CN113953522B - 一种正电性金纳米簇及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种正电性金纳米簇及其制备方法与应用，属于功能性生物纳米材料技术领域。该正电性金纳米簇通过把氨基或胍基与硫辛酸相连后作为配体分子与氯金酸及硼氢化钠反应获得。本发明的正电性金纳米簇的制备方法简单，操作性强，成本低，易于大规模制备；材料表面亲水性强，避免了纳米粒子的团聚，生物相容好，毒性低，发射荧光涵盖红光～近红外波段，易于与生物组织的自发荧光区分，对细胞核的靶向性高，与细胞孵育后主要富集在细胞核内，其中硫辛酸‑氨基乙基胍作为配体合成的金纳米簇相比于以硫辛酸‑乙二胺为配体合成的金纳米簇的细胞核靶向性更明显，可用于细胞核标记、核酸转染等，在生物医学领域有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于功能性生物纳米材料技术领域，具体涉及一种正电性金纳米簇及其制备方法与应用。
背景技术
荧光金纳米簇因其超微小尺寸、明确的结构组成、化学惰性、良好的生物安全性和特殊的荧光发射能力，在化学、生物和医学领域有潜在的应用价值。目前用于制备荧光金纳米簇的方法主要有两类：(1)刻蚀法，即通过合适的刻蚀分子把不发光、尺寸较大的金纳米颗粒刻蚀成可发射荧光且粒径较小的金纳米簇；(2)模板法，即以蛋白质、多肽、核酸、小分子等作为稳定剂和金离子反应，限制金纳米颗粒的生长，使金离子主要还原成荧光金纳米簇。金纳米簇的性质(尤其是生物学性质)与其表面修饰的分子密切相关，通过设计配体分子并以合适的比例与金离子反应，可得到具有特定功能的荧光金纳米簇。
靶向细胞核的金纳米簇有特殊的应用价值。细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构。细胞核是遗传信息库，是细胞代谢和遗传的控制中心。对细胞核进行标记或者把药物、核酸、蛋白等输送进入细胞核是重要而且时常进行的生物学实验。目前已有商品化的细胞核标记或者转染的试剂，但它们往往只有单一的功能。荧光金纳米簇因其超微小的尺寸和特殊的物理、化学性质，使其具有同时实现细胞核标记、转染、治疗功能的潜力，例如：应用金纳米簇的荧光发射性质可进行细胞核的标记和实时观察；利用金元素强烈的增敏效应可提高X射线对细胞核内核酸的放射损伤；通过设计合适的表面修饰分子可使金纳米簇具备转染药物、核酸、蛋白进入细胞核内的功能。但要实现这些功能，首先需要制备出高效靶向细胞核的荧光金纳米簇。王晓娟等以KCK肽(CN 106010513 A)或者KRKC和GSH两种多肽(CN 106085420 A)作为稳定剂修饰，通过设计多肽序列保证金属团簇的稳定性，制备出对细胞核仁具有靶向标记作用的红色荧光金纳米簇；Wang等以包含细胞穿膜肽序列的多肽为修饰分子，制备出具有明显细胞核靶向性的金纳米簇(Chem.Commun.,2012,48,871–873)。这些采用多肽作为修饰分子的方法虽然能制备出靶向细胞核的金纳米簇，但多肽的合成成本很高，导致难以采用这些方法进行大批量制备。
发明内容
为了克服现有技术中细胞核靶向性金纳米簇制作成本高、制作工艺复杂的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种正电性金纳米簇。该正电性金纳米簇可高效靶向细胞核。
本发明的另一目的在于提供上述正电性金纳米簇的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述正电性金纳米簇的用途。
本发明提出一种把氨基或胍基与硫辛酸相连后作为配体分子，并用于制备表面带明显正电荷的荧光金纳米簇的方法。通过细胞实验证明了此类荧光金纳米簇具有明显的细胞核靶向性质，可主要富集在细胞核内。此类荧光金纳米簇可应用于细胞核标记，核酸转染中，在生物医学领域有潜在的应用价值。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种正电性金纳米簇，通过把氨基或胍基与硫辛酸相连后作为配体分子与氯金酸及硼氢化钠反应获得。
优选的，所述的配体分子为硫辛酸-乙二胺和硫辛酸-氨基乙基胍中的至少一种。
(1)配体分子硫辛酸-乙二胺，其分子式为C10H20N2OS2，分子量为248.4，化学结构式如下：
合成路线：硫辛酸和N'N-羰基二咪唑溶解在二氯甲烷中，然后加入到含有乙二胺的二氯甲烷溶液中，加入过程中用冰浴对反应液进行冷却，加完继续搅拌1～5小时(优选3小时)，然后用饱和食盐水洗涤3～5次，用1％KHSO4水溶液提取1～3次，合并水层，用饱和氢氧化钠溶液调至碱性，然后用乙酸乙酯提取3～4次，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，最后旋蒸去除有机溶剂，得到浅黄色固体，即为硫辛酸-乙二胺。
