CN108619512A - 金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体公开了金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的应用。本发明经过实验研究发现，金纳米簇可通过受体介导的内吞进入细胞、形成内涵体并与溶酶体融合，沉积在溶酶体。在光照条件下，金纳米簇表面发生光化学反应，触发活性氧自由基(ROS)产生，启动细胞凋亡，ROS还可进攻细胞骨架，引起细胞骨架断裂、功能受损。本发明首次提出了金纳米簇可以作为一种新的纳米药物，用于肿瘤的治疗。作为纳米药物，金纳米簇生物相容性好，安全性高。作为惰性金属，金具有良好的生物相容性，对机体/细胞的正常生理活动干扰小，毒性低；只有特定条件下才具有杀伤肿瘤的作用，使用安全性高。

Description

金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体地说，涉及金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术
金纳米簇(gold nanoclusters,Au NCs)是粒径小于2nm的纳米粒子(Au NPs)，通常是由几个到几十个金原子组成，其排列方式更像原子，所以也常被认为是“人工原子”(Artificial atom)。由于Au NCs中的自由电子被限域在一个较小的空间内，不能自由运动，表现出明显的量子限域效应，这是其特性的本质。
Au NCs具有显著的库伦阻塞效应和特殊的磁性质，与半导体类似的电子结构也使它具有特殊的荧光性能。Au NCs表面的配位不饱和原子，使Au NCs具有高的催化活性。因此，Au NCs现已广泛应用于生物、医学、光电原件、检测、催化等领域。在生物医学领域，由于Au NCs具有尺寸小、荧光光稳定性好、荧光可调性、Stokes位移大、制备条件温和、无毒等突出优点，在生物传感、生物成像、细胞标记、药物传递、生物分子(DNA、蛋白质、酶)检测等方面有着巨大的应用潜力。
然而，现有技术中未见到任何关于金纳米簇可直接用于双光子光动力肿瘤治疗方面的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明经过实验研究发现，金纳米簇可通过受体介导的内吞进入细胞、形成内涵体并与溶酶体融合，沉积在溶酶体。并发现，在光照条件下，金纳米簇表面发生光化学反应，触发活性氧自由基(ROS)产生：一方面，在ROS作用下，溶酶体膜的通透性增加、释放水解酶等物质，进而诱发线粒体大量产生ROS、线粒体功能受损、膜电势下降，线粒体膜通透性增大，释放细胞色素c，启动细胞凋亡；另一方面，ROS进攻细胞骨架，细胞骨架断裂、功能受损。
进一步地，本发明通过实验动物肿瘤模型研究发现，金纳米簇在双光子照射下具有高效的肿瘤杀伤作用。
所述金纳米簇由1～200个金原子组成。
所述金纳米簇直径为0.1～10nm。
所述金纳米簇可不由配体保护，但优选由配体保护。
所述配体为巯基烷酸(C3-C18)、牛血清白蛋白(BSA)、L-酪氨酸、谷胱甘肽(GSH)、二氢硫辛酸(DHLA)、酪蛋白、转铁蛋白(transferrin)中的一种或几种。
作为优选，所述金纳米簇是由25个金原子组成、且表面包被二氢硫辛酸的纳米材料(AuNCs@DHLA)，其直径为1.7个纳米。由于其大小处于纳米尺度，金纳米簇具有显著的量子尺寸效应(quantum size effect)，具有异于宏观块体材料的特殊光、电等特性。基于其特殊的结构和理化性质，在300纳米～1400纳米特定波长的光照射下，金纳米簇可以高效杀死肿瘤细胞。
作为优选，在760纳米～1100纳米特定波长的光照射下，金纳米簇对肿瘤细胞的杀伤效果格外显著。
作为优选，所述照射为双光子照射。本发明经研究发现，双光子照射相较于单光子照射，具有更大的穿透深度和空间选择性，从而具有更好的杀肿瘤效果。
所述AuNCs@DHLA的制备技术为本领域技术人员依据现有技术可以直接地、毫无疑义地确定的技术内容。例如，《金纳米簇的制备及其在生物医学中的应用》(化学通报，2015年，第78卷)一文中曾对其有过明确记载。
在本发明的一个具体实施方式中，以AuNCs@DHLA作为示例性说明。
进一步地，本发明的另一个目的在于提供一种治疗肿瘤的纳米药物，所述药物含有前述金纳米簇或由前述金纳米簇制备。
本发明的有益效果在于：
本发明首次提出了金纳米簇可以作为一种新的纳米药物，用于肿瘤的治疗。作为纳米药物，金纳米簇具有如下优点：(1)生物相容性好，安全性高。作为惰性金属，金具有良好的生物相容性，对机体/细胞的正常生理活动干扰小，毒性低；只有特定条件下才具有杀伤肿瘤的作用，使用安全性高。(2)结构清晰、分子量固定，便于量化、精确给药。(3)作用机理明确，毒副作用小。(4)体内药代动力学清晰、肿瘤靶向效率高，生物利用度高；(5)原料易得，便于修饰。
