CN112691081B - 一种基于(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的紫杉醇胶束 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于(S)‑2‑癸酰氨基‑3‑(1‑萘基)丙酰基‑亮氨酰‑缬氨酸的紫杉醇胶束,包括(S)‑2‑癸酰氨基‑3‑(1‑萘基)丙酰基‑亮氨酰‑缬氨酸和紫杉醇。在本发明中,(S)‑2‑癸酰氨基‑3‑(1‑萘基)丙酰基‑亮氨酰‑缬氨酸具有羧基脂肪链,能够增加活性药物的入胞性,与紫杉醇制成胶束后,具有逆转抗肿瘤药物耐药作用和抗肿瘤细胞迁移、抗肿瘤细胞侵袭的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别涉及一种基于(S)-2-癸酰氨基-3- (1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的紫杉醇胶束。
背景技术
恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要原因。根据Global Cancer Observatory2018显示,全球恶性肿瘤新发病例约1808万例,死亡病例约956 万例,5年生存率为40.5%。肿瘤的异质性使肿瘤出现侵袭性和耐药性,化疗药物发生耐药和转移是导致多数肿瘤患者治疗失败的重要原因,如何逆转化疗药物耐药及其耐药机制研究已成为肿瘤领域研究的热点和难点,发明逆转耐药的新药具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种基于(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的紫杉醇胶束,本发明提供的紫杉醇胶束具有逆转抗肿瘤药物耐药作用、抗肿瘤细胞迁移作用和抗肿瘤细胞侵袭作用。
为了实现上述发明的目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种基于(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰- 缬氨酸的紫杉醇胶束,包括(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰- 缬氨酸和紫杉醇。
优选的,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与紫杉醇的质量比为0.68~20:1。
优选的,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与紫杉醇的质量比为3.4~13:1。
本发明提供了上述紫杉醇胶束的制备方法,包括以下步骤:
(1)将(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、紫杉醇与第一有机溶剂混合,得到混合液,将所述混合液制成薄膜;
(2)将所述薄膜与第二有机溶剂混合,进行超声,得到超声溶解液;
(3)将所述超声溶解液与水混合,进行冻干,得到紫杉醇胶束。
优选的,所述第一有机溶剂为二氯甲烷、二氧六环和四氢呋喃中的一种或几种。
优选的,所述制成薄膜的方式为旋转蒸发,所述旋转蒸发的温度为 30~40℃,时间为15~60min;所述旋转蒸发的速率为100~300rpm。
优选的,所述第二有机溶剂为乙醇、甲醇和乙腈中的一种或几种。
优选的,所述超声的功率为300~400W,时间为10~30min。
优选的,所述超声溶解液与水的体积比为1:0.9~1.2。
优选的,所述冻干的温度为-40~-20,时间为12~24h。
本发明提供了一种基于(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰- 缬氨酸的紫杉醇胶束,包括(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰- 缬氨酸和紫杉醇。在本发明中,(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸具有羧基脂肪链,能够增加活性药物的入胞性,与紫杉醇制成胶束后,具有逆转抗肿瘤药物耐药作用和抗肿瘤细胞迁移、抗肿瘤细胞侵袭的作用。同时,本发明提供的紫杉醇胶束是具有活性的小分子,合成容易,纳米制备工艺简单,没有体系质控标准不可控的风险。
本发明提供了上述紫杉醇胶束的制备方法,此法采用先制成薄膜,再分散、冻干的方法,操作简单,易于实现工业化批量生产。
附图说明
图1为性能测试(一)中A549细胞检测下胶束1~5的IC50值;
图2为性能测试(二)中LLC细胞检测下胶束1~5的IC50值;
图3为性能测试(三)中细胞凋亡图片;
图4为性能测试(三)中细胞凋亡比例图;
图5为性能测试(四)中不同培养细胞的染色图;
图6为性能测试(四)中荧光强度比较图;
图7为性能测试(五)中细胞凋亡成像结果;
图8为性能测试(六)中细胞划痕图;
图9为性能测试(七)中A549细胞染色结果;
图10为性能测试(七)中A549/TAX细胞的染色结果;
图11为性能测试(七)中LLC细胞的染色结果;
图12为性能测试(八)中A549细胞染色结果;
图13为性能测试(八)中A549/TAX细胞的染色结果;
图14为性能测试(八)中LLC细胞的染色结果;
图15为性能测试(九)中不同时间内肿瘤的体积变化图;
图16为性能测试(九)中不同时间内肿瘤的质量图;
图17为性能测试(十)中给药前小鼠各部位的脏体比;
图18为性能测试(十)中给药后小鼠各部位的脏体比;
图19为性能测试(十一)中HE染色图;
图20为性能测试(十一)中免疫荧光染色图。
具体实施方式
本发明提供了一种紫杉醇胶束,包括(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和紫杉醇。
在本发明中,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的结构式如式1所示:
在本发明中,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备方法优选包括以下步骤:
(1)L-Val-OBzl与Boc-Leu进行第一缩合反应,得到Boc-Leu-Val-OBzl;
(2)所述Boc-Leu-Val-OBzl与第一脱保护试剂进行第一脱保护基反应,得到HCl·Leu-Val-OBzl;
(3)Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸与所述HCl·Leu-Val-OBzl进行第二缩合反应,得到Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯;
(4)所述Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应,得到HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯;
(5)癸酸与所述HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应,得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯;
(6)在流动H2条件下,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基- 亮氨酰-缬氨酸苄酯在Pd/C催化下进行氢解反应,得到(S)-2-癸酰氨基-3- (1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸。
在本发明中,L-Val-OBzl与Boc-Leu进行第一缩合反应,得到 Boc-Leu-Val-OBzl。在本发明中,第一缩合反应体系中还优选包括EDC和 HOBt,所述Boc-Leu、EDC、HOBt和L-Val-OBzl的摩尔比优选为 1~1.3:1:0.2~0.6:1.1~1.2。在本发明中,所述第一缩合反应体系的pH值优选为8~9。在本发明中,所述第一缩合反应在极性有机溶剂中进行,所述极性有机溶剂优选为四氢呋喃。
本发明优选先将Boc-Leu、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、HOBt与极性有机溶剂混合,在冰浴条件下进行活化,得到活化混合液;再向所述活化混合液中加入L-Val-OBzl,调节pH值至8~10,进行第一缩合反应,得到Boc-Leu-Val-OBzl。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的混合方式即可,具体的如搅拌混合;在本发明中,所述极性有机溶剂优选为乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺。在本发明中,所述活化的时间优选为20~30min;本发明通过所述活化,能够生成活泼酯来活化羧基。在本发明中,所述调节pH值的pH值调节剂优选为N- 甲基吗啡啉(NMM);本发明通过调节pH值,能够使氨基游离。
所述第一缩合反应的温度优选为20~35℃,更优选为25~30℃;时间优选为12~24h,更优选为16~20h。
在第一缩合反应的过程中,本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行,当原料点消失时反应终止。在本发明中,所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚,所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2;在本发明中,所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第一缩合反应后,本发明优选对所述第一缩合反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
将所述第一缩合反应液依次进行去除极性有机溶剂、萃取分离、洗涤有机相、干燥和柱层析分离,得到Boc-Leu-Val-OBzl纯品。
本发明优选使用旋转蒸发仪去除极性有机溶剂。
在本发明中,所述萃取分离优选包括以下步骤:向所述去除有机溶剂后的第一缩合反应液中加入乙酸乙酯,进行超声混合,之后加入蒸馏水,得到上层油相和下层水相,通过分液漏斗分离出去下层水相。
在本发明中,所述洗涤用洗涤剂优选依次为饱和NaHCO3溶液、饱和 NaCl溶液、饱和KHSO4溶液、饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3和饱和NaCl 溶液;每种洗涤剂的洗涤次数优选为3次。
在本发明中,所述干燥优选包括以下步骤:向洗涤后的油相中加入干燥剂进行干燥,之后过滤除去干燥剂,所得滤液进行蒸干。在本发明中,所述干燥剂优选为无水Na2SO4,所述干燥剂干燥的时间优选为2~10h,更优选为 4~8h。本发明优选使用旋转蒸发仪进行所述蒸干。
在本发明中,所述柱层析分离的固定相优选为硅胶,流动相优选为乙酸乙酯和石油醚;所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:5。