优选的，硫辛酸：N'N-羰基二咪唑摩尔用量比为1：1.2～2.0，硫辛酸：乙二胺的摩尔用量比为1：5～20。
进一步的，硫辛酸：N'N-羰基二咪唑摩尔用量比为1：1.3，硫辛酸：乙二胺的摩尔用量比为1：8。
优选的，硫辛酸和N'N-羰基二咪唑的混合液加入乙二胺的方式为滴加。
(2)配体分子硫辛酸-氨基乙基胍，其分子式为C11H23N4OS2 +，分子量为291.4，化学结构式如下：
合成路线：硫辛酸-乙二胺溶于二氯甲烷中，加入1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，溶液在室温下搅拌2～10小时(优选4小时)，然后旋蒸去除溶剂，得到粗产物，经过洗涤纯化和干燥后得到硫辛酸-氨基乙基胍。
优选的，硫辛酸-乙二胺和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐的摩尔用量比例为1：1～1.5；进一步为1：1。
优选的，纯化方式为：粗产物溶于少量甲醇中，加入5～10倍量的乙醚，溶液中出现固体，离心收集固体，用乙醚冲洗，然后真空干燥。
本发明还提供一种正电性金纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
将配体分子溶解在水中，配置成一定浓度的溶液；取配体分子溶液与氯金酸水溶液混合，振摇反应液1～5分钟(优选2分钟)，然后加2～20倍量(优选2.5倍量)的水稀释，再加入新配置的NaBH4溶液进行还原，反应液避光反应，然后透析纯化，即得到正电性金纳米簇溶液。
优选的，反应容器为高透明度的塑料管或者经王水浸泡过夜的玻璃瓶。
所述的配体分子为硫辛酸-乙二胺和硫辛酸-氨基乙基胍中的至少一种。
所述的配体分子溶液的浓度为1mM～10mM，进一步为5mM。
优选的，硫辛酸-乙二胺或硫辛酸-氨基乙基胍溶液的浓度分别为1mM～10mM，进一步为5mM。
进一步的，使用硫辛酸-乙二胺和硫辛酸-氨基乙基胍的混合物作为配体时，二者的比例可任意调控。
优选的，氯金酸水溶液的浓度为1mM～25mM，进一步为5mM。
优选的，配体分子和氯金酸的摩尔比为2.0～3.5：1，进一步为3：1。
优选的，NaBH4溶液的浓度为0.001～0.02M，进一步为0.01M。
优选的，NaBH4和氯金酸的摩尔比为1：1～5，进一步为1/2～3/5。
优选的，避光反应的温度为20～40℃，反应时间为5～48小时；进一步为5～24小时。
优选的，纯化方式采用超滤或透析，超滤管和透析袋的截留分子量为1000～20000Da，进一步为1000Da。
本发明的正电性金纳米簇，粒径范围在1～2nm，当用波长范围在350nm～480nm的激发光对金纳米簇进行激发，可得到波长范围在550nm～800nm的荧光。进一步，激发光为405nm时，收集的荧光波段为600～750nm，发射峰为695nm。
本发明再提供上述正电性金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的用途，进一步可应用于对肿瘤细胞核进行标记，核酸转染，或者增强放射线对肿瘤细胞的损伤。
应用正电性金纳米簇对肿瘤细胞核进行标记成像，采用如下步骤：
肿瘤细胞悬浮液加入到共聚焦显微镜培养皿中，然后加入正电性金纳米簇，孵育一段时间后用PBS冲洗，再重新加入PBS，然后用共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像，成像时采用的激发光为405nm，收集的荧光波段为600～750nm。
优选的，细胞密度为2×104～2×105个/皿，进一步为2×104个/皿。
优选的，正电性金纳米簇的浓度为10～200μM(进一步为100μM)，用量为50～100μL(进一步为100μL)。
优选的，孵育时间为10分钟～1小时，进一步为30分钟。
应用金纳米簇增强放射线对肿瘤细胞的损伤，采用如下步骤：
肿瘤细胞在细胞培养瓶中贴壁生长24h，然后加入正电性金纳米簇，孵育一段时间后用X射线对细胞进行照射，然后检测细胞的短期和长期活性。检测细胞的短期活性采用的方法是：辐照结束后继续孵育细胞12h，然后用PBS小心冲洗细胞，再对贴壁的细胞进行计数。检测细胞的长期活性采用的方法是：辐照结束后把细胞接种于6孔塑料培养板中，每个孔的细胞个数为100个，然后培养9～15天，直至出现肉眼可见的细胞团，然后吸掉培养基，用PBS冲洗3遍，再用0.4％结晶紫染色，肉眼数染色后的细胞团数目，用于计算细胞的增殖能力。
优选的，细胞密度为1×105～1×106个/瓶，进一步为1×105个/瓶。
优选的，正电性金纳米簇的浓度为10～200μM(进一步为100μM)，用量为200～1000μL(进一步为200μL)。
优选的，孵育时间为10分钟～1小时，进一步为30分钟。
