 이것에 대해서, B16/KRN을 접종한 무리에서는 현저한 항종양효과가 인지되고, 종양 이식 후 70일까지 반수(50%)의 마우스가 생존했다.

이상의 결과로부터, 약리시험 2와는 별개의 종양세포를 사용한 경우에도, α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포를 암을 갖는 마우스에 접종함으로써 현저한 항종양효과가 얻어지는 것이 밝혀졌다. 따라서, α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포가 종양요법에 유효한 것이 밝혀졌다.

약리시험 4. 종양세포의 종양발생에 대한 α-글리코실세라미드의 효과

약리시험 2 및 3의 결과로부터, α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포는, 암을 갖는 마우스에 대해서 항종양효과를 발휘하는 것이 밝혀졌다. 여기서, 통상의 종양요법에서는, 방사선 조사 등의 처치에 의해 증식능을 소실시킨 후에 접종하는 것이고 통상의 방법이고, 그렇지 않은 경우에서는, 접종한 암 왁친자체가 종양을 형성해버리는 것으로 생각되어진다. 실제로, 약리시험 3의 결과에서는, 비히클로 처리한 종양세포를 접종한 마우스의 생존기간이 극히 조금이지만, 단축하는 경향을 나타내고 있다. 이것에 대해서, α-글리코실세라미드로 처리한 항종양세포에서는 생존기간이 연장하는 만큼은 아니고, 완치예가 얻어질 정도의 효과가 인정되고 있다. 이것으로부터, α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포는, 방사선 조사 등의 처치에 의해 증식능을 소실시키지 않고도 사용가능한 암 왁친인 것으로 생각되지만, 그의 종양형성능(종양발생)에 대해서 확인할 필요가 있다. 그래서, 각종 마우스 종양의 종양발생에 대한 α-글리코실세라미드의 영향에 관한 검토를 실시했다.

즉, C57BL/6 마우스 유래의 종양인 마우스 멜라노마 B16 세포(大日本製藥株式會社), 마우스 T 임파종 EL-4 세포 및 마우스 폐암 lewis lung carcinoma 세포(大日本製藥株式會社)의 3종류의 종양세포와 BALB/c 마우스 유래의 종양인 마우스 대장암 Colon 26세포(일본 재단법인 암연구회), 마우스 백혈병 L1210(일본 재단법인 암연구회), 및 마우스 섬유육종 Meth A 세포(일본 재단법인 암연구회)의 합계 6종류의 마우스 종양세포를, 상기 약리시험에 따라서, 비히클(0.1% DMSO) 또는 KRN 7000(100 ng/㎖)을 첨가, 또는 무첨가로 1일 동안 배양했다. 각각의 종양세포를 배지로 2회 세정한 후, 다시 신선한 배지에 현탁하고, 동일계 마우스의 꼬리 정맥으로부터 이식했다. B16, EL-4, LLC에 대해서는, 각각 5×10⁵ 세포/마우스, 1×10⁵ 세포/마우스, 5×10⁵ 세포/마우스의 비율로 C57 BL/6(9주령, 암컷)에 이식하고, Colon 26, Meth A, L1210에 대해서는 각각 2×10⁶ 세포/마우스, 1×10⁵ 세포/마우스, 5×10⁵ 세포/마우스의 비율로 BALB/c마우스(9주령, 암컷)에 이식했다.

꼬리정맥으로부터 이식한 각각의 종양세포는, 간장 또는 폐를 주체로한 장기에 전이결절(轉移結節)을 형성하여 최종적으로 치사했다. 그 때문에, 생존기간을 관찰하는 것으로, 종양발생(생착율, 종양형성능)에 대한 영향을 조사했다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 무첨가, 즉 통상의 배지만으로 배양한 각각의 종양세포를 이식한 마우스는, 전부가 사망하고, 그의 종양발생은 100%이였다. 동일하게, 비히클 존재하에서 1일 동안 배양한 각각의 종양세포를 이식한 마우스도 전부 사망하고, 그의 종양발생은 100%이였다. 이것에 대해서, KRN 7000 존재하에서 1일 동안 배양한 각각의 종양세포를 이식한 무리에서는, 40∼100%의 마우스가 존재하고, 그의 종양발생이 감소 또는 손실하였다.

이상으로부터, KRN 7000을 대표하는 α-글리코실세라미드를 첨가해서 배양함으로써, 종양세포의 종양발생이 현저하게 저하하는 것이 밝혀졌다. 또, 다른 검토로서, KRN 7000이 종양세포에 대해서 증식저해활성을 나타내는가 아닌가를 검토했다. 그 결과, 약리시험 4와 동일한 조건에서 KRN 7000을 첨가하여 배양한 종양세포에서도, 무첨가 또는 비히클 첨가로 배양한 종양세포와 동등한 증식능을 나타냈다. 이것으로부터, 본 발명의 효과는 종양세포에 대한 직접적인 세포독성에 기인하는 것은 아니고, 다른 작용에 의한 것인 것으로 생각되었다.

이와 같이, α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포를 접종하는 경우에, 방사선 조사에 의해 그의 증식능을 소실시키지 않고도, 암 왁친으로서 유용한 것으로 나타났다. 따라서, 약리시험 1 내지 4까지의 결과를 총괄하면, α-글리코실세라미드로 처리한 종양세포를 접종함으로써, 접종한 종양세포자체는 숙주의 면역에 의해 거의 완전히 배제되는 동시에, 숙주의 면역담당세포를 활성화시킴으로써, 원래부터 존재한 종양에 대해서도 항종양면역이 유도되는 것으로 생각되어진다.

