JP2019527044A - 抗菌ペプチド誘導体及びその使用 - Google Patents

Abstract

疎水性修飾抗菌ペプチド及びその使用。疎水的修飾は、抗菌ペプチドの窒素末端に疎水性フラグメントを結合させることを含む。更に、疎水性修飾抗菌ペプチドから調製されたミセル、並びに抗菌薬、核酸トランスポーター、免疫アジュバント等の調製における疎水性修飾抗菌ペプチド及びミセルの使用を提供する。本発明の抗菌ペプチドは分子量が小さいため、Ｆｍｏｃ固相ポリペプチドによって都合よく合成することができ、化学合成法によって簡単且つ実行可能な方法で疎水性フラグメントに結合させることができる。

Description

本発明は生物医学の分野に関し、主に抗菌ペプチド誘導体及びその使用、特に疎水性修飾抗菌ペプチドＤＰ７誘導体及びその使用に関する。

抗菌ペプチドは、宿主防御ペプチド（ＨＤＰ）としても知られており、一般に１２〜１００個のアミノ酸残基から構成されており、その大部分は、正電荷を帯びた塩基性ポリペプチドである。抗菌ペプチドは、その広域スペクトル抗菌効果により、真菌、ウイルス、及び寄生虫等の病原体を効果的に阻害及び殺傷することができ、また、腫瘍細胞を選択的に殺傷することができる。更に、抗菌ペプチドは薬剤耐性を発現しにくいため、病原性微生物の侵入に対する宿主防御のための最初の障壁を構成し、体の免疫系の重要な構成要素である。抗菌ペプチドは、疾患の予防及び管理のための潜在的な薬物となり、抗生物質の代用として広範な開発の見込みがある。大きな適用可能性にもかかわらず、主にその安定性及び毒性のために、臨床的に広く使用されている抗菌ペプチドは僅かに過ぎない。いくつかの研究は、ナノ結晶化により抗菌ペプチドがより良い安定性を得、毒性を減らすことができることを示唆し、これは抗菌ペプチドの応用のための新しい研究方向を提供する。

抗菌ペプチド又はＨＤＰの免疫調節活性は、シグナル経路を変えることによるサイトカイン及びケモカインの産生誘導、食細胞を含むエフェクター細胞の直接的又は間接的な動員、細胞内及び細胞外細菌殺傷の増強、樹状細胞成熟及びマクロファージ分化の促進、並びに創傷修復及びアポトーシスの媒介を含め、ますます注目されている。多くの抗菌ペプチドは、その優れた免疫調節効果によりアジュバント活性を示し、これは主に生来の免疫応答を活性化し後天的免疫応答を媒介することによって達成される。

抗菌ペプチドＤＰ７は、より高い細菌認識特異性及びより強い抗菌活性を有する一種の抗菌ペプチドであり、コンピュータ援用設計に基づく新規抗菌ペプチドスクリーニング法に従ってテンプレート抗菌ペプチドＨＨ２（特許番号：特許文献１）の２つのアミノ酸を置換することによって得られる。研究では、抗菌ペプチドＤＰ７がＨＨ２よりも優れた抗菌活性を有し、赤血球の溶血毒性が低く、免疫調節活性が強いことが示されている。インビトロでの抗菌活性の研究では、抗菌ペプチドＤＰ７は明らかに細菌細胞壁を破壊し細胞膜を崩壊させることができ、従って抗菌機能を実現することができる。インビボでの抗菌活性の研究では、病原性黄色ブドウ球菌に感染したマウスの腹腔モデルから、ＤＰ７が免疫細胞を誘導して細菌を除去することにより非常に良好な治療効果を有することが分かった。しかしながら、高濃度のＤＰ７は、赤血球の溶血を引き起こし、静脈内注射による投与後にマウスを殺傷する可能性があり、これは、高濃度のＤＰ７が赤血球に対して有毒であり、赤血球を破壊する可能性があることを示す。ＤＰ７は、正電荷を帯びた親水性抗菌ペプチドであり、疎水性フラグメントで修飾して両親媒性化合物を得ることができ、この化合物は、ナノ粒子に自己集合することができ、静脈内投与の毒性を大幅に減少させ、インビボでその抗菌性及び免疫調節効果を維持し、小さな核酸薬のための送達システムとして機能する。従って、ＤＰ７は薬品分野で広く使用されている。

国際公開ＷＯ０８０２２４４４号公報

本発明の目的は、新規修飾抗菌ペプチド、抗感染治療のための新規且つ効果的な選択、新規免疫アジュバントの調製、及び当該分野におけるｓｉＲＮＡ担体の調製を提供することである。

上記の技術的問題を解決するために、本発明によって採用される技術スキームは、疎水性修飾抗菌ペプチドを提供することであり、疎水的修飾は、抗菌ペプチドの窒素末端に疎水性フラグメントを結合させること（又は窒素末端に疎水性化合物を結合させること）である。抗菌ペプチドＤＰ７のアミノ酸配列はＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ（配列番号１）である。構造がＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ−ＮＨ_２である場合、ＤＰ７のＣ末端は通常その安定性を改善するためにアミド化によって修飾される。

疎水性修飾抗菌ペプチドにおいて、疎水性化合物（疎水性フラグメント）はステロール化合物又は飽和直鎖脂肪酸である。好ましくは、ステロール化合物はコレステロール化合物又はコール酸化合物である。

疎水性修飾抗菌ペプチドにおいて、ステロール化合物は、スクシニル化コレステロール、コール酸、又はデオキシコール酸である。

疎水性修飾抗菌ペプチドにおいて、長鎖脂肪酸はＣ６〜Ｃ２０の脂肪酸である。好ましくは、飽和直鎖脂肪酸はＣ８〜Ｃ１８の少なくとも１つである。

疎水性修飾抗菌ペプチドにおいて、長鎖脂肪酸はステアリン酸（Ｃ１８）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ラウリン酸（Ｃ１２）、又はｎ−オクタン酸（Ｃ８）のうちの少なくとも１つである。

疎水性修飾抗菌ペプチドにおいて、抗菌ペプチドの窒素末端は、疎水性セグメント（疎水性化合物）の−ＣＯ−ＯＨと抗菌ペプチドの−ＮＨ_２とのアミド化反応によって、疎水性セグメント（疎水性化合物）に結合される。

疎水性修飾抗菌ペプチドにおいて、構造は、

であり、式中、Ｒはコレステロール化合物、コール酸、又は長鎖脂肪酸である。

疎水性修飾抗菌ペプチドにおいて、Ｒは、

である。

本発明は更に、疎水性修飾抗菌ペプチドから調製されたミセルを提供する。

ミセルは、溶液中で疎水性修飾抗菌ペプチドから自己集合する。

ミセルを凍結乾燥処理する。

ミセルに核酸、小分子薬、ポリペプチドまたはタンパク質のうちの少なくとも１つをさらに搭載する。

本発明は更に、疎水性修飾抗菌ペプチドを調製するための方法を提供し、工程は、
ａ ポリペプチドＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ−ＮＨ２を提供する工程と、
ｂ ポリペプチドＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ−ＮＨ２の窒素末端に疎水性フラグメントを結合させる工程と
を含む。

本発明は更に、抗菌薬の調製における疎水性修飾抗菌ペプチド又はミセルの使用を提供する。

抗菌薬の調製における使用では、抗菌剤は抗菌性又は抗真菌性である。

抗菌薬の調製における使用では、細菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｍｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、又はチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）のうちの少なくとも１つである。

抗菌薬の調製における使用では、真菌は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｉｄｉａ Ａｌｂｉｃａｎｓ）又はカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）のうちの少なくとも１つである。

本発明は、疎水性修飾抗菌ペプチド又はミセルを主たる有効成分とする抗菌薬を提供する。

更に、抗菌薬は他の抗菌薬を含む。

更に、他の抗菌薬は抗生物質である。

抗菌薬において、抗生物質は、グリコペプチド系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、及びβ−ラクタム系抗生物質のうちの少なくとも１つである。

抗菌薬において、β−ラクタム系抗生物質は、ペニシリン系抗生物質、又はセファロスポリン系抗生物質の少なくとも一方である。

更に、ペニシリン系抗生物質は、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、フルクロキサシリン、オキサシリン、アンピシリン、カルボキシベンジルペニシリン、ピバムピシリン、スルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、又はアモキシシリンのうちの少なくとも１つである。セファロスポリン系抗生物質は、セファドロキシル、セファレキシン、セファゾリン、セフラジン、セフプロジル、セフロキシム、セファクロル、セファマンドール、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフィキシム、セフジニル、セフピロム、セフェピム、又はセフゾナムのうちの少なくとも１つである。

抗菌薬において、アミノグリコシド系抗生物質は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネオマイシン、シソマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、リボザイム、ミクロノマイシン、又はアジスロマイシンのうちの少なくとも１つである。

抗菌薬において、ポリペプチド抗生物質は、バンコマイシン、ノルバンコマイシン、ポリミキシンＢ、又はテイコプラニンのうちの少なくとも１つである。

抗菌薬において、マクロライド系抗生物質は、エリスロマイシン、アルボマイシン、無臭エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、ジョサマイシン、又はアジスロマイシンのうちの少なくとも１つである。

更に、抗菌薬の剤形は注射剤である。

本発明は更に、免疫アジュバントの調製における疎水性修飾抗菌ペプチド又はミセルの使用を提供する。

本発明は更に、免疫アジュバント及び抗原として、疎水性修飾抗菌ペプチド又はミセルから調製された免疫アジュバントを提供する。

免疫アジュバントは、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）を更に含む。更に、疎水性修飾抗菌ペプチド対ＣｐＧ ＯＤＮの比は、１：０．５〜１：５である。

本発明は更に、核酸トランスポーターの調製における疎水性修飾抗菌ペプチド又はミセルの使用を提供する。

核酸トランスポーターの調製における使用では、核酸はＲＮＡである。

核酸トランスポーターの調製における使用では、核酸は、メッセージＲＮＡ、ＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、又はゲノム編集のためのｓｇＲＮＡ（低分子ガイドＲＮＡ）のものである。

本発明は更に、疎水性修飾抗菌ペプチド又はミセルに搭載された核酸によって得られる核酸トランスポーターを提供する。

核酸トランスポーターにおいて、核酸はＲＮＡである。

核酸トランスポーターにおいて、核酸はメッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、又はゲノム編集のためのｓｇＲＮＡ（低分子ガイドＲＮＡ）である。

