CN105315341A - Trp-Trp-Trp六肽修饰的β-咔啉，其制备，纳米结构，活性和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val。公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它的抗肿瘤作用，公开了它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用，阐明了它在医学中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val及其制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的体内外抗肿瘤作用，涉及它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物，制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
技术背景
恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤并发的炎症、血栓和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上的恶性肿瘤患者都是死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织；4)炎症使进入正常组织的肿瘤细胞成长为转移的新生肿瘤。
由于现有抗肿瘤药物不具备抗炎症、抗血栓和抗转移作用，所以疗效不理想。发明同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤转移作用的药物是临床的迫切需求。
RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素αVβ3的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘附活性。Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val则能抑制HCCLM6的运动和侵袭。申请人曾经把RGD四肽与雌激素偶联，制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把RGD四肽与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构类型的代表。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤和抗肿瘤转移作用的化合物。
发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val与1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸偶联，形成的化合物会同时具有抗肿瘤和抗肿瘤转移作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供通式1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val
本发明的第二个内容是提供1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val的制备方法，该方法包括：
(1)在二氯亚砜(SOCl2)的存在下，L-色氨酸和甲醇反应，生成L-色氨酸甲酯；
(2)在三氟醋酸存在下，在水中4-异丙基苯甲醛(枯茗醛)和L-色氨酸甲酯缩合为(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(3)在二氧化硒(SeO2)的存在下，(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯在二氧六环中氧化1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(4)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中，1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸；
(5)采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，在干燥四氢呋喃(THF)中反应，得到全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl；
(6)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M)，全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl脱除Boc得Trp-Trp-Trp-OBzl；
(7)在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水四氢呋喃(THF)中与Trp-Trp-Trp-OBzl缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl；
(8)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中，化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp；
(9)采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，在干燥四氢呋喃中反应，得到全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(10)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)中，全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl脱除Boc得Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(11)在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp在无水四氢呋喃中分别与Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl，缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(12)在Pd/C/H2存在下，在甲醇中化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val；
本发明的第三个内容是测定1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val的纳米结构。
