CN115737594A - 一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料，该仿生普鲁士蓝纳米复合材料包括普鲁士蓝、华蟾毒精和仿生膜，且粒径为160nm～180nm。制备方法包括用铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮反应得到介孔普鲁士蓝分散液，将华蟾毒精加到普鲁士蓝分散液中制得物理包封华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料，最后将负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料与仿生膜混合搅拌得到负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料。本发明通过诱导三阴性乳腺癌细胞焦亡，诱发免疫反应实现肿瘤消融，实现三阴性乳腺癌的高效治疗，从而可用于制备热/化疗/免疫治疗联合的肿瘤治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体说是一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，作为一种严重威胁人类健康的疾病，乳腺癌已取代肺癌成为全球发病率最高的癌症，尤其是该疾病还呈现出发病年龄小的趋势。其中三阴性乳腺癌(TNBC)作为一种雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体-2(Her-2)表达均呈阴性的分子亚型，其临床治疗手段相对局限，且病情复杂，恶性程度和复发转移率最高，是预后最差的一种乳腺癌类型。因此如何降低发病率、提高治愈率、延缓复发转移率已成为当今世界上亟待解决的难题。随着免疫检查点阻断(ICB)用于某些临床晚期肿瘤病人治疗的成功，免疫治疗引起了广泛关注。然而，其对TNBC的治疗效果受到非免疫原性肿瘤微环境的严重限制。近年来在癌症治疗中显示一定潜力的光热疗法(PTT)被证实主要通过促进免疫细胞向肿瘤的迁移和活化T细胞来杀伤肿瘤细胞；同时，PPT促进肿瘤细胞释放包含肿瘤抗原和细胞因子的外泌体，招募CD11C+树突状细胞以及CD4+/CD8+T细胞，起到增强癌细胞的免疫原性、激活系统适应性免疫反应的作用。然而，通过单一的PTT疗法表现出肿瘤免疫原性较差，免疫检查点应答率低的缺点。细胞焦亡是光热治疗引起的另一种程序性细胞死亡，其明显区别于细胞凋亡、坏死和自噬等死亡方式，是一种炎症性细胞死亡。研究发现，焦亡引起的炎症能够激发强烈的抗肿瘤免疫，提高ICB的疗效。作为中药蟾酥的一种有效成分，华蟾毒精(CS-1)可有效诱导MDA-MB-231细胞焦亡。为此，我们推测：化疗和光热疗法(PTT)联合诱导细胞焦亡可以显著提高ICB的应答率，进而有效抑制肿瘤生长，同时在癌症患者和临床前肿瘤模型中产生强烈而持久的抗肿瘤反应。然而，单一的化疗药物毒副作用大，靶向性差，容易引起正常组织的焦亡和损伤。因此，有必要探索一种具有免疫促进效应和肿瘤特异性的有效治疗策略，以改善TNBC患者的预后。纳米医学为解决这一问题提供了新的思路，通过在纳米材料粒表面修饰靶向基团手段为靶向肿瘤微环境提供了可能。具有介孔结构的普鲁士蓝纳米颗粒不仅可作为药物载体，同时还可利用其自身的光热转换能力结合光热疗法实现化疗增敏。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种具备较长血液循环周期和良好靶向能力，且具有免疫激活能力，可有效杀伤三阴性乳腺癌的负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料及其制备方法，并且，相应地提供了一种上述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料在制备热/化疗/免疫治疗联合的肿瘤治疗药物中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料，所述仿生普鲁士蓝纳米复合材料包括普鲁士蓝、华蟾毒精和仿生膜，所述华蟾毒精物理装封于普鲁士蓝内，所述仿生膜包裹于普鲁士蓝外层，且所述仿生普鲁士蓝纳米复合材料粒径为160nm～180nm。
本发明还提供了一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将人源性红细胞膜与三阴性乳腺癌细胞膜超声破碎，在PBS溶液中搅拌反应融合制得仿生膜；
(2)将铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮溶解于HCl溶液中，经加热反应后，离心、水洗，得到普鲁士蓝分散液；
(3)将华蟾毒精加入普鲁士蓝分散液中混合搅拌反应，经离心分散后，得到负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料；
(4)将负载华蟾毒精的普鲁士蓝复合材料和仿生膜的PBS溶液在30～37℃温度下进行混合搅拌反应，经离心分散后得到负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料。
