ES2262994T3 - Utilizacion de l-alfa-lisofosfatidilcolina para obtener la diferenciacion in vitro de monocitos en celulas dendriticas maduras. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la diferenciación in vitro de monocitos en células dendríticas maduras según el cual A. se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado, B. se induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas en presencia de un factor de diferenciación, C. se añade a dicho medio L--lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.
Description
Utilización de
L-\alpha-lisofosfatidilcolina para
obtener la diferenciación in vitro de monocitos en células
dendríticas maduras.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la diferenciación de monocitos en células
dendríticas maduras según el cual se dispone de monocitos en un
medio apropiado que permite su diferenciación y se añade a dicho
medio la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina.
Las células dendríticas están implicadas en el
desarrollo de una respuesta inmune y en la iniciación de una
respuesta linfocitaria T específica por reconocimiento, captura y
presentación de los antígenos en particular los agentes infecciosos
(Steinman et al. 1997, Immuno. Rev., 156:
25-37; Cella et al. 1997, Curr. Opin.
Immunol., 9 : 10-16).
Si las células dendríticas inmaduras captan y
digieren los antígenos de los agentes infecciosos de manera muy
eficaz, algunas señales, como los agentes bacterianos o las
citoquinas inflamatorias, pueden activarlos induciendo un proceso
de maduración, que es la etapa inicial del disparo de la respuesta
inmunitaria adaptativa. En efecto, en el curso de esta activación
las células dendríticas adquieren la capacidad de emigrar hacia los
órganos linfoides donde se encuentran los linfocitos T y la
capacidad de transmitir unas señales de coestimulación
indispensables para la activación de los linfocitos T naives. Cuando
tiene lugar esta maduración, las células dendríticas sufren unas
modificaciones funcionales y fenotípicas tales como:
- \bullet
- un aumento de moléculas de superficie implicadas en la activación de los linfocitos T (tales como CD40, CD80, CD83, CD86 y las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CMH) de clase I y II),
- \bullet
- la producción de citoquinas proinflamatorias (tales como las iterleucinas IL-12, IL-1\beta, TNF\alpha y IL-6),
- \bullet
- la disminución de su capacidad para captar y para preparar el antígeno.
A parte de sus capacidades de desarrollo de una
respuesta inmune y de iniciación de una respuesta linfocitaria T
específica, las células dendríticas maduras presentan un interés
terapéutico particular, en especial en los campos de vacunación
antiinfecciosa y antitumoral y de inmunoterapia (Austin. 1998, Curr.
Opin. Hematol. 5: 3-15; Reise Sousa et al.
1999, Curr. Opin. Immunol. 11 : 392-399). Estas
células dendríticas, a parte de su capacidad para inducir una
tolerancia inmunitaria son también una diana interesante cuando se
desea inhibir la respuesta inmunitaria de un paciente, en
particular para luchar contra enfermedades autoinmunes o
inflamatorias.
In vitro, unas células dendríticas
maduras pueden ser obtenidas a partir de monocitos en cultivo. Estos
monocitos son in vivo unas células circulantes que,
atravesando en particular la pared vascular endotelial, entran en
contacto con factores ambientales influyendo su futuro de una forma
aún desconocida. Esquemáticamente, se prevén entonces tres
posibilidades para estos monocitos:
- \bullet
- la salida de los tejidos y el retorno hacia los ganglios linfáticos,
- \bullet
- la diferenciación en macrófagos,
- \bullet
- la diferenciación en células dendríticas inmaduras.
La primera etapa para obtener unas células
dendríticas maduras a partir de monocitos en cultivo, consiste
entonces en inducir la diferenciación de los monocitos en células
dendríticas inmaduras por en particular la interleucina
IL-4 y el factor GM-CSF (Granulocyte
Macrophage-Stimulating factor). Al cabo de 6 días,
95% de las células en cultivo son unas células dendríticas
inmaduras.
La segunda etapa consiste a continuación en una
inducción de la maduración de las células dendríticas inmaduras en
células dendríticas maduras por unos agentes exógenos, tales como
unos agentes bacterianos o virales. Así, la proteína kpOmpA de
Klebsiella pneumoniae es capaz de inducir la maduración de
estas células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras
(P. Jeannin et al., Nature Immunology, 2000, 1:
502-509). Se puede citar también la maduración de
las células dendríticas inmaduras en células dendríticas maduras
por otras moléculas exógenas, tales como los lipopolisacáridos de
la membrana bacteriana (Dichman et al, Journal of Cellular
Phisiology, 2000, 185: 394-400). Sin embargo, la
utilización de moléculas exógenas derivadas de agentes infecciosos
induce problemas de seguridad y financieros, (efectos secundarios
directos o indirectos in vivo; necesidad de purificación muy
importante según exigencias legales o reglamentarias muy
estrictas...), haciendo la utilización de este tipo de moléculas
delicado en el marco de la vacunología y de la inmunoterapia.
Más recientemente, se ha descrito por
Perrin-Cocon et al en 2001 (The Journal of
Immunology, 167 : 3785-3791) que la producción de
células dendríticas maduras a partir de monocitos en diferenciación
puede ser inducida por unas moléculas endógenas, tales como algunas
lipoproteínas plasmáticas oxidadas, y más particularmente las
lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas. Sin embargo, las LDL
oxidadas son unas partículas complejas, compuestas de proteínas, de
triacilgliceroles, de fosfolipoides, de colesterol libre y
esterificado, y son, por ello difíciles de sintetizar
artificialmente.
Así, la presente invención se propone resolver
los inconvenientes del estado de la técnica presentando una
molécula proinflamatoria, molécula endógena, fácil de sintetizar y
poco costosa que estimula la diferenciación de los monocitos en
células dendríticas maduras.
De manera sorprendente, la presente invención se
refiere a la utilización de
L-\alpha-lisofosfatidilcolina
para la diferenciación de monocitos en células dendríticas maduras
in vitro.
Por
L-\alpha-lisofosfatidilcolina, se
entiende una molécula cuya fórmula es la siguiente:
en la
que
representa una cadena larga de
ácidos grasos saturados que comprende de 12 a 20 átomos de carbono,
preferentemente de 16 a
18.
En efecto, una de las moléculas activas
generadas durante la oxidación de las LDL es la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina,
llamada a continuación LPC. Sin embargo, se ha demostrado que la
fijación de la LPC sobre el receptor G2A, que es el receptor de
alta afinidad de la LPC, inhibe en particular la proliferación y la
activación de los linfocitos T, sugiriendo más bien una función de
la LPC en la inhibición del disparo de una reacción inmunitaria
(Carson & Lo, 2001, Science, 293 : 618-619 ).
Además, también se ha demostrado que una alta concentración de LPC
(50 \muM) inhibe la actividad del factor de transcripción
NF-\kappaB (nuclear factor \kappaB), conocido no
obstante para ser activado cuando tiene lugar la maduración de las
células dendríticas. Además, la LPC está presente a alta
concentración en el plasma, sugiriendo que no sería activa en el
plasma, lo que no la predispone para ser elegida por el experto en
la materia para una utilización terapéutica.
