CN106279364A

CN106279364A - Rgds修饰的姜黄素,其制备,生物活性和应用

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Publication number: CN106279364A
Application number: CN201510353006.1A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 宋元博; 胡西
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2015-06-24
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2035-06-24
Also published as: CN106279364B

Abstract

本发明公开了下式的姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物，公开了它的制备方法，公开了它的抗肿瘤细胞增殖的活性，公开了它抑制A549细胞的迁移和侵袭的作用，公开了它抑制S180荷瘤小鼠瘤体增重的活性，公开了它抑制Lewis肺癌转移的活性，进一步公开了它抑制二甲苯诱导小鼠耳肿胀的活性，进一步公开了它抑制大鼠血栓生成活性。。

Description

RGDS修饰的姜黄素,其制备,生物活性和应用

技术领域

本发明涉及姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物，涉及它的制备方法，涉及它抗肿瘤细胞增殖的活性，涉及它抑制A549细胞的迁移和侵袭的作用，涉及它抑制S180荷瘤小鼠瘤体增重的活性，涉及它抑制Lewis肺癌转移的活性，进一步涉及它抑制二甲苯诱导小鼠耳肿胀的活性，进一步涉及它抑制大鼠血栓生成的活性。本发明属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康，恶性肿瘤的死亡率仅次于心脑血管疾病，在所有疾病中居第二位。恶性肿瘤患者大都伴随癌转移、炎症和血栓。癌转移、炎症和血栓使肿瘤患者面临更为恶劣的预后。发明同时具有抗肿瘤、抗癌转移、抗炎症和抗血栓作用的药物，是新药发明的前沿课题。众所周知，姜黄素是姜黄的主要成分，具有广泛的药理作用。例如姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗血栓、抗肿瘤和抗菌等作用。可是，由于稳定性差、生物利用率低和水溶性差，目前仍然没有同时具有抗肿瘤、抗癌转移、抗炎症和抗血栓作用的姜黄素衍生物。发明人曾经公开2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-PAK肽是治疗缺血性中风的优秀化合物，2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-RGD肽是抗血栓的优秀化合物。可是，发明人公开的这些化合物都不是同时具有抗肿瘤、抗癌转移、抗炎症和抗血栓作用的化合物。经过3年研究，发明人发现用2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰Lys(The)与Arg-Gly-Asp-Ser偶联生成的化合物同时具有抗肿瘤、抗癌转移、抗炎症和抗血栓作用。根据这些研究结果，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物的偶联物。

本发明的第二个内容是提供制备姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物的方法，该方法包括：

(1)制备(E)-6-(4-羟基-3-甲氧基苯基)己-5-烯-2，4-二酮；

(2)制备苄基-2-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯；

(3)由步骤1和2的产物制备苄基2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6- 二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯；

(4)将苄基2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯在4N NaOH水溶液中脱去苄酯基，得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸；

(5)将2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}羧酸与Lys(Boc)-OBzl缩合得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc)-OBzl；

(6)将2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc)-OBzl在冰浴下用4N HCl/EA脱除Boc保护基，得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl；

(7)将2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl与Boc-The缩合得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl；

(8)将2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl在2N NaOH水溶液中脱去甲酯保护基，得到2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)；

(9)将2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)与N端游离的侧链最小保护的Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl，缩合，制备图2所示的9；

(10)冰浴下先用4N NaOH水溶液中脱去苄酯保护基，再用4N氯化氢的乙酸乙酯溶液脱除Boc保护基，制备图2所示的10；

本发明的第三个内容是评价姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物的抑制肿瘤细胞增殖的活性。

本发明的第四个内容是评价姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物抑制A549细胞迁移的作用。

本发明的第五个内容是评价姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物抑制A549细胞的侵袭的的作用。

本发明的第六个内容是评价姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物抑制荷S180肿瘤小鼠的肿瘤生长的作用。

本发明的第七个内容是评价姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物抑制Lewis肺癌转移的作用。

本发明的第八个内容是评价姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物对小鼠炎症的抑制作用。

本发明的第九个内容是评价姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物在抑制SD大鼠体内动脉血栓生成作用。

附图说明

图1肽的合成路线.i)DCC，HOBT，DMF和NMM；ii)4N氯化氢的乙酸乙酯溶液；iii)4N的NaOH水溶液。

图2 2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(The)-Arg-Gly-Asp-Ser的合成路线.i)乙酰丙酮，硼酐，硼酸三正丁酯和正丁胺；ii)K₂CO₃和THF；iii)硼酐，硼酸三正丁酯和正丁胺；iv)4N NaOH水溶液；v)DCC，HOBT，DMF和NMM；vi)4N氯化氢-乙酸乙酯溶液。

