CN115025250B - 一种金纳米簇及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金纳米簇及其制备方法与应用。所述金纳米簇上修饰有配体，所述配体包括含巯基的负电配体和含巯基的两性离子配体。本发明中的金纳米簇，通过调控金纳米簇表面配体的种类，从而使其达到在淋巴结被动累积的效果，借助其本身的近红外荧光实现淋巴结的高对比度荧光造影以及癌症淋巴转移的诊断。

Description

一种金纳米簇及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种金纳米簇及其制备方法与应用。
背景技术
目前常用的近红外淋巴造影剂通常为有机小分子，其荧光产率较高，但通常其水溶液稳定性较差，从而生物利用率低。同时这些有机小分子也易于受到光漂白的影响，从而在手术当中需要反复多次注射，才能达到较好的成像效果。Au25(SR)18金纳米簇近年来被发现具有较好的近红外荧光性质，其荧光具有较好的生物穿透与成像效果，因此，其作为新一代的金纳米材料在生物成像方面具有越来越广泛地应用。但目前，传统的金纳米簇由于表面配体较为单一，使得其功能也高度单一化，极大地限制了它们的生物学应用。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种金纳米簇，为多配体修饰，具有多重应用效果。
本发明还提出一种金纳米簇的制备方法。
本发明还提出一种造影剂。
本发明还提出一种药物。
本发明还提出上述金纳米簇、造影剂或药物的应用。
本发明的第一方面，提出了一种金纳米簇，所述金纳米簇上修饰有配体，所述配体包括含巯基的负电配体和含巯基的两性离子配体。
根据本发明实施例的金纳米簇，至少具有以下有益效果：
淋巴结因其在自身免疫性疾病、器官移植、免疫检查点和肿瘤转移中的重要性而被广泛研究。癌细胞通过淋巴结扩散，特别是对于黑色素瘤或乳腺癌等高度转移性癌症类型，是癌症转移的最重要途径之一。由于淋巴管的上皮细胞间隙较宽，肿瘤转移通常从最接近肿瘤的淋巴结(称为前哨淋巴结)开始。临床上已经证明切除前哨淋巴结可有效治愈前列腺癌、黑色素瘤和乳腺癌。基于淋巴的肿瘤成像对于诊断肿瘤进展和指导淋巴结切除以控制癌症的转移和扩散至关重要。目前，迫切需要一种有效的、生物相容的术中荧光造影剂，以提供稳定的淋巴结实时生物成像，从而用于癌症转移的诊断和手术指导。
目前，受到其合成等方面的限制，传统金纳米簇通常为单一配体修饰，缺乏对于具体应用生理环境和配体种类的搭配。
本发明中的金纳米簇，为多配体修饰，包括含巯基的两性离子配体和呈负电性的含巯基的负电配体。由于负电性的颗粒更容易被淋巴系统截留，进而进入到淋巴结当中，而且组织间隙中的大量负电多糖(例如透明质酸)会吸附正电颗粒。而本发明中的金纳米簇由于含巯基的负电配体的修饰，具有一定的负电性，因此可以显著地规避组织间隙对其的滞留，同时由于含巯基的两性离子配体的共同修饰，金纳米簇的负电性可以受到有效调节，避免了因过高的负电性造成大量蛋白的非特异性吸附。这种表面配体的有效配合使得金纳米簇能够成功进入淋巴结，从而具有在淋巴结被动累积的特点。本发明中，根据金纳米簇进入生物体内的位置、方式的不同，金纳米簇积累的淋巴结不同。通常金纳米簇根据生物体的物质代谢流动方向，产生淋巴结积累。金纳米簇进入生物体内的方式通常包括静脉注射、瘤内注射或瘤旁注射等方式。
不同于常规单一配体包裹的金纳米簇仅能实现一种功能，本发明中的金纳米簇，通过调控金纳米簇表面多配体的种类，从而使其达到在淋巴结被动累积的效果，借助其本身的近红外荧光实现淋巴结的高对比度荧光成像以及淋巴手术指导，在增强淋巴结的被动累积的情况下利用其近红外荧光的性质作为造影剂指导淋巴结的手术切除，尤其是发生了癌症转移的前哨淋巴结切除手术。
此外，本发明中的金纳米簇具有近红外荧光成像效果好的特点，如在一些优选的实施例中，金纳米簇的淋巴成像曝光耗时仅需30ms，远远优于传统的造影剂的成像时间。因此，本发明中的金纳米簇在生物成像、肿瘤诊断或治疗中，具有巨大的应用价值。
在本发明的一些实施方式中，所述金纳米簇的粒径为1-1.5nm。
在本发明的一些实施方式中，所述金纳米簇包括结构式为Au25(SR)18、Au38(SR)24、Au15(SR)13、Au18(SR)14、Au23(SR)16或Au28(SR)20的金纳米簇中的至少一种，其中，SR为所述配体。
在本发明的一些实施方式中，所述金纳米簇中，金原子与配体的摩尔比为(15-38)：(13-30)。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述金纳米簇中，金原子与配体的摩尔比为(15-38)：(13-24)。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述金纳米簇中，金原子与配体的摩尔比为25：18。
在本发明的一些实施方式中，所述金纳米簇的结构式为Au25(SR)18，其中，SR为所述配体。
考虑到造影剂材料在生物医学工程方面尤其是可能在人体上的应用，所使用的材料应该尽量保证结构的一致性，以引起更低的使用安全性问题，进而提升其临床应用的价值。
Au25(SR)18型金纳米簇具有较好的近红外荧光性质，其近红外荧光为808nm激发，1050nm发射，处在近红外生物二区窗口，因而具有较好的生物穿透与成像效果，同时，还具有生物相容性好、结构稳定等特点。本发明中的Au25(SR)18金纳米簇结构稳定，具有近红外二区荧光特点(1000-1700nm)，有很强的临床应用前景。
在本发明的一些实施方式中，所述含巯基的两性离子配体包括巯基化的磺酸甜菜碱。
巯基化的磺酸甜菜碱，不仅可与含巯基的负电配体进行组合修饰，有效调节金纳米簇表面电负性，从而使得金纳米簇具有累积到淋巴结的性质，而且还可以提高金纳米簇的稳定性。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述巯基化的磺酸甜菜碱包括11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱。
11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱，简称：C5。
在本发明的一些实施方式中，所述含巯基的负电配体包括含巯基的羧酸类化合物、含巯基的磺酸类化合物或含巯基的膦酸类化合物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述含巯基的负电配体包括11-巯基十一烷酸、11-巯基十一烷基磺酸或11-巯基十一烷基膦酸中的至少一种。
11-巯基十一烷酸，简称：MUA；11-巯基十一烷基磺酸，简称：MUS；11-巯基十一烷基膦酸，简称：MUP。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述含巯基的负电配体包括11-巯基十一烷酸。