La invención se refiere a un procedimiento
para la diferenciación in vitro de monocitos en células
dendríticas maduras según el cual
- A.
- se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,
- B.
- se induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas en presencia de un factor de diferenciación,
- C.
- se añade a dicho medio la L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.
Por medio de cultivo apropiado, se entiende un
medio que comprende todos los elementos necesarios para la
viabilidad de las células. Se puede citar a título de ejemplo el
medio RPMI 1640 y sus derivados y cualquier medio de cultivo bien
conocido por el experto en la materia. Este medio comprende en
particular por lo menos un factor de diferenciación de los monocitos
en células dendríticas. Los factores de diferenciación de los
monocitos en células dendríticas son bien conocidos por el experto
en la materia, y se pueden citar en particular las citoquinas tales
como de manera no limitativa la interleucina IL4, el factor
GM-CSF (Granulocyte
Macrophage-Stimulating factor), la
IL-13, el TNF (tumor necrosis factor).
IL-13, el TNF (tumor necrosis factor).
Cuando tiene lugar la etapa C) la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina es
añadida en particular a dicho medio a una concentración final en el
medio comprendida entre aproximadamente 10 y 80 \muM,
preferentemente entre aproximadamente 20 y 60 \muM y
ventajosamente entre 30 y 50 \muM. Siempre cuando tiene lugar la
etapa C, la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina es
añadida en dicho medio entre el 3er y 6º día de diferenciación de
los monocitos, preferentemente entre el 4º y 5º día de
diferenciación de los monocitos.
Según un modo particular de realización de la
invención, se añade además en el medio de cultivo, cuando tiene
lugar la etapa C), por lo menos un antígeno es decir una molécula (o
un conjunto de moléculas) que es la diana de una respuesta
inmunitaria o que permite la síntesis de esta diana. Este antígeno
puede así ser elegido entre los antígenos de bacterias, de virus,
de levaduras, de parásitos, de hongos, los antígenos tumorales, los
lisados de células tumorales autologas y/o heterologas. Por células
tumorales autologas, se entienden unas células de tumores que
pertenecen al sujeto que recibe un medicamento determinado. Las
células tumorales pueden ser obtenidas por extracción de tejidos
cancerosos, en particular una biopsia o resección quirúrgica. Por
células tumorales heterologas, se entienden unas células salidas de
tumores que provienen de un sujeto diferente del que recibe un
medicamento determinado. La utilización de células heterologas
permite en particular obtener un medicamento que permite tratar
unos pacientes afectados de cáncer de los que una extracción de
células tumorales no es posible. Esto permite también utilizar una
fuente estándar de antígenos tumorales. Por lisado celular, se
entiende una mezcla de antígenos intracelulares y/o membranarios,
obtenida por una lisis de células según un protocolo conocido por
el experto en la materia, tal como una lisis mecánica, química o
enzimática. Este antígeno puede también ser un ácido nucleico que
codifica para por lo menos un antígeno elegido entre los antígenos
de bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, los
antígenos tumorales. Por antígeno tumoral se entiende un antígeno
salido de células tumorales, tal como un péptido tumoral, en
particular un péptido que interactúa con las moléculas de clase I y
presentado a los linfocitos T CD8. Se pueden citar a título no
limitativo, los antígenos tumorales siguientes:
MAGE-2, MAGE-3, MART,
MUC-1, MUC-2,
HER-2, GD-2, carcinoembryonic
antigen (CEA), TAG-72,
ovarian-associated antigens OV-TL3 y
MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP,
CA-125, CA-50,
CA-19-9, renal
tumor-associated antigen G250,
EGP-40 (o EpCAM), S 100 (malignant
meanoma-associated antigen), p53, prostate
tumor-associated antigens (por ejemplo, PSA y PSMA)
y p21ras.
Así, la adición de este antígeno en el medio de
cultivo permite obtener unas células dendríticas maduras que
permiten entonces la activación de linfocitos T que son dirigidos
contra un antígeno dado. Esas células dendríticas maduras,
obtenidas in vitro, pueden entonces ser reinyectadas in
vivo.
Además, se puede utilizar, cuando tiene lugar la
etapa C, un compuesto equivalente de la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina,
que es una molécula que actúa según los mismos mecanismos de acción
celulares que la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina, es
de decir por los mismos receptores membranarios, en particular unos
receptores membranarios de proteínas G, tales como los receptores
G2A, GPR4, receptor del PAF (factor de activación de plaquetas,
platelet activating factor), y/o por los mismos receptores
nucleares tales como los receptores PPAR (peroxisome
proliferator-activated receptor). Este compuesto
equivalente puede así ser en particular ser un agonista de los
receptores anteriormente citado (tal como en particular el
O-metil-PAF, el
carbamil-PAF, el
2-O-metil-PAF), pero
también el propio PAF. Este compuesto puede ser también un
agonista de los PPAR\delta tal como en particular el L 165041
(Merck Research), GW-501516 (Glaxo),
carboprostaciclín (Cayman) o un antagonista de los PPAR\delta tal
como en particular el bisfenol A diglicidil éter (Sigma), el
Diclofenac®. Este compuesto equivalente de la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina
puede ser utilizado solo o en sinergia con la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina.
Según un modo preferido de realización de la invención, la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina es
utilizada en sinergia con el factor de activación de plaquetas
(PAF).
La invención se refiere también a un
procedimiento para la activación de linfocitos T in vitro
según el cual
- A.
- se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,
- B.
- se induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas en presencia de un factor de diferenciación,
- C.
- se añade a dicho medio la L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras,
- D.
- se añade a dicho medio un antígeno, tal como el definido anteriormente, y se dirigen las células dendríticas maduras obtenidas en la etapa B contra dicho antígeno,
- E.
- se ponen en contacto las células dendríticas maduras dirigidas contra el antígeno según la etapa C con unos linfocitos T y se obtienen unos linfocitos T dirigidos contra el antígeno.
La etapa C) puede ser realizada tal como se ha
descrito anteriormente. Un procedimiento de este tipo permite así
obtener, in vitro, unos linfocitos T dirigidos contra un
antígeno dado, que se puede a continuación reinyectar, in
vivo, a un paciente, en particular inmunodeprimido. La invención
se refiere también a un procedimiento para la maduración de
células dendríticas in vitro según el cual
- A.
- se dispone de células dendríticas inmaduras en un medio de cultivo apropiado,
- B.
- se añade a dicho medio la L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.
El experto en la materia conoce bien las células
dendríticas y sus diferentes fases de maduración.
Cuando tiene lugar la etapa B) la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina es
añadida en particular a dicho medio a una concentración final en el
medio comprendida entre aproximadamente 10 y 80 \muM,
preferentemente entre aproximadamente 20 y 60 \muM y
ventajosamente entre 30 y 50 \muM.
