CN105153277A - KE修饰的β-咔啉,其制备,纳米结构,活性和应用 - Google Patents

Abstract

KE修饰的β-咔啉,其制备,纳米结构,活性和应用。本发明公开了下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu，Lys-Glu的标准缩写是KE。公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它的抗肿瘤作用，公开了它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用，进一步公开了它的抗炎作用，阐明了它在医学中的应用。

Description

KE修饰的β-咔啉,其制备,纳米结构,活性和应用

技术领域

本发明涉及1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu。涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的体内外抗肿瘤作用，涉及它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用，进一步涉及它的抗炎作用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤并发的炎症和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上的恶性肿瘤患者都是死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织；4)炎症使进入正常组织的肿瘤细胞成长为转移的新生肿瘤。

由于现有抗肿瘤药物不具备抗炎症、抗血栓和抗转移作用，所以疗效不理想。发明同时具有抗肿瘤、抗炎症和抗肿瘤转移作用的药物是临床的迫切需求。

RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α_Vβ₃的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘附活性。Lys-Glu(KE)在1μM浓度下则能抑制HCCLM6的运动和侵袭。。申请人曾经把它们与雌激素偶联，制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把它们与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构类型的代表。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤、抗炎症和抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭作用的化合物。

发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将Lys-Glu与1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸偶联，形成的化合物会同时具有抗肿瘤、抗炎症和抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu。

本发明的第二个内容是提供1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu的制备方法，该方法包括：

(1)在浓硫酸存在下，5-甲酰水杨酸在甲醇中微波90℃反应2h，生成5-甲酰水杨酸甲酯；

(2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；

(3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水杨酸和L-色氨酸苄酯缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(4)在2，3-二氯-5，6-二腈基-1，4-苯醌(DDQ)的存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃(THF)中氧化为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(5)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯反应生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸；

(6)在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反应，得到全保护多肽序列Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl；

(7)在冰浴下盐酸的乙酸乙酯溶液(4N)中，全保护多肽序列Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl脱除Boc得到Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl；

(8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水THF中与Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl；

(9)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl反应得到1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu。

本发明的第三个内容是测定1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu的纳米结构。

本发明的第四个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。

本发明的第五个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu对荷s180小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第六个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu体外抑制肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。

本发明的第七个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu的体内抗炎作用。

附图说明

图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨基酸或甘氨酸。

图2.化合物5的合成路线.i)CH₃OH，浓H₂S0₄，微波90℃；ii)多聚磷酸，苯甲醇，油浴75℃；iii)CH₂Cl₂，TFA；iv)THF，DDQ；v)CH₃OH，Pd/C，H₂；vi)DCC，HOBt，NMM，THF；vii)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4M)。

图3.化合物5在纯水溶液中1×10^-7M浓度下的透射电镜照片。

图4.化合物5作用于肿瘤细胞的细胞毒作用(n＝3)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备5-甲酰水杨酸甲酯

称取1.660g(10.0mmol)5-甲酰水杨酸于微波反应罐中，加入25mL甲醇及1mL浓H₂SO₄，于微波反应器中90℃反应2h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降至室温后，将反应液转移至100mL茄形瓶中，用浓氨水调pH值至7-8，将反应液减压浓缩至干后，加大量乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三遍，然后用无水Na₂SO₄干燥2h，过滤、减压浓缩至干，于室温放置过夜即有晶体析出，得1.635g(90.8％)目标化合物，为淡黄色针状晶体。ESI-MS(m/e)：181[M+H]⁺。

实施例2制备L-色氨酸苄酯

称取15.0g(44.4mmol)多聚磷酸于500mL茄形瓶中，加入80mL苯甲醇，使其在油浴50℃中溶解，待溶液温度上升至75℃后，称取10g(49.0mmol)L-色氨酸加入其中，75℃下反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温后，在冰浴搅拌下往反应瓶中倒入400mL无水乙醚，此时有白色固体析出，搅拌过夜后将之过滤，白色固体用200mL乙酸乙酯和10mL水悬浮，用三乙胺调溶液pH值至8左右，溶液变为澄清状，静置分液，将分离的酯层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三遍，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥2h，过滤、减压浓缩至干，得12.85g(89.2％)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e)：295[M+H]⁺。

实施例3制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

往250mL茄形瓶中加入100mLCH₂Cl₂及10mLTFA，搅拌均匀后称取11.76g(40.0mmol)L-色氨酸苄酯和7.92g(44.0mmol)5-甲酰水杨酸甲酯加入其中，数分钟后反应液变为微红色，2天后反应液变为黑色，在冰浴搅拌下缓慢滴加浓氨水将反应液调pH值至8，将反应液静置分液，将分离CH₂Cl₂层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三遍，CH₂Cl₂层用无水Na₂SO₄干燥2h，过滤、减压浓缩至干，得14.59g(80％)目标化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：457[M+H]⁺。