在本发明的一些实施方式中，所述配体中，所述含巯基的负电配体的摩尔分数为20-80％。
在本发明的一些实施方式中，所述配体中，所述含巯基的负电配体的摩尔分数为35-60％。
在本发明的一些实施方式中，所述配体中，所述含巯基的负电配体的摩尔分数为40-60％。
通过上述实施方式，含巯基的负电配体的摩尔分数为40-60％，所得金纳米簇，更加有利于淋巴累积，通过实验结果亦可证明，所得金纳米簇在小鼠足垫部位的淋巴结有明显的累积。本发明中通过调控金纳米簇表面配体的种类和比例，从而使其达到在淋巴结被动累积的效果，借助其本身的近红外荧光实现淋巴结的高对比度荧光造影以及淋巴手术指导。
具体地，由于负电性的颗粒更容易被淋巴系统截留，进而进入到淋巴结当中，而且组织间隙中的大量负电多糖会吸附正电颗粒，因此金纳米簇应当具有一定的负电性，即使用一定比例的含巯基的负电配体进行修饰。但是过高的负电性也会造成大量蛋白的非特异性吸附，从而使得颗粒尺寸超过淋巴结截留的范围。因此通过引入含巯基的两性离子配体，金纳米簇的负电性可以得到有效调节，使得其能够进入淋巴结。因此含巯基的负电配体和含巯基的两性离子配体这两种配体对于金纳米簇具有淋巴累积效果是必不可少的。
在本发明的一些实施方式中，所述配体中，所述含巯基的负电配体与所述含巯基的两性离子配体的摩尔比为(4-6)：(6-4)。
在本发明的一些实施方式中，所述配体还包括治疗性配体。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述治疗性配体包括巯基化甲氨蝶呤。
传统的近红外淋巴造影剂通常为有机小分子，由于对这些小分子进行化学修饰后会强烈影响它们的荧光性质，因此很难在分子层面上将诊断和治疗集成到一个分子实体上。同时，单一配体包裹的金纳米簇通常仅能实现一种功能。
不同于常规单一配体包裹的金纳米簇，本发明中的金纳米簇，通过表面修饰含巯基的负电配体和含巯基的两性离子配体，实现了对于淋巴结的累积。在此基础上，通过前期对甲氨蝶呤进行了巯基化修饰，进而将其作为药物分子加入整个系统，从而将修饰后的甲氨蝶呤集成在单个的金纳米簇分子实体上，而非简单的机械混合包载，使得金纳米簇药物装载量稳定且难以脱落。
本发明中的金纳米簇通过在表面引入化疗药物配体——巯基化甲氨蝶呤，能够递送药物进入生物淋巴结，在大幅度降低肝毒性的同时，达到与游离的化疗药物相似的抗癌效果，使得金纳米簇在增强淋巴结的被动累积的情况下，利用其近红外荧光的性质作为造影剂指导淋巴结的手术切除，尤其是发生了癌症转移的前哨淋巴结切除手术，同时具有抗癌和降低药物毒副作用的功能，对淋巴结癌症转移能够有效成像和治疗。
本发明中金纳米簇，具有生物体成像及肿瘤靶向诊疗的作用，能够在单个的金纳米簇分子上实现对癌症转移淋巴结的手术成像指导和癌症转移的治疗两种功能，能够有效在高效无延迟淋巴转移手术成像指导的基础上对转移病灶进行治疗，以实现对于癌症淋巴转移的多功能诊疗，且动物实验效果较好。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述配体中，所述巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数不超过30％。
通过上述实施方式，巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数不超过30％，所得金纳米簇的生物安全性更好。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述配体中，所述巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数为15-30％。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述配体中，所述巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数为20-30％。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述含巯基的两性离子配体、所述含巯基的负电配体与所述巯基化甲氨蝶呤的摩尔比为(4-6)：(4-6)：(0.5-3.5)。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述巯基化甲氨蝶呤的结构式如式(1)所示：
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述巯基化甲氨蝶呤的制备方法，包括如下步骤：使甲氨蝶呤与AcS-PEG4-NH2发生酰胺化反应，再于碱性条件下水解，得到所述巯基化甲氨蝶呤。
其中，AcS-PEG4-NH2的结构式如式(2)所示：
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述巯基化甲氨蝶呤的制备步骤包括：
Sa，于甲氨蝶呤、HBTU和AcS-PEG4-NH2·HCl的混合液中加入N,N'-二异丙基乙胺，搅拌，得到混合物，分离纯化，得到中间体；
Sb，将所述中间体与NaOH水溶液混合，搅拌，得到所述巯基化甲氨蝶呤。
其中，巯基化甲氨蝶呤的合成路线，如图1所示。
HBTU：O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤Sa中，甲氨蝶呤、HBTU和AcS-PEG4-NH2·HCl的摩尔比为(19-23)：(18-22)：(9-13)。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤Sa中，混合液的溶剂包括DMF。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤Sa中，甲氨蝶呤与N,N'-二异丙基乙胺的摩尔比为(19-23)：(38-42)。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤Sa中，所述搅拌为室温下搅拌10-14h。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤Sb中，所述中间体与NaOH的摩尔比为(0.45-0.51)：1。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述NaOH水溶液中，NaOH与水的质量之比为(1-3)：1000。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤Sb中，所述搅拌为室温下搅拌10-14h。