核酸トランスポーターにおいて、疎水性修飾抗菌ペプチド対核酸の質量比は、１：１〜２０：１である。

本発明は更に、核酸トランスポーターの調製方法を提供し、方法は、
ａ．請求項１〜９のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチドの適切な量を秤量し、溶解するための溶液を添加し、自発的にミセルを形成する工程、又は溶液を形成するために請求項９〜１２のいずれか１項に記載のミセルを取る工程と、
ｂ．ミセル溶液に核酸を添加し、室温でインキュベートする工程と、
を含む。

抗菌ペプチドＤＰ７と疎水性フラグメントとの結合生成物は、凍結乾燥粉末の形態で保存することができ、使用時に滅菌水又は生理的食塩水に直接溶解することができる。

本発明の有益な効果としては、疎水性修飾抗菌ペプチドＤＰ７中の抗菌ペプチドＤＰ７は、分子量が小さいため、Ｆｍｏｃ固相ポリペプチド合成法によって都合よく合成することができ、化学合成法によってシンプル且つ簡単な方法で疎水性セグメントに結合させることができる。本発明の疎水性修飾抗菌ペプチドＤＰ７は、ミセルに自己集合し、より良好な単分散性及びゼータ電位を発現し、凍結乾燥及び再溶解後に安定を維持することができる。疎水性修飾抗菌ペプチドＤＰ７のミセルは、赤血球溶解に対する抗菌ペプチドＤＰ７の毒性を有意に減少させ、静脈内投与を実現することができる。インビトロでの極めて低い抗菌活性にもかかわらず、疎水性修飾抗菌ペプチドＤＰ７は、ゼブラフィッシュ及びマウスにおいて良好な抗菌活性を有する。インビボでの抗菌活性は、直接滅菌によってではなく、マクロファージ、単球、好中球、及び他のリンパ球を動員し、いくつかの免疫サイトカインの発現を調節して生物に免疫防御を与えることによって達成される。一方、疎水性修飾抗菌ペプチドＤＰ７は、標的抗原に対する高い免疫応答を誘導するための免疫アジュバントとしても使用され得る。更に、本発明の疎水性修飾抗菌ペプチドＤＰ７カチオン性ミセルは、ｓｉＲＮＡを効率的に合成し、それを結腸がん細胞及び黒色腫細胞等の腫瘍細胞に導入し、腹腔内注射、腫瘍内注射、及び尾静脈注射によって腫瘍組織の増殖を阻害し、高い安全性を示すことができる。

本発明に含まれる英語の略語は、
（１）バンコマイシン（ＶＡＮ）
である。

本発明に関与する菌株は、
（１）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）：ＡＴＣＣ ３３５９１、ＡＴＣＣ ２５９２３、
（２）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）：ＡＴＣＣ ２５９２２、
（３）緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）：ＡＴＣＣ １０１４５、ＡＴＣＣ １０１４５ＧＦＰ
である。

抗菌ペプチドＤＰ７及び疎水性フラグメント共役体を合成するための経路図である。 修飾ＤＰ７疎水性フラグメントのマススペクトルである。 コレステロール修飾ＤＰ７−Ｃのマススペクトルである。 ステアリン酸修飾ＤＰ７−ＳＡのマススペクトルである。 ＤＰ７−Ｃミセルの自己集合及び臨界ミセル濃度の測定である。 ＤＰ７−Ｃミセルの自己集合の概略図である。 ＤＰ７−Ｃミセルの臨界ミセル濃度の測定である。 ＤＰ７−Ｃミセルの物理的特性である。 粒径である。 ゼータ電位である。 原子間力顕微鏡写真である。 外観である。 インビトロでのＤＰ７およびＤＰ７−Ｃミセルの溶血活性の比較である。 ヘモグロビン測定の曲線グラフである。 溶血試験の外観である。 インビボでのＤＰ７−Ｃの抗菌活性を示す。 緑膿菌に感染したゼブラフィッシュの腹腔の全体的な蛍光図（モデル）である。 蛍光グレー積分の概略図である。 黄色ブドウ球菌に感染したマウスの腹腔のコロニー数の概略図（モデル）である。 ＤＰ７−Ｃのインビボでの抗菌メカニズムの研究を示す。 ＤＰ７−Ｃ刺激後の腹腔内の単核球及び好中球の試験フローパターンである。 ＤＰ７−Ｃ刺激後の腹腔内マクロファージの試験フローパターンである。 ＤＰ７−Ｃ刺激後の腹腔内の全細胞、マクロファージ、好中球、及び単球の数を比較する概略図である。 ＤＰ７−ＣがＰＢＭＣを刺激した後にＱ−ＰＣＲによって試験した免疫関連サイトカインの発現の比較である。 ＤＰ７−ＣをＬＰＳと組み合わせてＰＢＭＣを刺激した後にＱ−ＰＣＲによって試験した免疫関連サイトカインの発現の比較である。 ＤＰ７−Ｃ／ＣｐＧ複合体の免疫効果の試験を示す。 ５週目の異なる免疫群の抗ＯＶＡ抗体力価の概略図である。 予防モデルにおけるマウスの各群における腫瘍の成長曲線である。 予防モデルにおけるマウスの生存期間の変化である。 治療モデルにおけるマウスの各群における腫瘍の成長曲線である。 ＤＰ７−Ｃによる樹状細胞の成熟促進実験である。 ＤＰ７−ＣによるＯＶＡ抗原のＤＣ取り込み促進実験である。 ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ複合体による先天性免疫応答の刺激実験である。 ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ複合体による細胞性免疫応答の刺激実験である。 ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃアジュバントによる高効率抗腫瘍免疫の刺激実験である。 ＤＰ７−Ｃミセル／ｓｉＲＮＡ複合体の電子顕微鏡形態である。 ＤＰ７−Ｃミセルである。 ＤＰ７−Ｃ／ｓｉＲＮＡ複合体である。 ｓｉＲＮＡを担持するＤＰ７−Ｃのインビトロでのトランスフェクション効率の試験を示す。 腫瘍細胞をトランスフェクトするｓｉＲＮＡを担持するＤＰ７−ＣとＰＥＩ２５Ｋ及びリポフェクタミン２０００との比較である。 フローサイトメトリーによって試験したＢ１６細胞のトランスフェクション効率の概略図である。 フローサイトメトリーによって試験したＣ２６細胞のトランスフェクション効率の概略図である。 ＤＰ７−Ｃの細胞毒性アッセイ（ＣＣＫ−８法）を示す。 ＤＰ７−Ｃ伝達ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡで処理した腹腔における転移性結腸癌のＣ２６マウスモデルである。 ＤＰ７−Ｃ伝達ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡで処理したＣ２６マウス結腸癌皮下移植腫瘍モデルである。 ＤＰ７−Ｃ伝達ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡで処理した肺の転移性黒色腫のＢ１６マウスモデルである。

ＤＰ７は、正電荷を帯びた親水性抗菌ペプチドであり、一般的にはＣ末端アミド化によって修飾される。本発明の実施形態において使用されるＤＰ７は、ＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ−ＮＨ_２である。コレステロール、コール酸、及び長鎖脂肪酸等の疎水性フラグメント（又は疎水性化合物）は、親水性ポリペプチドに結合されてもよく、ナノ構造に自己集合してもよい。本研究では、抗菌ペプチドＤＰ７は、疎水性フラグメントとの結合によってナノ結晶化し、それによってその安定性が増加し、溶血毒性が減少し、その静脈内投与が実現された。その直接的な抗菌効果及び免疫調節効果により、疎水性修飾ＤＰ７によって形成されたナノ粒子は抗感染効果を有する。

抗菌ペプチドＤＰ７は、良好な免疫調節活性を有し、生来の免疫応答を媒介することができ、これによりワクチンのための免疫アジュバントとなる。抗原との同時免疫は、宿主の細胞性免疫を増強し、抗原特異的免疫グロブリンの産生を媒介し得る。研究結果は、疎水性抗菌ペプチドが良好なアジュバント特性を示すことを示している。インビトロ試験中に、疎水性修飾ＤＰ７はナノ粒子に自己集合し、静電相互作用を介してＣｐＧを吸収することによって新しい免疫アジュバントとして作用し、抗原提示細胞による抗原取り込みを増強し、抗原提示細胞の成熟及びサイトカインの発現を促進することができる。動物腫瘍モデル試験において、疎水性修飾ＤＰ７／ＣｐＧ複合体は腫瘍を接種したマウスの生存期間を延長し、腫瘍の増殖を有意に阻害し、抗原特異的抗体のレベルを増強した。

一方、ＤＰ７が正電荷を帯びているため、自己集合によって形成された疎水性修飾ＤＰ７ミセルも水溶液中で正電荷を帯び、非ウイルス遺伝子伝達ベクター、特にｓｉＲＮＡ伝達ベクターとしての可能性を示す。腫瘍標的に対するｓｉＲＮＡサイレンシングと組み合わせて、疎水性修飾ＤＰ７は、ｓｉＲＮＡベースの腫瘍治療の研究と応用において重要な役割を果たすであろう。

現在、疎水性フラグメントと水溶性ペプチドとの結合によるナノ粒子の形成について多くの研究が行われているが、疎水性フラグメントと抗菌ペプチドとの結合に関する報告はなされていない。抗菌効果及び免疫調節効果並びに疎水性フラグメントと抗菌ペプチドとの結合のメカニズムが研究されるべきである。研究では、ＤＰ７−Ｃ共役体によって形成されたカチオン性ミセルは、腫瘍細胞への効率的なｓｉＲＮＡ導入をうまく実現し、様々な腫瘍モデルの増殖を効果的に阻害して新しいｓｉＲＮＡトランスファーベクターを得た。現在、抗菌ペプチド共役体に基づく遺伝子トランスファーベクターは報告されていない。

本発明を、図面及び実施形態と組み合わせて詳細に説明する。これらの実施例は、限定ではなく、本発明の技術的スキームを説明するための例示に過ぎないとみなされることを理解すべきである。

実施例１；抗菌ペプチドＤＰ７及びコレステロール共役体（ＤＰ７−Ｃ）の合成

抗菌ペプチドＤＰ７及び疎水性フラグメント共役体を図１に示すような合成経路によって合成し、ここで疎水性フラグメントはコレステロール、コール酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びラウリン酸を含む。