Según un modo particular de realización de la
invención, se añade además en el medio de cultivo, cuando tiene
lugar la etapa B), por lo menos un agente biológico tal como el
definido anteriormente.
La invención se refiere también a un medio de
cultivo caracterizado porque comprende la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina a
una concentración final comprendida entre aproximadamente 10 y 80
\muM, preferentemente entre aproximadamente 20 y 60 \muM y
ventajosamente entre 30 y 50 \muM y por lo menos un factor de
diferenciación tal como el definido anteriormente.
Según un modo particular de realización de la
invención, el medio de cultivo comprende además un antígeno, tal
como el definido anteriormente, que es en particular un antígeno de
bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, de
lisados de células tumorales autologas y/o heterologas, un antígeno
tumoral, un ácido nucleico que codifica para una antígeno de
bacterias, de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, un ácido
nucleico que codifica para un antígeno tumoral.
La invención se refiere también a la
utilización de la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina como
agente de activación del sistema inmunitario. Por agente de
activación, se entiende una molécula que, en una composición
farmacéutica, induce los efectos de una medicación o refuerza o
completa los efectos de la medicación principal. En el caso de una
composición vacunante, la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina
desempeña entonces la función de adyuvante que estimula la
respuesta inmunitaria del organismo huésped contra un antígeno dado.
Así, la invención se refiere a una composición vacunante
caracterizada porque comprende la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina como
agente de activación del sistema inmunitario, que desempeña
entonces la función de adyuvante y un antígeno tal como el definido
anteriormente, contra el cual se desea estimular la respuesta
inmunitaria del paciente.
Según un modo preferido de realización de la
invención, se utiliza la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina como
agente de activación del sistema inmunitario para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una
infección de origen bacteriano, viral, fúngico, parasitario o
provocada por una levadura, para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento y/o la prevención de los cánceres. Como
infección bacteriana, se pueden citar en particular las infecciones
inducidas por los estafilococos, las micobacterias, las bacterias
del género Neisseria, las legionelas, salmonelas...
Como infección viral, se pueden citar en
particular las infecciones inducidas por el VIH (virus de la
inmunodeficiencia humana), los virus de las hepatitis, del
sarampión, la rubéola, los poliovirus, flavivirus...
Como infección fúngica, se puede citar en
particular el aspergillosis, candidiasis...
Como infección parasitaria, se puede citar en
particular el paludismo, la leichmaniosis...
Por cáncer, se entienden todas las enfermedades
debidas a una multiplicación anormal de las células, y en particular
de forma no limitativa, los mielomas, linfomas, leucemias,
carcinomas del riñón, del cerebro, del colón, de la próstata, del
recto, del páncreas, de los ovarios, del pulmón, del hígado, de
mama, los cánceres cutáneos elegidos de entre los queratinomas y los
carcinomas, los melanomas.
El medicamento según la invención puede
presentarse en forma de una composición farmacéutica en asociación
con por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable bien
conocido por el experto en la materia. En las composiciones
farmacéuticas según la invención, para la administración oral,
sublingual, subcutánea, intramuscular, intravenosa, tópica,
intratraqueal, rectal, transdérmica, la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina
puede ser administrada en forma unitaria de administración o en
mezcla con unos soportes farmacéuticos clásicos, y destinados a una
administración por vía oral, por ejemplo en la forma de un
comprimido, de una píldora, de una solución bebible, etc, o por vía
rectal, en forma de un supositorio, por vía parenteral, en
particular en forma de una solución inyectable, en particular por
vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, etc. según unos
protocolos clásicos bien conocidos por el experto en la materia.
Para la aplicación tópica, se puede utilizar la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina en
unas cremas, pomadas, lociones, colirios.
Cuando se prepara una composición sólida en
forma de comprimidos, se mezcla la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina con
un excipiente farmacéuticamente aceptable también denominado
vehículo farmacéutico, tal como la gelatina, el almidón, la
lactosa, el estearato de magnesio, el talco, la goma arábiga o
análogos. Se pueden recubrir los comprimidos de sacarosa, con un
derivado celulósico, o de otras materias apropiadas. Se pueden
también tratar de tales maneras que tengan una actividad prolongada
o retardada y que liberen de una forma continua una cantidad
predeterminada de
L-\alpha-lisofosfatidilcolina. Se
puede también obtener una preparación en cápsulas mezclando la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina con
un diluyente y vertiendo la mezcla en unas cápsulas blandas o
duras. Se puede también obtener una preparación en forma de jarabe
o para la administración en forma de gotas, en la cual la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina está
presente conjuntamente con un edulcorante, un antiséptico, tal como
en particular el metilparabén y el propilparabén, así como un agente
que da sabor o un colorante apropiado. Los polvos o los gránulos
dispersables en agua pueden contener la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina en
mezcla con unos agentes de dispersión o unos agentes humectantes, o
unos agentes de puesta en suspensión, bien conocidos por el experto
en la materia. Para una administración parenteral, se utilizan unas
suspensiones acuosas, unas soluciones salinas isotónicas o unas
soluciones estériles e inyectables que contienen unos agentes de
dispersión, unos humectantes farmacológicamente compatibles, tales
como en particular el propilenglicol o el butilenglicol.
La figura 1 representa las curvas de titulación
que dan la absorbancia (Abs) en función del logaritmo de la dilución
del suero del lote de ratas que reciben el LPC mezclado con lisozima
de huevo de gallina (HEL, 1 mg/ml) o HEL sola.
Los ejemplos que siguen se dan a título de
explicativo y no tienen ningún carácter limitativo. Permitirán
comprender mejor la invención.
Ejemplo
1
Los monocitos son aislados de sangre periférica
humana por una primera centrifugación según el gradiente de densidad
(620 g; 20 minutos) en Ficoll-Hypaque, seguida de
una segunda centrifugación (770 g; 20 minutos) en una solución al
50% en Percoll. Los monocitos son a continuación purificados por
depleción inmunomagnética (Dynal, Oslo, Noruega), utilizando un
cocktail de anticuerpos monoclonales anti-CD19
(hibridoma 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA),
anti-CD3 (OTK3, American Type Culture Collection,
Rockeville, MD) y anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter,
Fullerton, CA, USA). Los monocitos así obtenidos son entonces
purificados a por lo menos 90%, como se ha mostrado por la ausencia
de los marcadores CD1a y la presencia del marcador CD14. La
diferenciación de los monocitos en células dendríticas es iniciada
por 40ng/ml de gm-CSF (Granulocyte
Macrophage-Colony Stimulating Factor) humano
recombinado y 250 U/ml de interleucina IL-4 humana
recombinada.
Los monocitos son puestos en cultivo en el medio
RPMI 1640 (Life technologies, Rockeville, MD, USA) enriquecido por 2
mM de glutamina (Life technologies), 10 mM de Hepes (Life
Technologies), 40 ng/ml de gentamicina (Life technologies) y 10% de
suero de ternera fetal desprovisto de lipoproteínas (LPDS, Sigma, St
Quentin-Fallavier, Francia).