本发明的第四个内容是评价1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本发明的第五个内容是评价1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val对荷S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。
本发明的第六个内容是1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val体外抑制肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。
附图说明
图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨基酸或甘氨酸。
图2.1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val的合成路线.i)甲醇，氯化亚砜；ii)三氟醋酸，水；iii)二氧化硒，75℃；iv)氢氧化钠水溶液(2M)，甲醇；v)苯并三氮唑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，N-甲基吗啉，N，N-二甲基甲酰胺；vi)N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，N-羟基苯并三唑(HOBt)，N-甲基吗啉，四氢呋喃；vii)Pd/C，H2，甲醇；viii)氯化氢/乙酸乙酯(4M)。
图3.化合物8a-c在纯水溶液中1×10-7M浓度下的透射电镜照片。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备L-色氨酸甲酯盐酸盐(1)
量100mL甲醇加入250mL茄瓶中，冰浴下向茄瓶中加入25.5mLSOCl2，塞上干燥管，搅拌30min后，加入称好的20.400g(100mmol)L-色氨酸。室温搅拌48h，TLC监测反应，当原料点消失后终止反应，减压浓缩除去溶剂，加入30mL甲醇，混匀后再次减压浓缩除去溶剂，重复操作2次。最后加入50mL乙醚，混悬30min后过滤，滤饼干燥后称量，得22.98g(90.2％)目标化合物，为灰色粉末。ESI-MS(m/e)：219[M+H]+。
实施例2制备(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(2)
量100mL蒸馏水加入250mL茄瓶中，冰浴下加入10mLTFA，搅拌5min后加入20.320g(80mmol)L-色氨酸甲酯盐酸盐，搅拌至溶解，加入10.672g(88mmol)对异丙基苯甲醛，室温搅拌24h，TLC监测原料点消失，终止反应。反应物减压过滤，滤饼用乙酸乙酯溶解，用饱和NaHCO3水溶液调节pH至8。乙酸乙酯层用饱和NaCl水溶液萃洗3次，再用5％KHSO4水溶液萃洗1次，乙酸乙酯层静置，析出无色固体，干燥后用甲醇重结晶，得16.704g(60％)目标化合物，为无色晶状固体。ESI-MS(m/e)：349.2[M+H]+。
实施例3制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯(3)
称13.92g(40mmol)(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯和5.772g(52mmol)二氧化硒加入到250mL茄瓶中，加入100mL二氧六环溶解，置于油浴中加热至75℃，反应10h，TLC监测原料点消失后终止反应。反应物冷却至室温，减压过滤，滤液减压浓缩至干，得12.384g(95％)目标化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：345.2[M+H]+。
实施例4制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸(4)
称10.320g(30mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯加入250mL茄瓶中，用100mL甲醇溶解，滴加氢氧化钠水溶液(2M)至pH12，室温反应24h。TLC监测原料消失后终止反应。冰浴下，反应液用饱和硫酸氢钾水溶液调pH至7，减压浓缩除去溶剂，残留物加20mL蒸馏水溶解，再用饱和硫酸氢钾水溶液调pH至2，用乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液萃洗3次。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥。减压过滤，滤液减压浓缩至干，得9.11g(92％)目标化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：329.2[M-H]-。
实施例5制备HCl·Trp-Trp-Trp-OBzl
1)制备L-色氨酸苄酯磷酸盐
向500mL茄瓶中依次加入16.900g(50mmol)多聚磷酸，80mL苯甲醇和10.200g(50mmol)L-色氨酸。置于油浴中加热至75℃，48h后TLC监测原料点消失，终止反应。反应物冷却至室温，加入300mL无水乙醚，冰浴下搅拌30min，过滤得15.96g(89％)目标化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：295[M+H]+。
2)制备Boc-Trp-Trp-OBzl
先后将3.344g(11mmol)Boc-L-Trp，1.782g(13.2mmol)N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)和2.719g(13.2mmol)N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入250mL茄瓶中，冰浴下加入无水四氢呋喃，搅拌30分钟得到反应液。2.940g(10.0mmol)色氨酸苄酯磷酸盐用无水四氢呋喃溶解，用N-甲基吗啉(NMM)调pH至8，加入刚刚得到的反应液中，用N-甲基吗啉调节pH至9，0℃搅拌6小时，室温搅拌6小时，TLC监测原料点消失结束反应，反应液减压过滤，滤液减压浓缩，残留物加乙酸乙酯溶解，冰浴下搅拌1h。减压过滤，滤液依次用饱和NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液，5％KHSO4水溶液，饱和NaCl水溶液，5％NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液萃洗，各萃洗重复3次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)，得4.756g(82％)目标化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：581[M+H]+。
3)制备HCl·Trp-Trp-OBzl
将4.000g(6mmol)Boc-Trp-Trp-OBzl置于250mL茄瓶中，冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加50mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，冰浴搅拌下反应2小时后TLC监测原料点消失，终止反应。搅拌下用水泵将反应液减压抽干，加乙酸乙酯溶解后再次用水泵减压抽干，重复三次。残留物加无水乙醚充分混悬后静置，倾倒出乙醚，抽干产物，重复三次，得2.940g(95％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：481[M+H]+。