塩化２−クロロトリチル樹脂；Ｆｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂、４−（２’、４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル−アミノメチル）−フェノキシル−アセトアミド−メチルベンズヒドリルアミン樹脂；Ｆｍｏｃ、フルオレニルメトキシカルボニル；ｐｂｆ、ｔｂｕ、Ｏｔｂｕ、Ｔｒｔ、及びＢｏｃは全て、それぞれ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル、第三級ブチル、ｔｅｒｔ−ブトキシ、トリフェニルメチル、ｔ−ブチルオキシカルボリルと名付けられた保護基である。

具体的な合成方法は以下の通りである。

１．樹脂の膨潤活性化及び脱保護

膨潤度：Ｒｉｎｋ ＭＢＨＡ（４−（２’、４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル−アミノメチル）−フェノキシル−アセトアミド−メチルベンズヒドリルアミン樹脂）樹脂（置換値：０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）１．０ｇを秤量し、ポリペプチド合成装置の反応容器に入れ、膨潤活性化をＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で行い、反応容器を上下に振盪して樹脂を完全に膨潤させ、膨潤プロセスの約２０分後に溶媒を除去する。

脱保護：１５ｍｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド）溶液を用いて、樹脂からＦｍｏｃ保護基を除去し、１５分の反応後、樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦ（ジクロロメタン／Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド）で３回交互に洗浄し、少量の樹脂をメタノール／ＤＣＭ／ＤＭＦで順次洗浄し、次いで５％ニンヒドリンを含有する無水エタノール溶液を満たしたＥＰチューブに添加し、樹脂が青色に変わるまで（即ち、陽性反応）チューブを沸騰水に３分間浸し、次いで２回洗浄して、次の反応を続けるか、あるいは脱保護工程を続ける。

２．最初のアミノ酸（Ｌｙｓ）の結合

Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．４４ｍｍｏｌ、０．９３ｇ、４当量）を秤量し、ＤＭＦ（約５ｍｌ）に溶解した後に反応容器に入れ、５ｍｌのＨＢＴｕ（ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−トラメチルウロニウムヘキサフルオホスファート）（１．４４ｍｍｏｌ、０．５４ｇ、４当量）及び５ｍＬのＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）（２．８８ｍｍｏｌ、０．４７４ｍＬ、８当量）をＤＭＦ溶液に添加し、最後に５ｍｌのＤＭＦを補充して反応を開始させた。反応容器を５０分間上下に振盪し、反応液を取り除く。少量の樹脂をＣＨ_３ＯＨ／ＤＣＭ／ＤＭＦで順番に洗浄し、５％ニンヒドリンを含む無水エタノール溶液を満たしたＥＰチューブに加える。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、即ち反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に３分間浸す。その後、反応容器内の樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦで３回交互に洗浄し、溶媒を除去して次の反応を行う。樹脂が濃青色又は赤褐色に変わった場合、反応は完了しておらず、縮合反応を繰り返す必要がある。しかし、縮合反応を行うのは容易であるため、一般的には完了している。この工程で使用される原材料は、Ｆｍｏｃに結合したＭＢＨＡ樹脂によって修飾されたＲｉｎｋアミンリンカーを含むＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂である。本発明では、置換度は０．３６ｍｍｏｌ／ｇであるが、他の置換度も同じ又は類似の技術的効果を達成することができ、それらも本発明の範囲内である。本発明で用いられる置換度０．３６ｍｍｏｌ／ｇは、合成フラグメントの収率、純度、樹脂利用率等の諸要因をバランスさせて得られる最良の値である。

３．アミノ酸鎖の延長

工程２で得られたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＭＢＨＡ樹脂からＦｍｏｃを除去した後、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート及びＮ、Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミンを添加し、それらを窒素保護下で反応させてＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＭＢＨＡ樹脂を得る。次に、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨを同じ方法に従って、順に接続する。

上記の合成により、完全に保護されたＤＰ７配列ペプチドが得られる。

４．アセチル化ブロッキング

縮合反応が理想的ではない場合、ペプチドが失われたために後続の反応に影響を及ぼさないように、一般に以下の工程が必要である。遊離アミノ基に対してアセチル化ブロッキングを行い、樹脂で満たした反応容器に調製ブロッキング溶液（無水酢酸：ピリジン：ＤＭＦ：３：３：４）を加え、反応容器を上下に約２０分間振盪し、ニンヒドリンで試験する。樹脂が黄色に変わったら、反応は完了しており、次の反応を実施することができる。ブロッキングが不完全である場合には、ブロッキング時間を長くするか、又はブロッキング溶液の比率を調整して反応をできるだけ完全にする必要がある。

５．ＤＰ７の疎水性修飾

１）スクシニル化コレステロールによるＤＰ７の疎水性修飾

０．６７ｇ（１．４４ｍｍｏｌ、４．０当量）のスクシニル化コレステロールを秤量し、ＤＣＭ（約１０ｍｌ）に溶解し、反応容器に加えた。次に、５ｍＬのＨＢＴｕ（１．４４ｍｍｏｌ、０．５４ｇ、４当量）及びＤＩＥＡ（２．８８ｍｍｏｌ、０．４７４ｍＬ、８当量）をＤＭＦ溶液にそれぞれ添加した。反応容器を５０分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の樹脂をＣＨ_３ＯＨ／ＤＣＭ／ＤＭＦで順番に洗浄し、次いで５％ニンヒドリンを含む無水エタノール溶液を満たしたＥＰチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、即ち、反応が完了したことを示す陽性反応になるまで、チューブを沸騰水に３分間浸した。その後、反応容器内の樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦで３回交互に洗浄し、溶媒を除去した。得られた樹脂を、ライセートを満たした反応容器に入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固定して反応させた。約２時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をＤＣＭで数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりＴＦＡ及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速（４０００ｒ／分）で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をＨＰＬＣで更に精製し不純物を取り除いて標的生成物、即ち、コレステロール含有ＤＰ７（ＤＰ７−Ｃ）を得た。その質量スペクトルを図２Ａに示し、測定された分子量は予想通りである。

２）コール酸によるＤＰ７の疎水性修飾

０．５９ｇ（１．４４ｍｍｏｌ、４．０当量）のコール酸を秤量し、ＤＣＭ（約１０ｍｌ）に溶解し、反応容器に入れ、次いで５ｍｌのＨＢＴＵ（１．４４ｍｍｏｌ、０．５４ｇ、４当量）及びＤＩＥＡ（２．８８ｍｍｏｌ、０．４７４ｍｌ、８当量）をそれぞれＤＭＦ溶液中に加えた。反応容器を５０分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の樹脂をＣＨ_３ＯＨ／ＤＣＭ／ＤＭＦで順番に洗浄し、次いで５％ニンヒドリンを含む無水エタノール溶液を満たしたＥＰチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、即ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に３分間浸した。その後、反応容器内の樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦで３回交互に洗浄し、溶媒を除去した。ライセートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固定して反応させた。約２時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をＤＣＭで数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりＴＦＡ及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速（４０００ｒ／分）で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をＨＰＬＣで更に精製し不純物を取り除いて標的生成物、即ち、コレステロールＤＰ７（ＤＰ７−ＣＡ）を得た。

３）ステアリン酸によるＤＰ７の疎水性変性

０．４１ｇ（１．４４ｍｍｏｌ、４．０当量）のステアリン酸を秤量し、ＤＣＭ（約１０ｍｌ）に溶解し、反応容器に入れ、次いで５ｍｌのＨＢＴＵ（１．４４ｍｍｏｌ、０．５４ｇ、４当量）及びＤＩＥＡ（２．８８ｍｍｏｌ、０．４７４ｍｌ、８当量）をそれぞれＤＭＦ溶液中に加えた。反応容器を５０分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の樹脂をＣＨ_３ＯＨ／ＤＣＭ／ＤＭＦで順番に洗浄し、次いで５％ニンヒドリンを含む無水エタノール溶液を満たしたＥＰチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、即ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に３分間浸した。その後、反応容器内の樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦで３回交互に洗浄し、溶媒を除去した。ライセートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固定して反応させた。約２時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をＤＣＭで数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりＴＦＡ及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速（４０００ｒ／分）で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をＨＰＬＣで更に精製し不純物を取り除いて標的生成物、即ち、ステアリン酸ＤＰ７（ＤＰ７−ＳＡ）を得た。その質量スペクトルが図２Ｂに示されており、測定された分子量は予想通りである。

４）パルミチン酸によるＤＰ７の疎水性修飾

パルミチン酸０．３７ｇ（１．４４ｍｍｏｌ、４．０当量）を秤量し、ＤＣＭ（約１０ｍｌ）に溶解し、反応容器に入れ、次いで５ｍｌのＨＢＴＵ（１．４４ｍｍｏｌ、０．５４ｇ、４当量）及びＤＩＥＡ（２．８８ｍｍｏｌ、０．４７４ｍｌ、８当量）をそれぞれＤＭＦ溶液中に加えた。反応容器を５０分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の樹脂をＣＨ_３ＯＨ／ＤＣＭ／ＤＭＦで順番に洗浄し、次いで５％ニンヒドリンを含む無水エタノール溶液を満たしたＥＰチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、即ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に３分間浸した。その後、反応容器内の樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦで３回交互に洗浄し、溶媒を除去した。ライセートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固定して反応させた。約２時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をＤＣＭで数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりＴＦＡ及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速（４０００ｒ／分）で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をＨＰＬＣで更に精製し不純物を取り除いて標的生成物、即ち、パルミチン酸ＤＰ７（ＤＰ７−ＰＡ）を得た。