Debe observarse que el medio de cultivo
presentado en este ejemplo es un medio de cultivo LPDS. Unos
resultados comparables pueden ser obtenidos por la utilización de
otros medios de cultivo, tal como un medio FCS, es decir un medio
que contiene 10% de suero de ternera fetal no desprovisto de
lipoproteínas, o podrían ser obtenidos por la utilización de
cualquier medio de cultivo sintético conocido por el experto en la
materia.
Tratamiento de los monocitos por la
LPC-5 días después del inicio de la diferenciación
de los monocitos se añaden en el medio de cultivo 40 \muM de LPC
durante 24 horas
(L-\alpha-lisofosfatidilcolina;
Sigma; St Quentin Fallavier, Francia). Unas células control son
también obtenidas en ausencia de LPC en el medio de cultivo.
Se obtienen entonces unas células llamadas
"controles" y unas células llamadas "LPC".
Ejemplo
2
Las células utilizadas en este análisis son las
obtenidas al 6º día de diferenciación según el protocolo descrito en
el ejemplo 1.
El fenotipo de las células "control" y
"LPC" se analiza por citometría de flujo sobre un FACSCalibur
(Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA) por la utilización de
conjugado FITC (isotiocianato de fluoresceína)
anti-CD14,
anti-HLA-DR,
anti-CD80 y conjugado PE (ficoeritrina)
anti-CD1a, anti-CD83,
anti-CD86, anti-CD40 (Beckman
Coulter). Según el estado de la técnica, los monocitos tienen
preferentemente un fenotipo CD14+CD1a-, las células dendríticas
inmaduras tienen preferentemente un fenotipo CD14- CD1a+ CD86-, las
células dendríticas maduras tienen preferentemente un fenotipo
CD-14-CD1a
intermedio-CD86+.
Los resultados obtenidos se presentan en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| CD83 | HLA-DR | CD86 | |
| Control | 5,79 | 78,76 | 117,77 |
| LPC | 11,74 | 146,31 | 759,69 |
\vskip1.000000\baselineskip
Las células "LPC" obtenidas después de la
iniciación de la diferenciación de los monocitos en presencia de
LPC, presentan un fenotipo comparable con el de las células
dendríticas maduras, tal como demuestra en particular la inducción
de los marcadores CD86, y el aumento de HLA-DR por
comparación al fenotipo de las células "controles".
\newpage
Ejemplo
3
Las células "control" y "LPC"
utilizadas en este análisis son las obtenidas después de 6 días de
diferenciación según el protocolo descrito en el ejemplo 1. Estas
células son incubadas a 37ºC:
- \bullet
- durante 30 minutos con 1 mg/ml de FITC-T70-Dextran (Sigma) a fin de estimar la capacidad de internalización de estas células por endocitosis,
- \bullet
- durante 30 minutos con 1 mg/ml de Lucifer Yellow (ref. L0259, Sigma, St Quentin-Fallavier, Francia) a fin de estimar la capacidad de internalización de estas células por pinocitosis,
- \bullet
- durante 3 horas con carboxylate-modified yellow-green FluoSpheres (nombre comercial. 0,45 \mum, Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) a fin de estimar la capacidad de internalización de estas células por macropinocitosis.
La internalización es parada sobre hielo por un
tampón PBS frío que contiene 0,1% de BSA (Bovine serum Albumin,
albúmina sérica bovina) y 0,05% de NaN_{3}. Las células
"control" y "LPC "son lavadas 3 veces a 4ºC en este mismo
tampón y la fluorescencia es cuantificada por FACScalibur (nombre
comercial, Becton Dickinson).
Como muestra la tabla 2, las capacidades de
internalización por endocitosis, pinocitosis y macropinocitosis
están muy disminuidas por la adición de LPC en el medio de cultivo
al 5º día de diferenciación de los monocitos con respecto a las
células controles diferenciadas en ausencia de LPC.
\vskip1.000000\baselineskip
| Endocitosis | Pinocitosis | Macropinocitosis | |
| Control | 100% | 100% | 100% |
| LPC | 53% | 49% | 66% |
\vskip1.000000\baselineskip
La reducción de las capacidades de
internalización es una de las características de las células
dendríticas maduras. Estos resultados muestran que en presencia de
LPC, los monocitos tienen una fuerte tendencia a diferenciarse en
células dendríticas maduras.
Ejemplo
4
Las células "control" y "LPC"
utilizadas en este análisis son las obtenidas después de 6 días de
diferenciación según el protocolo descrito en el ejemplo 1.
Los linfocitos T alogénicos naives son aislados
de sangre periférica humana. Las células mononucleadas de la sangre
periférica son aisladas por centrifugación (600 g, 20 minutos) según
el gradiente de densidad en presencia de
Ficoll-Hypaque. Después de eliminación de los
monocitos sobre gradiente de Percoll, los linfocitos de la sangre
periférica se sitúan en la fracción densa. Los linfocitos T son
purificados por depleción inmunomagnética por la utilización de un
cocktail de anticuerpos monoclonales anti-CD19
(anticuerpo 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA),
anti-CD16 (anticuerpo 3G8),
anti-CD56 (anticuerpo NKH1),
anti-glicoforin A (anticuerpo 11E4B7.6) y
anti-CD14 (anticuerpo RMPO52), comercializados por
Beckman Coulter.
Los linfocitos T purificados son cultivados en
uno placas de cultivo de 96 pocillos con fondo plano con las células
"control" o "LPC".
2X10^{5} células T son cultivadas en 200
\mul de medio de cultivo según una relación de 1:5, 1:10 ó 1:20
monocitos diferenciados en presencia o no de LPC/células T (relación
DC/LT). Después de 4 días, 50 \mul del sobrenadante de cultivo son
utilizados para determinar la secreción de IL-2
(interleucina 2) y de IFN\gamma (interferón gamma) por un kit
ELISA (Endogen, Woburn, MA, USA).
\newpage
Como presenta la tabla 3, la secreción de IL2 y
de IFN\gamma por los linfocitos T, expresada clásicamente según la
relación células dendríticas/linfocito T, (relación DC/LT) está muy
estimulada por las células que provienen de la diferenciación de
monocitos en presencia de LPC añadida 5 días después de la
iniciación de la diferenciación de los monocitos (células
"LPC"), por comparación con los resultados controles (células
"controles").
\vskip1.000000\baselineskip
| Relación DC/LT | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | |
| Control | IL-2 | 0 | 6 \pm 8 | 15 \pm 6 | 35 \pm 11 |
| IFN\gamma | 0 | 41 \pm 14 | 51 \pm 4 | 119 \pm 9 | |
| LPC | IL-2 | 0 | 23 \pm 1 | 47 \pm 26 | 173 \pm 31 |
| IFN\gamma | 0 | 73 \pm 47 | 439 \pm 108 | 795 \pm 19 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran un aumento de las
capacidades de los monocitos diferenciados en presencia de LPC para
estimular los linfocitos T alogénicos, lo que es una característica
de las células dendríticas maduras. A título indicativo, unos
resultados comparables se obtienen cuando la LPC está disuelta en
etanol o en forma de emulsión lipídica.