4)制备Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl
按制备Boc-Trp-Trp-OBzl的方法，由1.824g(6mmol)Boc-Trp和2.583g(5mmol)HCl·Trp-L-Trp-OBzl得3.14g(82％)目标化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)767[M+H]+。
5)制备HCl·Trp-Trp-Trp-OBzl
按制备HCl·Trp-Trp-OBzl的方法，由3.14g(4.1mmol)Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl得2.74g(95％)目标化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：667[M+H]+。
实施例6制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl(5)
将1.19g(3.6mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸和1.629g(4.3mmol)苯并三氮唑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)加入250mL茄瓶中，冰浴下加入无水N，N-二甲基甲酰胺，搅拌30分钟，得到反应液。2.81g(4mmol)HCl·Trp-Trp-Trp-OBzl用无水二甲基甲酰胺溶解，用N-甲基吗啉(NMM)调pH至8，加入刚刚得到的反应液中，用N-甲基吗啉调节pH至9，0℃搅拌6小时，室温搅拌6小时，TLC显示原料点消失，结束反应。反应液减压过滤，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，冰浴下搅拌1h，减压过滤，滤液依次用饱和NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液，5％KHSO4水溶液，饱和NaCl水溶液，5％NaHCO3水溶液，饱和NaCl水溶液各洗3次。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到的无色固体经硅胶柱层析纯化(石油醚/丙酮＝1∶1)，得1.76g(45％)目标化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：979[M+H]+。
实施例7制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp(6)
将0.98g(1mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl溶解在甲醇中，冰浴下滴加氢氧化钠水溶液(2M)至反应体系pH为12，搅拌4h后原料完全消失。反应化合物用5％KHSO4水溶液调节pH至中性，减压浓缩，残留物加入5mL蒸馏水溶解，溶液用5％KHSO4水溶液调节pH至4，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯层。减压浓缩除去溶剂，得8.36g(95％)目标化合物，为灰白色固体。ESI-MS(m/e)：889[M+H]+。
实施例8制备Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl
1)制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按制备Boc-Trp-Trp-Obzl的方法，由2.411g(7mmol)Boc-Asp(OBzl)和3.556g(8.4mmol)TosH·Val-OBzl得3.592g(94％)目标物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：513.5[M+H]+。
2)制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl
按制备HCl·Trp-Trp-OBzl的方法，由3.00g(5mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl得2.47g(95％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：413.1[M+H]+。
3)制备Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按制备Boc-Trp-Trp-Obzl的方法，由0.508g(2mmol)Boc-Leu和0.897g(2mmol)HCl.Asp(OBzl)-Val-OBzl得1.063g(85％)目标化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：625.3[M+H]+。
4)制备HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl
按制备HCl·Trp-Trp-OBzl的方法，由1.251g(2mmol)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl得1.067g(95％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：525.3[M+H]+。
实施例9制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl(7)
按制备Boc-Trp-Trp-Obzl的方法，由0.627g(0.7mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp和0.413g(0.7mmol)HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl得0.438g(44.4％)目标化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1396.7[M+H]+。
实施例10制备1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val(8)
