CN113171465A - 一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配体，以透明质酸(HA)为主动靶向配体，包载蛋白质药物(如细胞色素C，Cyt C)，构筑了一种递送蛋白质药物的骨靶向MOFs纳米载体。本发明制备方法中的纳米递药载体具有良好的血清稳定性，能够在酸性条件下快速释药，对蛋白质药物有较好的保护作用，能够将活性蛋白质有效地传递到细胞内部并从溶酶体中逃逸到达所需的细胞内位点的递药载体，该药物递送材料既具有良好的组织相容性，又具有良好的骨靶向性能，可用于作为治疗各种癌症骨转移的蛋白药物载体。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质药物载体，具体是一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法。
背景技术
蛋白质在新陈代谢、信号传递、能量学、基因调节和免疫反应等多种细胞过程中发挥着重要作用。许多疾病都是由细胞内蛋白质的功能改变或缺乏引起的。蛋白质疗法是将蛋白质导入细胞以代替失调的蛋白质的治疗方法。因此，蛋白质药物在药物研发和疾病的诊断治疗中具有重要的现实意义。蛋白质药物与传统的小分子化学药物相比，具有低毒性、高特异性和高选择性的优点。但是，由于蛋白质的化学本质与传统的小分子化学药物差异较大，包括分子量较大、所带电性复杂、结构不稳定等，在体内递送方面仍存在很多难题，如体内外稳定性差、易被体内蛋白酶降解、强免疫原性等。此外，对于作用靶点在胞内的蛋白质药物，能否被细胞有效内吞、能否完成溶酶体逃逸等问题。因此，开发一种能够将活性蛋白质有效地传递到细胞内部并从溶酶体中逃逸到达所需的细胞内位点的递送系统具有重要的意义。
肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要因素之一，转移位点主要包括骨、肺、肝等组织。其中，由于骨组织特殊的构造和生理微环境，十分适合播散肿瘤细胞的休眠和再激活，使其成为乳腺癌、肺癌、前列腺癌等恶性肿瘤最常见的转移部位之一。使用骨靶向载体递送药物至骨转移病灶已成为开发中重要治疗手段。例如，以双磷酸盐类、酸性寡肽类、四环素类、大环蒽醌类等骨亲和力分子作为靶头的纳米载体已经被报道用于骨转移瘤等骨疾病治疗的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，通过以MOFs材料为载体，以阿仑膦酸钠(ALN)为骨靶向配体，以透明质酸(HA)为主动靶向配体，包载蛋白质药物，构筑一种递送蛋白质药物的骨靶向MOFs纳米载体；该药物递送材料既具有良好的组织相容性，又具有良好的骨靶向性能，可用于作为治疗各种癌症骨转移的蛋白药物载体。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，通过以MOFs材料为载体，以ALN为骨靶向配体，以HA为主动靶向配体，包载蛋白质药物，构筑一种递送蛋白质药物的骨靶向MOFs纳米载体。
进一步地，所述MOFs纳米粒包括MOF纳米粒、MOF-Cyt C纳米粒、HA@MOF-Cyt C纳米粒和ALN-HA@MOF-Cyt C纳米粒。
进一步地，所述制备方法的操作步骤包括：
S1、通过酰胺化反应制备骨靶向聚合物ALN-PEG-HA和非骨靶向聚合物CH3O-PEG-HA；
S2、一锅法制备MOFs纳米粒
利用HA所带有的-COOH与Zn2+通过静电结合以及配位作用的方式包裹在MOFs纳米粒的表面，制备出HA@MOF-Cyt C纳米粒和ALN-HA@Cyt C纳米粒；
S3、优化MOFs纳米粒的制备条件
设置制备液的不同浓度梯度，通过实验对比，筛选出MOFs纳米粒的最佳制备条件；
S4、观测记录并对纳米粒的包封率和载药量进行测定
S5、不同MOFs纳米粒的体外骨靶向性研究
S51、MOFs纳米粒表面包裹发光材料，用于追踪；
S52、采用离体骨片吸附实验考查MOFs纳米粒的体外骨靶向性能；
S6、MOFs相关纳米粒的组织相容性考察
以A549细胞为模型，将MOF、HA@MOF和ALN-HA@MOF与A549细胞共孵育48h，进行相容性考察；
S7、MOFs纳米粒体外药效学研究
取A549细胞孵育培养，吸取培养液，加入不同浓度的Cyt C,MOF-Cyt C、HA@MOF-Cyt C和ALN-HA@MOF-Cyt C溶液，设置纯培养液组为阴性对照组，无细胞组为空白对照组，检测并计算细胞存活率；