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述治疗性配体包括巯基化甲氨蝶呤，所述含巯基的负电配体包括含巯基的羧酸类化合物，所述含巯基的两性离子配体包括巯基化的磺酸甜菜碱，所述巯基化的磺酸甜菜碱、所述含巯基的羧酸类化合物与所述巯基化甲氨蝶呤的摩尔比为(4-6)：(4-6)：(0.5-3.5)。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述巯基化的磺酸甜菜碱、所述含巯基的羧酸类化合物与所述巯基化甲氨蝶呤的摩尔比为(4-6)：(4-6)：(2-3)。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述配体包括11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱、11-巯基十一烷酸和巯基化甲氨蝶呤。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述配体中，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱、11-巯基十一烷酸和巯基化甲氨蝶呤的摩尔比为(4.5-5.5)：(4.5-5.5)：(2.5-3.5)。
本发明的第二方面，提出了一种金纳米簇的制备方法，包括如下步骤：将配体与氯金酸溶液混合，得到修饰有配体的金纳米簇，其中，所述配体包括含巯基的负电配体和含巯基的两性离子配体。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
S1，将配体与氯金酸溶液混合，得到含有金-配体的络合物混合溶液；
S2，将强碱溶液与上述操作得到的混合溶液混合后，加入醇，搅拌条件下，再加入硼氢化钠溶液，得到反应混合液，反应，纯化，得到所述金纳米簇；其中，所述反应混合液的pH为9.7-10.3。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中，将配体溶液与氯金酸溶液混合。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤S1中，将配体水溶液与氯金酸水溶液混合，得到含有金-配体的络合物混合溶液。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中，将巯基化甲氨蝶呤、11-巯基十一烷酸和11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱的混合液与氯金酸溶液混合，得到混合溶液。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述混合液中，配体的摩尔浓度为4.8-5.2mmol/L。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤S1中，以配体总量为基准，巯基化甲氨蝶呤、11-巯基十一烷酸和11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱的摩尔比为3：5：5。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述氯金酸与所述配体的摩尔比为(0.9-1.1)：2。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S1中，所述氯金酸溶液中，氯金酸的浓度为18-22mmol/L。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述反应混合液的pH为10左右。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述强碱溶液中氢氧根离子的浓度为0.8-1.2mol/L。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述强碱溶液包括NaOH溶液或KOH溶液。
通过上述实施方式，加入强碱溶液，其主要目的为碱化反应体系至pH值为9.7-10.3，活化配体巯基。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述强碱溶液为NaOH溶液，所述NaOH溶液中NaOH的浓度为0.8-1.2mol/L。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤S2中，NaOH溶液与混合溶液的体积之比为(0.9-1.1)：45。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，所述硼氢化钠溶液为硼氢化钠碱性溶液，所述硼氢化钠碱性溶液中，硼氢化钠与NaOH的摩尔比为(0.9-1.1)：2。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤S2中，所述硼氢化钠碱性溶液中，硼氢化钠与NaOH的摩尔浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤S2中，将NaOH溶液与混合溶液混合后，加入乙醇，使得乙醇体积百分比为15-25％，搅拌条件下，再逐滴加入硼氢化钠碱性溶液，反应2.5-4h，使用超滤装置纯化产物并用水洗涤直至滤液的pH值达到6.9-7.1，得到所述金纳米簇。
本发明的第三方面，提出了一种造影剂，所述造影剂包括上述金纳米簇。
本发明中的金纳米簇，具有近红外荧光成像效果好的特点，在一些优选的实施例中，金纳米簇的淋巴成像曝光耗时仅需30ms，远远优于传统的造影剂的成像时间(成像时间约3000ms)。本发明中的金纳米簇在增强淋巴结的被动累积的情况下，借助其本身的近红外荧光实现淋巴结的高对比度荧光造影以及淋巴手术指导。在一些优选的实施例中，本发明中的金纳米簇通过在表面引入化疗药物配体，能够递送药物进入生物体内(如淋巴结等)，具有抗肿瘤效果，且与游离的化疗药物相比，本发明中的金纳米簇能够大幅度降低肝毒性同时达到相似的抗癌效果，即同时具有抗癌和降低药物毒副作用的功能。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述造影剂用于激光激发成像时，成像时间约30ms。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述造影剂在生物体内，于淋巴累积成像。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述造影剂在生物体内，于6h内在淋巴累积成像。
本发明的第四方面，提出了一种药物，所述药物包括上述金纳米簇或上述造影剂。
通过上述实施方式，本发明中药物包括修饰有巯基化的甲氨蝶呤的金纳米簇，抗癌效果与游离的甲氨蝶呤药物相接近，本发明中药物在有效抗癌效果的基础上能够大大缓解肝毒性，从而降低药物的毒副作用。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为纳米药物。