得到所述Boc-Leu-Val-OBzl后,本发明将所述Boc-Leu-Val-OBzl与氯化氢-乙酸乙酯溶液进行第一脱保护基反应,得到HCl·Leu-Val-OBzl。在本发明中,所述第一脱保护试剂优选为氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液 (TFA);所述氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液的摩尔浓度优选为 2~4mol/L,更优选为3mol/L;所述Boc-Leu-Val-OBzl的质量与第一脱保护试剂的体积比优选为1g:8~14mL,更优选为1g:10~12mL。本发明优选在冰浴搅拌的条件下进行所述第一脱保护基反应,所述第一脱保护基反应的时间优选为6~10h,更优选为7~8h。
在第一脱保护基反应的过程中,本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行,当原料点消失时反应终止。在本发明中,所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚,所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2;在本发明中,所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第一脱保护基反应后,本发明优选对所得第一脱保护基反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
对所述第一脱保护基反应液依次进行浓缩、洗涤和干燥,得到HCl· Leu-Val-OBzl纯品。
在本发明中,所述浓缩优选为减压浓缩;本发明对所述减压浓缩没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的减压浓缩方式即可,所浓缩后的状态优选为糖浆状。在本发明中,所述洗涤用洗涤剂优选为无水乙酸乙酯;所述干燥的方式优选为减压抽干。本发明优选重复所述浓缩、洗涤和干燥,所述重复的次数优选为三次。
得到所述HCl·Leu-Val-OBzl后,本发明将Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸与所述HCl·Leu-Val-OBzl进行第二缩合反应,得到Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰 -缬氨酸苄酯。在本发明中,所述第二缩合反应体系中优选还包括EDC和 HOBt;所述Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸、EDC、HOBt与HCl·Leu-Val-OBzl的摩尔比优选为1:1~1.3:0.2~1:1~1.2,更优选为1:1:0.2~0.6:1.1~1.2。
本发明优选先将HCl·Leu-Val-OBzl、EDC、HOBt与极性有机溶剂混合,在冰浴条件下进行活化,得到活化混合液;再向所述活化混合液中加入 Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸,调节pH值至8~9,进行第二缩合反应,得到 Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的混合方式即可,具体的如搅拌混合;在本发明中,所述极性有机溶剂优选为乙腈。在本发明中,所述活化的时间优选为20min;本发明通过所述活化,能够生成活泼酯活化羧基组分。在本发明中,所述调节pH值的pH值调节剂优选为N-甲基吗啡啉(NMM);所述第二缩合反应的温度优选为室温,时间优选为12h。
在第二缩合反应的过程中,本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行,当原料点消失时反应终止。在本发明中,所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚,所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2;在本发明中,所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第二缩合反应后,本发明优选对所述第一缩合反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
将所述第二缩合反应液依次进行去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离,得到Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。
在本发明中,所述去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离的具体操作方式与上文中第一缩合反应液的后处理中的操作方式相同,在此不再赘述。
得到所述Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后,所述Boc-3-(1- 萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应,得到HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中,所述第二脱保护试剂优选为氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液(TFA);所述氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液的摩尔浓度优选为2~4mol/L,更优选为3mol/L。;所述Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯的质量与第二脱保护试剂的体积比优选为1g:8~15mL,更优选为1g:10~12mL。本发明优选在冰浴搅拌的条件下进行所述第二脱保护基反应,所述第二脱保护基反应的时间优选为6~10h,更优选为7~8h。
在第二脱保护基反应的过程中,本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行,当原料点消失时反应终止。在本发明中,所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚,所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2;在本发明中,所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第二脱保护基反应后,本发明优选对所得第二脱保护基反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
对所述第二脱保护基反应液依次进行浓缩、洗涤和干燥,得到HCl· NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。
在本发明中,所述浓缩、洗涤和干燥的具体操作方式与上文第一脱保护基反应液后处理中的具体操作方式相同,在此不再赘述。
得到所述HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后,癸酸与所述HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应,得到 (S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中,第三缩合反应体系中优选还包括EDC和HOBt,所述癸酸、EDC、HOBt和 HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯的摩尔比优选为 1:1~1.3:0.2~1:1~1.2,更优选为1:1:1:1.1。本发明优选先将癸酸、EDC、HOBt 与极性有机溶剂混合,在冰浴条件下进行活化,得到活化混合液;再向所述活化混合液中加入EDC、HOBt和HCl·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯,调节pH值至8~9,进行第三缩合反应,得到(S)-2-癸酰氨基-3- (1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的混合方式即可,具体的如搅拌混合;在本发明中,所述极性有机溶剂优选为乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺。在本发明中,所述活化的时间优选为20~30min;本发明通过所述活化,能够生成活泼酯活化羧基组分。在本发明中,所述调节pH值的pH值调节剂优选为N-甲基吗啡啉(NMM);本发明通过调节pH值,能够使氨基游离。
在本发明中,所述第三缩合反应的温度优选为20~35℃,更优选为 25~30℃;时间优选为12~24h,更优选为16~20h。
在第三缩合反应的过程中,本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行,当原料点消失时反应终止。在本发明中,所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚,所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2;在本发明中,所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述第三缩合反应后,本发明优选对所述第三缩合反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
将所述第三缩合反应液依次进行去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离,得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。在本发明中,所述去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离的具体操作方式与上文对第一缩合反应液后处理的具体操作方式相同,在此不再赘述。
得到所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后,在密闭H2条件下,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在Pd/C催化下进行氢解反应,得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸。在进行氢解反应前,本发明优选使用极性溶剂将所述 (S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯溶解;所述极性有机溶剂优选为四氢呋喃。本发明对所述极性有机溶剂的用量没有特殊的要求,能够将所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯溶解即可;所述溶解的温度优选为35~40℃,更优选为36~38℃。