作为优选，所述步骤(1)中，所述红细胞膜和三阴性乳腺癌细胞膜的质量比为1:0.5～1，所述步骤(2)中，所述铁氰化钾与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1∶11～23，所述步骤(3)中，所述华蟾毒精和普鲁士蓝分散液的质量比为1∶10，所述步骤(4)中，所述仿生膜和所述负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料的质量比为1∶5～10。
作为优选，所述步骤(1)中，所述超声的功率为80W～100W，所述超声的时间为1min～2min所述搅拌反应的温度为30℃～37℃，所述搅拌反应的转速为500rpm～600rpm，所述搅拌反应的时间为2h～3h。
作为优选，所述步骤(2)中，所述加热反应的温度为75℃～85℃，所述加热反应的时间为18h～22h，所述加热反应采用油浴方式进行，所述离心的转速为10000rpm～13000rpm。
作为优选，所述步骤(3)中，所述搅拌反应的转速为500rpm～800rpm，所述搅拌反应的时间为10h～12h，所述离心的转速为10000rpm～13000rpm。
作为优选，所述步骤(4)中，所述搅拌反应的转速为500rpm～800rpm，所述搅拌反应的时间为2h～4h，所述离心的转速为10000rpm～13000rpm。
本发明还提供了负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料和/或按照上述制备方法制备得到的负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料在制备热/化疗/免疫治疗联合的肿瘤治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明可诱导三阴性乳腺癌细胞焦亡，激活抗肿瘤免疫，有效杀伤三阴性乳腺癌细胞，其中本发明负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料由普鲁士蓝对化疗药物华蟾毒精进行物理装封，仿生膜生物伪装在负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料的最外层。彼此的结合顺序有助于仿生普鲁士蓝纳米复合材料发挥最大功效。最外层的仿生膜通过同源癌细胞的归巢效应主动靶向肿瘤病灶，红细胞膜的引入增强仿生普鲁士蓝纳米复合材料的血液循环周期。进入肿瘤部位后，外源性近红外光的刺激通过产热使化疗药物华蟾毒精释放。化疗药物和光热疗法(PTT)诱导的焦亡可以最大限度地提高ICB的应答率，并实现对肿瘤生长的明显控制，从而在癌症患者和临床前肿瘤模型中产生强烈而持久的抗肿瘤反应；
2、本发明解决了三阴性乳腺癌(TNBC)的治疗效果受到非免疫原性肿瘤微环境的严重限制的问题，同时又能改善药剂的血液半衰期和肿瘤靶向效果。为开发一种具有免疫促进效应和肿瘤特异性的抗癌药剂及相关临床治疗提供新理论支持，具有重要的实用价值和经济价值。
附图说明
图1为仿生膜的双膜融合荧光成像图；
图2为普鲁士蓝(PB)、负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料(PC)、负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)的透射电镜图；
图3为普鲁士蓝(PB)、负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料(PC)、负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)的紫外可见光谱；
图4为普鲁士蓝(PB)、负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料(PC)、负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)的升温曲线(808nm近红外激发，1W/cm2)；
图5为罗丹明、PB和M@PB的体外肿瘤3D球渗透能力荧光变化；
图6为华蟾毒精(CS-1)、普鲁士蓝(PB)和负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)在有/无近红外激光刺激下对三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的细胞毒性；
图7为华蟾毒精(CS-1)、普鲁士蓝(PB)和负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)在有/无近红外激光处理后的线粒体膜电位图；
图8为华蟾毒精(CS-1)、普鲁士蓝(PB)和负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)在有/无近红外激光处理后细胞内三磷酸腺苷定量图；
图9为蛋白免疫印迹法检测华蟾毒精(CS-1)、普鲁士蓝(PB)和负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)在有/无近红外激光处理后Caspase3、GSDME蛋白剪切图；