本发明的第五方面，提出了上述金纳米簇、上述造影剂或上述药物在造影、肿瘤诊断产品制备或肿瘤治疗产品制备中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤包括肝癌、前列腺癌、黑色素瘤或乳腺癌中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，上述金纳米簇、上述造影剂或上述药物应用于淋巴结成像、癌症转移的诊断产品制备或癌症转移的治疗产品制备中。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述癌症转移包括癌症淋巴转移。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明中实施例1的巯基化甲氨蝶呤合成路线图；
图2为本发明中实施例1的巯基化甲氨蝶呤的质谱图；
图3为本发明中实施例1的巯基化甲氨蝶呤的1H-NMR图；
图4为本发明中实施例1的金纳米簇的微观结构测试结果图；
图5为本发明中实施例5-8及对比例1-2所得金纳米簇的紫外-可见光谱图；
图6为本发明中实施例1所得金纳米簇的紫外-可见光谱图；
图7为本发明中实施例6、11、15及对比例1-4所得金纳米簇的傅里叶变换红外光谱图；
图8为本发明中实施例5-16及对比例1-4所得金纳米簇的Zeta电位测试结果图；
图9为本发明中实施例1的金纳米簇的造影成像效果图；
图10为本发明中实施例5-8及对比例1-2的金纳米簇(后肢足垫注射)的造影成像效果图；
图11为本发明中实施例9-12及对比例3的金纳米簇(后肢足垫注射)的造影成像效果图；
图12为本发明中实施例13-16及对比例4的金纳米簇(后肢足垫注射)的造影成像效果图；
图13为本发明中实施例5-8及对比例1-2的金纳米簇(尾静脉注射)的造影成像效果图；
图14为本发明中实施例1的金纳米簇于小鼠异位皮下模型和小鼠腹部肿瘤模型中的造影成像效果图；
图15为本发明中实施例6的金纳米簇的生物安全性测试结果图；
图16为本发明中实施例1的金纳米簇的抗肿瘤转移效果图；
图17为本发明中实施例1的金纳米簇的抗肿瘤转移效果中肿瘤重量统计图；
图18为本发明中实施例1的金纳米簇对小鼠肝功能指标影响测试结果图；
图19为本发明中实施例1的金纳米簇对小鼠不同治疗过程后肝和肾组织的H&E、PAS和Masson染色结果图，标尺为100μm；
图20为本发明中实施例1的金纳米簇对人肝癌细胞系抗癌效果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，多配体修饰的含义是两种以上配体修饰，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本发明中实施例和对比例中采用的AcS-PEG4-NH2·HCl，购自广州市碳水科技有限公司。
实施例1
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MTX-三配体金纳米簇，其制备过程包括：
(Ⅰ)巯基化甲氨蝶呤的合成：
本实施例中巯基化甲氨蝶呤合成路线如图1所示，具体包括如下步骤：
将甲氨蝶呤(94.5mg，0.21mmol)、HBTU(75.8mg，0.20mmol)和AcS-PEG4-NH2·HCl(33.1mg，0.11mmol)溶解在2mL DMF中，得到混合物Ⅰ。然后，将N,N'-二异丙基乙胺(66μL，0.4mmol)添加到混合物Ⅰ中，并将所得溶液在25℃下搅拌12h，得到混合物II，所得混合物Ⅱ通过半制备高效液相色谱(LC-20AR,SHIMADZU)纯化，得到目标化合物A，为淡黄色粉末(35.2mg，纯度43.7％)；
将氢氧化钠(4.0mg，0.1mmol)溶解在2mL水中，加入化合物A(35.2mg，0.048mmol)，得到混合物Ⅲ。将混合物Ⅲ在25℃下搅拌12h。使用半制备高效液相色谱纯化混合物，得到目标化合物巯基化甲氨蝶呤(20.1mg，纯度60.7％)；所得巯基化甲氨蝶呤的质谱和1H-NMR如图2-3所示，证明成功制备得到目标化合物巯基化甲氨蝶呤。
(Ⅱ)三配体修饰的金纳米簇的合成：
以11-巯基十一烷酸(简称：MUA)、11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(简称：C5)、步骤(Ⅰ)制得的巯基化甲氨蝶呤为配体；采用上述三种配体配制得到总配体浓度为5mmol/L的混合水溶液，所述混合水溶液中，11-巯基十一烷酸、11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱和巯基化甲氨蝶呤的摩尔比分别为5：5：3；
将四水氯金酸水溶液(20mmol/L，250μL)与上述三种配体的混合水溶液(5mmol/L，2mL)混合，得到混合溶液，混合溶液很快变成金黄色。随后，加入50μL的1mol/L NaOH溶液，最终加入乙醇，使得乙醇终体积百分比为20％。在剧烈搅拌下逐滴加入25μL硼氢化钠碱性溶液(硼氢化钠碱性溶液中，硼氢化钠与氢氧化钠的浓度分别为100mmol/L、0.2mol/L)，得到反应混合液，所述反应混合液的pH为10左右。反应3h后，使用3k Da分子量截止的超滤装置纯化产物并用去离子水洗涤直至滤液的pH值达到7，得到Au25(SR)18金纳米簇，简称：MTX-三配体金纳米簇。测试所得MTX-三配体金纳米簇的微观结构，双球差校正透射电镜(DSAC-TEM，FEI Titan Themis G2)测试结果如图4所示，所得金纳米簇的粒径为1-1.5nm，尺寸均匀。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例2
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MTX-三配体金纳米簇，其与实施例1的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，巯基化甲氨蝶呤，11-巯基十一烷酸(MUA)和11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔比为：2：5：5。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例3
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MTX-三配体金纳米簇，其与实施例1的区别之处在于：本实施例中采用11-巯基十一烷基磺酸(简称：MUS)替换实施例1中的11-巯基十一烷酸(MUA)。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例4