附图说明
图1为AuNCs@DHLA金纳米簇的双光子光学性质及双光子荧光成像。
图2为AuNCs@DHLA金纳米簇的细胞毒性实验。
图3为光照条件下，AuNCs@DHLA金纳米簇的细胞杀伤效应，及AuNCs@DHLA金纳米簇诱导细胞内ROS升高。
图4为不同实验组的肿瘤杀伤效应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例以AuNCs@DHLA为例，用于说明其对肿瘤细胞的杀伤作用。
一、实验材料：
1、实验药品
氯金酸(Chloroauricacid,HAuCl4·4H2O,金含量≥47.8％)，硼氢化钠(Sodiumborohydride,NaHB4,98％)购自阿拉丁试剂有限公司。氢氧化钠(Sodiumhydroxide,NaOH，97％)，甲醇(Methanol,99％)，无水乙醇(Ethanol,C2H5OH)，盐酸(Hydrochloric acid,HCl,36.5％)购自北京化学试剂公司。蛋白酶消化液(Tyrisin,0.25％)，磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)购自Hyclone公司。青霉素-链霉素溶液(Penicillin-Streptomycin)，DMEM细胞培养基(Dulbecco's modified Eagle medium)购自Invitrogen公司。罗丹明6G(Rhodamine 6G，95％)购自上海晶纯实业有限公司。二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO,99.7％)购自Sigma-Aldrich公司。噻唑蓝(Thiazolyl Blue TetrazoliumBromide，MTT,98％)购自Amresco公司。异氟烷(Isoflurane)购自深圳沃尔德生命科技有限公司。5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA，98％)购自Ark Pharm公司。牛血清(Fatal bovine serum,FBS)购自杭州天杭生物科技有限公司。
2、实验动物
实验采用BABL/c裸鼠，5～6周龄，小鼠购于北京大学医学部实验动物中心。实验动物的饲养和应用遵照《美国国立卫生研究院实验室动物应用指南》进行，并通过北京大学医学部动物伦理委员会的批准。
3、仪器设备
二氧化碳细胞培养箱(NAPCO公司)；生物安全柜(Heal Force公司)；倒置显微镜(Leica公司)；HW-10型远红外线干燥箱(北京兴争仪器设备厂)；TU-1901紫外-可见分光光度计(北京普析通用公司)；F-4500荧光分光光度计(日立公司)；激光粒度分析仪(美国Brookhaven公司)；多功能成像电子能谱仪(XPS,Kratos Analytical Ltd.公司)；透射电子显微镜(Tecnai F30，FEI公司)；皮秒寿命荧光光谱仪(LifeSpec-red，英国爱丁堡仪器有限公司)；Spinning-disk激光共聚焦显微镜(Zeiss公司)；LSM-780型双光子激光共聚焦显微镜(Zeiss公司)；ETS-D5型电磁搅拌(KiKa Werke公司)；KQ-100型超声波清洗仪(昆明市超声仪器有限公司)；旋转薄膜蒸发仪(BüCHI RotavaporR-205)；PB-10型pH计(Sartorius公司)；VMR型小动物呼吸麻醉机(美国Matrix公司)；高精度电子分析天平(Sartorius公司)；H-1850R型冷冻离心机(深圳市凯铭杰仪器设备有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；超纯水系统(北京市历元电子仪器公司)；Epoch 2TC型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。
二、实验方法：
1、制备二氢硫辛酸(DHLA)
配制碳酸氢钠溶液(117mL，0.25mol/L)。冰浴下向碳酸氢钠溶液中加入0.03mol的硫辛酸(6g)，充分搅拌溶解。搅拌下加入0.1mol(4g)硼氢化钠(每次加10mg,每次加完后待反应剧烈程度下降后再加第二次)。在室温下搅拌30min，此时溶液为白色，然后加入100mL的甲苯萃取。缓慢加入浓盐酸(36％-38％)，每次加0.1mL，每次加完后待反应剧烈程度下降后再加第二次，直到pH为1.0，此时两相均为乳白色，界限模糊。将反应液转移到分液漏斗，并反复震荡萃取水相产物。向甲苯中加入无水硫酸钠干燥剂干燥，待瓶底有粉末状的晶粒时，停止加干燥剂。用滤纸将甲苯过滤，在旋转真空蒸发仪下，70℃下蒸馏，待到液体体积无明显后将温度升到85℃继续蒸馏10min。将最终产物充入氩气后密封放到5℃冰箱密封保存。