图10为共聚焦观察华蟾毒精(CS-1)、普鲁士蓝(PB)和负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)在近红外激光处理后诱导细胞焦亡图；
图11为不同处理治疗体内原位三阴性乳腺癌模型的肿瘤相对大小，且在治疗期结束的实体瘤照片。
具体实施方式
下面将结合图1-11详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售。
一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料，其述包括普鲁士蓝、华蟾毒精和仿生膜，华蟾毒精物理装封于普鲁士蓝内，仿生膜包裹于普鲁士蓝外层，且该仿生普鲁士蓝纳米复合材料粒径为160nm～180nm。
实施例1
(1)负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝复合材料的合成
a.制备仿生膜分散液
BALB/c小鼠的新鲜血液在4℃，2000rpm转速下离心10min，用PBS多次洗涤沉淀。然后，将0.25×PBS与沉淀混合置于冰上2h。以12000rpm，4℃离心5min，取第二层溶液得到红细胞膜(RBC M)。采用膜蛋白提取试剂盒制备MDA-MB-231细胞膜。将MDA-MB-231细胞重悬在膜提取试剂A(含1％PMSF)中。冰上放置1h后，在-80℃与37℃环境中反复冻融5次，每次各30min。以12000rpm，4℃离心30min得到MDA-MB-231细胞膜。将两者(按照质量比1：1)的混合物冰上超声2min，在37℃，600rpm转速下混合搅拌反应2h以得到仿生膜分散液(记作：M)。
b.制备普鲁士蓝分散液
将264mg铁氰化钾和3g聚乙烯吡咯烷酮溶解在40mL浓度为0.01M的HCl溶液中，HCl溶液的pH值为2，然后将所得黄色混合液于80℃的油浴中加热反应20h，再将反应所得产物溶液在12000rpm的转速下离心15min，沉淀物重悬分散在去离子水中，继续水洗3次，用去离子水分散，制得普鲁士蓝分散液(记作：PB)；
c.制备负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料
向5mL普鲁士蓝分散液(2mg/mL)加入20μL华蟾毒精(5mg/mL)的甲醇溶液，在4℃，800rpm转速下搅拌12h。所得溶液高速离心(30min，12000rpm)，沉淀分散在去离子水中，制得负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料(记作：PC)。
d.制备负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料
将负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料(5mL，1mg/mL)和仿生膜分散液(500μL)的混合物在37℃和600rpm下搅拌2h。最终以12000rpm离心，沉淀分散在PBS中以得到负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(记作：M@PC)。
(2)负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的表征如下：
如图1所示，对本实施例制得的仿生膜进行荧光能量共振转移，其结果表明仿生膜成功融合和制备。
如图2所示，对本实施例中制得的PB和M@PC负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料进行透射电镜图像分析。结果表明均匀分散的方形介孔普鲁士蓝被成功制备，仿生膜在最外层伪装后的载药仿生普鲁士蓝纳米复合材料外观出现9nm左右的膜外层。
用紫外可见(UV-vis)分光光度计分析本实施例制得的PB、PC和M@PC负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料，得到如图3所示的紫外吸收光谱曲线图，从图中可以看出，PB的特征吸收峰位于720nm附近。普鲁士蓝负载华蟾毒精后，紫外吸收分别在260nm处出现了归属于华蟾毒精的特征吸收峰。最后，经过仿生膜最外层伪装制得的M@PC在420nm处出现了归属于生物膜的紫外特征吸收峰。
(3)负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的光热性能如下：
如图4所示，对本实施例中制得的普鲁士蓝(PB)、负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料(PC)、负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)进行光热评估，结果表明，在808nm近红外光照射5min后，PB、PC和M@PC的温度升高分别为17.8℃，18.2℃和18.0℃，而PBS的温度仅升高3.3℃，表明M@PC具有优异的光热性能，在近红外光照射下，该负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料能将光能转化为热能，表现出优异的光热效应，还可进一步触发并加速华蟾毒精的释放，实现更加强烈的抗肿瘤作用。