S8、A549细胞对MOFs纳米粒摄取的观察
观察培养瓶中的A549细胞状态；
对培养瓶中的细胞清洗、消化、吹打制成单细胞悬液；
给药前观察、洗涤和预处理；
加入FITC-BSA、MOF-FITC-BSA、HA@MOF-FITC-BSA和ALN-HA@MOF-FITC-BSA溶液孵育；
固定清洗细胞，加入Hoechst染细胞核，显微镜观察。
进一步地，所述ALN-PEG-HA的制备包括以下步骤：
S11、ALN在弱碱性的条件下与COOH-PEG-NH2反应生成ALN-PEG-NH2；
S12、将步骤S11的产物ALN-PEG-NH2中的氨基与HA中的羧基发生酰胺化反应生成ALN-PEG-HA。
进一步地，所述步骤S3中MOFs纳米粒的最佳制备条件为：有机配体的浓度为1.5-5.5mM、蛋白浓度为0.05-0.5mg/mL和HA浓度为0.1-0.5mg/mL。
进一步地，所述MOF纳米粒呈现类六边形的形貌，MOF-Cyt C纳米粒呈现类多边形的形貌，以ALN-HA@MOF-Cyt C为代表的经HA修饰的纳米粒呈现出不规则球形的形貌，TEM粒径均小于100nm。
进一步地，所述步骤S6中MOFs材料的体外生物相容性考察采用MT法。
进一步地，所述步骤S7中MOFs纳米粒体外药效学研究采用MTT法。
本发明的有益效果：
本发明制备方法中的纳米递药载体具有良好的血清稳定性，能够在酸性条件下快速释药，对蛋白质药物有较好的保护作用，能够将活性蛋白质有效地传递到细胞内部并从溶酶体中逃逸到达所需的细胞内位点的递药载体，该药物递送材料既具有良好的组织相容性，又具有良好的骨靶向性能，可用于作为治疗各种癌症骨转移的蛋白药物载体。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明(A)MOF、(B)MOF-Cyt C和(C)ALN-HA@MOF-Cyt C纳米粒图；
图2是本发明MOFs纳米粒粒径、PDI和Zeta电位图；
图3是本发明MOFs纳米粒的载药量图；
图4是本发明MOF-FITC-BSA、HA@MOF-FITC-BSA和ALN-HA@MOF-FITC-BSA纳米粒对大鼠离体骨片的吸附情况图；
图5是本发明MOF、HA@MOF和ALN-HA@MOF体外生物相容性研究结果图；
图6是本发明Cyt C、MOF-Cyt C、HA@MOF-Cyt C和ALN-HA@MOF-Cyt C作用于A549细胞48h细胞存活率图；
图7是本发明A549细胞对FITC-BSA、MOF-FITC-BSA、HA@MOF-FITC-BSA和ALN-HA@MOF-FITC-BSA和游离HA预处理组的摄取情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，提供一种透明质酸(HA)修饰的阿伦磷酸钠(ALN)作靶头的MOF蛋白载体材料的制备方法，具体操作步骤如下：
S1、通过酰胺化反应制备骨靶向聚合物ALN-PEG-HA和非骨靶向聚合物CH3O-PEG-HA
ALN-PEG-HA的制备包括以下步骤：
S11、ALN在弱碱性的条件下与COOH-PEG-NH2反应生成ALN-PEG-NH2；
S12、将步骤S11的产物ALN-PEG-NH2中的氨基与HA中的羧基发生酰胺化反应生成ALN-PEG-HA；
S2、一锅法制备MOFs纳米粒
利用HA所带有的-COOH与Zn2+通过静电结合以及配位作用的方式包裹在MOFs纳米粒的表面，制备出HA@MOF-Cyt C纳米粒和ALN-HA@Cyt C纳米粒。
如图1所示，MOFs纳米粒包括MOF纳米粒、MOF-Cyt C纳米粒、HA@MOF-Cyt C纳米粒和ALN-HA@MOF-Cyt C纳米粒共四种不同纳米粒，四种不同纳米粒的粒径、PDI和Zeta电位，如图2所示；
S3、优化MOFs纳米粒的制备条件
设置制备液的不同浓度梯度，通过实验对比，筛选出MOFs纳米粒的最佳制备条件。
实验测得最佳制备条件为：有机配体的浓度为1.5-5.5mM、蛋白浓度为0.05-0.5mg/mL和HA浓度为0.1-0.5mg/mL；
S4、观测记录并对纳米粒的包封率和载药量进行测定
MOF纳米粒呈现类六边形的形貌，MOF-Cyt C纳米粒呈现类多边形的形貌，以ALN-HA@MOF-Cyt C为代表的经HA修饰的纳米粒呈现出不规则球形的形貌，TEM粒径均小于100nm。
如图3所示，MOF-Cyt C、HA@MOF-Cyt C,和ALN-HA@MOF-Cyt C的包封率均在88％以上，载药量均在3％以上，包封率高；