Ejemplo
5
El objetivo de este ejemplo es demostrar que los
mecanismos de acción puestos en juego cuando tiene lugar la
diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras en
presencia de LPC podrían ser diferentes de los puestos en juego
cuando tiene lugar la diferenciación de los monocitos en células
dendríticas maduras en presencia de LDL oxidadas
(Perrin-Cocon et al. The Journal of
Immunology, 167: 3785-3891, 2001).
En este ejemplo se utilizan unas células
"control" y "LPC" tales como las obtenidas en el ejemplo
1, así como unas células "LDLox", obtenidas tal como se ha
descrito en la publicación científica (Perrin-Cocon
et al. The Journal of Immunology, 167:
3785-3891, 2001) es decir después de diferenciación
de monocitos en cultivo en presencia de LDL oxidadas añadidas en el
medio 5 días después de la iniciación de la diferenciación.
Los inventores han investigado si los
inhibidores de la acción de las LDL oxidadas sobre la diferenciación
de los monocitos en células dendríticas maduras inhibían también
la acción de la LPC sobre la diferenciación de los monocitos en
células dendríticas maduras.
Así, una solución de Intralipid® (50 \mug/ml
de fosfolípidos, Fresenius Kabi, Sèvres, Francia), o una solución
de moléculas sintéticas de naturaleza lipídica (lipoid
E-80®, Lipoid Ag, Ludwigshafen, Alemania, 50
\mug/ml de fosfolípidos) han sido añadidas en el medio de cultivo
al 5º día de diferenciación. La expresión de CD86 de las células
"LPC" y "LDLox" en presencia de estos inhibidores es
analizada según el protocolo descrito en el ejemplo 2, y los
resultados se presentan en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
| Intralipid® | Lipoid E-80 | |
| LDLox | 88% \pm 10 | 81% \pm 14 |
| LPC | 86% \pm 12 | 24% \pm 19 |
\vskip1.000000\baselineskip
La adición de Intralipid® inhibe la
diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras por
las LDL oxidadas y por la LPC de una forma comparable (inhibición
del orden de 80%).
Por el contrario, de una forma sorprendente, la
adición de lipoid E-80 induce una inhibición de la
expresión de los CD86 de 81% cuando los monocitos son cultivados en
presencia de LDL oxidadas, mientras que esta inhibición es de
solamente 24% cuando los monocitos son cultivados en presencia de
LPC.
Estos resultados sugieren que los mecanismos de
acción de la LPC para la diferenciación de los monocitos en células
dendríticas maduras serían diferentes de los mecanismos de acción de
las LDL oxidadas.
Ejemplo
6
A fin de ir más adelante en la búsqueda de los
mecanismos celulares de la acción de la LPC en la diferenciación de
los monocitos en células dendríticas maduras, los inventores han
buscado cuáles son los receptores que podrían estar implicados. En
un primer tiempo, a fin de determinar si los receptores implicados
en la acción de la LPC cuando tiene lugar la diferenciación de los
monocitos en células dendríticas maduras pertenecían a la familia de
los receptores acoplados a una proteína G, PTX (toxina pertussis;
100 ng/ml), conocida para bloquear las proteínas Gi, es añadida
durante 3 horas en el medio de cultivo. El medio de cultivo es a
continuación cambiado y la LPC es añadida tal como se ha descrito en
el ejemplo 1.
Los resultados presentados en la tabla 5
muestran que la preincubación de los monocitos por la PTX bloquea el
aumento de CD86 inducido por la LPC, sugiriendo que la acción de la
LPC implica unos receptores con proteínas Gi.
\vskip1.000000\baselineskip
| Inducción de CD86 | |
| LPC | 100% |
| LPC + PTX | 10% |
Estos captadores podrían ser en particular los
receptores siguientes:
- \bullet
- receptor G2A (G2A-R): se ha demostrado recientemente que la LPC era un ligante de alta afinidad para la proteína G2A, una proteína G acoplada a un receptor expresado en los linfocitos. Además, la estimulación de G2A por la LPC induce la fosforilación de una quinasa extracelular (ERK1/2: extracelular signal-related quinases). Esta fosforilación puede por otra parte ser observada cuando tiene lugar la adición de LPC en el medio de cultivo sugiriendo la implicación del receptor G2A en la diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras por la LPC.
- \bullet
- receptor PAF (PAF-R) como se ha descrito anteriormente, algunos efectos de la LPC podrían implicar el receptor del PAF en diversos tipos de células,
- \bullet
- receptor GPR4: la LPC es también un ligante de la proteína GPR4, otra proteína G acoplada a un receptor que tiene una alta afinidad para la esfingosilfosforilcolina.
A continuación, los inventores han buscado los
factores de transcripción implicados en el proceso de maduración
inducido por la LPC. A fin de determinar si los PPAR están
implicados en la maduración inducida por la LPC, la capacidad de
enlace de los dos factores de transcripción PPAR\gamma y
PPAR\delta ha sido analizada por la técnica de retardo sobre el
gel. Existen 3 isotipos de receptores nucleares PPAR (peroxisome
proliferator-activated receptor): \alpha,
\gamma y \delta. Los PPAR\gamma son las dianas de moléculas de
la clase de las tiazolindionas como la Ciglitizone, utilizadas en
el tratamiento de la diabetes de tipo II. Los PPAR\delta tienen
un expresión más amplia y pueden ser represor de los PPAR\gamma.
Los monocitos en curso de diferenciación han sido incubados durante
dos horas con una solución de LPC (40 \muM) (células llamadas
"LPC"). Unas células llamadas "control" son también
obtenidas en ausencia de LPC en el medio de cultivo. Después de
recolección de las células, las proteínas nucleares han sido
extraídas con el kit Nuclear Extract Kit (SIGMA). Las proteínas
nucleares han sido a continuación puestas en contacto con una sonda
marcada radioactivamente que contiene un elemento de respuesta
reconocido por los PPARs. Después de migración sobre un gel no
desnaturalizante, una banda que contiene PPAR\gamma y un doblete
que contiene PPAR\delta han sido identificados con la ayuda de
anticuerpos por la técnica de Supershift. La actividad de enlace de
los PPAR ha sido determinada por medición de la intensidad de estas
bandas. Estas actividades están expresadas en porcentaje con
respecto a las células llamadas "control".
| PPAR\gamma | PPAR\delta | |
| Control | 100% | 100% |
| LPC | 0% | 263% |
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento por LPC induce una fuerte
reducción de la actividad de enlace de PPAR\gamma que puede
conducir a una desaparición total y estimula en gran manera la
actividad de PPAR\delta.