５）ソフトラウリン酸によるＤＰ７の疎水性修飾

０．２９ｇ（１．４４ｍｍｏｌ、４．０当量）のラウリン酸を秤量し、ＤＣＭ（約１０ｍｌ）に溶解し、反応容器に入れ、次いで５ｍｌのＨＢＴＵ（１．４４ｍｍｏｌ、０．５４ｇ、４当量）及びＤＩＥＡ（２．８８ｍｍｏｌ、０．４７４ｍｌ、８当量）をそれぞれＤＭＦ溶液中に加えた。反応容器を５０分間上下に振盪し、反応液を取り除いた。少量の樹脂をＣＨ_３ＯＨ／ＤＣＭ／ＤＭＦで順番に洗浄し、次いで５％ニンヒドリンを含む無水エタノール溶液を満たしたＥＰチューブに加えた。樹脂が黄色又は淡青色に変わるまで、即ち、反応が完了したことを示す陰性反応になるまで、チューブを沸騰水に３分間浸した。その後、反応容器内の樹脂をＤＣＭ／ＤＭＦで３回交互に洗浄し、溶媒を除去した。ライセートを満たした反応容器に得られた樹脂を入れ、反応容器を密閉し、クレードルに固定して反応させた。約２時間の反応過程の後、樹脂を濾過により除去し、樹脂をＤＣＭで数回洗浄し、濾液を回収し、回転蒸発によりＴＦＡ及び溶媒を除去し、残りの液体に氷の無水エーテルを添加して白色の綿状沈殿物を大量に生成し、この白色沈殿物を高速（４０００ｒ／分）で遠心分離して粗生成物を得た。粗生成物をＨＰＬＣで更に精製し不純物を取り除いて標的生成物、即ち、ソフトラウリン酸ＤＰ７（ＤＰ７−ＤＡ）を得た。

固相ペプチド合成技術はほぼ成熟しており、抗菌ペプチドＤＰ７と疎水性フラグメントとの共役体も関連会社によって合成され得る。例えば、スクシニル化コレステロールで修飾されたＤＰ７−Ｃ（Ｃｈｏｌ−ｓｕｃ−ＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ−ＮＨ_２）は、固相ペプチド合成法に基づいてＳｈａｎｇｈａｉ Ｋｅｔａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄにより合成される。合成されたＤＰ７−ＣはＨＰＬＣによって精製され、純度は９５％以上であり、ＤＰ７−Ｃの分子量はＭＳによって決定される。合成したポリペプチドは−２０℃で保存し、ＭｉｌｌＱ水で５ｍｇ／ｍｌの母液に調製して使用する。固相ペプチド合成法によって合成されたＤＰ７−Ｃ（Ｃｈｏｌ−ｓｕｃ−ＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ−ＮＨ_２）において、Ｎ末端はＤＰ７に基づいてエステル結合を介して疎水性コレステロールに結合され、Ｃ末端は保護のための分子−ＮＨ_２に結合される。ＤＰ７−Ｃの質量分析図を図２に示す。その分子量は１９９１．３４０８であり、ＭＳ上の主ピークは９９６．１７４８であり、これは正しいＤＰ７−Ｃが合成されたことを示す。

実験により、上記で調製された疎水性修飾ＤＰ７が類似の性質を有することが示されているため、以下の実施例は、コレステロールＤＰ７（ＤＰ７−Ｃ）と組み合わせて詳細に記載されている。

実施例２；ＤＰ７−Ｃの臨界ミセル濃度

ＤＰ７−Ｃは、水溶液中でミセルに自己集合することができる。ピレン蛍光プローブ分光法により、ＤＰ７−Ｃの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を検出した。

ピレンは水に不溶であり、水への溶解度は約６×１０^−７ｍｏｌ／Ｌであるが、エタノールやジエチルエーテルには容易に溶解する。水溶液中のピレンの蛍光発光スペクトルは５つの蛍光ピークを有し、水溶液中の第１発光スペクトル光強度Ｉ１と第３発光スペクトル光強度Ｉ３との比（３７３ｎｍと３８４ｎｍの蛍光強度の比）は約１．８である。文献によれば、界面活性剤は非極性有機化合物を可溶化し得、異なる濃度の界面活性剤はピレンを様々な程度に可溶化し得る。従って、溶液の可溶化能力は、界面活性剤の濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超えた後に明らかな変異点を有するであろう。界面活性剤濃度によるＩ１／Ｉ３の変化に従って曲線が描かれる場合、曲線変異の中点は試験される基質のＣＭＣである。従って、溶液中のピレンのＣＭＣは、異なる濃度のＤＰ７−Ｃ溶液中のピレンの蛍光スペクトルを測定することによって決定することができる。ＣＭＣの検出方法：ＤＰ７−Ｃを秤量し、３７℃の水浴中でＭｉｌｌｉｑ水に溶解し、濃度１．５ｍｇ／ｍＬのＤＰ７−Ｃ母液を得た。溶媒としてメタノールを使用して６×１０^−５ｍｏｌ／Ｌのピレン溶液を調製した。メタノールを揮発させ、換気の良い暗い場所で乾燥させた後、１．５ｍｇ／ｍＬのＤＰ７−Ｃ溶液を４ｍＬ加え、３７℃で４時間超音波処理し、クレードル上で８時間振盪した。その後、蛍光分光光度計でＩ１とＩ３を検出した。微量のピレンを含むＢＤチューブに、それぞれ０．０００１、０．００１、０．０１、０．０２５、０．０５、０．１０、０．１２５、０．２５、０．５、１．０、及び１．５ｍｇ／ｍｌの濃度に達するように、異なる量の試料母液を加え、各溶液の蛍光スペクトルを決定した。臨界ミセル濃度は蛍光スペクトルに従って計算することができ、ここで蛍光走査の励起波長は３３４ｎｍであり、発光波長は３７３ｎｍ及び３８４ｎｍであり、励起スリットは８．０ｎｍに設定し、発光スリットは２．５ｎｍに設定し、走査速度は１２００ｎｍ／分である。

図３Ａは、水溶液中でミセルに自己集合したＤＰ７−Ｃの概略図であり、そのＣＭＣ測定値は３．４７μｇ／ｍＬである（結果については図３Ｂを参照）。

実施例３；ＤＰ７−Ｃミセルの物理的特性

原子間力顕微鏡とＭａｌｖｉｎ粒度計により、ＤＰ７−Ｃミセルの粒度及びゼータ電位等のいくつかの物理的特性を検出した。

１．原子間力顕微鏡写真：異なる濃度のＤＰ７−Ｃ溶液を調製し、マイカシートに滴加して自然乾燥させた。ＤＰ７−Ｃでコーティングしたマイカシートを原子間力顕微鏡に置き、写真を撮影した。
２．粒径とゼータ電位の検出：ＤＰ７−ＣをＭｉｌｌｉｑ水に溶解し、Ｍａｌｖｉｎ粒度計で粒径とゼータ電位を測定し、各試料を４回検出して平均値を得た。
３．ＤＰ７−Ｃの外観と溶液状態：ＭｉｌｌｉＱ水、ＤＰ７−Ｃ水溶液、及び凍結乾燥粉末の外観を観察し、カメラで写真を撮影した。ここで、ａはＭｉｌｌｉＱ水、ｂは水溶液に溶解したＤＰ７−Ｃ、Ｃは再溶解後のＤＰ７−Ｃ凍結乾燥粉末の状態、ｄはＤＰ７−Ｃ凍結乾燥粉末の形状及び色である。

結果を図４に示す。具体的には、ＤＰ７−Ｃミセルは球形又は楕円形であり（図４Ｃ）、ＤＰ７−Ｃミセルの粒径は約２４．３±１．５ｎｍであり（図４Ａ）、ゼータ電位は約２８．８±０．２７ｍＶである（図４Ｂ）。ＤＰ７−Ｃ凍結乾燥粉末は、白色の綿毛状であり、水に溶けて無色透明である。

実施例４；ＤＰ７及びＤＰ７−Ｃミセルのインビトロでの溶血活性

溶血試験では、赤血球の溶血について、同じ濃度のＤＰ７及びＤＰ７−Ｃが検出された。

１．健康な志願者の血液を取り、抗凝固チューブに入れて静かに混ぜた。
２．抗凝固剤を取り出し、等尺性生理食塩水を加え、ゆっくりと均一に混ぜ合わせ、４００×ｇで１０分間遠心し、上清を捨てた。
３．赤血球をゆっくり混合してＰＢＳで洗浄し、４００×ｇで１０分間遠心し、上清を捨て、細胞沈殿物をＰＢＳで３回洗浄した。
４．ＰＢＳで希釈して２０％（ｖ／ｖ）の赤血球溶液を得、これはすぐに使用するか、又は４℃で約２週間保存することができる（溶血なし）。
５．薬物をＰＢＳで一連の濃度勾配に希釈し、１００μＬの薬物を９６ウェルプレートに加え、１００μＬの２％Ｔｗａｉｎ ２０を陽性対照として取り、１００μＬのＰＢＳを陰性対照に加えた。この過程を各濃度の薬物について３回繰り返した。
６．２０：１の体積比に従って２０％（ｖ／ｖ）の赤血球溶液をＰＢＳで希釈し、均一に混合し、それぞれ１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１６００μｇ／ｍＬの薬物濃度で９６ウェルプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。
７．薬物と赤血球の混合液をインキュベートし、９００×ｇで１０分間遠心し、１６０μＬの上清を新しい９６ウェルプレートに加え、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度の値を読んだ。
８．Ａ４５０の吸光度の値に基づいて、薬物の各濃度に対応する溶血の割合を計算した。

溶血率の計算式は、

である。

溶血試験の結果を図５Ａに示す。薬物濃度が０．８ｍｇ／ｍＬを超えると、赤血球に対するＤＰ７−Ｃミセルの溶解度はＤＰ７よりもはるかに低く、これは、抗菌ペプチドＤＰ７が、コレステロールと結合して赤血球に対する毒性を大幅に低減することができることを示している。図５Ｂは、異なる条件下での赤血球の溶血を視覚的に示す。具体的には、陰性対照群（ＰＢＳ）（群ａ）では溶血は観察されず、赤血球は容器の底に沈降する。陽性対照群（２％Ｔｗｅｅｎ−２０）（群ｂ）及びＤＰ７溶液群（群ｃ）では、赤血球は溶解する。ＤＰ７−Ｃミセル（群ｄ）では、赤血球は溶解されないが、ミセルの特徴により溶液中に均一に懸濁する。

実施例５；ＤＰ７−Ｃのインビボでの抗菌活性

従来の実験では、コレステロール含有ＤＰ７−Ｃミセルがインビトロで低い抗菌活性を有することが示されている（複数の菌株においてＭＩＣ＞１０２４ｍｇ／Ｌ）。本発明者らは更に、インビボで腹腔内感染マウス及びゼブラフィッシュモデルの抗菌活性を検出した。