优选的，X射线能量为160kVp，照射剂量为2～8Gy。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的正电性金纳米簇的制备方法简单，操作性强，成本低，易于大规模制备；材料表面亲水性强，避免了纳米粒子的团聚，生物相容好，毒性低，发射荧光涵盖红光～近红外波段，易于与生物组织的自发荧光区分，对细胞核的靶向性高，与细胞孵育后主要富集在细胞核内，其中硫辛酸-氨基乙基胍作为配体合成的金纳米簇相比于以硫辛酸-乙二胺为配体合成的金纳米簇的细胞核靶向性更明显，可用于细胞核标记、核酸转染等。
附图说明
图1为本发明硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇的结构示意图。
图2为本发明硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇的结构示意图。
图3为本发明合成的硫辛酸-氨基乙基胍的1H NMR图(400MHz，D2O为溶剂)。
图4为本发明硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇的图片及其在365nm紫外光照射下发出的荧光图。
图5为本发明硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇的激发光谱和荧光光谱。
图6为以硫辛酸-氨基乙基胍为配体合成的金纳米簇的透射电镜图。
图7为本发明合成的硫辛酸-氨基乙基胍(DM)以及以硫辛酸-氨基乙基胍为配体合成的金纳米簇(DM-Au)的红外吸收光谱图。
图8为本发明硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇的zeta电位图。
图9为与硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇孵育后的细胞荧光显微成像图。
图10为与硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇孵育后的细胞荧光显微成像图。
图11为应用硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇增强X射线辐照损伤细胞的效果图。
图12为应用硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇增强X射线辐照损伤细胞的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：硫辛酸-乙二胺的制备
硫辛酸(784mg，3.8mmol)和N'N-羰基二咪唑(812mg，5.0mmol)溶解在25mL二氯甲烷中，然后滴入乙二胺的二氯甲烷溶液中(2mL乙二胺(30mmol)溶解在7mL二氯甲烷中)，滴入过程中用冰浴对反应液进行冷却，滴完继续搅拌3小时，然后用饱和食盐水洗涤3次，用1％KHSO4水溶液提取3次，合并水层，用饱和氢氧化钠溶液调至碱性，然后用乙酸乙酯提取3次，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，最后旋蒸去除有机溶剂，得到600mg浅黄色固体，即为硫辛酸-乙二胺。
实施例2：硫辛酸-氨基乙基胍的制备
硫辛酸-乙二胺(419mg，1.7mmol)溶于30mL二氯甲烷中，加入1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐(250mg，1.7mmol)，溶液在室温下搅拌4h，然后旋蒸去除溶剂，固体溶于1mL甲醇中，加入10mL乙醚，溶液中出现固体，离心收集固体，用乙醚冲洗，干燥后得到320mg硫辛酸-氨基乙基胍(记为DM)。硫辛酸-氨基乙基胍的1H NMR图如图3所示。
实施例3：硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇的制备
硫辛酸-乙二胺溶解在水中，配置成5mM的浓度。取150μL硫辛酸-乙二胺水溶液与50μL氯金酸水溶液(5mM)混合，振摇反应液2分钟，然后加入500μL水稀释，再加入15μL新配置的0.01M的NaBH4溶液进行还原，反应液室温避光反应5小时，然后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析纯化，即得到硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇溶液。其中，硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇的结构示意图如图1所示。
实施例4：硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇(记为DM-Au)的制备