在本发明中,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与Pd/C的质量比优选为10:1。在本发明中,所述氢解反应的温度优选为室温,时间优选为6~12h;所述氢解反应时H2的气压优选为1.1~1.4倍大气压。
在氢解反应的过程中,本发明优选通过薄层色谱(TLC)监测反应的进行,当原料点消失时反应终止。在本发明中,所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚,所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2;在本发明中,所述薄层色谱分析时的Rf值优选为0.3。
所述氢解反应后,本发明优选对所述氢解反应液依次进行过滤和蒸干,得到(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸纯品。本发明对所述过滤的方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的过滤方式即可;本发明通过所述过滤,除去所述氢解反应液中的Pd/C催化剂。本发明优选使用旋转蒸发仪进行所述蒸干。
在本发明中,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备过程如式A所示。
本发明对所述紫杉醇的来源没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的紫杉醇即可。在本发明中,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基- 亮氨酰-缬氨酸与紫杉醇的质量比优选为0.68~20:1,更优选为3.4~13:1,进一步优选为5~10:1。
在本发明中,所述紫杉醇胶束的制备方法,包括以下步骤:
(1)将(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、紫杉醇与第一有机溶剂混合,得到混合液,将所述混合液制成薄膜;
(2)将所述薄膜与第二有机溶剂混合,进行超声,得到超声溶解液;
(3)将所述超声溶解液与水混合,进行冻干,得到紫杉醇胶束。
本发明将(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、紫杉醇与第一有机溶剂混合,得到混合液,将所述混合液制成薄膜。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中,所述第一有机溶剂优选为二氯甲烷、二氧六环和四氢呋喃中的一种或几种;本发明对所述第一有机溶剂的用量没有特殊的要求,能够将所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、紫杉醇完全溶解即可。本发明优选将所述混合液旋转蒸发,制成薄膜;在本发明中,所述旋转蒸发的温度优选为30~40℃,更优选为35℃;时间优选为15~60min,更优选为25~40min;所述旋转蒸发的速率优选为100~300rpm,更优选为 150~250rpm。
本发明将所述薄膜与第二有机溶剂混合,进行超声,得到超声溶解液。在本发明中,所述第二有机溶剂优选为、甲醇和乙腈中的一种或几种。本发明对所述第二有机溶剂的用量没有特殊的要求,能够将所述薄膜完全溶解即可。在本发明中,所述超声的功率优选为300~400W,更优选为350W,时间优选为10~30min,更优选为15~25min。本发明通过所述超声,能够得到均一的溶液。
本发明将将所述超声溶解液与水混合,进行冻干,得到紫杉醇胶束。在本发明中,所述超声溶解液与水的体积比优选为11:9。在本发明中,所述冻干的温度优选为-40~-20℃,时间优选为12~24h。
下面结合实施例对本发明提供的基于(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的紫杉醇胶束进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备
(一)制备Boc-Leu-Val-OBzl
称取1.15g(5mmol)Boc-Leu、0.96g(5mmol)EDC、0.68g(5mmol) HOBt,放入搅拌子,加入20mL乙腈,冰浴下活化20min,称取1.35g(5.5 mmol)HCl·H-Val-OBzl加入茄瓶中,并加入NMM 2mL调pH至9,室温下反应12小时,TLC监测反应(乙酸乙酯/石油醚1:2,Rf=0.3),原料点消失终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂,得到黄色粘稠样物,加入乙酸乙酯,超声得到浅黄色混悬液,加入蒸馏水,溶液分层。将混合溶液倒入分液漏斗,将下层液体弃去,保留上层乙酸乙酯层,依次用饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液、饱和KHSO4溶液、饱和NaCl溶液、饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液各萃洗3遍。酯层用无水Na2SO4干燥2小时,利用水泵减压过滤,除去Na2SO4,滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚1:5),得到目标产物,白色蜡状固体,称重1.74g,产率82.86%。
ESI-MS(m/e):421[M+H]+,443[M+Na]+,Mp 88.1-88.5℃;[α]25 D= -39.99(c=0.1,CH3OH)。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=7.98(d,J= 8.2Hz,1H),7.36(d,J=2.9Hz,5H),6.91(d,J=8.4Hz,1H),5.19(m,2H),4.22 (dd,J=8.2,6.2Hz,1H),4.03(m,1H),2.05(m,1H),1.57(s,2H),1.36(s,10H), 0.84(ddt,J=8.9,6.5,3.7Hz,12H).
(二)制备HCl·Leu-Val-OBzl
称取1.74g(4.14mmol)Boc-Leu-Val-OBzl于茄瓶中,加入搅拌子,冰浴搅拌下缓慢滴加17mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4M),并置干燥管,冰浴搅拌下反应6小时后,TLC监测(乙酸乙酯/石油醚1:2,Rf=0.3)原料点消失终止反应。反应液在水泵下减压浓缩,残留物加入20mL无水乙酸乙酯溶解,再减压抽干,重复磨洗3遍,得到白色固体。称重1.35g,产率91.84%。
ESI-MS(m/e):321[M+H]+,Mp 125.3-126.5℃;[α]25 D=-29.99(c=0.1, CH3OH)。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ/ppm=8.39(s,2H),7.77(d,J=7.2Hz, 1H),7.32(s,5H),5.13(q,J=12.2Hz,2H),4.48(t,J=5.9Hz,1H),4.35(s, 1H),2.24(s,1H),1.77(m,1H),1.25(m,2H)0.92(dt,J=16.2,5.5Hz,12H).
(三)制备Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
将1.00g(3.17mmol)Boc-3-(1-萘基)-L-丙氨酸、0.62g(3.25mmol)EDC、 0.43g(3.19mmol)HOBt于茄瓶中,加入搅拌子加入30mL乙腈,冰浴下活化20min,称取1.35g(3.79mmol)HCl·Leu-Val-OBzl加入20mL乙腈溶解于另一茄瓶中,并加入NMM 1mL调pH至9。然后将两反应液混合,反应 12小时,TLC(乙酸乙酯/石油醚1:2,Rf=0.3)监测反应,原料点消失。用旋转蒸发仪去除有机溶剂,得到浅黄色粘稠样物,加入乙酸乙酯,超声得到浅黄色混悬液,加入蒸馏水,溶液澄清分层。将混合溶液转移至分液漏斗,将下层液体弃去,保留上层乙酸乙酯层,依次用饱和NaHCO3、饱和NaCl、饱和KHSO4、饱和NaCl、饱和NaHCO3、饱和NaCl各萃洗3遍。用无水 Na2SO4干燥2小时,利用水泵减压过滤除去Na2SO4,滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚1:5),得到目标产物白色固体,称重1.67g,产率85.20%。
ESI-MS(m/e):618[M+H]+,Mp 152.9-154.2℃;[α]25 D=-59.99(c=0.1, CH3OH)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.15(d,J=8.04Hz,1H), 7.88(d,J=7.53Hz,1H),7.78(d,J=7.86Hz,1H),7.54(m,2H),7.37(m,6 H),7.28(s,1H),6.52(d,J=8.19Hz,1H),6.37(d,J=7.35Hz,1H),5.18(q,J =12.21Hz,2H),4.52(m,2H),4.41(m,1H),3.66(m,1H),3.47(m,1H),2.19 (m,1H),1.95(m,1H),1.38(m,10H),0.90(m,12H).
(四)制备HCL·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
向盛有1.67g(2.71mmol)Boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯于茄瓶中,加入搅拌子,冰浴搅拌下缓慢滴加16mL氯化氢-乙酸乙酯溶液(4M), 并置干燥管,冰浴搅拌下反应6小时后终止反应。TLC监测(乙酸乙酯/石油醚1:2,Rf=0.3)原料点消失终止反应。用水泵将反应液减压抽干,残留物加入20mL乙酸乙酯溶解,再减压抽干,重复磨洗3遍,得到白色固体,称重1.45g,产率97.32%。
ESI-MS(m/e):518[M+H]+,Mp 209.4-210.6℃;[α]25 D=-41.72(c=0.1, CH3OH)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.72(d,J=8.04Hz,1H), 8.42(s,4H),8.32(d,J=7.17Hz,1H),7.94(d,J=7.41Hz,1H),7.84(m,1H), 7.56(m,2H),7.35(s,7H),5.10(d,J=3.27Hz,2H),4.50(d,J=7.47Hz,1H), 4.17(t,J=6.30Hz,2H),3.47(s,2H),3.34(s,2H),3.17(s,1H),2.50(s,4H), 2.10(m,1H),1.61(m,2H),1.38(m,2H),0.92(t,J=8.58Hz,6H),0.84(s,6 H).