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MTX-三配体金纳米簇，其与实施例1的区别之处在于：本实施例中采用11-巯基十一烷基膦酸(简称：MUP)替换实施例1中的11-巯基十一烷酸(MUA)。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例5
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUA-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷酸(MUA)的摩尔分数为：20％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)和巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数分别为：80％和0％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例6
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUA-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷酸(MUA)的摩尔分数为：40％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)和巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数分别为：60％和0％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例7
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUA-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷酸(MUA)的摩尔分数为：60％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)和巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数分别为：40％和0％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例8
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUA-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷酸(MUA)的摩尔分数为：80％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)和巯基化甲氨蝶呤的摩尔分数分别为：20％和0％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例9
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUS-GNC，其与实施例8的区别之处在于：本实施例中采用11-巯基十一烷基磺酸(MUS)替换实施例8中的11-巯基十一烷酸(MUA)，即本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基磺酸(MUS)的摩尔分数为：80％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：20％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例10
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUS-GNC，其与实施例9的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基磺酸(MUS)的摩尔分数为：60％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：40％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例11
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUS-GNC，其与实施例9的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基磺酸(MUS)的摩尔分数为：40％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：60％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例12
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUS-GNC，其与实施例9的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基磺酸(MUS)的摩尔分数为：20％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：80％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例13
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUP-GNC，其与实施例8的区别之处在于：本实施例中采用11-巯基十一烷基膦酸(MUP)替换实施例8中的11-巯基十一烷酸(MUA)，即本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基膦酸(MUP)的摩尔分数为：80％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：20％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例14
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUP-GNC，其与实施例13的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基膦酸(MUP)的摩尔分数为：60％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：40％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例15