또한, 이 검토에서는, 약리시험 1 내지 3까지 사용한 종양세포 이외에 대해서도 검토를 실시하고, α-글리코실세라미드로 처리함으로써, 모든 종양세포의 조종양성이 감소 또는 저하하는 것이 명확해졌다. α-글리코실세라미드로 처리한 B16 및 EL-4의 치료효과가 그의 조종양성의 저하와 밀접하게 상관하는 것으로 생각하면, B16 및 EL-4 이외의 종양세포에 대해서도 종양요법이 가능한 것으로 생각된다.

약리시험 5. α-글리코실세라미드로 처리하고, 또한 방사선을 방사한 종양세포의 B16 멜라노마 폐전이 모델 마우스에 대한 치료효과

약리시험 2∼4의 결과로부터, α-글리코실세라미드로 처치한 종양세포는, 방사선 조사 또는 화학요법제 등의 처치에 의해 사멸시키지 않고도, 왐왁친으로서 유용한 것이 밝혀졌다. 그러나, 통상의 종양요법에서는 방사선 조사 등에 의해 사멸시킨 것보다 안전한 종양왁친을 사용하는 것이 상례이다. 그래서, α-글리코실세라미드로 처치한 종양세포를 방사선 조사 후에, 암을 갖는 마우스에 접종한 경우에도 치료효과가 얻어지는지 검토를 실시했다.

C57 BL/6 마우스(9주령, 암컷)을 1군에 7마리로 해서, 마우스 B16 멜로마 세포 5×10⁵ 세포/마우스를 꼬리 정맥으로부터 이식함으로써 암을 갖는 마우스를 제작하고, 이 날을 제 0일째로 했다. 또한, 동일에, 약리시험 4에 따라서 신선한 배지에 현탁한 B16 세포에 생체외에서 비히클(0.1% DMSO) 또는 KRN 7000(100 ng/㎖)을 첨가하여 배양을 개시했다. 제 1일 째에, 비히클 또는 KRN 7000 공존하에 1일 동안 배양한 B16/V 또는 B16/KRN을 회수하여, PBS(Phosphate buffered saline)으로 2회 세정했다. 이어서, 얻어진 세포를 200Gy 방사선을 조사한 군과 조사하지 않은 군의 2군으로 나누고, 상기 암을 갖는 마우스의 꼬리정맥으로부터 1×10⁵ 세포/마우스의 비율로 접종하여, 각각의 항종양효과를 비교했다.

도 5에 나타낸 바와 같이, B16/V를 접종한 군에서는 방사선 조사의 유무에 의존하지 않고, 종양을 이식한 만큼의 콘트롤군과 비교해서 전부 항종양효과가 얻어지지 않았다. 한편, B16/KRN을 접종한 무리에서는, 방사선 조사의 유무에 불구하고, 공히 현저한 항종양효과가 인식되고, 종양이식 후 50일까지 약 60∼70%의 마우스가 생존했다.

이상의 결과로부터, 약리시험 2 및 3의 경우와 같이, α-글리코실세라미드로 처치한 종양세포에 대해서 방사선 조사를 실시하지 않은 경우와 동일하게, 방사선 조사를 실시한 경우에도, 현저한 항종양효과가 얻어지는 것이 밝혀졌다. 따라서, α-글리코실세라미드로 처치한 종양세포에 대해서, 또한 방사선 조사 등의 처리를 함으로써, 보다 안전하게 종양요법에 응용할 수 있는 것이 판명되었다.

Claims

종양세포를 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물과 생체외에서 접촉시키는 것을 포함하는 종양세포의 면역원성 증강방법:

화학식 I

상기 식 중에서,

R¹은 H 또는 OH이고, X는 7∼27 중 하나의 정수이고,

R²는 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고(여기서, Y는 5∼17 중 하나의 정수임),

(a) -CH₂(CH₂)_YCH₃

(b) -CH(OH)(CH₂)_YCH₃

(c) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)₂

(d) -CH=CH(CH₂)_YCH₃

(e) -CH(OH)(CH₂)_YCH(CH₃)CH₂CH₃, 및

R³~ R⁹은 하기 i) 또는 ii) 중 어느 것으로 정의되는 치환기이고:

i) R³, R⁶ 및 R⁸이 H일 경우,

R⁴는 OH이고, R⁵는 OH이고, R⁷은 OH이고,

R⁹는 H, CH₃, 또는 CH₂OH로 이루어지는 군에서 선택되는 치환기이고;

ii) R³, R⁶, 및 R⁷이 H일 경우,

R⁴는 OH이고, R⁵는 OH이고, R⁸은 OH이고,

R⁹는 H, CH₃, CH₂OH로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기임.
제 1항에 있어서, 화학식 I의 화합물 중, X가 21∼25의 정수이고, R²가 치환기(b)(식 중, Y는 11∼15임)를 나타내는 방법.
제 1항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 (2S, 3S, 4R)-1-(α-D-갈락토피라노실옥시)-2-헥사코사노일아미노-3,4-옥타데칸디올인 방법.
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하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물과, 생체외에서 접촉시킴으로써 얻을 수 있는 면역원성이 증강된 종양세포:

화학식 I

상기 식 중에서, R¹내지 R⁹, 및 X는 청구항 1에 정의된 바와 같음.
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제 5항에 따른 세포의 유효량을 함유하는, 종양 치료용 의약 조성물.
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제 8항에 있어서, 상기 종양이 멜라노마, 신장암, 자궁암, 췌장암, 뇌종양, 신경글리아 아세포종, 대장암, 폐암, 간장암, 임파종, 백혈병, 및 섬유육종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 의약 조성물.
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