图3 10对A549细胞迁移能力的影响。

图4 10对A549细胞侵袭能力的影响。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备(E)-6-(4-羟基-3-甲氧基苯基)己-5-烯-2，4-二酮

将30mL(100.0mmol)乙酰丙酮溶解于200mL乙酸乙酯中，于60℃加热搅拌。在搅拌中加入12.6g(200mmol)硼酸酐(B₂O₃)搅拌1小时。随后加入27mL(100.0mmol)硼酸三正丁酯和15.6g(100.0mmol)香草醛，加热至70℃反应30min。之后将10mL正丁胺用乙酸乙酯稀释至100mL缓慢加入反应中并升温至100℃反应2小时。待反应完成后降温至60℃加入100mL 2N盐酸搅拌30分钟。待沉淀物充分析出后，滤除沉淀物并至于分液漏斗中。用饱和硫酸氢钾和饱和氯化钠分别洗涤三次。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯，4∶1)，得到8.4g(36％)标题化合物，为浅黄色固体。ESI⁺-MS(m/e)：235[M+H]⁺。

实施例2制备苄基-2-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯

将15.6g(100.0mmol)香草醛用100mL无水四氢呋喃溶解，加入8.2g(60mmol)碳酸钾搅拌2小时。随后加入17.4mL(120mol)溴乙酸苄酯，60℃加热反应3天。待原料消失后，滤除不溶物，滤液减压浓缩除去THF。残留物用乙醚结晶，得到20.6g(69％)标题化合物，为无色固体。ESI⁺-MS(m/e)：301[M+H]⁺。

实施例3制备苄基2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯

将10g(42.7mmol)(E)-6-(4-羟基-3-甲氧基苯基)己-5-烯-2，4-二酮溶解于100mL乙酸乙酯，60℃加热搅拌。在搅拌中加入5.4g(85.4mmol)硼酸酐(B₂O₃)，搅拌1小时。随后加入12mL(42.7mmol)硼酸三正丁酯和6.7g(42.7mmol)苄基-2-(4-甲酰基-2-甲氧基苯氧基)乙酸乙酯，70℃加热反应30min。之后，缓慢加入4.2mL正丁胺与50mL乙酸乙酯的溶液。升温至100℃反应2小时。待反应完成后降温至60℃，加入42mL 2N盐酸，搅拌30分钟。待沉淀物充分析出后，滤除沉淀物。滤液用饱和硫酸氢钾和饱和氯化钠分别洗涤三次。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(石油醚∶乙酸乙酯，3∶1)，得到4.2g(19％)标题化合物，为浅黄色固体。ESI^--MS(m/e)：516[M-H]^-。

实施例4制备2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸

将8.0g(15.5mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸乙酯溶解在100mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(4M)，调节pH值到14，搅拌反应6h，TLC检测反应结束。加饱和KHSO₄调节pH值到7，滤液减压蒸馏除去全部甲醇，残留水溶液继续用KHSO₄调节pH值到2，用乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯层合并，用饱和NaCl萃洗三次，无水Na₂SO₄干燥8小时，过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物用二氯甲烷溶解，滤去不容物，得到3.2g(49％)标题化合物，为红色油状物。ESI^--MS(m/e)：425[M-H]^-。

实施例5制备2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰酸-Lys(Boc)-OBzl

将2.13g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酸溶解在20mL无水THF中，冰浴下加入0.81g(6.0mmol)HOBt和1.15g(6.0mmol)DCC。搅拌5分钟后加入1.862g(5.0mmol)HCl·Lys(Boc)-OBzl的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 9，冰浴搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤3次。二氯甲烷层用无水Na₂SO₄干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CH₂Cl₂∶CH₃OH，100∶1)，得到2.125g(57％)标题化合物，为黄色固体。ESI⁺-MS(m/e)：745[M+H]⁺。

实施例6制备2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl

将3.720g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc)-OBzl溶解在15mL氯化氢-乙酸乙酯(4mol/L)溶液中，室温搅拌2小时，TLC检测原料点消失。减压除去乙酸乙酯，反复加少量乙醚磨洗，减压除去产品中的氯化氢。最后加少量乙醚将产品研磨成固体粉末，直接用于下一步反应。