Los inventores han utilizado a continuación un
agonista de los PPAR\gamma, la Ciglitizone. Una solución de
Ciglitizone (Sigma, 50 \muM) ha sido añadida al medio de cultivo
al quinto día de diferenciación de los monocitos, como se ha
descrito en el ejemplo 1, 15 minutos antes de la adición de una
solución de LPC (40 \muM durante 2 horas). Las células obtenidas
se denominan "LPC + Ciglitizone". Unas células llamadas
"Ciglitizone" han sido obtenidas según el mismo protocolo pero
en ausencia de LPC y unas células llamadas "LPC" han sido
obtenidas como se ha descrito en el ejemplo 1, en ausencia de
Ciglitizone.
La actividad de los factores de transcripción
PPAR\gamma y PPAR\delta ha sido medida en estas células por la
técnica de gel retard, como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
| PPAR\gamma | PPAR\delta | |
| Control | 100% | 100% |
| Ciglitizone | 237% | 106% |
| LPC + Ciglitizone | 115% | 147% |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados indican que la Ciglitizone que
activa PPAR\gamma, inhibe en gran manera el efecto de la LPC
sobre los PPAR\gamma y PPAR\delta, y bloquea por ello la
maduración de las células dendríticas inducida por LPC.
Las capacidades funcionales de estas células
("control", "Ciglitizone" y "LPC + Ciglitizone") para
estimular unos linfocitos T (LT) han sido a continuación analizadas.
Estas células han sido cultivadas como se ha descrito en el ejemplo
4, en presencia de linfocitos T alogénicos purificados. La secreción
de IFN\gamma ha sido medida como en el ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
| Relación DC/LT | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 |
| Control | 0 | 54 \pm 82 | 69 \pm 4 | 364 \pm 27 |
| LPC | 0 | 750 \pm 184 | 899 \pm 124 | 1326 \pm 248 |
| LPC + Ciglitizone | 0 | 93 \pm 7 | 169 \pm 105 | 484 \pm 229 |
\newpage
El conjunto de estos resultados subraya una
función importante de los PPAR en la maduración de las células
dendríticas inducida por LPC así como la importancia de la relación
PPAR\gamma / PPAR\delta en la génesis de células dendríticas
funcionalmente maduras. Esta relación es modulada por la LPC y la
Ciglitizone.
Ejemplo
7
Los inventores han determinado si unos
compuestos equivalentes a la LPC, es decir que implican los mismo
mecanismos de acción celulares a través de los mismos receptores
membranarios o intracelular, podían también inducir la
diferenciación de los monocitos en células dendríticas maduras.
Para ello, los inventores han buscado si la
adición de PAF en el medio de cultivo podía aumentar la acción de
la LPC sobre la diferenciación de los monocitos en células
dendríticas maduras.
Así, una solución de PAF (Sigma, 5 \muM) ha
sido añadida en el medio de cultivo al 5º día de diferenciación de
los monocitos. La expresión de CD86 de las células "control", y
de las células "LPC", obtenidas en presencia o en ausencia de
PAF, es analizada según el protocolo descrito en ele ejemplo 2, y
los resultados se presentan en la
tabla 9.
tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
| CD86 | |
| Control | 49,02 |
| PAF | 102,88 |
| LPC | 287,11 |
| LPC + PAF | 676,88 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados sugieren que el PAF solo induce
una ligera sobreexpresión de CD86 contrariamente a la LPC que induce
un aumento de la expresión de CD86 de 470%. Por el contrario, es
importante observar que el PAF actúa en sinergia con la LPC, puesto
que la acción de los dos compuestos induce un aumento de la
expresión de CD86 de más de 1200%. A fin de reforzar la implicación
del receptor al PAF, los inventores han estudiado la acción de un
antagonista de este receptor sobre la diferenciación de los
monocitos en células dendríticas maduras por la
LPC.
LPC.
Así, una solución del antagonista BN52021 del
PAF (Biomol, Plymouth Meeting, USA, 100 \muM) ha sido añadida en
el medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos. La
expresión de CD86 de las células "controles" y "LPC",
obtenidas en presencia o en ausencia de BN52021, es analizada según
el protocolo descrito en el ejemplo 2, y los resultados se presentan
en la tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
| CD86 | |
| LPC | 100% |
| LPC + BN52021 | 54% |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados sugieren que la acción de la
LPC implica bien el receptor del PAF pero sugieren también que la
acción de la LPC podría implicar otros receptores.
A título indicativo, los inventores han
demostrado también que el antagonista BN52021 añadido en el medio
de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos en células
dendríticas maduras inducidas por unas LDL oxidadas inducía una
inhibición de 100% de la acción de las LDL oxidadas, sugiriendo aquí
también, que los mecanismos de acción de la LPC y de las LDL
oxidadas serían diferentes.
Ejemplo
8
El objetivo de este ejemplo es demostrar que la
LPC es una molécula adyuvante del sistema inmunitario, que puede
ser utilizada en el marco de la inmunización para aumentar la
respuesta T específica contra un antígeno.
La LPC es un producto inflamatorio. En este
ejemplo, una solución de LPC de 100 a 500 nmol disuelta en 50
\mul de PBS son inyectados en el cojín plantar de ratas BALB/c
(Charles River Laboratoires) el día 0. Los cojines plantares son
medidos con la ayuda de un micrómetro antes y después de la
inyección, hasta el 10º día, y comparado con los cojines plantares
de ratas "controles", obtenidos por inyección de PBS (50
\mul). La intensidad de la inflamación es traducida por el
engruesado de la pata. El máximo de engruesado es observado al 1er
día, 24 horas después de la inyec-
ción.
ción.
\vskip1.000000\baselineskip
| Engruesado de la pata (mm) | |
| PBS | 0,025 |
| LPC 100 nmol | 0,35 |
| LPC 200 nmol | 0,55 |
| LPC 300 nmol | 0,725 |
| LPC 400 nmol | 1,125 |
| LPC 500 nmol | 1,075 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que la LPC induce una
inflamación que depende de la dosis inyectada.
A fin de demostrar que la PLC induce in
vivo la maduración y por tanto la emigración de las células
dendríticas hacia los ganglios drenantes, una solución de LPC (0,1 M
en dibutil-ftalato) ha sido aplicada sobre la piel
de las orejas de ratas BALB/c (Charles River Laboratoires), 10
minutos antes de la aplicación de una solución de FITC (Sigma) al
1,5% en dibutil-ftalato/acetona 1:1. Este marcador
fluorescente es capturado por las células dendríticas de la piel.
Después de 24 h, los ganglios auriculares y maxilares son extraídos
y las células son puestas en suspensión. La suspensión celular es
enriquecida con células dendríticas por centrifugación sobre
gradiente de metrizamida (Sigma). Las células son marcadas por un
anticuerpo (Pharmingen) que reconoce las moléculas de clase II del
Complejo Principal de Histocompatibilidad (CMH) y el análisis en
citometría de flujo permite cuantificar el porcentaje de células de
gran tamaño (células dendríticas), que expresan las moléculas de
clase II del CMH y que contiene FITC. Estas células son unas células
presentadoras que han capturado el FITC en la periferia y que han
emigrado hacia los
ganglios.
ganglios.