称0.500g(0.4mmol)1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl，用10mL甲醇溶解，加入0.196g钯碳，插入氢解套管并连接三通，一端连接氢气袋，另一端连接水泵，打开水泵，抽除体系中的空气，调节三通活塞使体系只连通氢气袋，通入氢气；重复抽气-通气操作三次，然后调节三通活塞使体系只连通氢气袋，向体系持续通入氢气，室温下搅拌。TLC显示原料消失，拆除氢解装置，反应液减压过滤，滤液减压浓缩至干，得0.457g(94.0％)目标化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：l216.6[M+H]+.mp：164.9-166.1℃；(c＝0.10，CH3OH).IR(KBr)：3369.64，3057.17，2960.73，2933.73，2873.97，1660.71，1519.91，1458.18，1348.24，1249.87，742.59cm-1.1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝11.831(s，1H)，10.828(s，lH)，10.802(s，lH)，10.825(s，lH)，8.715(s，1H)，8.570(d，J＝7.2Hz，1H)，8.468(d，J＝7.2Hz，1H)，8.315(d，J＝7.5Hz，1H)，8.293(d，J＝6.3Hz，1H)，8.137(d，J＝7.5Hz，lH)，7.991(d，J＝7.8Hz，1H)，7.867(s，1H)，7.841(s，1H)，7.689-7.511(m，8H)，7.312-7.266(m，4H)，7.177-7.139(m，3H)，7.051-6.850(m，5H)，6.825(t，J1＝15Hz，J2＝7.5Hz，2H)，4.805(m，1H)，4.628(m，3H)，4.388(m，1H)，4.104(m，2H)，3.408(m，2H)，3.30-2.80(m，9H)，2.766-2.691(m，1H)，2.057(dd，J1＝12.3Hz，J2＝7.5Hz，1H)，1.584(m，1H)，1.470(m，1H)1.338(d，.J＝6.6Hz，6H)，1.093(t，J1＝14.1Hz，J2＝7.2Hz，2H)，O.8-0.7(m，12H)。
实验例1测定化合物8的透射电镜照片
将化合物8按照1×10-7M的浓度配置纯水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图3。结果表明，化合物8在水中可形成纳米颗粒，直径为50-140nm。
实验例2测定化合物8对肿瘤细胞的细胞毒作用
1)本发明的化合物8用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。
2)实验用的肿瘤细胞为HepG2(人肝细胞癌细胞)，HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)，Bel-7402(人肝癌细胞)，HT-29(人结肠癌细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，A549(人肺癌细胞)，S180(小鼠腹水瘤细胞)，H22(小鼠肝癌细胞)，HCT-8(人结肠癌细胞)，K562(人白血病细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，SH-sy5y(人神经质细胞瘤)，U2OS(人骨肉瘤细胞)和HCCLM3(人高转移肝癌细胞)。
3)实验方法HL-60，HT-29，Bel-7402，A549，K562，HeLa，H22，HCT-8和S180细胞选用RPMI-1640培养基；MCF-7，SH-sy5y，U2OS，HepG2和HCCLM3细胞选用DMEM培养基。培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
贴壁细胞HepG2，HT-29，Bel-7402，A549，HeLa，HCCLM3，HCT-8，MCF-7，HCCLM3，SH-sy5y，U2OS和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以4×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。
悬浮细胞HL60，K562的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。
按下式求出各个浓度下化合物8抑制肿瘤细胞增殖的活性：
细胞增殖(％)＝(化合物8组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC50(半数有效抑制浓度)值。4)结果见表1-3。结果表明，化合物8对HeLa、HL60、Bel-7402三株人癌细胞株较为敏感，IC50分别为49.1+0.77μM、57.1±0.50μM、80.1±9.18μM。
表1化合物8对HCT-8、HeLa、K562、HL60和A549细胞毒活性
(ICs0，均值±SDμM)
a)n＝6
表2化合物8对SH-sy5y、MCF-7、Bel-7402、HCCLM3和S180细胞毒活性
(IC50，均值±SDμM)
a)n＝6
表3化合物8对HepG2、U2OS、H22和HT-29细胞毒活性(IC50，均值±SDμM)
a)n＝6
实验例3评价化合物8的体内抗肿瘤活性
1)本发明的化合物8用含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素和阿糖胞苷用生理盐水溶解作为阳性对照，含吐温80的生理盐水作为阴性对照；
2)化合物8和含吐温80的生理盐水均灌胃给药，化合物8的给药剂量为10nmol/kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，连续给药10天，共给药10次；阿霉素和阿糖胞苷腹腔给药，给药剂量分别为为2μmol/kg和8.2μmol/kg，连续给药10天，共给药10次。
3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组15只小鼠。
4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。
5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。
细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数＝细胞数/mL
细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％
将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×107个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日口服化合物8，剂量为10nmol/kg。空白组小鼠每日口服0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素，剂量为2μmol/kg。实验进行至第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以(均值±SDg)表示。结果见表4。由表4可以看出，在10nmol/kg的口服剂量下，化合物8治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组相比具显著性差异，说明化合物8能明显抑制肿瘤的生长。
表4化合物8的体内抗肿瘤活性
n＝15；a)与生理盐水组比p＜0.01.