(五)制备(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
称取0.55g(3.20mmol)癸酸、0.61g(3.20mmol)EDC、0.43g(3.20mmol) HOBt于茄瓶中,加入搅拌子加入20mL乙腈,冰浴下活化20min;将1.45g (2.62mmol)HCL·NH2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯于另一茄瓶加入20mL乙腈溶解,并加入NMM 1mL调pH至9。将两反应液混合,反应 12小时,有白色固体析出,TLC监测反应(乙酸乙酯/石油醚1:2,Rf=0.3),原料点消失,终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂,得到浅黄色粘稠样物,加入乙酸乙酯,超声得到白色混悬液,加入蒸馏水,不溶解。溶液分层上层为白色乳液,下层溶液澄清。将混合溶液倒入分液漏斗,将下层液体弃去,保留上层乙酸乙酯层,依次用饱和NaHCO3、饱和NaCl、饱和KHSO4、饱和NaCl、饱和NaHCO3、饱和NaCl各洗3遍。用水泵减压过滤,得到白色固体即为产物,称重1.24g,产率70.86%。
ESI-MS(m/e):672[M+H]+,Mp 185.5-187.5℃;[α]25 D=-20.99(c=0.1, CH3OH)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.17(d,J=7.44Hz,3H), 8.11(d,J=8.22Hz,1H),7.90(d,J=7.11Hz,1H),7.76(d,J=7.26Hz,1H), 7.52(m,2H),7.38(s,2H),7.35(s,5H),5.11(d,J=12.54Hz,2H),4.68(m,1 H),4.50(m,1H),4.22(t,J=6.69Hz,1H),3.51(m,1H),3.13(m,1H),2.09 (m,1H),1.97(t,J=6.33Hz,2H),1.59(m,1H),1.45(m,2H),1.22(m,12H), 1.01(s,2H),0.87(m,16H);
13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm=172.68,172.59,171.63,171.57,136.31,134.29,133.81,132.11,128.98,128.83,128.46,127.70,127.36,126.42,125.92,125.67,125.67,124.21,66.22,57.93,53.50,51.36,41.47,35.67,34.90,31.74, 30.30,29.26,29.11,28.86,25.57,24.55,23.49,22.53,22.20,19.36,18.63,14.40.
(六)制备(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸
将1.24g(1.85mmol)(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰- 缬氨酸苄酯加入30mL四氢呋喃,40℃加热溶解,加入钯碳130mg,使用三通管连接反应瓶和氢气袋,先用真空水泵抽走反应液中的空气,然后通入氢气,如此反复3次,确保茄瓶内排除空气布满氢气,室温搅拌6小时,TLC 监测反应(乙酸乙酯/石油醚1:2,Rf=0.3),原料点消失,终止反应,将钯碳过滤,滤液用旋转蒸发仪蒸干,称重0.9g,产率84.11%。
ESI-MS(m/e):580[M-H]-,Mp 77.8-79.8℃;[α]25 D=-11.67(c=0.1, CH3OH)。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.17(t,J=7.68Hz,2H), 7.85(m,2H),7.53(m,1H),7.39(m,1H),4.68(m,1H),4.41(m,1H),4.13(m, 1H),3.54(m,1H),3.37(m,1H),3.14(m,1H),2.23(m,1H),2.03(m,2H), 1.62(m,1H),1.48(m,3H),1.22(m,14H),1.01(s,1H),0.87(m,15H);13C NMR(75MHz,DMSO-d6):δ/ppm=173.14,172.51,172.46,171.71,134.27, 133.81,132.09,128.98,127.71,127.38,126.45,125.94,125.67,124.25,57.46, 57.37,53.41,51.51,41.30,35.65,34.85,33.55,31.75,30.35,29.25,28.85,28.53, 27.85,25.58,24.58,23.55,22.54,22.17,19.51,18.40,14.41.
本实施例总产率为30.98%。
实施例2制备基于(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的紫杉醇胶束
胶束1:称取0.58mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和0.85mg紫杉醇与200ml茄瓶中,加入10ml二氯甲烷溶解,用旋转蒸发仪在35℃下以200rpm的速率旋蒸20min,制成薄膜,加入75%乙醇1ml, 300W功率下超声30min,加入蒸馏水9ml,溶液透明,冻干,得到白色粉末。
胶束2:称取2.9mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和0.85mg紫杉醇与200ml茄瓶中,加入10ml二氯甲烷溶解,用旋转蒸发仪在35℃下以200rpm的速率旋蒸20min,制成薄膜,加入75%乙醇1ml, 300W功率下超声30min,加入蒸馏水9ml,冻干后得到白色粉末。
胶束3:称取5.8mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和0.85mg紫杉醇与200ml茄瓶中,加入10ml二氯甲烷溶解,用旋转蒸发仪在35℃下以200rpm的速率旋蒸20min,制成薄膜,加入75%乙醇1ml, 300W功率下超声30min,加入蒸馏水9ml,冻干后得到白色粉末。
胶束4:称取11.6mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和0.85mg紫杉醇与200ml茄瓶中,加入10ml二氯甲烷溶解,用旋转蒸发仪在35℃下以200rpm的速率旋蒸20min,制成薄膜,加入75%乙醇1ml, 300W功率下超声30min,加入蒸馏水9ml,冻干后得到白色粉末。
胶束5:称取17.4mg(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和0.85mg紫杉醇与200ml茄瓶中,加入10ml二氯甲烷溶解,用旋转蒸发仪在35℃下以200rpm的速率旋蒸20min,制成薄膜,加入75%乙醇1ml, 300W功率下超声30min,加入蒸馏水9ml,冻干后得到白色粉末。
性能测试1
(一)评价不同胶束逆转耐药的作用
1.耐药细胞A549/TAX培养
(1)细胞复苏:将冻存的细胞在37℃的水浴中快速融化,边融化边摇动,吸出细胞悬液转移至离心管中,并加入10mL完全培养基,设置离心机 1000转/分钟,离心5分钟,去除后弃上清,加入新的完全培养基转移至T25 细胞培养瓶中,在37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时,观察细胞生长情况,根据细胞数量进行传代培养。(2)细胞传代:细胞愈合度在80%以上可进行传代,弃去旧培养,加入2mL的PBS缓冲液冲洗2遍,加入1ml 胰酶,放入37℃、5%CO2的培养箱中消化2分钟,轻轻摇晃细胞可脱落,加入新的完全培养基2ml终止消化,用吸管轻轻吹起,将细胞混悬液转移至离心管中,设置离心机1000转/分钟,离心5分钟去除后弃上清,加入新的完全培养基转移至T25细胞培养瓶中,在37℃、5%CO2的培养箱中培养48 小时,观察细胞生长情况。(3)给药培养:将细胞生长状态良好的细胞转移至离心管中,设置离心机1000转/分钟,离心5分钟去除后弃上清,加入加入含有100ng/ml紫衫醇培养基,转移至T25细胞培养瓶中,在37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时,观察细胞生长情况。细胞生长良好,大量存活,继续传代并给与含有200ng/ml紫杉醇的培养基培养,培养至细胞生长稳定,培养至细胞生长稳定。(4)脱药培养:将含有紫衫醇培养基培养的细胞加入1ml胰酶,放入37℃、5%CO2的培养箱中消化2分钟,加入新的完全培养基2ml终止消化,用吸管轻轻吹起,将细胞混悬液转移至离心管中,设置离心机1000转/分钟,离心5分钟去除后弃上清,加入新的完全培养基转移至T25细胞培养瓶中,在37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时,观察细胞生长情况。并进行传代,传代后细胞可用于药物评价。