（Ｉ）マウスにおけるＤＰ７−Ｃの抗菌活性の検出（グラム陽性菌−黄色ブドウ球菌）

ＤＰ７−Ｃの抗感染活性を腹腔内感染モデルによって決定した。実験群は、
ＮＳ群：マウス１匹あたり通常生理食塩水１００μＬ、
ＤＰ７−Ｃ群：０．３ｍｇ／ｋｇ、
ＶＡＮ陽性対照群：１０ｍｇ／ｋｇ
とした。

実験手順は次の通りである。
（１）実験前日に黄色ブドウ球菌３３５９１をＭＨＢで活性化し、実験当日に活性化株を通常生理食塩水で２回洗浄し、後で使用するために細菌液の濃度を測定した。
（２）腹部感染マウスモデルを確立するために、１．５×１０^８ｃｆｕ／０．５ｍＬの細菌溶液を各マウスに腹腔内注射した。
（３）１時間の感染後、群ごとに０．１ｍＬ／マウスで薬物を静脈内注射した。
（４）２４時間後、５ｍＬの通常生理食塩水をマウスに腹腔内注射し、腹部を軽くマッサージし、マウスを屠殺し、７５％アルコールで消毒した。５分後、腹腔上皮をはさみで切り、腹腔に小さな開口部を作り、１ｍｌの注射器で開口部からできるだけ多くの腹水を引き、次に、混合するために滅菌ＥＰチューブに移した。
（５）通常生理食塩水で例えば１０倍、１００倍、１０００倍、及び１００００倍の希釈度で希釈し、各々２０μＬの適切な濃度の３つの細菌性溶液を取り、ＭＨＡプレートにコーティングし、バクテリアインキュベーターで一晩インキュベートした。
（６）２０〜２００コロニーを有するプレートを選択し、腹水５ｍＬ中のｍＬあたりの細菌の量を変換し計算した。

腹部感染マウスモデルの処理におけるＤＰ７−Ｃの治療成績を図６Ｃに示す。結果は、静脈内投与後のＤＰ７−Ｃ群（１ｍｇ／ｋｇ）及び陽性薬物群（２０ｍｇ／ｋｇ ＶＡＮ）における黄色ブドウ球菌の平均コロニー形成単位（ＣＦＵ）が、ＮＳ群よりも有意に低いことを示した（ｐ＜０．０１）。また、ＤＰ７−Ｃ群の抗菌効果は、陽性薬物群と基本的に同じであり、統計的な差異はない。このことは、ＤＰ７−Ｃが全身感染マウスモデルにおいて良好な抗菌活性を有することを示す。

（ＩＩ）ゼブラフィッシュ（グラム陰性菌−緑膿菌）におけるＤＰ７−Ｃの抗菌活性

次に、ＤＰ７−Ｃの抗感染効果をさらに検証するために、蛍光を含む緑膿菌（ＰＡＯ１−ＧＦＰ）を介して腹部感染ゼブラフィッシュモデルを確立した。

交配及び繁殖手順に従って、雄と雌のＡＢ野生ゼブラフィッシュを交配した。産卵後、卵を集め、２８℃のインキュベーターに入れ、ＰＴＵを含む海水中でインキュベートした。ＰＴＵを含む海水は一日一回交換した。ゼブラフィッシュを４８時間インキュベートした時に、ＤＰ７−Ｃと通常生理食塩水で希釈した蛍光を有する緑膿菌（ＰＡＯ１−ＧＦＰ）を腹腔内注射し、蛍光顕微鏡下で３時間、８時間、及び１８時間目に写真を撮影して、ゼブラフィッシュの腹部内のＰＡＯ１−ＧＦＰの成長を観察した。

結果を図６（Ａ、Ｂ）に示す。ゼブラフィッシュ腹腔内のＰＡＯ１−ＧＦＰの成長率は緑色蛍光の全強度と正の相関があり、ＤＰ７−Ｃ群のＰＡＯ１−ＧＦＰの成長率はＮＳ群よりもはるかに低く、低濃度（１ｍｇ／ｍＬ）のＤＰ７−Ｃミセルが、ゼブラフィッシュにおいて良好な抗菌活性を有することを示す。

実施例６；ＤＰ７−Ｃのインビボ抗菌メカニズムに関する研究

ＤＰ７−Ｃ抗菌活性の検出中に、ＤＰ７−Ｃは低いインビトロ抗菌活性を有するが、高いインビボ抗菌活性を有することが見出された。考えられる理由は、ＤＰ７−Ｃが生物の免疫系を調節することによって抗菌効果を達成したことにある。細胞レベルとサイトカインレベルから免疫機能に対するＤＰ７−Ｃの効果を検出した。

（Ｉ）活性化された免疫関連細胞の検出
分類：マウスを各群５匹の２群（ＮＳ群及びＤＰ７−Ｃ群）に無作為に分ける。検出された免疫細胞及びそれらの表面マーカーを以下の表に示す。

ＤＰ７−Ｃ群の各マウスには２００μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＤＰ７−Ｃを投与し、ＮＳ群の各マウスには２００μＬの通常生理食塩水を注射した。両群のマウスを２４時間後に屠殺した。各マウスに５ｍＬの通常生理食塩水を腹腔内注射した。腹部を穏やかにマッサージすることによって腹腔内の腹水を吸引して、腹水中の細胞濃度及び全細胞数を計算した。腹水のリンパ球分類をフローサイトメトリーにより検出し、全細胞中のマクロファージ、好中球、及び炎症性単球の割合を分析し、フローサイトメトリーの結果及び腹水中の細胞の総数に従って、マクロファージ、好中球、及び炎症性単球の数を計算した。

結果を図７Ｃに示す。マウスにＤＰ７−Ｃを腹腔内注射した後、腹腔内の細胞の総数は有意に増加し、マクロファージ、好中球、及び単球の数は有意に異なる。特に、単球の割合は２．７％から３２．８％に増加し（図７Ａ）、マクロファージの割合は３８．８％から５０．８％に増加した（図７Ｂ）。

（ＩＩ）免疫関連サイトカインの測定
ＤＰ７−Ｃ刺激後のマウスＰＢＭＣ中のサイトカインの変化を決定するために、単離したマウスＰＢＭＣを１×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、６ウェルプレートに２ｍｌ／ウェルで加え、ＤＰ７−Ｃの刺激濃度は２００μｇ／ｍｌ、刺激時間は４時間とした。刺激後、細胞を集めて−８０℃の冷蔵庫に保存した。一方、ＤＰ７−ＣがＬＰＳ誘発炎症反応を逆転させることができるかどうかを検証するために、ＬＰＳと共にＰＢＭＣを刺激するように実験を設定した。ＰＢＭＣを１×１０^６細胞／ｍｌに希釈し、６ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルで加え、ＤＰ７−Ｃの刺激濃度を２００μｇ／ｍＬとし、１時間後、ＬＰＳで４時間刺激し、細胞を集め、−８０℃の冷蔵庫に保存した。全てのサンプルを収集した後、遠心分離、洗浄、全ＲＮＡ抽出、逆転写、及びリアルタイム定量的ＰＣＲを含むその後の工程を行った。

ＤＰ７−Ｃによって刺激されたＰＢＭＣに関連するサイトカインの発現を図７Ｄに示す。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、及び免疫活性化に関連する他のサイトカインの発現は大幅に増加している。一方、ＤＰ７−ＣとＬＰＳが共にＰＢＭＣを刺激すると、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−α等のサイトカインストームに関連する主要なサイトカインの遺伝子発現が有意に減少することがわかった。これは、ＤＰ７−Ｃが敗血症及び他の関連する感染症によって引き起こされる損傷の程度を軽減できることを示している。

実施例７；免疫アジュバントとしてのＤＰ７−Ｃに関する研究

従来の試験では、ＤＰ７−ＣがマウスＰＢＭＣにおける免疫関連サイトカインの発現を有意に上方制御できることがわかった。従って、ＣｐＧ ＯＤＮと組み合わせたＤＰ７−Ｃは新規免疫アジュバントとして使用することができ、且つＤＰ７−Ｃは自発的にミセルを形成することができることが予測され、これはまた、ＤＰ７−Ｃをアルミニウムアジュバントの可能性のある代替物として使用することを本発明者らに想起させる。本研究において、本発明者らは、モデル抗原としてＯＶＡを採用することによって、ＤＰ７−Ｃ／ＣｐＧ複合体アジュバントの免疫調節効果、並びにマウスの予防的及び治療的腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果を研究した。

（１）動物の分類：
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスを、各群１０匹の４群に無作為に分け、
ＮＳ群：通常生理食塩水１００μＬ、
ＣｐＧ群：１０μｇのＯＶＡ＋２０μｇのＣｐＧ、
ＤＰ７−Ｃ群：１０μｇのＯＶＡ＋４０μｇのＤＰ７−Ｃ、
ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ群：１０μｇのＯＶＡ＋４０μｇのＤＰ７−Ｃ＋２０μｇのＣｐＧ
とした。

（２）予防的免疫腫瘍モデル：０、２、及び４週目に複数の部位で皮下免疫療法を行い、５週目に腫瘍ワクチン接種の前に総抗体価を検出した。各マウスの背部に腫瘍細胞ＥＧ７−ＯＶＡ：２×１０^６を皮下接種した。腫瘍が増殖した後、３日間隔で測定した。腫瘍体積の計算式は、０．５２×長さ×幅^２である。

治療用免疫腫瘍モデル：０日目に各マウスの背部に２×１０^６個のＥＧ７−ＯＶＡ腫瘍細胞を皮下接種し、５日目に免疫した（週１回、３回連続）。３日間隔で測定し、腫瘍が増殖した後の生存期間を観察した。

結果を図８に示す。予防モデル（Ａ及びＢ）では、ＤＰ７−Ｃ／ＣｐＧ群において産生されたＯＶＡ特異的抗体は、５週目に他の群において産生されたものよりも有意に高く、統計的差異を示す。ＤＰ７−Ｃ／ＣｐＧ群における腫瘍増殖は、腫瘍接種後２６日目に有意に阻害された。治療モデル（Ｃ及びＤ）では、腫瘍を接種したマウスの生存期間は、ＤＰ７−Ｃ／ＣｐＧ群で有意に延長され、腫瘍の増殖は大きく阻害される。結果は、ＤＰ７−Ｃ／ＣｐＧが良好な免疫賦活活性を有する新規免疫アジュバントであることを示している。