S5、不同MOFs纳米粒的体外骨靶向性研究
S51、MOFs纳米粒表面包裹发光材料，用于追踪；
S52、采用离体骨片吸附实验考查MOFs纳米粒的体外骨靶向性能。
如图4所示，ALN-HA@MOF-FITC-BSA组有着更强的荧光强度，表明更多的纳米粒结合在骨片上，ALN-HA@MOF-FITC-BSA纳米粒具有良好的骨靶向性能；HA@MOF-FITC-BSA组和MOF-FITC-BSA组的荧光强度较弱，是因为静电结合作用，导致纳米粒吸附在骨片上，但效果明显弱ALN-HA@MOF-FITC-BSA组。
ALN-HA@MOF-FITC-BSA、HA@MOF-FITC-BSA和MOF-FITC-BSA纳米粒均为为包裹发光材料的MOFs纳米粒；
S6、MOFs相关纳米粒的组织相容性测定
以A549细胞为模型，将MOF,、HA@MOF和ALN-HA@MOF与A549细胞共孵育48h，采用MTT法对MOFs材料的体外生物相容性进行考察。
如图5所示，MOFs材料在浓度范围0-100μg/mL内，A549细胞仍然保持88％以上的存活率。当MOF、HA@MOF和ALN-HA@MOF的浓度高达100μg/mL时，A549细胞的存活率分别为97.13±1.58％，89.28±4.08％，88.47±3.22％，均在80％以上，表明MOFs材料具有良好的体外生物相容性；
S7、MOFs纳米粒体外药效学研究
采用MTT法，取对数生长期的A549细胞，以5×103cell/pore的密度接种于96孔板中，37℃下孵育24h后，吸取培养液，并用0.01M pH 7.4PBS洗涤3次，分别加入100μL不同浓度的不含有FBS的1640培养液稀释的Cyt C,MOF-Cyt C,HA@MOF-Cyt C,ALN-HA@MOF-Cyt C溶液(Cyt C浓度范围为0.01μg/mL-10μg/mL)，平行操作六份，以纯培养液组为阴性对照组，无细胞组为空白对照组，37℃下孵育48h。
孵育完后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃条件下继续孵育4h，4h后，轻轻吸去上清，每孔加入200μL DMSO，避光震15min，使甲瓒结晶充分溶解。随后，用酶标仪在570nm处进行检测，计算细胞存活率。
如图6所示，随着Cyt C浓度增大，细胞存活率依次降低，当Cyt C的浓度为0-2μg/mL，各给药组的细胞存活率没有较大的差别。当Cyt C的浓度大于等于10μg/mL时，HA@MOF-Cyt C、ALN-HA@MOF-Cyt C能更好的抑制肿瘤细胞活性。
体外药效试验显示，当Cyt C的浓度大于等于10μg/mL时，相比于游离Cyt C，ALN-HA@MOF-Cyt C作用48h后表现出更强的体外抗肿瘤效果；
S8、A549细胞对MOFs纳米粒摄取的观察
当培养瓶中的A549细胞状态良好，生长密度达到75％左右时，进行细胞摄取实验。
对培养瓶中的细胞清洗、消化、吹打制成单细胞悬液，以1×104cell/pore的密度接种于铺有无菌盖玻片的六孔板中。培养过夜后，显微镜观察细胞生长至融合度达80％左右时，游离HA处理组。
在给药之前，吸去培养液，用PBS洗涤，随后加入含有200μg HA的不含FBS培养液预处理2h。
2h后，所有分组均吸去培养液，用PBS清洗3遍，分别加入2mL用不含FBS培养液稀释的FITC-BSA,MOF-FITC-BSA,HA@MOF-FITC-BSA和ALN-HA@MOF-FITC-BSA溶液(每孔FITC的含量为100ng/mL)，孵育4h后，用4℃预冷的PBS洗涤3遍。
随后，每孔加入0.5mL 4％多聚甲醛固定细胞，固定时间为15min。
固定完成后用PBS清洗3遍，每孔加入1mL 10μg/mL的Hoechst染细胞核10min，加入PBS洗涤3遍。取出六孔板内的盖玻片，反扣在滴有10μL封片液的载玻片上，黑暗处放置过夜，待晾干后用激光共聚焦显微镜观察。
如图7所示，与MOF-FITC-BSA相比，表层包裹HA的HA@MOF-FITC-BSA和ALN-HA@MOF-FITC-BSA组，显示出更强的绿色荧光，表明HA的修饰能够增加细胞对纳米粒的摄取。同样，采用HA预处理，使A549细胞表面的CD44受体达到饱和时，细胞对ALN-HA@MOF-FITC-BSA纳米粒的摄取明显减少，进一步证明了HA经CD44受体内吞被细胞摄取。
细胞摄取实验结果表明，经HA表面修饰的纳米粒可通过CD44受体介导的内吞作用增加细胞摄取率，表明HA和MOFs材料能促进蛋白质药物进入细胞内发挥药效。