实施例4制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)

称取1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯4.56g(10.0mmol)于250mL茄形瓶中，用干燥THF溶解，加入DDQ4.54g(20.0mmol)，数分钟后反应液变浑浊，4h后反应完全，过滤，滤出固体依次用饱和NaHCO₃、甲醇、乙醚洗，过滤，得3.75g(82.7％)目标化合物，为灰白色固体。ESI-MS(m/e)：453[M+H]⁺；Mp：190.4-191.0℃.¹HNMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝8.87(s，1H)，8.42(m，2H)，8.10(dd，J＝2.1Hz，J＝2.1Hz，1H)，7.69(d，J＝8.1Hz，1H)，7.57(m，3H)，7.37(m，3H)，7.04(d，J＝6.3Hz)，5.46(s，1H)，3.88(s，3H).¹³CNMR(75MHz，DMSO)：δ/ppm＝169.28，165.93，142.35，137.07，135.13，131.75，129.30，128.98，128.47，128.41，122.40，121.73，120.62，116.54，114.71，66.39，52.47.Elem.Anal：C₂₇H₂₀N₂O₅.C，71.67；H，4.46；N，6.19。

实施例5制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸(3)

将2.26g(5.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯混悬于120mL甲醇中，加入400mgPd/C，反应液先用真空水泵抽走空气，然后通入氢气，如此反复3次，室温下反应2天，利用TLC监测至原料斑点消失，常压过滤反应液，将反应液减压浓缩至干，得1.080g(59.7％)目标化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：361[M-H]^-；Mp：227.1-227.9℃.Elem.Anal：C₂₀H₁₄N₂O₅.C，66.30；H，3.89；N，7.73。

实施例6制备Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl

1)Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl的制备

将1.9g(5.0mmol)Boc-Lys(Z)混悬于20mL干燥THF，室温搅拌下向溶液中加入0.68g(5.0mmol)HOBt，冰浴搅拌下加入1.133g(5.5mmol)DCC，得到反应液I，冰浴下搅拌30分钟。将2.50g(5.0mmol)Glu(OBzl)-OBzl混悬于20mL干燥THF中，然后逐渐加入NMM，调节pH至8-9，得到反应液II。将反应液II加入反应液I中，先在冰浴下搅拌1h，再在室温搅拌，TLC监测至原料点消失。后处理：减压过滤除去DCU，将滤液减压浓缩除去THF，残留物用150mLEA溶解，将得到的溶液置于250mL分液漏斗中，依次用5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液各洗3次，EA层用无水Na₂SO₄干燥30min，减压过滤，滤液减压浓缩至干，得3.10g(89.9％)标题化合物，为无色油状物。TLC条件：PE/EA，1∶1，R_f＝0.57.ESI-MS(m/e)：690[M+H]⁺。

2)Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl的制备

将3.10g(4.5mmol)Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl置于50mg茄瓶中，冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加30mL4NHCl/EA溶液，加干燥管，冰浴搅拌下反应2小时后TLC监测原料点消失，终止反应。后处理：搅拌下用水泵将反应液减压抽干，加EA溶解后再次用水泵减压抽干，重复三次；加无水乙醚充分混悬后静置，倾倒出乙醚，抽干产物，重复三次，制得2.73g(97％)标题化合物，为无色油状物。TLC条件：PE/EA，1∶1.ESI-MS(m/e)：590[M+H]⁺。

实施例7制备1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu(5)

1)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl(4)的制备

按Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl的制备方法由0.36g(1.0mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸(3)和0.63g(1.0mmol)Lys(z)-Glu(OBzl)-OBzl得0.49g(52.7％)标题化合物，为淡黄色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH/HAc，50∶1∶0.5，R_f＝0.44.ESI-MS(m/e)：934[M+H]⁺.¹HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝11.91(s，1H)，10.76(s，1H)，8.83(s，1H)，8.66(dd，J＝7Hz，J＝2.5Hz，2H)，8.46(d，J＝1.5Hz，1H)，8.41(d，J＝7.5Hz，1H)，8.21(dd，J＝8.5Hz，J＝2.0Hz，1H)，7.70(d，J＝8.0Hz，1H)，7.61(t，J＝7.5Hz，1H)，7.28(m，18H)，5.13(s，2H)，5.07(s，2H)，4.94(s，2H)，4.67(dd，J＝13.5Hz，J＝8.0Hz，1H)，4.42(dd，J＝13.5Hz，J＝8.0Hz，1H)，3.97(s，3H)，2.96(dd，J＝12.5Hz，J＝6.5Hz，2H)，2.48(m，1H)，2.08(m，1H)，1.94(m，1H)，1.81(m，1H)，1.51(m，1H)，0.84(m，1H).Elem.Anal：C₅₃H₅₁N₅O₁₁.C，68.16；H，5.50；N，7.50。