実施例８；インビトロでの抗原取り込み促進におけるＤＰ７−Ｃの役割に関する研究

アジュバント活性化免疫応答のメカニズムはおそらく、ＤＣ細胞の成熟を促進して、抗原の取り込み及びプロセシングを改善することにある。本発明者らはインビトロでＤＣ活性に対するＤＰ７−Ｃミセルの効果を研究した。

（Ｉ）樹状細胞の成熟促進
樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、免疫応答又は身体の耐性を主に決定する。それらの表面抗原ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＭＨＣ−ＩＩは明らかに、ＤＣの成熟と共に上方制御されている。従って、本発明者らは、フローサイトメトリーによって樹状細胞成熟に対するＤＰ７−Ｃアジュバントの効果を検出した。

実験手順は次の通りである。
（１）Ｃ５７／ＢＬマウス初代骨髄細胞を単離し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含有する誘導培地中で５日間インキュベートした。
（２）ＤＰ７−ＣアジュバントをＤＣ細胞培養液に添加し、よく混合して１６時間インキュベートした。
（３）刺激したＤＣ細胞を集め、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬのＰＢＳに細胞を再懸濁し、１μＬの抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２を加え、４℃で３０分間ブロッキングした。
（４）ＰＢＳで３回洗浄し、１μｇのＦＩＴＣ−抗ＣＤ８０、ＡＰＣ−抗ＣＤ８６、及びＰＥ−抗ＭＨＣ−ＩＩを加え、室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳを３回洗浄し、フローサイトメトリーのために２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。

結果を図９に示す。ＤＰ７−ＣアジュバントをＤＣＳ細胞に添加した後、細胞成熟分子ＭＨＣ ＩＩ並びに共発現したＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は増加し、ＮＳ群とのそれらの差異は統計的に有意である。

（ＩＩ）樹状細胞の抗原取り込みの増強
ＤＣ細胞は体内で最も強力な抗原提示細胞であり、異物を吸収し、それらを処理し、Ｔ細胞に提示して免疫応答を刺激することができる。ＤＣ細胞は、Ｔ細胞免疫応答及びＴ細胞依存性抗体の産生において重要な役割を果たす。本発明者らは、フローサイトメトリーによって、ＤＣ提示抗原に対するＤＰ７−Ｃの効果を調べた。

実験手順は次の通りである。
（１）Ｃ５７／ＢＬマウス初代骨髄細胞を単離し、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含有する誘導培地中で５日間インキュベートした。
（２）ＤＣ細胞培養液にＯＶＡタンパク質マーカーＦＩＴＣ、ＯＶＡ、又はＤＰ７−Ｃ／ＯＶＡを添加し、よく混合し、３時間インキュベートした。
（３）刺激したＤＣ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、３００μＬのＰＢＳに細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーを行った。

結果を図１０に示す。ＤＣ細胞単独によるＯＶＡ抗原の取り込み率は低く、ＤＣ細胞によるＯＶＡの取り込みは、４０μｇ／ｍｌのＤＰ７−Ｃによってある程度までわずかに増強される。しかしながら、２．５μｇ／ｍｌのＤＰ７−Ｃは、ＤＣ細胞による抗原の取り込みを有意に増加させることができ、取り込み効果はＤＰ７−Ｃ濃度と共に増加する。

実施例９；ＤＰ７−Ｃは先天性免疫応答を刺激する

先天性免疫は抗腫瘍免疫において重要な役割を果たす。ＤＰ７−Ｃアジュバントで免疫した後のマウスＮＫ細胞の殺傷活性を検出した。

実験手順は次の通りである。

（１）エフェクター細胞の調製
一次免疫の４８時間後、頸椎脱臼によってマウスを屠殺し、エフェクター細胞としてリンパ球分離培地から脾臓リンパ球を単離した。

（２）標的細胞の調製
ＹＡＣ−１細胞を蘇生し、インキュベートし、実験の前日に移し、２×１０^６／２０ｍｌを保った。トリパンブルーで染色した。活性が９５％以上の場合に利用可能である。

（３）エフェクター細胞と標的細胞の共培養
１．９６ウェルプレートに標的細胞とエフェクター細胞を加え（標的細胞対エフェクター細胞の比率は、１ウェルあたり１０，０００個の標的細胞について１：２５、１：５０、１：１００、１：２００）、３７℃で４時間インキュベートした。
２．２５０ｇで遠心し、上清を取り出してＬＤＨ放出試験を行った。

結果を図１１に示す。具体的には、ＮＳ群は基本的にＮＫ細胞活性を示さず、ＣｐＧ群とＤＰ７−Ｃ群はやや強いＮＫ細胞殺傷活性を示し、ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ複合体はＮＫ細胞活性を効果的に増強することができた。これらの差異は有意である。

実施例１０；ＤＰ７−Ｃは細胞性免疫応答を刺激する

上記の結果から、ＤＰ７−ＣをＣｐＧと組み合わせると、抗原の特異的免疫応答を刺激し、腫瘍の成長及び転移を効果的に阻害し、マウスの生存期間を延長することができることがわかる。更に、ＤＰ７−ＣとＣｐＧは、ＯＶＡ抗原の特異的抗体価を有意に上方制御し、体液性免疫応答を増強することができた。そこで本発明者らは、ＤＰ７−Ｃ活性化細胞性免疫応答を更に検出した。

具体的な手順は次の通りである。

（１）インビトロでの脾臓リンパ球の刺激
１．７日間で３回免疫した後、マウスの脾臓リンパ球を分離し、計数し、５×１０^６／ｍｌまで希釈した。
２．６ウェルプレートに５×１０^６／ウェルで入れ、各ウェルに１０μｇ／ｍｌのＯＶＡホロタンパク質を加え、３７℃で１時間刺激した（陰性対照：ＤＭＳＯ、陽性対照：５μｇ／ｍｌ ｃｏｎＡ）。
３．各ウェルに１μＬのゴルジプラグを加えてよく混ぜ、６〜１２時間インキュベートした。

（２）蛍光標識抗体
１．細胞を集めて２ｍｌの１×ＢＤ Ｐｈａｒｍｌｙｓｅボルテックスに加え、暗所にて室温で１０分間インキュベートし、５００ｇで５分間遠心し、上清を捨てた。
２．１×ｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、１００μＬの１×ｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、１μＬの抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２を加え、４℃で１５分間インキュベートしてブロッキングした。
３．１×ｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、１００μｌの染色バッファーに再懸濁し、ＰＥ抗マウスＣＤ８とｐｅｒＣＰ−ｃｙ５抗マウスＣＤ４をそれぞれ１μｌ加え、暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。
４．染色バッファーで２回洗浄した後、２５０μｌの固定化／透過化ボルテックスを加えて完全に懸濁させ、暗所にて室温で２０分間インキュベートし、細胞を固定化し透過化した。
（７）２ｍＬのＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄バッファーを加え、５００ｇで５分間遠心し、上清を捨てた。
（８）１００μＬのＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄バッファーに細胞を再懸濁し、細胞内抗原抗体（ＦＩＴＣ−ＩＦＮ−γ又はＰＥ−ＩＬ−１７Ａ）を添加し、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。その後、２ｍｌのＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄バッファーを加え、５００ｇで５分間遠心し、上清を捨てた。２％パラホルムアルデヒドを含む５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ボルテックスが完全に停止したら、フローサイトメトリーを実行することができる。

結果を図１２に示す。ＮＳ群ではＣＤ４^＋／ＩＦＮ−γ^＋、ＣＤ８^＋／ＩＦＮ−γ^＋、及びＣＤ４^＋／ＩＬ−１７Ａ^＋細胞の割合は低く、一方、ＣｐＧ及びＤＰ７−Ｃアジュバントで免疫したマウスではこれらの細胞の割合は増加する。しかしながら、ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ複合体で免疫したマウス脾臓において、これら３種類の細胞の割合は高く、その差はＮＳ群と比較して統計的に有意である。

実施例１１；ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃアジュバントは高効率抗腫瘍免疫を刺激する

上記の結果から、ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ複合体で免疫したマウスの腫瘍増殖が、ＥＧ７−ＯＶＡ腫瘍モデルにおいて阻害されることがわかる。本発明者らは、抗原としてＮＹ−ＥＳＯ−１を更に使用してＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃアジュバントでワクチンを形成し、ワクチンが抗原の高発現と共に黒色腫の増殖を阻害できるかどうかを試験することを目的とする。
具体的な手順は次の通りである。

（１）ワクチン調製
２０μｇのＣｐＧと４０μｇのＤＰ７−Ｃを３７℃で１５分間インキュベートし、５μｇのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を加え、滅菌ＰＢＳを用いて１００μｌの容量になるまで補充した。

（２）分類と投与計画
本研究では、動物実験は、各群１０匹のマウスをＮＳ、ＣｐＧ、ＤＰ７−Ｃ、及びＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃの５群に分け、各マウスの投与量は、
１．ＮＳ群：ＰＢＳ１００μｌ、
２．ＣｐＧ群：ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質５μｇ＋ＣｐＧ２０μｇ、
３．ＤＰ７−Ｃ群：ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質５μｇ＋ＤＰ７−Ｃ４０μｇ、
４．ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ群：ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質５μｇ＋ＣｐＧ２０μｇ＋ＤＰ７−Ｃ４０μｇ
とした。

各マウスの総投与量は１００μｌであり、投与量が１００μｌ未満の場合には、滅菌ＰＢＳを加えて１００μｌにすることができる。

（３）予防的免疫腫瘍モデルは、０、２、及び４週目に複数の部位で皮下免疫療法を行い、５週目に腫瘍を接種する前に総抗体価を検出した。各マウスの背部に腫瘍細胞ＮＹ−ＥＳＯ−１^＋Ｂ１６：２×１０^５を皮下接種した。腫瘍が増殖した後、３日間隔で測定した。腫瘍体積の計算式は、０．５２×長さ×幅^２である。治療用免疫腫瘍モデル：０日目に各マウスの背部に２×１０^５個のＮＹ−ＥＳＯ−１^＋Ｂ１６腫瘍細胞を皮下接種し、５日目に免疫した（１週間に１回、３回連続）。３日間隔で測定し、腫瘍が増殖した後の生存期間を観察した。