硫辛酸-氨基乙基胍溶解在水中，配置成5mM的浓度。取150μL硫辛酸-氨基乙基胍水溶液与50μL氯金酸水溶液(5mM)混合，振摇反应液2分钟，然后加入500μL水稀释，再加入15μL新配置的0.01M的NaBH4溶液进行还原，反应液室温避光反应24小时，然后用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析纯化，即得到硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇溶液。其中，硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇的结构示意图如图2所示。荧光金纳米簇溶液的图片及其在365nm紫外光照射下发出的荧光如图4所示，说明金纳米簇在合适波长的激发光照射下可发射出强烈的红色荧光。荧光金纳米簇溶液的荧光光谱图如图5所示，说明金纳米簇发射的荧光波长范围较宽，最大荧光发射峰位置在695nm。荧光金纳米簇的透射电镜图如图6所示，说明金纳米簇的粒径范围是1～2nm。荧光金纳米簇的红外吸收光谱如图7所示，说明金纳米簇表面修饰了大量DM分子，而且分子的特征红外吸收峰没有明显改变。荧光金纳米簇溶液的zeta电位如图8所示，说明金纳米簇呈明显的正电性。
实施例5：应用硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇对细胞核进行标记成像
HeLa细胞接种到共聚焦显微镜培养皿中，细胞密度为2×104个/皿，孵育24小时使细胞贴壁，洗掉培养基，用PBS冲洗1次，再加入无血清的DMEM培养基，然后加入100μL硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇溶液(100μM Au)，孵育30分钟后用PBS冲洗3次，再重新加入PBS，然后用共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像，成像时采用的激发光为405nm，收集的荧光波段为600～750nm。与金纳米簇孵育后的细胞荧光显微成像图如图9所示，说明硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇能大量进入细胞内，并富集在细胞核中。
实施例6：应用硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇对细胞核进行标记成像
HeLa细胞接种到共聚焦显微镜培养皿中，细胞密度为2×104个/皿，孵育24小时使细胞贴壁，洗掉培养基，用PBS冲洗1次，再加入无血清的DMEM培养基，然后加入100μL硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇溶液(100μM Au)，孵育30分钟后用PBS冲洗3次，再重新加入PBS，然后用共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像，成像时采用的激发光为405nm，收集的荧光波段为600～750nm。与金纳米簇孵育后的细胞荧光显微成像图如图10所示，说明硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇能大量进入细胞内，并大部分富集在细胞核中。
实施例7：应用硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇增强X射线辐照损伤细胞
HeLa细胞接种到细胞培养瓶中，细胞浓度为1×105个/瓶。细胞在细胞培养瓶中贴壁生长24h，然后加入200μL硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇溶液(100μM Au)，并以不加金纳米簇溶液作为对照组；孵育30分钟后用X射线对细胞进行照射，X射线能量为160kVp，照射剂量为0～8Gy(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)，辐照结束后把细胞接种于6孔塑料培养板中，每个孔的细胞个数为100个，然后放置在细胞培养箱中进行培养，每隔3天换一次培养液，在第15天吸掉培养基，用PBS冲洗3遍，再用0.4％结晶紫染色10分钟，用PBS洗去过量的染色液，之后计数染色后的细胞团，用于计算细胞的增殖能力。金纳米簇增强X射线辐照损伤细胞的效果如图11所示，说明硫辛酸-氨基乙基胍修饰的金纳米簇可明显增强X射线对细胞的损伤作用。
实施例8：应用硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇增强X射线辐照损伤细胞