2.MTT法评价胶束对耐药肿瘤细胞毒性
细胞计数后按照每孔100μL含有5000个细胞种板,放置于37℃,含有 5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养,培养时间6h后加入不同浓度的受试药物(紫杉醇TAX,胶束1~5),每种受试药物设6孔并设置对照孔,对照孔中不给药,只加入含有5‰DMSO完全培养基,放置于37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μL配置好的MTT 溶液(浓度为5mg/mL),再放置于细胞培养箱中进行培养,培养时间约为 4小时,终止培养。取出96孔板,将其放入离心机中进行离心,设置离心机转速为1000rpm,10min。离心后小心取出96孔板,将孔内的培养液吸除干净,再用枪头向每孔中加入150μL的DMSO,将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀,使结晶物甲臜充分溶解于DMSO中。最后,在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm,测定各孔的吸光度值,与对照组相比计算细胞的存活率。利用GrapHPad Prism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算IC50。实验共重复三次,然后取平均值。
A549细胞测得TAX的IC50为4.26±0.78,A549/TAX细胞测得TAX的 IC50为51.72±3.69,耐药倍数12.14倍。A549细胞检测下胶束1~5的IC50值如图1所示,由图1可以看出,不同比例(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基) 丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与紫杉醇混合制成的胶束中,随着化合物比例的增加,逆转耐药倍数不断变化,胶束4和胶束5无统计学差异p>0.05。胶束4的IC50 为2.28±0.23,逆转耐药倍数为22.68。由此可以看出,本发明提供的紫杉醇胶束具有良好的抗逆转耐药作用。
(二)评价各胶束对体外LLC细胞的细胞毒性
按照每孔100μl含有5000个细胞种板,放置于37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养,培养时间6h后加入药物,每种受试药物设6 孔并设置对照孔,对照孔中不给药,只加入含有5‰DMSO完全培养基,放置于37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μL配置好的MTT溶液(浓度为5mg/mL),再放置于细胞培养箱中进行培养,培养时间约为4小时,终止培养。取出96孔板,将其放入离心机中进行离心,设置离心机转速为1000rpm,10min。离心后小心取出 96孔板,将孔内的培养液吸除干净,再用枪头向每孔中加入150μL的DMSO,将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀,使结晶物甲臜充分溶解于DMSO中。最后,在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm,测定各孔的吸光度值,与对照组相比计算细胞的存活率。利用GraphPad Prism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算IC50。实验共重复三次,然后取平均值,所得结果如图2所示,由图2可以看出,各胶束的IC50值明显低于TAX。
(三)评价不同浓度的胶束4对细胞凋亡的影响
在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35.8KD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异结合。FITC-Annexin-V 结合到凋亡细胞后,在蓝色光的激发下,发出绿色荧光,区分出凋亡细胞和正常细胞,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测。碘化丙啶(propidineiodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早期细胞、晚期细胞以及死细胞区分开来。
采用流式细胞术检测胶束4对A549/TAX细胞凋亡的影响。首先细胞培养:将1×106个/ml细胞接种于六孔板中,每孔接种1ml,放置于37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养,培养时间6h后分别加入含有2, 5,10μM紫杉醇的胶束4,在37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养24h。细胞收集采用以下方式:
1.用移液枪吸去培养基,每孔加入加入不含EDTA的胰酶300ul,消化1 分钟后加入含血清培养基终止消化,转移至离心管中,设置离心机1000转/ 分钟,离心5分钟去除后弃上清,并用冷的PBS洗涤,再次离心,弃上清。
2.用1ml稀释的1×Binding Buffer悬浮细胞,300×g离心10min,弃上清。再加入1ml 1×Binding Buffer重悬细胞,使细胞密度达到1×106个/ml。
3.各样本取200μl细胞液(含细胞2×105个)于EP管中,再向管中加入10μlAnnexin-V-FITC,室温避光,轻轻摇匀,孵育10min。再加入PI 10μl,室温避光,轻轻摇匀,孵育5min。
4.加入PBS 500μl,轻轻混匀,过滤膜,1小时内用流式细胞仪监测。
细胞凋亡图片如图3所示,细胞凋亡比例图如图4所示。图3、4中a 为对照组(含有5‰DMSO完全培养基),b为含2μM TAX的胶束4,c 为含5μM TAX的胶束4,d为含10μM TAX的胶束4。由图3、4可以看出, TAX的胶束4可显著增加肿瘤细胞的凋亡比例,并且凋亡比例随着浓度增加而增加。
(四)评价胶束4对细胞骨架的影响
Phalloidin(鬼笔环肽),是从伞菌目中分离到的一种七个氨基酸的短肽,它以极高的亲和力和特异性结合肌动蛋白丝F-actin(聚合形式的肌动蛋白)。肌动蛋白是一种球状的,约42kDa的蛋白质,几乎存在于所有的真核细胞中。它是细胞中微丝的基本组成单位,参与细胞骨架的构成。肌动蛋白参与许多重要的细胞过程,包括肌肉收缩、细胞运动、细胞分裂和胞质分裂、囊泡和细胞器运动、细胞信号传导,以及细胞连接和细胞形态的建立和维持。利用FITC标记的Phalloidin对不同药物作用细胞进行染色,评价药物对细胞骨架的影响。
首先细胞培养:将1×106个/ml细胞接种共聚焦小皿中,放置于37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养,培养时间6h后分别加入含有 5‰DMSO完全培养基、5μM TAX、胶束4(含TAX 5μM)在37℃,含有 5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养24h。吸出培养基,用移液枪吸取PBS 洗涤一次,吸出PBS,加入4%甲醛室温固定20min,然后将甲醛吸出,加入PBS清洗固定细胞3次。