結果を図１３に示す。予防モデル（図１３Ａ）及び治療モデル（図１３Ｂ）の両方において、ＮＳ群マウスの腫瘍は急速に増殖し、ＣｐＧ単独又はＤＰ７−Ｃアジュバントは、ある程度腫瘍増殖を抑制することができ、免疫ＣｐＧ／ＤＰ７−Ｃ複合体アジュバントは、腫瘍の増殖を効果的に阻害することができ、これはＮＳ群とは有意に異なる。

実施例１２；電子顕微鏡下でのＤＰ７−Ｃミセル／ｓｉＲＮＡ複合体の形態

ＤＰ７が正電荷を帯びているため、自己集合によって形成されたＤＰ７−Ｃミセルも水溶液中で正電荷を帯び、非ウイルス性遺伝子伝達ベクター、特にｓｉＲＮＡ伝達ベクターとしての可能性を示す。自己集合及びＤＰ７−Ｃ／ｓｉＲＮＡ複合体によって形成されたＤＰ７−Ｃミセルの形態を、透過型電子顕微鏡（Ｈ−６００９ＩＶ、日立、日本）で観察した。まず、１ｍｇ／ｍＬのミセル溶液を蒸留水で希釈し、ニトロセルロースで覆った銅メッシュ上にコーティングし、次いでリンタングステン酸でネガティブ染色し、室温で乾燥させ、電子顕微鏡下で観察した。結果はＤＰ７−Ｃミセルが球状であり均一に分布していることを示した。電子顕微鏡下で、ＤＰ７−Ｃミセルの粒径は約６０ｎｍであり、ＤＰ７−Ｃミセル／ｓｉＲＮＡ複合体の粒径は約１００ｎｍである（結果については図１４を参照）。

実施例１３；ＤＰ７−Ｃ／ｓｉＲＮＡ複合体のインビトロでのトランスフェクション効率の検出

トランスフェクションの２４時間前に、Ｃ２６マウス結腸癌細胞又はＢ１６マウス黒色腫細胞を、６ウェルプレートにウェルあたり５×１０^４細胞の密度で置き、２０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地２ｍｌを各ウェルに添加した。トランスフェクション効率を検出するためのレポーター遺伝子としてＦＡＭ修飾無センスｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ）を使用し、ＰＥＩ２５Ｋとリポフェクタミン２０００を陽性対照として使用した。トランスフェクションの間、培地を最初に１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地と交換した。続いて、異なる比率で混合した遺伝子トランスフェクション複合体を各ウェルに添加し、各複合体は１μｇのＦＡＭ−ｓｉＲＮＡを含む。これらのうち、ｓｉＲＮＡ／ＤＰ７−Ｃ、ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ２５Ｋ、及びｓｉＲＮＡ／リポフェクタミン２０００の比はそれぞれ１：５、１：２、及び１：２である。培地を３７℃で４時間インキュベートした後、それを２０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地と交換し、順次インキュベートした。２４時間後、トランスフェクションを顕微鏡下で観察し、写真を撮影した。浮遊細胞及び接着細胞を含むウェル中の全ての細胞を集め、予冷したＰＢＳで２回洗浄し、各群の全蛍光強度をフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ Ｅｌｉｔｅ ＥＳＰ、ＵＳＡ）により計数した。

トランスフェクション結果を図１５に示す。検出及び観察の結果は、ＤＰ７−Ｃが、ＦＡＭ修飾蛍光ｓｉＲＮＡをＣｔ２６（図１５ｃ）及びＢ１６（図１５ｂ）細胞にそれぞれ４２．４±３．５％及び５３．３±４．０％のトランスフェクション効率でトランスフェクトできることを示す。ＰＥＩ複合体の対応するトランスフェクション効率は、それぞれ１９．０±１．８％と７２．０±４．１％であり、リポフェクタミン２０００複合体の対応するトランスフェクション効率は、それぞれ２９．５±３．２％及び２５．６±４．２％であり、これは図１５ａに直接反映され得る。結果は、ＤＰ７−Ｃミセルが、ＰＥＩ２５Ｋおよびリポフェクタミン２０００よりも高いｓｉＲＮＡトランスフェクション効率を有することを示す。

実施例１４；ＤＰ７−Ｃ細胞毒性検出

カチオンの細胞毒性は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの適用を制限する重要な要素の１つである。正常細胞である２９３Ｔヒト胎児腎臓細胞株に対するＤＰ７−Ｃミセルの毒性を、細胞生存実験を通して検出した。２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり３×１０^３細胞の密度で置き、１００μＬのＤＭＥＭ／２０％ＦＢＳ培地を各ウェルに添加し、２４時間インキュベートした。実験では、３群、即ち、ＤＰ７−Ｃ、ＰＥＩ２５Ｋ、及びリポフェクタミン２０００を設定し、各群はそれぞれ０、１２．５、１８．７５、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、及び２００μｇ／ｍＬの１０種類の濃度勾配を有した。細胞の生存はＣＣＫ−８法により検出した。２４時間投与後、１０μＬのＣＣＫ−８溶液を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。各ウェルの吸収値は、マイクロプレートリーダーによって６３０ｎｍ及び４５０ｎｍの波長で検出した。標準曲線を描き、ＩＣ５０を算出し、６群の並行実験の平均値を最終結果とした。

検出結果を図１６に示す。ＰＥＩ２５Ｋとリポフェクタミン２０００は非常に有毒であり、ＩＣ_５０は２０μｇ／ｍＬ未満であるが、ＤＰ７−Ｃミセルは毒性が弱く、ＩＣ_５０は２００μｇ／ｍＬを超え、従って安全である。

実施例１５；ＤＰ７−Ｃ伝達ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡで治療した腹腔内転移性大腸癌のＣ２６マウスモデル

腫瘍治療におけるＤＰ７−Ｃミセルの応用可能性を更に特徴付けるために、Ｃ２６マウス結腸癌腹膜転移モデルを確立し、ＤＰ７−Ｃを使用して、治療研究のために抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ治療遺伝子を伝達した。

（１）腹部転移モデルの確立：０日目に、６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに０．１ｍｌの細胞懸濁液（約１×１０^５個のＣ２６細胞を含む）を腹腔内注射した。
（２）３日目に、マウスを各群８匹ずつ４群に無作為に分け、標識した。
（３）４群のマウスにそれぞれ、１０用量の通常生理食塩水（ブランク対照群）、ブランクＤＰ７−Ｃミセル（１７．５μｇ）、ＤＰ７−Ｃ／無センス対照ｓｉＲＮＡ（スクランブルｓｉＲＮＡ）複合体（１７．５μｇ／３．５μｇ）、又はＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体（１７．５μｇ／３．５μｇ）を腹腔内注射した。
（４）２０日目に、対照群のマウスが既に非常に弱っているときに、全てのマウスを頸椎脱臼により屠殺し、腹腔内の腫瘍組織、並びに心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織を直ちに採取し、秤量し、分析した。また、各群のマウスの腹水も収集及び測定し、ＣＤ３１免疫組織化学的染色を各実験群の腫瘍組織に対して行った。採取した心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織をＨＥ染色で分析した。

図１７は、腹部転移Ｃ２６腫瘍モデルを治療するために腹腔内注射したＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体の治療効果を示す図である。図１７ａは、各群の動物における代表的なマウスの腹腔の写真である。これらのうち、平均腫瘍重量は、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体処理群では１．０７±０．５ｇ、通常生理食塩水対照群では８．８２±０．６３ｇ、無負荷ＤＰ７−Ｃ群では７．９４±０．５３ｇ、ＤＰ７−Ｃ／無センス対照ｓｉＲＮＡ複合体群では５．３±０．７２ｇである（図１７ｃ）。腹腔内の転移性腫瘍結節の数は、他の処理群と比較して、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体で処理したマウスでは有意に少ない。従って、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体で処理したマウスにおいて、腫瘍増殖は大きく阻害される。

一方、図１７ｂに示すように、各群のマウスによって産生された腹水の量は有意に異なる。平均腫瘍重量は、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体処理群では０．２±０．１ｍＬ、通常生理食塩水対照群では１．１７±０．４ｍＬ、ブランクＤＰ７−Ｃミセル群では１．１７±０．５１ｍＬ、ＤＰ７−Ｃ／無センス対照ｓｉＲＮＡ複合体群では０．５８±０．１１ｍＬである。ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体で処理していない各群のマウスでは、腹水は明らかな血赤色を示し、これらの群のマウスは重篤な腸間膜損傷を有することが確認された。他の実験群と比較して、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体は、Ｃ２６腹膜転移腫瘍モデルの増殖と付随する深刻な腫瘍浸潤及び炎症の発生を効果的に阻害する。

加えて、ＣＤ３１免疫組織化学的染色の結果は、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体処理群が他の３つの実験群よりも腫瘍組織内の新規血管が少ないことを示しており、ＤＰ７−Ｃが、抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡの伝達によって腫瘍組織の血管形成を効果的に阻害できたことが確認される（図１７ｄ）。一方、ＨＥ染色の結果（図１７ｅ）は、ＤＰ７−Ｃミセルを腹腔内注射した後に主要な臓器組織において有意な病理学的変化は観察されず、ＤＰ７−Ｃに副作用がほとんどないことが確認される。

実施例１６；ＤＰ７−Ｃ伝達ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡで処理したＣ２６マウス結腸癌の皮下移植腫瘍モデル

腫瘍治療におけるＤＰ７−Ｃミセルの応用可能性をさらに特徴付けるために、Ｃ２６マウス結腸がんの皮下移植腫瘍モデルを確立し、ＤＰ７−Ｃを使用して、治療研究のために抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ治療遺伝子を伝達した。
（１）０日目に、６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに０．１ｍＬの細胞懸濁液（約１．５×１０^６個のＣ２６細胞を含む）を皮下接種した。
（２）８日目に、腫瘍が触診可能になったとき、マウスを各群８匹ずつ４群に無作為に分け、標識した。
（３）４群のマウスにそれぞれ、１０用量の通常生理食塩水（ブランク対照群）、ブランクＤＰ７−Ｃミセル（２５μｇ）、ＤＰ７−Ｃ／無センス対照ｓｉＲＮＡ複合体（２５μｇ／５μｇ）、又はＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体（２５μｇ／５μｇ）を腫瘍内注射した。
（４）２０日目に、対照群のマウスが既に非常に弱っているときに、全てのマウスを頸椎脱臼により屠殺し、腹腔内の腫瘍組織、並びに心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織を直ちに採取し、秤量し、分析した。また、各群のマウスの腹水も収集及び測定し、ＣＤ３１免疫組織化学的染色を各実験群の腫瘍組織に対して行った。採取した心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織をＨＥ染色で分析した。