HeLa细胞接种到细胞培养瓶中，细胞浓度为1×105个/瓶。细胞在细胞培养瓶中贴壁生长24h，然后加入200μL硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇溶液(100μM Au)，并以不加金纳米簇溶液作为对照组；孵育30分钟后用X射线对细胞进行照射，X射线能量为160kVp，照射剂量为0～8Gy(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)，辐照结束后把细胞接种于6孔塑料培养板中，每个孔的细胞个数为100个，然后放置在细胞培养箱中进行培养，每隔3天换一次培养液，在第15天吸掉培养基，用PBS冲洗3遍，再用0.4％结晶紫染色10分钟，用PBS洗去过量的染色液，之后计数染色后的细胞团，用于计算细胞的增殖能力。金纳米簇增强X射线辐照损伤细胞的效果如图12所示，说明硫辛酸-乙二胺修饰的金纳米簇可明显增强X射线对细胞的损伤作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种正电性金纳米簇，其特征在于：该正电性金纳米簇通过把氨基或胍基与硫辛酸相连后作为配体分子与氯金酸及硼氢化钠反应获得；正电性金纳米簇粒径范围在1～2nm，当用波长范围在350nm～480nm的激发光对金纳米簇进行激发，得到波长范围在550nm～800nm的荧光；
所述的配体分子为硫辛酸-乙二胺和硫辛酸-氨基乙基胍中的至少一种；
配体分子硫辛酸-乙二胺的化学结构式如下：
配体分子硫辛酸-氨基乙基胍的化学结构式如下：
所述的硫辛酸-乙二胺的制备方法，包括如下步骤：
硫辛酸和N'N-羰基二咪唑溶解在二氯甲烷中，然后加入到含有乙二胺的二氯甲烷溶液中，加入过程中用冰浴对反应液进行冷却，加完继续搅拌1～5小时，然后用饱和食盐水洗涤3～5次，用1％KHSO4水溶液提取1～3次，合并水层，用饱和氢氧化钠溶液调至碱性，然后用乙酸乙酯提取3～4次，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，最后旋蒸去除有机溶剂，得到浅黄色固体，即为硫辛酸-乙二胺；
所述的硫辛酸-氨基乙基胍的制备方法，包括如下步骤：
硫辛酸-乙二胺溶于二氯甲烷中，加入1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，溶液在室温下搅拌2～10小时，然后旋蒸去除溶剂，得到粗产物，经过洗涤纯化和干燥后得到硫辛酸-氨基乙基胍。
2.根据权利要求1所述的正电性金纳米簇，其特征在于：
硫辛酸：N'N-羰基二咪唑摩尔用量比为1：1.2～2.0，硫辛酸：乙二胺的摩尔用量比为1：5～20；
硫辛酸-乙二胺和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐的摩尔用量比例为1：1～1.5。
3.根据权利要求2所述的正电性金纳米簇，其特征在于：
硫辛酸：N'N-羰基二咪唑摩尔用量比为1：1.3，硫辛酸：乙二胺的摩尔用量比为1：8。
4.根据权利要求2所述的正电性金纳米簇，其特征在于：
硫辛酸-乙二胺和1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐的摩尔用量比例为1：1。
5.权利要求1～4任一项所述的正电性金纳米簇的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
将配体分子溶解在水中，配置成一定浓度的溶液；取配体分子溶液与氯金酸水溶液混合，振摇反应液1～5分钟，然后加2～20倍量的水稀释，再加入新配置的NaBH4溶液进行还原，反应液避光反应，然后透析纯化，即得到正电性金纳米簇溶液；
所述的配体分子溶液的浓度为1mM～10mM；
氯金酸水溶液的浓度为1mM～25mM；
配体分子和氯金酸的摩尔比为2.0～3.5：1；
NaBH4溶液的浓度为0.001～0.02M；
NaBH4和氯金酸的摩尔比为1：1～5；
避光反应的温度为20～40℃，反应时间为5～48小时；
纯化方式采用超滤或透析，超滤管和透析袋的截留分子量为1000～20000Da。
6.根据权利要求5所述的正电性金纳米簇的制备方法，其特征在于：
振摇反应液2分钟；
加入2.5倍量的水稀释；
所述的配体分子溶液的浓度为5mM；
氯金酸水溶液的浓度为5mM；
配体分子和氯金酸的摩尔比为3：1；
NaBH4溶液的浓度为0.01M；
NaBH4和氯金酸的摩尔比为1/2～3/5；
避光反应的反应时间为5～24小时；
超滤管和透析袋的截留分子量为1000Da。
7.权利要求1～4任一项所述的正电性金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：
所述的正电性金纳米簇在制备对肿瘤细胞核进行标记，核酸转染，或者增强放射线对肿瘤细胞的损伤的药物中的应用。
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