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUP-GNC，其与实施例13的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基膦酸(MUP)的摩尔分数为：40％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：60％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
实施例16
本实施例公开了一种金纳米簇，简称：MUP-GNC，其与实施例13的区别之处在于：本实施例中金纳米簇的总配体中，11-巯基十一烷基膦酸(MUP)的摩尔分数为：20％，11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)的摩尔分数为：80％。
本实施例提供了一种造影剂，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
本实施例提供了一种纳米药物，包括本实施例制备得到的金纳米簇。
对比例1
本对比例公开了一种金纳米簇，简称：C5-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本对比例中金纳米簇为单一配体修饰，所述配体为11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)。
对比例2
本对比例公开了一种金纳米簇，简称：MUA-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本对比例中金纳米簇为单一配体修饰，所述配体为11-巯基十一烷酸(MUA)。
对比例3
本对比例公开了一种金纳米簇，简称：MUS-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本对比例中金纳米簇为单一配体修饰，所述配体为11-巯基十一烷基磺酸(MUS)。
对比例4
本对比例公开了一种金纳米簇，简称：MUP-GNC，其与实施例1的区别之处在于：本对比例中金纳米簇为单一配体修饰，所述配体为11-巯基十一烷基膦酸(MUP)。
实施例1-16制得的金纳米簇的粒径均为1-1.5nm。
试验例
本试验例对实施例及对比例得到的金纳米簇进行了性能测试，具体包括：
1、关于金纳米簇的结构和定性相关测试：
(1)采用紫外-可见分光光度计(UV-2600i，SHIMADZU)测试金纳米簇的紫外-可见光谱，实施例5-8及对比例1-2所得金纳米簇的测试结果如图5所示；实施例1所得金纳米簇的紫外-可见光谱如图6所示。由图5和6可知：各测试曲线均表现出明显的Au25(SR)18型金纳米簇的特征吸收峰：约695nm和790nm处的吸收峰，证明成功制备得到Au25(SR)18型金纳米簇，且图5中随着MUA比例的增加，曲线逐渐变得更平滑。
(2)测试实施例6、11、15及对比例1-4所得金纳米簇的傅里叶变换红外光谱(FTIR)，其中红外光谱仪：Thermo Scientific Nicolet iS5；测试结果如图7所示：证实了相应的带负电荷的配体和两性离子配体(C5)在金纳米簇表面共存，不同的配体成功地结合到金纳米簇上，金纳米簇表现出相应自由配体的MUA、MUP或MUS峰的特征红外吸收峰。同时，在值2500nm左右处的S-H峰完全消失，证实了游离硫醇向Au-S键的转变。
(3)Zeta电位测试：测试实施例5-16及对比例1-4所得金纳米簇的Zeta电位，测试设备：Zetasizer Nano ZS 90(Malvern Panalytical)。测试结果如图8所示，由图8可知，金纳米簇的Zeta电位与含巯基的负电配体的比例有关，随着带负电荷的配体比例的增加，金纳米簇的Zeta电位向负电性增强转移，证实了配体被有效地修饰在金纳米簇表面(pH＝7)。
本文中所有动物实验均按照相关法律和机构指南以及机构动物护理和使用委员会(IACUC)对动物实验的伦理要求进行，并获得动物实验福利和伦理批准(编号：TOP-IACUC-2021-0063)。小鼠饲养于动物中心的屏障设施中。具体来说，温度控制在20-26℃之间，相对湿度在40％和70％之间。笼内气流控制在0.2m s-1，最小静压差为10Pa。动物每天喂食一次，并更新水。其中，小鼠为6周龄左右的BALB/c雌性小鼠，购自广东省医学实验动物中心。
涉及动物实验及体外试验的相关测试包括：
2、测试金纳米簇作为造影剂的成像效果：
(1)针对于实施例1制得的MTX-三配体金纳米簇：
通过在小鼠的后肢足垫处(也可以是尾静脉)注射实施例1的MTX-三配体金纳米簇的磷酸盐缓冲液溶液(溶液注射体积为100μL；溶液中金纳米簇的浓度为1mg mL-1；金纳米簇的注射剂量大约为5毫克每千克体重：5mg kg-1；)，并用配备808nm激光的近红外二区小动物成像仪(NIROPTICS，III系列900/1700)进行激光激发成像，收集信号采用1020nm长通滤光片(下同)用于生物成像和外科手术。仰卧位和俯卧位的照片是分开拍摄的。如图9所示，图9为经过足垫注射的实施例1的MTX-三配体金纳米簇6h后在下肢淋巴结部位富集形成高对比度的近红外荧光图像(左：仰卧图，右：俯卧图)。
由图9可以看到在注射后，金纳米簇能够在6h内被动富集小鼠下肢的淋巴结部位，形成高对比度的荧光图片，在曝光时间仅为30ms、激光密度为20mW cm-2的情况下仍然能获得无延迟的高清图像和视频用于手术指导，从而对于尺寸异常的淋巴结进行手术切除的成像指导。此技术不仅能应用于原位的肿瘤模型，还可以应用于异位的肿瘤模型，例如腹腔肿瘤模型。
(2)针对于实施例5-8及对比例1-2制得的金纳米簇(实施例5-8及对比例2制得的金纳米簇，简称为MUA-GNCs)：将其注射小鼠的后肢足垫处，并拍摄荧光图片，具体步骤同(1)中所述，测试结果如图10所示：
图10显示了应用不同比例11-巯基十一烷酸(MUA)和11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱(C5)制备得到的金纳米簇在淋巴累积的变化，可以看到MUA的含量在40-60％范围内(对应实施例6，7)，在小鼠足垫部位的淋巴结有明显的累积。对比例1-2，采用单一配体修饰，没有淋巴结累积效果。
(3)针对于实施例9-12及对比例3制得的金纳米簇(实施例9-12及对比例3制得的金纳米簇，简称为MUP-GNCs)：将其注射于小鼠的后肢足垫处，并拍摄荧光图片，具体步骤同(1)中所述，测试结果如图11所示：实施例9-12中测试结果观察到腘窝淋巴结中的积累，尽管荧光强度稍低于MUA-GNCs。