図１８は、Ｃ２６皮下移植腫瘍モデルを治療するために腫瘍内注射したＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体の治療効果を示す。図１８ａは、各群の動物におけるマウス皮下腫瘍の写真を示す。これらのうち、平均腫瘍重量は、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体処理群では２６１．４±１１５．５１ｍｍ^３、通常生理食塩水対照群では５７７．２１±１０７．４６ｍｍ^３、ブランクＤＰ７−Ｃミセル群では３５７．６４±３０．５６ｍｍ^３、ＤＰ７−Ｃ／無センス対照ｓｉＲＮＡ複合体群では４７４．４３±１２０．６７ｍｍ^３である。ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体で処理したマウスの皮下腫瘍の体積は、他の処理群の体積よりも有意に小さい（図１８ｂ）。従って、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体で処理したマウスにおいて、腫瘍増殖は大きく阻害される。

加えて、ＣＤ３１免疫組織化学的染色の結果（図１８ｃ）は、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体処理群が他の３つの実験群よりも腫瘍組織内の新規血管が少ないことを示しており、ＤＰ７−Ｃが、抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡの伝達によって腫瘍組織の血管形成を効果的に阻害できたことが確認される。一方、ＨＥ染色の結果（図１８ｄ）は、ＤＰ７−Ｃミセルを腹腔内注射した後に、主要な臓器組織において有意な病理学的変化が観察されないことを示し、ＤＰ７−Ｃに副作用がほとんどないことが確認される。

実施例１７；ＤＰ７−Ｃ伝達ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡで処理した肺の転移性黒色腫のＢ１６マウスモデル

腫瘍治療におけるＤＰ７−Ｃミセルの適用可能性を更に特徴付けるために、肺の転移性黒色腫のＢ１６マウスモデルを確立し、ＤＰ７−Ｃを使用して、治療研究のために抗ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ治療遺伝子を伝達した。
（１）０日目に、６〜８週齢の雌性Ｃ５７マウスに０．１ｍＬの細胞懸濁液（約２．５×１０^５個のＢ１６細胞を含む）を皮下接種した。
（２）３日目に、マウスを各群８匹ずつ４群に無作為に分け、標識した。
（３）７用量の通常生理食塩水（ブランク対照群）、ブランクＤＰ７−Ｃミセル（６０μｇ）、ＤＰ７−Ｃ ／無センス対照ｓｉＲＮＡ複合体（６０μｇ／１２μｇ）、又はＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体（６０μｇ／１２μｇ）を、それぞれ尾静脈を通じてマウスに注射した。
（４）２０日目に、対照群のマウスが既に非常に弱っているときに、全てのマウスを頸椎脱臼により屠殺し、肺、並びに心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織中の腫瘍組織を直ちに採取し、秤量し、分析した。採取した心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓の組織をＨＥ染色で分析した。

図１９は、肺の転移性黒色腫のＢ１６マウスモデルを治療するために静脈内注射したＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体の治療効果を示す。図１９ａは、各群の動物におけるマウスの肺腫瘍の写真を示す。このうち、腫瘍結節の平均数は、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体処理群では３０±１２、通常生理食塩水対照群では１７２±１６、ブランクＤＰ７−Ｃミセル群では１３２±２２、ＤＰ７−Ｃ／無センス対照ｓｉＲＮＡ複合体群では１０６±１５である。更に、肺組織の平均重量は、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体処理群では０．２２±０．０２ｇ、通常生理食塩水対照群では０．５２±０．１８ｇ、ブランクＤＰ７−Ｃミセル群では０．４１±０．１ｇ、ＤＰ７−Ｃ／無センス対照ｓｉＲＮＡ複合体群では０．４２±０．１７ｇである。ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体で処理したマウスの肺における転移性腫瘍肺結節の数は、他の処理群のものよりも有意に少なく（図１９ａ）、マウスの平均肺重量は、他の処理群のものよりも有意に軽い（図１９ｂ）。従って、ＤＰ７−Ｃ／ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ複合体で処理したマウスにおいて、腫瘍増殖は大きく阻害される。

加えて、ＨＥ染色の結果（図１９ｃ）は、ＤＰ７−Ｃミセルを腹腔内注射した後に、主要な臓器組織において有意な病理学的変化が観察されないことを示し、ＤＰ７−Ｃに副作用がほとんどないことが確認される。

Claims (38)

1. 疎水性修飾が、抗菌ペプチドの窒素末端に疎水性フラグメントを結合させることであり、前記抗菌ペプチドのアミノ酸配列がＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫである、疎水性修飾抗菌ペプチド。
2. 前記抗菌ペプチドＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫが、Ｃ末端アミド化によって修飾されてＶＱＷＲＩＲＶＡＶＩＲＫ−ＮＨ_２を生成する、請求項１に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
3. 前記疎水性フラグメントがステロール化合物又は飽和直鎖脂肪酸である、請求項１又は２に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
4. 前記ステロール化合物がコレステロール化合物またはコール酸化合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
5. 前記ステロール化合物が、スクシニル化コレステロール、コール酸、又はデオキシコール酸のうちの少なくとも１つである、請求項３に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
6. 前記飽和直鎖脂肪酸が炭素数６〜２０の少なくとも１つである、請求項３に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
7. 前記飽和直鎖脂肪酸が炭素数８〜１８の少なくとも１つである、請求項６に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
8. 長鎖脂肪酸が、ステアリン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、又はｎ−オクタン酸の少なくとも１つである、請求項７に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
9. 前記抗菌ペプチドの前記窒素末端が、疎水性セグメントの−ＣＯ−ＯＨと抗菌ペプチドの−ＮＨ_２とのアミド化反応によって疎水性セグメントに結合されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
10. 前記疎水性修飾抗菌ペプチドの構造が、
    
    であり、
    式中、Ｒはステロール化合物又は飽和直鎖脂肪酸である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
11. Ｒが、
    
    である、請求項１０に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチドから調製されたミセル。
13. 前記ミセルが、溶液中で前記疎水性修飾抗菌ペプチドから自己集合している、請求項１２に記載のミセル。
14. 前記ミセルが、核酸、小分子薬、又はタンパク質のうちの少なくとも１つを更に搭載している、請求項１２又は１３に記載のミセル。
15. 抗菌薬の調製における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のミセルの使用。
16. 抗菌剤が抗菌剤又は抗真菌剤である、請求項１５に記載の使用。
17. 細菌が、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｍｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、又はまたはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）のうちの少なくとも１つである、請求項１６に記載の使用。
18. 真菌が、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｉｄｉａ Ａｌｂｉｃａｎｓ）又はカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）のうちの少なくとも１つである、請求項１５に記載の使用。
19. 抗菌薬が、主たる有効成分、即ち請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のミセルから調製される、抗菌薬。
20. 他の抗菌薬を更に含む、請求項１９に記載の抗菌薬。
21. 前記他の抗菌薬が抗生物質である、請求項２０に記載の抗菌薬。
22. 前記抗生物質が、グリコペプチド系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、及びβ−ラクタム系抗生物質のうちの少なくとも１つである、請求項２１に記載の抗菌薬。
23. ペニシリン系抗生物質が、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、フルクロキサシリン、オキサシリン、アンピシリン、カルボキシベンジルペニシリン、ピバンピシリン、スルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、又はアモキシシリンのうちの少なくとも１つであり、セファロスポリン系抗生物質が、セファドロキシル、セファレキシン、セファゾリン、セフラジン、セフプロジル、セフロキシム、セファクロル、セファマンドール、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフィキシム、セフジニル、セフピロム、セフェピム、又はセフゾナムのうちの少なくとも１つである、請求項２２に記載の抗菌薬。
24. アミノグリコシド系抗生物質が、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネオマイシン、シソマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、リボザイム、ミクロノマイシン、又はアジスロマイシンのうちの少なくとも１つである、請求項２２に記載の抗菌薬。
25. ポリペプチド抗生物質が、バンコマイシン、ノルバンコマイシン、ポリミキシンＢ、又はテイコプラニンのうちの少なくとも１つである、請求項２２に記載の抗菌薬。
26. マクロライド系抗生物質が、エリスロマイシン、アルボマイシン、無臭エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、ジョサマイシン、又はアジスロマイシンのうちの少なくとも１つである、請求項２２に記載の抗菌薬。
27. 免疫アジュバントの調製における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のミセルの使用。
28. 免疫アジュバントが主成分、即ち、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のミセルから調製される、免疫アジュバント。
29. 一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドＣｐＧ ＯＤＮを更に含む、請求項２８に記載の免疫アジュバント。
30. 疎水性修飾抗菌ペプチド対ＣｐＧ ＯＤＮの比が１：０．５〜１：５である、請求項２８又は２９に記載の免疫アジュバント。
31. 核酸トランスポーターの調製における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のミセルの使用。
32. 前記核酸がＲＮＡである、請求項３１に記載の使用。
33. 前記核酸が、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ、又はゲノム編集のためのｓｇＲＮＡのうちの少なくとも１つである、請求項３２記載の使用。
34. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチド又は請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のミセルに搭載された核酸によって得られる、核酸トランスポーター。
35. 前記核酸がＲＮＡである、請求項３４に記載の核酸トランスポーター。
36. 前記核酸がｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡである、請求項３４に記載の核酸トランスポーター。
37. 前記疎水性修飾抗菌ペプチド対前記核酸の質量比が、１：１〜２０：１である、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の核酸トランスポーター。
38. ａ．請求項１〜１１のいずれか１項に記載の疎水性修飾抗菌ペプチドの適切な量を秤量し、溶解するための溶液を添加し、自発的にミセルを形成する工程；又は溶液を形成するために請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のミセルを取る工程と、
    ｂ．ミセル溶液に核酸を添加し、室温でインキュベートする工程と、
    を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の核酸トランスポーターの調製方法。