采用本发明所提供的技术方案，该药物递送材料既具有良好的组织相容性，又具有良好的骨靶向性能，可用于作为治疗各种癌症骨转移的蛋白药物载体。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (8)
1.一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，通过以MOFs材料为载体，以ALN为骨靶向配体，以HA为主动靶向配体，包载蛋白质药物，构筑一种递送蛋白质药物的骨靶向MOFs纳米载体。
2.根据权利要求书1所述的一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，所述MOFs纳米粒包括MOF纳米粒、MOF-Cyt C纳米粒、HA@MOF-Cyt C纳米粒和ALN-HA@MOF-Cyt C纳米粒。
3.根据权利要求书2所述的一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的操作步骤包括：
S1、通过酰胺化反应制备骨靶向聚合物ALN-PEG-HA和非骨靶向聚合物CH3O-PEG-HA；
S2、一锅法制备MOFs纳米粒
利用HA所带有的-COOH与Zn2+通过静电结合以及配位作用的方式包裹在MOFs纳米粒的表面，制备出HA@MOF-Cyt C纳米粒和ALN-HA@Cyt C纳米粒；
S3、优化MOFs纳米粒的制备条件
设置制备液的不同浓度梯度，通过实验对比，筛选出MOFs纳米粒的最佳制备条件；
S4、观测记录并对纳米粒的包封率和载药量进行测定
S5、不同MOFs纳米粒的体外骨靶向性研究
S51、MOFs纳米粒表面包裹发光材料，用于追踪；
S52、采用离体骨片吸附实验考查MOFs纳米粒的体外骨靶向性能；
S6、MOFs相关纳米粒的组织相容性考察
以A549细胞为模型，将MOF、HA@MOF和ALN-HA@MOF与A549细胞共孵育48h，进行相容性考察；
S7、MOFs纳米粒体外药效学研究
取A549细胞孵育培养，吸取培养液，加入不同浓度的Cyt C,MOF-Cyt C、HA@MOF-Cyt C和ALN-HA@MOF-Cyt C溶液，设置纯培养液组为阴性对照组，无细胞组为空白对照组，检测并计算细胞存活率；
S8、A549细胞对MOFs纳米粒摄取的观察
观察培养瓶中的A549细胞状态；
对培养瓶中的细胞清洗、消化、吹打制成单细胞悬液；
给药前观察、洗涤和预处理；
加入FITC-BSA、MOF-FITC-BSA、HA@MOF-FITC-BSA和ALN-HA@MOF-FITC-BSA溶液孵育；
固定清洗细胞，加入Hoechst染细胞核，显微镜观察。
4.根据权利要求书3所述的一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，所述ALN-PEG-HA的制备包括以下步骤：
S11、ALN在弱碱性的条件下与COOH-PEG-NH2反应生成ALN-PEG-NH2；
S12、将步骤S11的产物ALN-PEG-NH2中的氨基与HA中的羧基发生酰胺化反应生成ALN-PEG-HA。
5.根据权利要求书3所述的一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中MOFs纳米粒的最佳制备条件为：有机配体的浓度为1.5-5.5mM、蛋白浓度为0.05-0.5mg/mL和HA浓度为0.1-0.5mg/mL。
6.根据权利要求书3所述的一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，所述MOF纳米粒呈现类六边形的形貌，MOF-Cyt C纳米粒呈现类多边形的形貌，以ALN-HA@MOF-Cyt C为代表的经HA修饰的纳米粒呈现出不规则球形的形貌，TEM粒径均小于100nm。
7.根据权利要求书3所述的一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，所述步骤S6中MOFs材料的体外生物相容性考察采用MT法。
8.根据权利要求书3所述的一种递送蛋白药物的骨靶向MOFs纳米递药载体的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中MOFs纳米粒体外药效学研究采用MTT法。
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