2、制备AuNCs@DHLA
将所有实验中用到的玻璃器皿反复清洗，确保干净。在冰浴(0℃-5℃)下将0.005mol/L的氯金酸5mL，与15μL的DHLA混和搅拌30min。称量7.556mg的硼氢化钠充分溶解在1mL的水中，在0℃下孵育5min，后迅速将其加入反应瓶中。快速搅拌下继续反应1小时，停止。将反应物放入15mL的离心管中，用50微升，1mol/L的HCL将反应物沉淀下来。在4000r/min转速下离心3min，弃上清，用去离子水轻轻的将残余甲醇液洗掉。将水加到12mL，用氢氧化钠溶液将pH调到9，加入9.2微升的DHLA。放到加热下的超声清洗器中(40kHz，300w)，超声蚀刻20min。用30KD规格的超滤管超滤3次，最终得AuNCs@DHLA。
3、AuNCs@DHLA标记肿瘤细胞
HepG2细胞用DMEM培养基(含10％胎牛血清和1％双抗)培养。以1×106/mL的浓度接种在培养皿上，待细胞贴壁以后，用PBS(pH 7.4)小心洗去培养基，加入含有AuNCs@DHLA的PBS(pH 7.4)溶液终浓度小于0.1mg/mL，于37℃，5％CO2培养30min，用PBS(pH 7.4)小心洗三次后，置于荧光显微镜下观察。
4、AuNC@DHLA用于双光子光动力治疗动物试验
4.1荷瘤裸鼠模型的构建
BABL/c裸鼠，雌性，5～6周龄，体重为15-20g，无特定病原体(SPF)级，由北京大学医学部提供。HepG-2细胞用含10％FBS和1％的抗生素的DMEM细胞培养基，5％CO2，37℃条件下进行常规培养。取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化后，用无血清DMEM培养基于1500r/min离心3min，将细胞分散于无血清的DMEM中(细胞浓度约为1×107/ml)，接种于裸鼠的右肩皮下部位，每只注射150μL。于SPF条件下饲养，隔天用游标卡尺测量肿瘤大小，约1～2周时间左右，待肿瘤大小直径长到0.3-0.5cm时用于后续实验。
4.2荷瘤裸鼠模型的双光子光动力治疗
将荷瘤裸鼠进行分组：空白对照组、激光对照组、金纳米簇对照组和金纳米簇光动力治疗组。每周治疗一次，连续治疗4次。每天称重，用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤的长径、短径并观察其生存状态。肿瘤体积计算公式：V＝1/2×a×b2，其中，a：肿瘤的长径；b：肿瘤的短径，计算肿瘤体积。绘制各组肿瘤体积增长趋势图。激光照射条件：800nm fs，200mW/cm2，每个点照射时间为30min，照射面积约0.1mm2；4个点/只。
实施例2
参照实施例1，制备巯基十一烷酸(MUA)保护的金纳米簇(AuNCs@MUA)。同样参照实施例1，对荷瘤裸鼠进行光动力治疗，试验结果显示，光照条件下，AuNCs@MUA具有明显的肿瘤杀伤作用，其肿瘤抑制效率可达83％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.金纳米簇在制备治疗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述金纳米簇由1～200个金原子组成。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述金纳米簇直径为0.1～10纳米。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金纳米簇由配体保护。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述配体为巯基烷酸、牛血清白蛋白、L-酪氨酸、谷胱甘肽、二氢硫辛酸、酪蛋白、转铁蛋白中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述金纳米簇为AuNCs@DHLA。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的应用，其特征在于，将所述金纳米簇在300～1400纳米特定波长的光下照射。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述金纳米簇在760～1100纳米特定波长的光下照射。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述照射为双光子照射。
10.一种治疗肿瘤的纳米药物，其特征在于，所述药物含有金纳米簇或由金纳米簇制备。
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