2)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu(5)的制备

将0.25g(0.27mmol)1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl溶于15mL甲醇中，室温搅拌下加入50mgPd/C，使用三通连接反应瓶和氢气袋，反应液先用真空水泵抽走空气，然后通入氢气，如此反复3次，室温搅拌下反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，减压过滤反应液，将反应液减压浓缩至干，得0.055g(33.2％)目标化合物，为灰白色固体。TLC条件：CH₂Cl₂/CH₃OH/HAc/H₂O，2.5∶0.5∶0.25∶0.1，R_f＝0.37.HPLC：流动相(色谱乙腈/超纯水，0min，10∶90；2min，20∶80；5min，30∶70；8min，35∶65；9min，40∶60；10min，50∶50；11min，90∶10；30min，90∶10)，保留时间13.79min，纯度95.9％.ESI-MS(m/e)：620[M+H]⁺.Mp：156.7-157.2℃.(c＝0.36，CH₃OH).IR(KBr)：3155.54，1653.00，1490.97，1363.67，1246.02，441.70cm^-1.ESI-MS(m/e)：934[M+H]⁺.¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝11.97(s，1H)，10.79(s，1H)，8.83(s，1H)，8.72(d，J＝8.4Hz，1H)，8.54(d，J＝7.5Hz，1H)，8.44(dd，J＝8.1Hz，J＝2.4Hz，2H)，8.21(dd，J＝8.4Hz，J＝2.4Hz，1H)，7.86(m，3H)，7.69(d，J＝8.1Hz，1H)，7.61(t，J＝7.8Hz，1H)，7.33(m，2H)，4.67(m，1H)，4.23(m，1H)，3.96(s，3H)，2.73(m，1H)，2.32(m，1H)，1.99(m，2H)，1.81(m，3H)，1.58(m，2H)，1.42(m，2H).Elem.Anal：C₃₁H₃₃N₅O₉.C，60.09；H，5.37；N，11.30。

实验例1测定化合物5的透射电镜照片

将化合物5按照1×10^-7M的浓度配置化合物的纯水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图3。结果表明，化合物5在水中均可形成纳米颗粒，直径在80-160nm之间。

实验例2测定化合物5对肿瘤细胞的细胞毒作用

1)本发明的化合物5用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为HepG₂(人肝细胞癌细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，Bel-7402(人肝癌细胞)，HT-29(人结肠癌细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，A549(人肺癌细胞)，S180(小鼠腹水瘤细胞)和HCCLM3(人高转移肝癌细胞)。

3)实验方法HL-60，HT-29，Bel-7402，A549和S180细胞选用RPMI-1640培养基；HepG₂，HeLa和HCCLM3细胞选用DMEM培养基。培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

贴壁细胞HepG2，HT-29，Bel-7402，A549，HeLa，HCCLM3和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

悬浮细胞HL60的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

按下式求出各个浓度下化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性：

细胞增殖(％)＝(化合物5组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

4)结果见图4。结果表明，

在体外细胞毒试验中，评价了化合物5仅在100和200μM的高浓度对Bel-7402，HepG₂，HL60，HT-29，HeLa，S180，A549和HCCLM3等8株肿瘤细胞显示弱的细胞毒作用。

实验例3评价化合物5的体内抗肿瘤活性

1)本发明的化合物5含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照，含吐温80的生理盐水作为阴性对照；

2)化合物5和含吐温80的生理盐水均灌胃给药，化合物5的给药剂量为10nmol/kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，连续给药7天，共给药7次；阿霉素腹腔给药，给药剂量为2μmol/kg，连续给药7天，共给药7次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日口服化合物5，剂量为10nmol/kg。空白组小鼠每日口服0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素，剂量为2μmol/kg。实验进行至第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物5组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以 表示。结果见表1。由表1可以看出，在10nmol/kg的口服剂量下，化合物5治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组相比具显著性差异，与阿霉素组相比没有显著性差异。可见，化合物5的有效剂量比阿霉素低200倍。

表1化合物5的体内抗肿瘤活性

n＝12；a)与生理盐水组比p＜0.01，与阿霉素组比p＞0.05。

实验例4评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞粘附活性

1)化合物3和5用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100nM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)Fn(人纤维连接蛋白)。