实施例2：
本发明的一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料在制备光热/化疗/免疫联合的肿瘤治疗药剂的应用，采用实施例1制得的负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料。
(1)3D球渗透性能研究
采用体外肿瘤3D球模型测定了实施例1制备的M@PC负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料在微酸环境下有/无仿生膜包裹的细胞渗透能力。实验结果如图5所示，纳米材料PB相比于荧光染料罗丹明具有良好的渗透能力，说明纳米材料PB在穿透方面具有优势；此外，M@PB仿生纳米制剂在仿生膜及微酸环境作用下表现出更好的渗透能力，本发明中M@PB是材料，具体为裹了膜的PB；M@PC是—PB载药(PC)再裹膜。
(2)细胞毒性研究
用MTT法检测负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。所有细胞均在37℃下，5％CO2中培养。MDA-MB-231细胞与含有华蟾毒精(CS-1)，普鲁士蓝(PB)和负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料(M@PC)(CS-1：5μM；PB：30μg/mL)的培养基孵育4h。继续孵育20h后，使用MTT试验评估各组分的细胞毒性。如图6所示，单独华蟾毒精的化疗和普鲁士蓝激光刺激的光热治疗所引起的细胞毒性均低，MDA-MB-231细胞死亡率分别为48.1％和17.5％。然而，负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的细胞毒性最高，能引起MDA-MB-231细胞74.4％的死亡率。
实施例3：
沿用实施例1制得的负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料，对诱导MDA-MB-231细胞焦亡进行测定。
(1)线粒体膜电位研究
当负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料释放的CS-1富集在线粒体中,线粒体的膜电位将受到影响.因此用线粒体膜电位检测试剂JC-1来检测本实施例中制得的PB、PC和M@PC仿生纳米制剂处理8h后的细胞的膜电位。将MDA-MB-231细胞以10万细胞每孔的密度铺入激光共聚焦专用皿中培养12小时，将含有CS-1、M@PB和M@PC(CS-1：5μM；PB/PC：30μg/mL)的培养基加入到细胞中孵育8h,CCCP处理的细胞作为阳性对照。用10ug/mL.的JC-1试剂孵育25分钟后,然后利用共聚焦显微镜观察JC-1的荧光变化,结果如图7所示。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光(即JC-1-aggregates一行图中灰白色部分所示)；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光(即JC-1monomer一行图中白色部分所示)。由图7可知:经过M@PC处理后的MDA-MB-231细胞中红色荧光减弱,绿色荧光增加，说明线粒体功能受到影响。线粒体功能破环，ATP合成降低。图8所示，细胞内ATP的浓度是通过ATP检测试剂盒来检测。将MDA-MB-231细胞以20万细胞每孔的密度铺入12孔板中培养12小时,将含有CS-1、M@PB和M@PC(CS-1：5μM；PB/PC：30μg/mL)的培养基加入到细胞中孵育8h,未处理的细胞作为对照。吸除培养液，每孔加入100uL裂解液,裂解细胞；裂解后在4℃和12000g的状态下离心5分钟,取上清,用于后续的测定。利用ATP检测工作液检测上清中ATP的浓度,检测结果如图8所示。细胞内ATP水平显著降低，说明M@PC可以抑制细胞内ATP产生。
(2)M@PC诱导胞内GSDME蛋白剪切研究
当M@PC放射纳米颗粒破坏线粒体后，线粒体中的细胞色素C释放到胞质中，激活Caspase3，剪切GSDME蛋白。将MDA-MB-231细胞以10万细胞每孔的密度铺入24孔板中培养12小时,将含有CS-1、M@PB和M@PC(CS-1：5μM；PB/PC：30μg/mL)的培养基分别加入到细胞中孵育8h,未处理的细胞作为阴性对照。用裂解液裂解细胞,之后用蛋白免疫印迹法检测Caspase3和GSDME蛋白的剪切情况。由图9可知:加入M@PC后，Caspase3蛋白激活，切割条带增强；GSDME蛋白发生了明显的剪切,GSDME蛋白条带减弱，GSDME-N条带增强,说明M@PC可以诱导细胞发生GSDME蛋白剪切。
(3)M@PC诱导细胞焦亡研究
当胞内的GSDME蛋白被Caspase 3剪切后,GSDME的N端会在细胞膜上寡聚形成质膜膜孔,从而诱导细胞焦亡。细胞焦亡主要特征之一是胞胀大吹泡,本发明通过共聚焦观察这一现象。将MDA-MB-231细胞以10万细胞每孔的密度铺入玻底培养皿中培养12小时,将含有CS-1、M@PB和M@PC(CS-1：5μM；PB/PC：30μg/mL)的培养基分别加入到细胞中孵育8h,未处理的细胞作为阴性对照,用共聚焦观察细胞状态,测试结果如图10所示。M@PC处理后的细胞有明显的吹泡现象，说明M@PC可诱导MDA-MB-231细胞焦亡。