(4)针对于实施例13-16及对比例4制得的金纳米簇(实施例13-16及对比例4制得的金纳米簇，简称为MUS-GNCs)：将其注射于小鼠的后肢足垫处，并拍摄荧光图片，具体步骤同(1)中所述，测试结果如图12所示：实施例13-16中测试结果观察到腘窝淋巴结中的积累，尽管荧光强度稍低于MUA-GNCs。
(5)为了研究胃肠外给药后含巯基负电配体和两性离子配体修饰的金纳米簇的体内分布情况，将实施例5-8及对比例1-2制得的金纳米簇通过尾静脉注射方式注射到小鼠体内，其他实验信息及步骤同(1)中所述，以实现快速的全身分布。静脉注射后，麻醉小鼠，并使用NIR-II动物成像仪对小鼠在不同时间点上的仰卧位和俯卧位进行拍照(0.5-6h)，测试结果如图13所示。
由图13可知，含巯基负电配体的百分比与肾脏清除时间具有统一关系。例如，对于对比例1中的纯两性离子配体(C5)修饰的金纳米簇，其几乎不进入其他脏器，短时间内就经过肾清除排出。当MUA配体摩尔含量从0％(对比例1)增加到20％(实施例5)时，所得到的金纳米簇的保留时间略有增加。肾脏清除时间增加到约2h，同时肝脏和肾脏的积累略有增加。随着MUA配体摩尔比例从40％(实施例6)增加到60％(实施例7)，注射后2h，一个明显的荧光信号显示于淋巴结(表示强烈信号的骶骨的位置)，证实高淋巴积累与混合C5和MUA配体在一定配体比例范围相关。然而，进一步增加MUA配体的摩尔比例达80％以上的金纳米簇(实施例8，对比例2)没有明显淋巴积累，且主要累积到肝脏和脾脏。
(6)针对于异位肿瘤模型，将实施例1制得的金纳米簇注射于相对应的小鼠体内，具体步骤同(1)中所述，得到荷瘤小鼠的NIR-II荧光图像(20ms,20mW cm-2)，如图14所示。图14中：左侧部分为伴有转移的小鼠的异位皮下模型测试结果。肿瘤部位用实线框标记。同侧坐骨肿瘤的淋巴结显示异常大小和形状(左：皮肤保留，右：切除皮肤)。图14右侧部分为癌症转移小鼠的腹部肿瘤模型测试结果，将实施例1制得的金纳米簇注射于对应小鼠的体内，其注射剂量、其他实验信息及具体步骤如(1)中所述，得到NIR-II荧光图像(20ms,20mW cm-2)。在NIR-II荧光图像和相应的光学照片中，含有淋巴转移的淋巴结用白色箭头标记，可以看到通过金纳米簇成像后的癌症转移淋巴结与正常淋巴结相比有明显增大的和不规则的外形。
3、测试金纳米簇的生物安全性：
针对实施例6所合成的金纳米簇，对其本身的生物安全性进行了研究。具体操作包括：将实施例6制得的金纳米簇配制得到金纳米簇磷酸盐缓冲液溶液(其中金纳米簇的浓度为8mg mL-1)，通过尾静脉或足垫注射到不同组的小鼠体内进行材料的安全性测试(溶液注射体积为100μL；金纳米簇的注射剂量大约为40毫克每千克体重：40mg kg-1；)，并进行生化指标，包括血常规和肝肾功能指标的检测，测试结果见图15。在使用极高浓度(40mg kg-1)的金纳米簇处理后三天，不同给药方式的两组的生化指标，包括肝功能指标(ALT：谷丙转氨酶，AST：谷草转氨酶，ALP：碱性磷酸酶，TP：总蛋白，以及ALB：白蛋白)；肾功能指标(CR：肌酐和BUN：尿素氮)；和血常规指标(红细胞数量，白细胞数量以及血小板数量)均与对照组(于小鼠相同部位注射同等体积的不含金纳米簇的磷酸盐缓冲液)无显着差异，且均在正常值范围内(以斜线框形式指示，图15)。这些结果表明本发明中金纳米簇具有很高的生物安全性，可以安全地用于各种生物成像应用。
4、测试金纳米簇的抗肿瘤效果：
(1)针对于实施例1制得的MTX-三配体金纳米簇：将人肝癌肿瘤细胞Hep3B注射到小鼠左后肢足垫中，构建淋巴结转移小鼠模型，其中，所述人肝癌细胞为市购所得。注射后4天，同侧腘窝淋巴结肿胀。在上述足垫荷瘤小鼠的肿瘤部位注射20mg kg-1的MTX-三配体金纳米簇的磷酸盐缓冲液溶液(溶液注射体积为100μL；金纳米簇的浓度为4mg mL-1；金纳米簇的注射剂量大约为20毫克每千克体重：20mg kg-1；)，阴性对照组和阳性对照组在相同部位分别注射等量的磷酸盐缓冲液和游离的甲氨蝶呤分子(5mg kg-1)，每两天注射一次，持续12天，荷瘤小鼠经过不同治疗手段后的淋巴尺寸比较，测试结果如图16-17所示，由图16-17可知：可以看到小鼠的肿瘤尺寸相对于未注射金纳米簇的对照组尺寸上明显减小，其抗肿瘤转移效果和游离药物组相接近。
测量小鼠的肝功能指标，测试结果如图18所示，图18中显示了不同治疗手段后肝功能指标(ALT：谷丙转氨酶，AST：谷草转氨酶，ALP：碱性磷酸酶，斜线框指示正常参考值范围)，发现注射金纳米簇组的肝肾损伤相较于游离药物组(阳性对照)大幅降低，证明MTX-三配体金纳米簇达到较好的转移治疗效果，在有效抗癌的基础上能够大大缓解肝毒性，从而降低药物的毒副作用。
进一步地，增加设置新的对照组：向所述构建淋巴结转移小鼠模型，注射相同剂量的无配体修饰的金纳米簇(无负载)的磷酸盐缓冲液溶液(溶液注射体积为100μL；金纳米簇的注射剂量大约为20毫克每千克体重：20mg kg-1；)。测试了不同治疗过程后肝和肾组织的H&E、PAS和Masson染色，测试结果如图19所示：图19中，黑色箭头：肝窦和肝索变性(肝H&E)；肝细胞坏死(肝PAS)；肝纤维桥接(肝Masson)；肾小球损伤和纤维化(肾H&E)；刷状边缘脱落(肾PAS)。由图19可知，MTX-三配体金纳米簇保留了游离MTX的治疗作用，但大大降低了其在体内的毒副作用。
其中，H&E染色包括如下步骤：切下固定的组织标本，放入包埋盒中。然后分别用70％、75％、80％、95％、100％酒精梯度脱水，石蜡包埋。包埋后，用Leica 2235切片机对样品进行切片，切片厚度为4μm。石蜡切片三次脱蜡，每次15min，用梯度酒精复水(从高浓度到低浓度100％、95％、90％、80％、70％，2min/次)，放入苏木精染液5min，用流水冲洗，放入0.5％盐酸乙醇溶液分化5s，再用流水冲洗，放入1％伊红染料溶液3min。再次梯度脱水后，将二甲苯加入透明样品中20-30min。切片用树脂固定并用数字病理扫描仪(PanoramicMIDI，3D HISTECH)扫描。
PAS染色包括如下步骤：石蜡包埋切片按上述流程脱蜡并用PAS染色试剂盒(G1008，Servicebio)染色。将切片浸入PAS染色液B中10-15min，用自来水和蒸馏水洗涤两次。将切片浸入PAS染色液A中25-30min，遮光，用流水冲洗5min。随后，切片用PAS染色液C染色30s，自来水冲洗，HCl溶液分化，水洗，氨水蓝染，流水冲洗。最后，将切片脱水并用中性树脂固定。PAS染色后，糖原和含有多糖的组织呈紫红色，细胞核呈淡蓝色。
Masson染色包括如下步骤：石蜡包埋切片按上述流程脱蜡，用Masson染色试剂盒(G1006，Servicebio)染色。将切片浸入Masson A溶液中过夜并用自来水洗涤。然后，将等比例的Masson B和C混合溶液加入切片中并浸泡1min。切片用自来水冲洗，用1％盐酸和酒精进行分化，再次冲洗，然后分别在Masson D和E溶液中浸泡6min和1min。然后将切片浸入Masson F溶液中2-30s，用1％冰醋酸冲洗和分化，并在两个无水乙醇罐中脱水。将切片放入第三罐无水乙醇中5min，用二甲苯使其透明5min，并用中性香脂固定。