实验例4评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞粘附活性
1)化合物5和8用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。
2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。
3)Fn(人纤维连接蛋白)。
4)实验方法
用PBS将Fn配制成浓度为100μg/mL的溶液，按100μL/孔加入96孔培养板中，将培养板置于4℃冰箱过夜。次日，吸除未包被Fn溶液，用PBS洗1次，每孔加入含2％FBS的PBS溶液30μL封板，在37℃和5％CO2的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCCLM3细胞以5×104个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔100μL，同时加入25μL化合物5或8的溶液，使其终浓度为20nM，在37℃和5％CO2培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO2培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率(％)＝[1-(化合物8组细胞的OD值/空白组细胞的OD值)]×100％；实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以均值±SD％表示。
5)结果见表5。由表5可以看出，在20nM浓度下化合物8能抑制HCCLM3细胞与Fn粘附，粘附抑制率为20.73％。与发明人公开的Leu-Asp-Val抑制SACC-LM细胞与ECM及血小板粘附的有效浓度为1μM相比，化合物8的有效浓度降低了50倍。
表5化合物8的体外抗肿瘤细胞粘附活性
n＝5；a)与化合物5组比p＜0.01
实验例5评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
1)化合物5和8用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。
2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。
3)基质胶为matrigel。
4)实验方法
将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μLMatrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个，放入37℃和5％CO2培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μLDMEM培养基，37℃和5％CO2培养箱中孵育30min。
HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×105个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物5或8的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO2培养箱中培养48小时。
用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
将Transwell上室放入含有LysisBuffer的6孔板中，室温放置10min，前后震荡使结晶紫充分溶解，用酶标仪测量混合液的O.D.值。
侵袭抑制率＝(1-给药组O.D.值/空白组O.D.值)×100％
实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭抑制率以均值±SD％表示。
5)结果见表6。可以看出，在20nM浓度下化合物8可抑制HCCLM3细胞对ECM的侵袭，抑制率为28.73％。与发明人公开的Leu-Asp-Val抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比，化合物8的有效浓度降低了50倍。
表6化合物8的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
n＝5；a)与化合物5组比p＜0.01.
实验例6评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞迁移活性
1)化合物5和8用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。
2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。
3)实验方法
HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×106个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物5或8的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO2培养箱中培养6小时。
用棉签擦去上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，迁移的细胞数以均值±SD表示。
4)结果见表7。可以看出，化合物8在20nM剂量下可抑制HCCLM3细胞迁移，抑制率为20.58％。与发明人公开的Leu-Asp-Val抑制SACC-LM细胞迁移的有效浓度为1μM相比，化合物8的有效浓度降低了50倍。
表7化合物5和8的体外抗肿瘤细胞迁移活性
n＝9；a)与化合物5组比p＜0.01。
Claims (5)
1.下面结构的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val。
2.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val的制备方法，该方法由以下步骤构成：
(1)在二氯亚砜(SOCl2)的存在下，L-色氨酸和甲醇反应，生成L-色氨酸甲酯；
(2)在三氟醋酸存在下，在水中4-异丙基苯甲醛(枯茗醛)和L-色氨酸甲酯缩合为(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(3)在二氧化硒(SeO2)的存在下，(3S)-1-(4-异丙基苯基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯在二氧六环中氧化1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯；
(4)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中，1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸甲酯转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸；
(5)采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，在干燥四氢呋喃(THF)中反应，得到全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl；
(6)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M)，全保护多肽序列Boc-Trp-Trp-Trp-OBzl脱除Boc得Trp-Trp-Trp-OBzl；
(7)在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-羧酸在无水四氢呋喃(THF)中与Trp-Trp-Trp-OBzl缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl；
(8)冰浴下在氢氧化钠的水溶液(2M)和甲醇中，化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp；
(9)采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，在干燥四氢呋喃中反应，得到全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(10)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)中，全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl脱除Boc得Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(11)在N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp在无水四氢呋喃中分别与Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl，缩合为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；
(12)在Pd/C/H2存在下，在甲醇中化合物1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val。
3.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val的纳米结构。
4.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1的1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val在制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。
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