配置Phalloidin FITC工作液,将1μl的1000X Phallodin结合储备液加入 1mlPBS(含1%BSA)中混合均匀。每个共聚焦小皿加入1ml Phalloidin FITC工作液,室温下培养60min,PBS洗涤3次。在Ex/Em=492/518nm处,观察细胞。
不同培养细胞的染色图如图5所示,荧光强度比较图如图6所示,图5 和图6中,a:含有5‰DMSO完全培养基;b:5μM TAX;c:胶束4(含 TAX 5μM)。由图5和图6可以看出,相对于游离的TAX,胶束4能显著增加TAX对细胞骨架蛋白的作用。
(五)评价药物对A549/TAX细胞凋亡相关蛋白表达
1.细胞准备
取2×106个对数生长期细胞,接种于100mm×20mm培养皿中,加入 6~8ml R1640完全培养基,1号接种A549细胞株,2、3、4号接种A549/TAX 细胞株,在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养时间6h后,1号和2号分别含有5‰DMSO完全培养基,3号加入TAX 2μM,4号加入胶束4(含 TAX2μM),在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养时间48h。
2.细胞裂解
配制细胞裂解液每毫升含有:950μl RIPA+40μl protein kinase inhibitis+10μl PMSF,并置于冰盒内保存。
用移液枪吸去培养液后,加入4℃PBS清洗3遍,在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS,尽量在冰上操作。加入配置好的冷的细胞裂解液 500μl,然后用细胞刮刀刮细胞,收集细胞碎片和裂解液移至1.5ml EP管中,置于冰盒内。提前设置离心机4℃预冷,设置离心机12000rpm,15min。离心后用移液枪吸取上清,可放于-20℃保存,长时间存放可置于-70℃冰箱。
3.蛋白含量测定
1)绘制标准曲线取一块96孔板,按表1加入稀释试剂,根据孔数量,按照50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配置BCA工作液,每孔加入200μL。将96孔板放在振荡器上振荡30s,放于37℃的孵箱中孵育 30min,然后在562nm下测吸光度,绘制BCA蛋白含量标准曲线。
表1不同孔中加入的稀释剂用量
2)稀释待测样品至适当浓度,使稀释样品总体积为20μL,加入BCA 工作液200μL,在振荡器振荡30s后,置于37℃的孵箱中孵育30min,然后在562nm下测吸光度。根据标准曲线计算相应的蛋白含量,并适当稀释蛋白浓度。
4.蛋白变性
每400μL细胞裂解样本加入100μL的5×蛋白上样缓冲液,涡旋混匀,置于100℃金属浴加热5min,然后转移至冰盒,使蛋白变性。
5.WesterBlot蛋白免疫印迹实验
1)配制10%SDS-PAGE凝胶电泳:上层为5%的浓缩胶,下层为10%的分离胶。首先按一定比例配置10%的分离胶,混合均匀,用移液枪均匀加入两层玻璃板中间(加入高度为距离加样孔底端1cm),用去离子水封闭。室温静置,待胶凝固后,将去离子水倒掉,并用吸水纸吸干残留水分。然后配置5%浓缩胶,用移液枪均匀加满上层,避免气泡产生,插入梳子。待浓缩胶凝固后,将胶板安装在电泳槽内,加入电泳缓存液,取下梳子。
2)样品上样:将配置好的样本加入各胶孔,Marker5μL作为标记。设置90V电压30min,然后转成120V电压60min,至溴酚蓝跑至底端。
3)转膜:将滤纸和PVDF膜剪成6cm×8cm大小,并将PVDF膜甲醇浸泡15min,使其活化;将滤纸和海绵用预冷的1×转膜液充分浸泡,避免产生气泡。将电泳后的凝集小心拆下,切除浓缩胶。按照从负极到正极是海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序安装于夹板内,每层之间都要排除空气,将夹板安装于电转槽中,加入预冷的1×转膜液,电转槽周围加冰盒,设置100V电压75min。
4)封闭:用1×TBST和脱脂奶粉配置5%的牛奶封闭液,将转膜后的 PVDF膜浸没于5%的牛奶封闭液中,在水平摇床上室温孵育1h。
5)孵育一抗:根据Marker所示的分子量范围,剪切需要的目标条带。用5%牛奶封闭液配置按照比例配置一抗,将目标条带浸泡于一抗工作液中,在4℃冰箱中,孵育过夜。
6)孵育二抗:将一抗孵育的条带,用1×TBST洗涤3次,每次置于摇床上摇动10min。按照比例用5%牛奶封闭液配置二抗,室温置于水平摇床上孵育1h。
7)显色:将二抗孵育后的条带,用1×TBST洗涤3次,每次置于摇床上摇动10min。按照A液和B液1:1的比例配置ECL工作液,现用现配避光保存。取出条带置于保鲜膜上,滴加ECL工作液,并用保鲜膜覆盖,用凝胶成像系统进行成像。
所得成像结果如图7所示。由图7可以看出,P53蛋白在A549/TAX细胞表达较A549细胞有所增强,胶束4可适当降低它的表达量。Bax、Bcl-2 共属于Bcl-2基因家族,但Bax在A549/TAX细胞和A549细胞表达量相当,胶束4可以降低Bcl-2表达。LC3A/B在A549/TAX细胞比A549细胞表达量增加,胶束4可降低LC3A/B的表达,说明胶束4可能通过降低自噬增强凋亡的方式,影响细胞的活性。
(六)细胞划痕实验
A549细胞属于贴壁依赖型细胞株,具有转移性。取对数生长期的细胞,显微镜下观察细胞生长状态良好形态饱满,透明度大,折光性良好,均贴壁且培养液上清透明无漂浮物,弃去原培养基,加入2mL PBS缓冲液清洗2 次后,加入1ml胰酶消化细胞2min,加入含血清培养基终止消化,用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散,将细胞混悬液转移至经过灭菌的15mL 离心管中,设置离心机1000转/分钟,离心5分钟去除后弃上清,加入新的R1640完全培养基重悬,利用细胞计数板在显微镜下进行计数,配成细胞浓度为5×105个/mL的细胞悬液。取12孔板,每孔加入1mL细胞悬液,轻轻摇匀,使细胞均匀铺在孔的底部,置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中进行培养6小时,使细胞贴壁,并用移液枪枪头在孔底划1cm长的线。
用移液枪吸除培养基和悬浮的细胞,更换新的R1640完全培养基2mL,并给与不同的药物,用Lecia倒置显微镜拍摄。所得细胞划痕图如图8所示,图8中,a:含有5‰DMSO完全培养基;b:RGDS 20μM;c:化合物20μ M;d:胶束4(含TAX 1μM);e:TAX 1μM。由图8可以看出,相对于游离的TAX,在细胞划痕实验中胶束4能显著抑制细胞的迁徙。
(七)评价体外抗肿瘤细胞迁移活性(Transwell小室模型)
利用A549、A549/TAX、LLC细胞细胞评价化合物和胶束4体外抗抗迁移活性。取对数生长期的细胞,弃去原培养基,加入2mL PBS缓冲液清洗 2次后,加入1ml胰酶消化细胞2min,加入含血清培养基终止消化,用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散,将细胞混悬液转移至经过灭菌的15mL 离心管中,设置离心机1000转/分钟,离心5分钟去除后弃上清,加入5mL 不含血清培养基,混匀后再次离心,弃上清,目的是除去残留的含血清的培养基。用滴管轻轻吹打细胞使其分散均匀,利用细胞计数板在显微镜下进行计数,并加入适量不含血清培养基,配成细胞浓度为5×105个/mL的细胞悬液。Transwell小室上室每孔加入100μL细胞悬液,同时加入受试药物的溶液25μL。下室加入600μL含血清的RPMI-1640培养基,放置于37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养8小时。
8小时后,从孵箱中取出Transwell小室,使用移液枪将上室液体小心吸出,避免破坏Transwell的聚碳酸酯膜,并在上室每孔中加入100μLPBS缓冲液进行洗涤,使用移液枪将上室液体小心吸出,用蓬松的棉签轻轻擦去残留的液体,重复此操作3次使上室膜上无细胞残留。使用移液枪将下室液体吸出,并加入600μL4%多聚甲醛,固定上室膜下侧细胞30min,30min后吸除下室4%多聚甲醛,每孔中加入600μL 0.1%的结晶紫染色液,染色15min,15min后吸除染色液并用镊子夹住小室边缘,放入盛有蒸馏水的烧杯清洗,重复洗涤3次。置于通风橱晾干后于显微镜下拍照计数。每孔选取9个视野,每个视野细胞分布均匀且数量基本一致,并利用ImageJ软件进行计数。