\vskip1.000000\baselineskip
| Células dendríticas FITC^{+} | |
| FITC | 7,1 \pm 1,7% |
| LPC + FITC | 19,3 \pm 3,3% |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que la aplicación de
LPC estimula la emigración de las células dendríticas por la piel
hacia los ganglios drenantes.
La LPC estimula la respuesta T específica de un
antígeno soluble coinyectado. La LPC disuelta en PBS (250 o 500
nmol en 50 \mul) es mezclada con lisozima de huevo de gallina
(HEL, 50 \mug) y esta mezcla es inyectada en el cojín plantar de
ratas BALB/c. Después de 7 días, los ganglios popliteos son
extraídos, y sus células son reestimuladas en triplicado in
vitro, en un medio de cultivo que contiene 30 \muM de antígeno
HEL o en ausencia de HEL. Después de 3 días, la proliferación de los
linfocitos T es medida por incorporación de timidina tritiada
durante 16 h.
\vskip1.000000\baselineskip
| Condiciones de inmunización | Proliferación en ausencia de HEL | Reestimulación por HEL (30 \muM) |
| HEL | 1315 \pm 275 | 5370 \pm 1983 |
| HEL + LPC 250 nmol | 1608 \pm 7 | 10885 \pm 2861 |
| HEL + LPC 500 nmol | 2101 \pm 87 | 23739 \pm 4265 |
Estos resultados muestran que la LPC coinyectada
con el antígeno favorece la activación in vivo de los
linfocitos T específicos de este antígeno.
La LPC estimula la producción de anticuerpos
específicos contra un antígeno soluble coinyectado. La LPC disuelta
en PBS (350 nmol en 50 \mul) es mezclada con lisozima de huevo de
gallina (HEL, 1 mg/ml) y esta mezcla es inyectada en el cojín
plantar de ratas BALB/c. El lote de ratas denominado "HEL +
LPC" recibe 50 \mul de esta mezcla en los cojines de las dos
patas posteriores. El lote de ratas llamado "HEL" recibe 50
\mul de solución HEL (1 mg/ml en PBS) en las dos patas. Después de
15 días, se realiza una inyección de recuerdo en subcutáneo en los 2
flancos. El lote "HEL + LPC" recibe en cada flanco 100 \mul
de una solución de LPC (5 mM) y de HEL (1 mg/ml) en PBS. El lote
"HEL" recibe en cada flanco 100 \mul de una solución de HEL
(1 mg/ml) en PBS. Dos semanas más tarde, la sangre de las ratas es
extraída y los IgG específicos del antígeno HEL son dosificados por
ELISA con respecto a una gama de solución estándar de IgG. Las
curvas de titración que dan la absorbancia (Abs) en función del
logaritmo de la dilución del suero están representadas en la figura
1. Estos resultados sugieren que la LPC coinyectada con el antígeno
favorece la activación del sistema inmunitario e induce la síntesis
de anticuerpos específicos del antígeno mientras que la inyección
del antígeno solo no induce respuesta. La LPC induce una respuesta
humoral contra el antígeno, demostrando su capacidad de
adyuvante.
La LPC puede inducir una respuesta de los
linfocitos T CD8+in vivo. En este ejemplo, ha sido utilizado
un test de hipersensibilidad retardada de contacto a los haptenos.
En este modelo, unas ratas BALB/c son sensibilizadas por la
aplicación de un hapteno, el DNFB
(1-fluoro-2,4-dinitrobenzeno,
solución a 0,5% en aceite de oliva/acetona 1:1), sobre la espalda.
Cinco días más tarde, una dosis no irritante de DNFB (solución al
0,2% en aceite de oliva/acetona 1:1) es aplicada en la oreja
izquierda mientras que la oreja derecha recibe el solvente. En esta
fase de revelado de los linfocitos T CD8^{+} específicos de las
proteínas haptenizadas son reclutados e inflitran la oreja,
segregando IFN\gamma y produciendo un edema.
Un lote de ratas llamado "control" ha sido
sensibilizado por el DNFB solo y otro lote (ratas "LPC") ha
recibido 500 nmol de LPC por aplicación sobre la piel de la espalda
de 20 \mul de una solución etanólica de LPC, 10 minutos antes de
la aplicación del DNFB. Cinco días más tarde, los dos lotes han sido
tratados de la misma manera para la fase de revelado y el engruesado
de las orejas ha sido medido con la ayuda de un micrómetro 48 h
después de esta aplicación.
| Engruesado de la oreja derecha | Engruesado de la oreja izquierda | |
| (\mum) | (\mum) | |
| Control | 0 \pm 4 | 67 \pm 32 |
| LPC | 0 \pm 3 | 149 \pm 31 |
Estos resultados demuestran que la aplicación de
LPC 10 minutos antes del hapteno cuando tiene lugar la fase de
sensibilización aumenta el edema inducido cuando tiene lugar la 2ª
aplicación del hapteno (revelado). Esto significa que la LPC
estimula la respuesta producida por los linfocitos T CD8+.
Ejemplo
9
Puesto que se ha demostrado en el ejemplo 5 que
una emulsión lipídica tal como el Intralipid® bloquea la génesis de
células dendríticas maduras inducida por LPC, los inventores han
buscado también si este bloqueo provenía de una acción indirecta de
esta emulsión lípidica a través de un inhibición de la acción de la
LPC y/o de una acción directa de esta emulsión lipídica.
El Intralipid® regula in vitro los PPAR.
En un primer tiempo, una solución de Intralipid® (50 \mug/ml de
fosfolípidos) ha sido añadida al medio de cultivo al 5º día de
diferenciación de los monocitos, según un protocolo comparable con
el descrito en el ejemplo 6. Las células han sido recolectadas
después de 1h, 2h u 8h de incubación con el Intralipid®, las
proteínas nucleares han sido extraídas y la actividad de los
PPAR\gamma y PPAR\delta ha sido determinada como se ha descrito
en el ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo de incubación con el Intralipid (h) | PPAR\gamma | PPAR\delta |
| 0 | 100% | 100% |
| 1 | 130% | 94% |
| 2 | 160% | 94% |
| 8 | 170% | 77% |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demuestran que el Intralipid®
solo, activa PPAR\gamma e inhibe la actividad de PPAR\delta.
Esta acción del Intralipid® es opuesta a la de la LPC.
En un segundo tiempo, una solución de
Intralipid® (50 \mug/ml de fosfolípidos) ha sido añadida en el
medio de cultivo al 5º día de diferenciación de los monocitos, 15
min antes de la adición de una solución de LPC (40 \muM) (células
llamadas "LPC + Intralipid"). Unas células llamadas
"Intralipid" han sido también obtenidas en ausencia de LPC.