4)实验方法

用PBS将Fn配制成浓度为100μg/mL的溶液，按100μL/孔加入96孔培养板中，将培养板置于4℃冰箱过夜。次日，吸除未包被Fn溶液，用PBS洗1次，每孔加入含2％FBS的PBS溶液30μL封板，在37℃和5％CO₂的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCCLM3细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔100μL，同时加入25μL化合物3或5的溶液，使其终浓度为20nM，在37℃和5％CO₂培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率(％)＝[1-(化合物5组细胞的OD值/空白组细胞的OD值)]×100％；实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以均值±SD表示。

5)结果见表2。由表2可以看出，化合物5在20nM浓度下明显抑制HCCLM3细胞与FN粘附，粘附抑制率为24.2％。与LPNISKP抑制SACC-LM细胞与ECM及血小板粘附的有效浓度为1μM相比，化合物5的有效浓度降低了50倍。

表2化合物5的体外抗肿瘤细胞粘附活性

n＝3。

实验例5评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

1)化合物3和5用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100nM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)基质胶为matrigel。

4)实验方法

将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μLMatrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个，放入37℃和5％CO₂培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μLDMEM培养基，37℃和5％CO₂培养箱中孵育30min。

HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物3或5的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养48小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

5)结果见表3。可以看出，在20nM浓度下化合物3与空白对照组相比，发生侵袭的细胞数显著减少，说明在该条件下化合物3具有明显的抗HCCLM3细胞侵袭作用。还可以看出，在20nM浓度下化合物5与化合物3相比，发生侵袭的细胞数也显著减少，说明在该条件下化合物5抗HCCLM3细胞侵袭作用明显比化合物3强。与LPNISKP抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比，化合物5的有效浓度降低了50倍。

表3化合物5的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

n＝9；a)与空白对照组和化合物3组比p＜0.01；b)与空白对照组比p＜0.01。

实验例6评价化合物3和5的体外抗肿瘤细胞迁移活性

1)化合物3和5用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100nM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)实验方法

HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物3或5的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养6小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

4)结果见表4。可以看出，在20nM浓度下化合物3与空白对照组相比，发生侵袭的细胞数显著减少，说明在该条件下化合物3具有明显的抗HCCLM3细胞侵袭作用。还可以看出，在20nM浓度下化合物5与化合物3相比，发生侵袭的细胞数也显著减少，说明在该条件下化合物5抗HCCLM3细胞侵袭作用明显比化合物3强。与LPNISKP抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比，化合物5的有效浓度降低了50倍。

表4化合物5的体外抗肿瘤细胞迁移活性

n＝9；a)与空白对照组和化合物3组比p＜0.01。

实验例7评价化合物5的体内抗炎活性

1)实验方法

18-22gICR雄性小鼠随机分为空白对照组、阳性用药组及给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次给药30分钟后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL)，2小时后将小白鼠颈椎脱臼处死。将小鼠的左，右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度。肿胀度＝左耳原片重量-右耳原片重量。

2)给药方法和剂量

灌胃给药。空白对照为生理盐水，给药剂量为0.2mL/20g。阳性对照为阿司匹林，给药剂量为1.11mmol/kg。化合物5的给药剂量为10nmol/kg.

3)统计方法

数据统计均采用t检验和方差分析，肿胀度以均值±SDmg表示。

4)结果见表5。可以看出，剂量为10nmol/kg时化合物5治疗组的鼠耳肿胀度与NS组相比具有显著性差异，说明化合物5可抑制小鼠发生炎症。剂量为10nmol/kg时化合物5治疗组的鼠耳肿胀度与剂量为1.11mmol/kg的阿司匹林治疗组的鼠耳肿胀度相比无显著性差异，说明化合物5的抗炎活性比阿司匹林强111000倍。

表5化合物5的体内抗炎活性

n＝12；a)与生理盐水组比p＜0.01，与阿司匹林组比p＞0.05。

Claims (6)

1.下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu。

2.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu的制备方法，该方法由以下步骤构成：

(1)在浓硫酸存在下，5-甲酰水杨酸在甲醇中微波90℃反应2h，生成5-甲酰水杨酸甲酯；

(2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；

(3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水杨酸和L-色氨酸苄酯缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(4)在2，3-二氯-5，6-二腈基-1，4-苯醌(DDQ)的存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃(THF)中氧化为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(5)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯反应生成1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸；

(6)在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反应，得到全保护多肽序列Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl；

(7)在冰浴下盐酸的乙酸乙酯溶液(4N)中，全保护多肽序列Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl脱除Boc得到Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl；

(8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水THF中与Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl缩合为1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl；

(9)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl反应得到1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu。

3.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu的纳米结构。

4.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu在制备抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭药物中的应用。

6.权利要求1的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Lys-Glu在制备抗炎症药物中的应用。