A549细胞染色结果如图9所示。图9中A~F分别为不同的受试药物,其中A:PBS,B:TAX 0.5μM,C:TAX 1μM,D:RGDS20μM,E:胶束 4(含TAX 0.5μM),F:胶束4(含TAX 1μM)。
不同受试药物体外抑制A549细胞迁移结果如表2所示。
表2不同受试药物体外抑制A549细胞迁移结果
注:n=9,经过t检验,a:与PBS组相比,P<0.01。
A549/TAX细胞的染色结果如图10所示。图10中A~E分别为不同的受试药物,其中A:PBS,B:RGDS 20μM,C:化合物(S)-2-癸酰氨基-3- (1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸20μM,D:TAX 1μM,E:胶束4(含TAX 1μM)。
不同受试药物体外抑制A549/TAX细胞迁移结果如表3所示。
表3不同受试药物体外抑制A549/TAX细胞迁移结果
注:n=9,经过t检验,a:与PBS组相比,P<0.01;b:与PBS组相比,P>0.05。
LLC细胞的染色结果如图11所示。图11中A~E分别为不同的受试药物,其中A:PBS,B:TAX 1μM,C:胶束4(含TAX 1μM),D:RGDS 20μM, E:化合物(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸20mΜ。
不同受试药物体外抑制LLC细胞迁移结果如表4所示。
表4不同受试药物体外抑制LLC细胞迁移结果
注:n=9,经过t检验,a:与PBS组相比,P<0.01;b:与RGDS组相比,P>0.05。
由表2~4可以看出,本发明提供的紫杉醇胶束具有良好的体外抗肿瘤细胞迁移活性。
(八)评价化合物及胶束4体外抗肿瘤细胞侵袭活性(Transwell小室模型)
利用Transwell小室评价体外抗A549、A549/TAX、LLC细胞的细胞侵袭活性,需要先在Transwell小室上室铺一层基质胶,模拟肿瘤细胞发生侵袭时的体内环境。
实验方法:
1)包被基质胶:将冻存于-20℃冰箱中呈固态的Matrigel基质胶置于4℃冰箱过夜,使Matrigel基质变成粉红色的液态。取960μL无血清R1640 培养基加入240μLMatrigel基质胶,充分混和均匀,加入至Transwell小室上室,每孔加100μL,然后Transwell小室将37℃,5%CO2的细胞孵箱中孵育5h,使基质胶凝固。
2)水化基底膜:用移液枪小心吸除上室剩余液体,加入50μL相应无血清培养基,置于37℃,5%CO2的细胞孵箱中孵育30min。之后用移液枪小心吸除上室剩余液体。
3)接种细胞:取对数生长期的细胞,显微镜下观察细胞生长状态良好形态饱满,透明度大,折光性良好,均贴壁且培养液上清透明无漂浮物,弃去原培养基,加入2mLPBS缓冲液清洗2次后,加入1ml胰酶消化细胞2min,加入含血清培养基终止消化,用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散,将细胞混悬液转移至经过灭菌的15mL离心管中,设置离心机1000转/分钟,离心5分钟去除后弃上清,加入5mL不含血清培养基,混匀后再次离心,弃上清,目的是除去残留的含血清的培养基。用滴管轻轻吹打细胞使其分散均匀,利用细胞计数板在显微镜下进行计数,并加入适量不含血清培养基,配成细胞浓度为5×105个/mL的细胞悬液。Transwell小室上室每孔加入100 μL细胞悬液,同时加入受试药物的溶液25μL,设置复孔。下室加入600 μL含血清的RPMI-1640培养基,放置于37℃,含有5%CO2环境的细胞培养箱中进行培养12小时。
4)后处理:使用移液枪将上室液体小心吸出,并在上室每孔中加入100 μLPBS缓冲液进行洗涤,使用移液枪将上室液体小心吸出,用蓬松的棉签轻轻擦去残留的液体,重复此操作3次。使用移液枪将下室液体吸出,并加入600μL4%多聚甲醛,固定上室膜下侧细胞30min,30min后吸除下室4%多聚甲醛,每孔中加入600μL 0.1%的结晶紫染色液,染色15min,15min 后吸除染色液并用镊子夹住小室边缘,放入盛有蒸馏水的烧杯清洗,重复洗涤3次。置于通风橱晾干后于显微镜下拍照计数。每孔选取9个视野,每个视野细胞分布均匀且数量基本一致,并利用ImageJ软件进行计数。
A549细胞染色结果如图12所示。图12中a~e分别为不同的受试药物,其中a:PBS,b:RGDS20μM,c:化合物20μM,d:TAX 1μM,e:胶束4(含TAX 1μM)。
不同受试药物体外抑制A549细胞侵袭活性结果如表5所示。
表5不同受试药物体外抑制A549细胞侵袭活性结果
注:n=9,经过t检验,a:与PBS组相比,P<0.01;b:与PBS组相比,P<0.05。
A549/TAX细胞染色结果如图13所示。图13中a~e分别为不同的受试药物,其中a:PBS,b:RGDS20μM,c:化合物(S)-2-癸酰氨基-3-(1- 萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸20μM,d:TAX 1μM,e:胶束4(含TAX 1 μM)。
不同受试药物体外抑制A549/TAX细胞侵袭活性结果如表6所示。
表6不同受试药物体外抑制A549/TAX细胞侵袭活性结果
注:n=9,经过t检验,a:与PBS组相比,P<0.01;b:与PBS组相比,P>0.05。
LLC细胞染色结果如图14所示。图14中a~e分别为不同的受试药物,其中a:PBS,b:RGDS 20μM,c:化合物(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基) 丙酰基-亮氨酰-缬氨酸20μM,d:TAX 1μM,e:胶束4(含TAX 1μM)。
不同受试药物体外抑制LLC细胞侵袭活性结果如表7所示。
表7不同受试药物体外抑制LLC细胞侵袭活性结果
注:n=9,经过t检验,a:与PBS组相比,P<0.01。
由表5~7可以看出,本发明提供的紫杉醇胶束具有良好的体外抗肿瘤细胞侵袭活性。
(九)评价体内抗肿瘤及抗转移活性(小鼠Lewis肺癌转移模型)
采用雄性C57小鼠(体重20±2g)。取对数期生长的LLC细胞,37℃ PBS洗涤2遍,加入胰酶消化细胞2min,加入含血清培养基终止消化,用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散,将细胞混悬液转移至经过灭菌的15 mL离心管中,设置离心机1000转/分钟,离心5分钟去除后弃上清,并用4℃ PBS洗绦两次,细胞计数后适当稀释,调整细胞浓度5×107个/mL,每只皮下注射0.2mL接种于右腋下,2周后右下肿块增长至2000mm3,将鼠安乐死之后,取出肿瘤,剪切成1mm3碎块,并轻轻研磨,过滤后,制成细胞悬液,细胞计数后适当稀释,调整细胞浓度1×107个/mL,每只皮下注射0.2mL接种于右腋下。
6天后肿瘤体积长至100mm3,将小鼠随机分组每组6只。每组分别给药是为化合物55mg/kg,TAX 5mg/kg,胶束4含TAX 2mg/kg,胶束4含 TAX 0.4mg/kg,NS 0.2ml为阴性对照。
每日进行给药,观察小鼠生长状况,隔日测量体重和瘤体积,连续给药 9天,第十天将小鼠安乐死,用剪刀剪开皮肤,暴露肿瘤组织,钝性分离保持肿瘤组织的完整,取出肿瘤组织,并暴露胸腔,取出肺,放入盛有生理盐水的表面皿中,去除附着的血液成分,对肺转移病灶点进行计数,并且拍照观察。
不同受试药物对小鼠Lewis肺癌转移的影响结果如表8所示。
表8不同受试药物对小鼠Lewis肺癌转移的影响结果
不同时间内肿瘤的体积变化如图15所示,不同时间内肿瘤的质量如图 16所示。由图15、16可以看出,相对于游离的TAX,胶束4中TAX降低了2.5倍和12.5倍,但依然能显著抑制肿瘤的生长和肺部转移的瘤结数,剂量降低的情况下抗肿瘤活性和抗肿瘤转移活性无显著差异。
(十)评价体内抗A549/TAX肿瘤效果