(2)针对于实施例1制得的MTX-三配体金纳米簇：在体外试验中，分别应用实施例1制得的MTX-三配体金纳米簇对人肝癌细胞系(Hep3B)进行抗癌效果测试，其中，所述人肝癌细胞为市购所得，配制不同浓度的金纳米簇磷酸盐缓冲液溶液：
具体地，包括如下步骤：将人肝癌细胞在96孔板中预孵育5×105个/mL过夜。将金纳米簇磷酸盐缓冲液溶液添加到96孔板的每个孔中，并将板进一步孵育一天。之后，用含有噻唑蓝(5mg mL-1)的工作溶液代替原来的培养基。4h后，溶液用厚叠餐巾纸吸收，紫色沉淀物溶解在150μL二甲基亚砜中。用移液管将混合物抽吸数次并置于振荡器上10min以完全溶解晶体。用酶标仪测量570nm处的吸光度。
其中，实施例1制得的MTX-三配体金纳米簇的测试结果如图20所示，从图20可以看出：细胞活度越低，证明材料的抗癌效果越好，该材料对于肝癌细胞的半数抑制浓度为大约5mg mL-1。
实施例2制得的金纳米簇的体外试验测试结果与实施例1基本相当，其对于肝癌细胞的半数抑制浓度为大约5.5mg mL-1，同样具有较好的抗癌作用。
相较于单配体金纳米簇，本发明中的金纳米簇具有淋巴结被动累积的效果，借助其本身的近红外荧光实现淋巴结的高对比度荧光造影以及癌症淋巴转移的诊断。同时，还实现了抗癌药物的有效负载，在达到抗癌效果的同时显著降低肝毒性，实现了一举三得的效果。
通过在体外细胞和动物模型中进行实验，已经证明本发明中的金纳米簇的功能的可行性。其中在小鼠的足垫荷瘤模型上进行了体内成像和手术指导切除异常的淋巴结。同时在治疗足垫肿瘤的淋巴结转移模型中也显示出较好的抗癌效果以及显著减少的肝毒性(相对于对照组和游离药物组)。
目前，金纳米簇通常由单一类型的巯基化配体修饰，极大地限制了它们的生物学应用。由于生物体内的生理环境极其复杂，这些单配体金纳米簇不能满足在体内有效使用的要求。具体来说，对于淋巴系统，带负电的金纳米簇必须通过细胞间质进行迁移，而间质中充满了纠缠在一起的胶原纤维和带负电的糖胺聚糖(主要是透明质酸)基质。因此，太高或太低的金纳米簇表面电荷都会导致非特异性吸附或通过肾清除迅速排出体外。因此，找到最佳电荷密度是有效淋巴结积累的关键，但这对于用单一类型配体修饰的金纳米簇来说是极其困难的。
相较于一般的单配体金纳米簇，本发明中的Au25(SR)18金纳米簇，为多配体修饰，合适的表面特性可用于有效的淋巴结生物成像、手术指导和治疗淋巴结转移。具体地，本发明中的Au25(SR)18金纳米簇，特别是MTX-三配体金纳米簇(如实施例1制得的金纳米簇)，能够通过调节表面配体的种类及比例，实现有效的淋巴聚集，从而作为淋巴造影剂实现转移淋巴结的成像和手术切除的指导。
与最广泛使用的淋巴结造影剂——吲哚菁绿(半衰期：约0.5h)相比，本发明中的MTX-三配体金纳米簇具有更高的光稳定性、更长的储存时间和最佳的体内停留时间，其稳定的近红外二区荧光允许超过3h的单次注射成像，使其非常适合荧光引导手术。同时，通过调节其表面配体的比例，成功实现了金纳米簇在淋巴结肿的有效聚集，其淋巴成像曝光耗时仅需30ms。
与此同时，本发明中，通过前期对甲氨蝶呤进行了巯基化修饰，进而将其作为配体分子与金纳米簇核心以配位键方式相连，这样就将修饰后的甲氨蝶呤集成在单个的Au25(SR)18金纳米簇分子实体上，使得药物装载量稳定且难以脱落，能够在影像学指导下进行肿瘤转移的治疗，保证稳定性的基础上在金纳米簇上携带药物分子，能够在单个的金纳米簇分子上实现癌症淋巴转移手术成像指导和癌症转移治疗两种功能，使MTX-三配体金纳米簇在增强淋巴结的被动累积的情况下，利用其近红外荧光的性质作为造影剂指导手术切除，同时具有抗癌和降低药物毒副作用的功能。
本发明中，成功地将一种化疗药物甲氨蝶呤纳入三配体修饰的金纳米簇的合成中，这不仅大大提高了向淋巴结的药物递送效率，而且将游离药物的肝毒性降低了5倍以上，同时保留了相当的抗肿瘤效应，证明了这种三配体金纳米簇作为一种有吸引力的多功能工具的巨大潜力，可用于有效治疗癌症淋巴转移。MTX-三配体金纳米簇能够有效在高效无延迟淋巴转移手术成像指导的基础上对转移病灶进行治疗，以实现对于癌症淋巴转移的多功能诊疗，且动物实验效果较好。
需要说明的是，本文中的“室温”，如无特殊说明，约为25℃；本文中涉及数值的“约”、“左右”的含义为误差±2％。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (7)

1.一种金纳米簇，其特征在于，所述金纳米簇上修饰有配体，所述配体包括含巯基的负电配体、含巯基的两性离子配体和治疗性配体；所述配体中，所述含巯基的负电配体的摩尔分数为20-80%；
所述金纳米簇的结构式为Au25(SR)18，其中，SR为所述配体；所述金纳米簇的粒径为1-1.5 nm；
所述治疗性配体为巯基化甲氨蝶呤，所述巯基化甲氨蝶呤的结构式如式（1）所示：
（1）；
所述含巯基的两性离子配体为11-巯基十一烷基磺酸甜菜碱；所述含巯基的负电配体为11-巯基十一烷酸。
2.根据权利要求1所述的一种金纳米簇，其特征在于，所述配体中，所述含巯基的负电配体的摩尔分数为40-60%。
3.一种权利要求1所述的金纳米簇的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将配体与氯金酸溶液混合，得到含有金-配体的络合物混合溶液；
S2，将强碱溶液与步骤S1得到的混合溶液混合后，加入醇，搅拌条件下，再加入硼氢化钠溶液，得到反应混合液，反应，纯化，得到所述金纳米簇；其中，所述反应混合液的pH为9.7-10.3；
步骤S2中，所述强碱溶液中氢氧根离子的浓度为0.8-1.2 mol/L。
4.一种造影剂，其特征在于，所述造影剂包括如权利要求1-2任一项所述的金纳米簇或如权利要求3所述制备方法制得的金纳米簇。
5.一种药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1-2任一项所述的金纳米簇或如权利要求3所述制备方法制得的金纳米簇或如权利要求4所述的造影剂。
6.如权利要求1-2任一项所述的金纳米簇或如权利要求3所述制备方法制得的金纳米簇或如权利要求4所述的造影剂或如权利要求5所述的药物在制备造影产品、肿瘤诊断产品或肿瘤治疗产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将所述金纳米簇、所述造影剂或所述药物应用于制备淋巴结成像产品、癌症转移的诊断产品或癌症转移的治疗产品中。
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