Unas células llamadas "LPC" han sido obtenidas en ausencia de
Intralipid®. Las células han sido recolectadas después de 2h de
incubación, las proteínas nucleares han sido extraídas y la
actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta ha sido determinada
como se ha descrito en el ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
| PPAR\gamma | PPAR\delta | |
| Control | 100% | 100% |
| Intralipid | 156% | 99% |
| LPC | 1% | 160% |
| LPC + Intralipid | 40% | 80% |
\vskip1.000000\baselineskip
El Intralipid® bloquea también la acción de la
LPC modulando la actividad de los PPAR\gamma y PPAR\delta.
EL Intralipid® bloquea in vivo la
inflamación y la respuesta inmune inducida por LPC. En este ejemplo,
3 lotes de ratas BALB/c son inmunizadas contra el antígeno de
lisozima de huevo de gallina (HEL) por inyección de 50 \mul de
solución en el cojín plantar. El lote control "HEL" recibe 50
\mug de HEL, el lote "HEL + Intralipid" recibe una mezcla de
Intralipid® (45 \mul) y de 50 \mug de HEL (5 \mul de una
solución con 10 mg/ml). El lote "HEL +LPC" recibe 50 \mug de
HEL con 350 nmol de LPC disuelta en PBS. El lote "HEL + LPC+
Intralipid" recibe 50 \mug de HEL mezclado con 350 nmol de LPC
disuelta en 45 \mul de Intralipid®. Después de 24 horas, el
espesor de los cojines es medido con la ayuda de un micrómetro y
comparado con la medida realizada antes de la inyección. La
diferencia de espesor es proporcional a la intensidad de la
inflamación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Engruesado medio de la pata a 24 h (mm) | |
| HEL + Intralipid | 0,19 \pm 0,04 |
| HEL + LPC | 1,07 \pm 0,19 |
| HEL + LPC + Intralipid | 0,45 \pm 0,04 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que la inyección de
Intralipid® al mismo tiempo que la LPC reduce un 70% la inflamación
del cojín plantar inducida por LPC.
Siete días después de la inyección, los ganglios
popliteos son extraídos y sus células son reestimuladas in
vitro en triplicado, en un medio de cultivo que contiene 10
\muM de HEL o en ausencia de HEL. Después de 3 días, la
proliferación de los linfocitos T específicos de HEL es medida por
incorporación de timidina tritiada durante 16 h.
\vskip1.000000\baselineskip
| Condiciones de inmunización | Proliferación en ausencia de HEL | Reestimulación por HEL |
| (cpm) | (10 mM) (cpm) | |
| HEL | 370 \pm 212 | 738 \pm 408 |
| HEL + LPC | 2568 \pm 1570 | 11340 \pm 4426 |
| HEL + LPC + Intralipid | 1124 \pm 541 | 3959 \pm 2103 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que el Intralipid®
inyectado al mismo tiempo que la LPC bloquea la estimulación de la
respuesta T inducida por LPC.
El conjunto de estos resultados muestra que el
Intralipid® bloquea la génesis de células dendríticas maduras
inducida por LPC, por una acción indirecta del Intralipid® a través
de una inhibición de la acción de la LPC pero también por una
acción directa del Intralipid® sobre los PPAR, antagonista de la
LPC. Estos resultados muestran que el Intralipid® solo tiene una
función antiinflamatoria. El conjunto de estos resultados muestra la
importancia de la relación PPAR\gamma/PPAR\delta en la génesis
de células dendríticas funcionalmente maduras. Esta relación es
modulada por la LPC, pero también, de una forma inversa, por una
emulsión lipídica tal como el Intralipid® y la ciglitizone.
Claims (16)
1. Procedimiento para la diferenciación in
vitro de monocitos en células dendríticas maduras según el
cual
- A.
- se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,
- B.
- se induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas en presencia de un factor de diferenciación,
- C.
- se añade a dicho medio L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.
2. Procedimiento según la reivindicación 1
según el cual, cuando tiene lugar la etapa B) la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina es
añadida a dicho medio a una concentración final en el medio
comprendida entre aproximadamente 10 y 80 \muM.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2
según el cual, cuando tiene lugar la etapa B) la
L-\alpha-lisofosfatidilcolina es
añadida en dicho medio entre el 3º y 6º día de diferenciación de los
monocitos
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque, cuando tiene
lugar la etapa C), se añade además, en el medio de cultivo por lo
menos un antígeno.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque el antígeno es un antígeno de bacterias,
de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, de lisados de
células tumorales autologas y/o heterologas, un antígeno tumoral,
un ácido nucleico que codifica para una antígeno de bacterias, de
virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, un ácido nucleico que
codifica para un antígeno tumoral.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, cuando tiene
lugar la etapa C), se añade además, en el medio de cultivo un
factor de activación de las plaquetas (PAF).
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el factor de
diferenciación se elige entre la interleucina 4, el
GM-CSF, la interleucina 13, el TNF.
8. Procedimiento para la activación de
linfocitos T in vitro según el cual
- A.
- se dispone de monocitos en un medio de cultivo apropiado,
- B.
- se induce la diferenciación de los monocitos en células dendríticas en presencia de un factor de diferenciación,
- C.
- se añade a dicho medio L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras,
- D.
- se añade a dicho medio un antígeno y se dirigen las células dendríticas maduras obtenidas en la etapa C contra dicho antígeno,
- E.
- se ponen en contacto las células dendríticas maduras dirigidas contra el antígeno según la etapa D con unos linfocitos T y se obtienen unos linfocitos T dirigidos contra el antígeno.
9. Procedimiento para la maduración de las
células dendríticas in vitro según el cual
- A.
- se dispone de células dendríticas inmaduras en un medio de cultivo apropiado,
- B.
- se añade a dicho medio L-\alpha-lisofosfatidilcolina y se obtienen unas células dendríticas maduras.
10. Medio de cultivo, caracterizado
porque comprende
L-\alpha-lisofosfatidilcolina a
una concentración final en el medio comprendida entre 10 y 80 \mum
y por lo menos un factor de diferenciación de los monocitos en
células dendríticas.
11. Medio de cultivo según la reivindicación 10,
caracterizado porque comprende además un antígeno.
12. Medio de cultivo según la reivindicación 11,
caracterizado porque el antígeno es un antígeno de bacterias,
de virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, de lisados de
células tumorales autologas y/o heterologas, un antígeno tumoral,
un ácido nucleico que codifica para un antígeno de bacterias, de
virus, de levaduras, de parásitos, de hongos, un ácido nucleico que
codifica para un antígeno tumoral.
13. Medio de cultivo según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque el factor de
diferenciación se elige entre la interleucina 4, el
GM-CSF, la interleucina 13, el TNF.
\newpage
14. Utilización de
L-\alpha-lisofosfatidilcolina como
agente de activación del sistema inmunitario para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una
infección de origen bacteriano, viral, fúngico, parasitario o
provocada por una levadura.
15. Utilización de
L-\alpha-lisofosfatidilcolina como
agente de activación del sistema inmunitario para la fabricación de
un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de los
cánceres.
16. Composición vacunante, caracterizada
porque comprende
L-\alpha-lisofosfatidilcolina como
agente de activación del sistema inmunitario y un antígeno.
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