取对数生长期的A549/TAX细胞,37℃PBS洗涤2遍,加入胰酶消化细胞2min,加入含血清培养基终止消化,用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散,将细胞混悬液转移至无菌的15mL离心管中,设置离心机1000转/ 分钟,离心5分钟去除后弃上清,并用4℃PBS洗绦两次,细胞计数后适当稀释,调整细胞浓度5×107个/mL,放入冰盒中待用,小鼠选用Balb/cnude 雄鼠,5周龄,体重15-16g,每只皮下注射0.1mL接种于右腋下。观察肿瘤生长情况,每周2次测量肿瘤体积,待肿瘤接种第12天体积达到 100~200mm3,将裸鼠随机分组每组6只。每组分别给药是为化合物55mg/kg, TAX 4mg/kg,胶束4含TAX 4mg/kg,胶束4含TAX 1mg/kg,NS 0.2ml为阴性对照,腹腔注射隔日给药,连续给药18天,共9次。待肿瘤接种后第 31天,将小鼠用乙醚麻醉,麻醉后进行眼球取血,取出的血进行血常规和生化指标的测量。并将小鼠安乐死,用剪刀剪开皮肤,暴露肿瘤组织,钝性分离保持肿瘤组织的完整,取出肿瘤组织,并暴露胸腹腔,取出心、肝、脾、肾称重。
各组药物体内抗肿瘤活性如表9所示,各组药物对小鼠血细胞的影响如表10所示。
表9各组药物体内抗肿瘤活性
注:经t检验,a表示与NS组相比,P<0.01;b表示与NS组相比,P>0.05。
表10各组药物对小鼠血细胞的影响
由表9和表10可以看出,相对于游离的TAX,胶束4中TAX即使剂量相同,在PLT和RBC指标上也优于游离的TAX组。
给药前小鼠各部位的脏体比如图17所示、给药后小鼠各部位的脏体比如图18所示。由图17、18可以看出,相对于游离的TAX,胶束4中TAX 即使剂量相同,在脏体比上与游离的TAX组无显著性差异。
(十一)评价胶束4在皮下移植瘤中抗肿瘤机制研究
将肿瘤取出后用4%多聚甲醛室温固定48小时后,进行HE和荧光切片制作。①经固定的肿瘤组织经过75%、90%、95%的乙醇梯度脱水,每次浸泡2小时;②将脱水后组织浸泡于二甲苯中2小时,更换二甲苯,再浸泡2 小时,以便于充分替换出乙醇;③预先将石蜡至于烘箱中融化,将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中,浸泡2小时,待石蜡完全浸入组织块后进行包埋;④将包埋组织的蜡块冷却凝固后,在切片机上切成5~8mm薄片;⑤将切下的薄片放入40℃水浴展平,贴到载玻片上;⑥将载玻片放入40℃的烘箱中烘干;⑦将切片进行HE染色和免疫荧光染色,利用全自动切片扫描机将切片进行扫描,观察组织形态。
所得免疫荧光染色图如图19所示,HE染色图如图20所示。CD206是M2型巨噬细胞标志物,具有高度特异性,与肿瘤细胞的增殖和转移有一定关系。有研究表明M2型巨噬细胞在体外具有肿瘤促进作用。胶束4含 TAX4mg/kg的剂量可以明显降低CD206和tublin的表达,抑制肿瘤转移,影响细胞骨架结构。HE切片中可以看到细胞质消失,细胞核固缩。因此,胶束4可以促进细胞凋亡,抑制肿瘤转移。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的紫杉醇胶束,包括(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和紫杉醇。
2.根据权利要求1所述的紫杉醇胶束,其特征在于,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与紫杉醇的质量比为0.68~20:1。
3.根据权利要求2所述的紫杉醇胶束,其特征在于,所述(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与紫杉醇的质量比为3.4~13:1。
4.权利要求1~3任意一项所述紫杉醇胶束的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将(S)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、紫杉醇与第一有机溶剂混合,得到混合液,将所述混合液制成薄膜;
(2)将所述薄膜与第二有机溶剂混合,进行超声,得到超声溶解液;
(3)将所述超声溶解液与水混合,进行冻干,得到紫杉醇胶束。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述第一有机溶剂为二氯甲烷、二氧六环和四氢呋喃中的一种或几种。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述制成薄膜的方式为旋转蒸发,所述旋转蒸发的温度为30~40℃,时间为15~60min;所述旋转蒸发的速率为100~300rpm。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述第二有机溶剂为乙醇、甲醇和乙腈中的一种或几种。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述超声的功率为300~400W,时间为10~30min。
9.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述超声溶解液与水的体积比为1:0.9~1.2。
10.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述冻干的温度为-40~-20℃,时间为12~24h。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101023119A (zh) * | 2004-09-22 | 2007-08-22 | 日本化药株式会社 | 新型嵌段共聚物,胶束制剂以及含胶束制剂为活性组分的抗癌剂 |
CN104095814A (zh) * | 2014-07-10 | 2014-10-15 | 苏州大学 | 一种三嵌段聚合物胶束、制备方法及应用 |
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Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN107441501B (zh) * | 2016-07-01 | 2020-11-10 | 四川大学 | 抗菌肽修饰的载药脂质体及其制备方法和用途 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101023119A (zh) * | 2004-09-22 | 2007-08-22 | 日本化药株式会社 | 新型嵌段共聚物,胶束制剂以及含胶束制剂为活性组分的抗癌剂 |
CN104095814A (zh) * | 2014-07-10 | 2014-10-15 | 苏州大学 | 一种三嵌段聚合物胶束、制备方法及应用 |
WO2017167929A1 (en) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | Universite De Strasbourg | Amphiphilic monomers based nanovectors and their use for sirna delivery |
CN110652595A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-01-07 | 南通大学附属医院 | 一种聚亮氨酸-聚天冬氨酸嵌段共聚物立构复合载药胶束及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Amphiphilic Peptides With Arginine and Valine Residues as siRNA Carriers;Dong-Wook Ryu等;《Journal of Cellular Biochemistry》;20110928;第113卷;第619-628页 * |
Leucine-Based Block Copolymer Nano-Objects via Polymerization-Induced Self-Assembly (PISA);Kamal Bauri等;《Macromol. Symp.》;20161231;第369卷;第101-107页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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GR01 | Patent grant | ||
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