实施例4：
沿用实施例1制得的负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料用于体内皮下宫颈癌肿瘤治疗。
尾静脉注射100uL CS-1、M@PB或M@PC(CS-6：1.0mg/kg；PB：5mg/kg)用于荷瘤裸鼠的原位三阴性乳腺癌治疗，并且对肿瘤部位进行808nm近红外辐射(1W/cm2，5min)。如图11显示，在给药期内的未经治疗小鼠的肿瘤体积在10天内迅速扩大到约1000mm3。然而，负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料联合光热治疗组(M@PC+L)的肿瘤生长缓慢，体积最终减小至约100mm3以下。
由此可见，本发明的负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料可诱导三阴性乳腺癌细胞焦亡，激活抗肿瘤免疫，有效杀伤三阴性乳腺癌细胞。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
1.一种负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料，其特征在于：所述仿生普鲁士蓝纳米复合材料包括普鲁士蓝、华蟾毒精和仿生膜，所述华蟾毒精物理装封于普鲁士蓝内，所述仿生膜包裹于普鲁士蓝外层，且所述仿生普鲁士蓝纳米复合材料粒径为160nm～180nm。
2.根据权利要求1所述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将人源性红细胞膜与三阴性乳腺癌细胞膜超声破碎，在PBS溶液中搅拌反应融合制得仿生膜；
(2)将铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮溶解于HCl溶液中，经加热反应后，离心、水洗，得到普鲁士蓝分散液；
(3)将华蟾毒精加入普鲁士蓝分散液中混合搅拌反应，经离心分散后，得到负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料；
(4)将负载华蟾毒精的普鲁士蓝复合材料和仿生膜的PBS溶液在30～37℃温度下进行混合搅拌反应，经离心分散后得到负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料。
3.根据权利要求2所述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述红细胞膜和三阴性乳腺癌细胞膜的质量比为1:0.5～1，所述步骤(2)中，所述铁氰化钾与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1∶11～23，所述步骤(3)中，所述华蟾毒精和普鲁士蓝分散液的质量比为1∶10，所述步骤(4)中，所述仿生膜和所述负载华蟾毒精的普鲁士蓝纳米复合材料的质量比为1∶5～10。
4.根据权利要求2所述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述超声的功率为80W～100W，所述超声的时间为1min～2min所述搅拌反应的温度为30℃～37℃，所述搅拌反应的转速为500rpm～600rpm，所述搅拌反应的时间为2h～3h。
5.根据权利要求2所述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述加热反应的温度为75℃～85℃，所述加热反应的时间为18h～22h，所述加热反应采用油浴方式进行，所述离心的转速为10000rpm～13000rpm。
6.根据权利要求2所述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述搅拌反应的转速为500rpm～800rpm，所述搅拌反应的时间为10h～12h，所述离心的转速为10000rpm～13000rpm。
7.根据权利要求2所述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，所述搅拌反应的转速为500rpm～800rpm，所述搅拌反应的时间为2h～4h，所述离心的转速为10000rpm～13000rpm。
8.根据权利要求1所述负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料和/或按照权利要求2～7任意一项所述制备方法制备得到的负载华蟾毒精的仿生普鲁士蓝纳米复合材料在制备热/化疗/免疫治疗联合的肿瘤治疗药物中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 姜伟奇: "中药蟾酥活性成分抗肿瘤作用研究进展", 云南中医中药杂志, vol. 35, no. 9, 20 September 2014 (2014-09-20), pages 80 - 82 * |
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