实施例7制备2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl

将1.37g(5.0mmol)Boc-The溶解在20mL无水THF中，冰浴下加入0.81g(6.0mmol)HOBt和1.15g(6.0mmol)DCC。搅拌30分钟后加入3.22g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys-OBzl的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 9，冰浴搅拌10小时。停止反应，滤去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤3次。二氯甲烷层用无水Na₂SO₄干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CH₂Cl₂∶CH₃OH，20∶1)，得到2.229g(50％)标题化合物，为黄色固体。ESI⁺-MS(m/e)：901[M+H]⁺。

实施例8制备2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)

将4.505g(5.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-OBzl溶解在10mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(2M)，调节pH值到12，搅拌反应1h，TLC检测反应结束。加饱和KHSO₄调节pH值到7，滤液减压蒸馏除去全部甲醇，残留水溶液继续用KHSO₄调节pH值到2，用乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯层合并，用饱和NaCl萃洗三次，无水Na₂SO₄干燥8小时，过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯，得到3.529g(87％)标题化合物，为黄色固体。

实施例9制备2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(9)

将0.810g(1.0mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)溶解在20mL无水THF中，冰浴下加入0.135g(1.0mmol)HOBt和0.244g(1.2mmol)DCC。搅拌30分钟后加入0.649g(1.0mmol)HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 9，冰浴搅拌10小时。停止反应，滤去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于二氯甲烷中，得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤3次。二氯甲烷层用无水Na₂SO₄干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩除去二氯甲烷。残留物用柱层析分离(CH₂Cl₂∶CH₃OH，20∶1)，得到0.124g(9％)标题化合物，为黄色固体。ESI⁺-MS(m/e)：1406.7[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.39-8.06(m，2H)，7.82-7.48(m，3H)，7.35(m，13H)，7.17-6.90(m，2H)，6.87-6.75(m，2H)，5.08(m，4H)，4.77-4.49(m，3H)，4.38-4.05(m，2H)，3.87-3.71(m，4H)，3.72-3.69(m，2H)，3.58-3.51(m，4H)，3.03(m，4H)，2.82(m，2H)，2.64(m，1H)，2.33-2.26(m，2H)，2.18(m，2H)，2.05-1.96(m，2H)，1.76-1.65(m，6H)，1.36-1.24(m，14H)，1.06(m，3H)。

实施例10制备2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(The)-Arg-Gly-Asp-Ser(10)

将100mg(0.07mmol)2-{4-[(1E，6E)-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3，5-二氧庚-1，6-二烯-1-基]-2-甲氧基苯氧基}乙酰-Lys(Boc-The)-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl溶解在10mL甲醇中，冰浴下加入NaOH水溶液(1.5M)，调节pH值到12，搅拌反应1h，TLC检测反应结束。加饱和KHSO₄调节pH值到7，滤液减压蒸馏除去全部甲醇，残留水溶液继续用KHSO₄调节pH到2，用乙酸乙酯萃取6次，乙酸乙酯层合并，用饱和NaCl洗3次，无水Na₂SO₄干燥8小时，过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。随后加入氯化氢-乙酸乙酯溶液(4M)，室温搅拌12小时，TLC检测原料点消失。减压除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚磨洗，减压除去产品中的氯化氢。最后加少量乙醚将产品研磨成粉末。将所得化合物溶于少量水，调pH至7，经Sephadex-G₁₀分离并冷冻干燥。得到0.021g(25％)标题化合物，为黄色固体。 (c＝0.09，甲醇)；ESI⁺-MS(m/e)：1125.9[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝8.59(m，2H)，8.47(m，1H)，8.29(m，3H)，8.01(m，1H)，7.62(m，1H)，7.54-7.41(m，2H)，7.32-6.70(m，5H)，4.65-4.49(m，2H)，4.26(m，2H)，3.90-3.84(m，4H)，3.76(m，4H)，3.64-3.35(m，3H)，3.06(m，4H)，2.18(m，2H)，1.98-1.86(m，5H)，1.72-1.60(m，5H)，1.57(m，2H)，1.49(m，2H)，1.31-1.20(m，6H)，0.98(m，4H)；IR：3261，3063，2969，2938，1730，1657，1650，1511，1447，1423，1373，1250，1216，1140，1029，850，811；HPLC(甲醇∶水95％∶5％C₁₈1.0mL/min)纯度为96％。

实施例11制备HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

用于制备9的HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl按照图1的路线，由标准接肽操作制备。它的前体Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl：ESI-MS(m/e)为714[M+H]⁺，HPLC纯度＞95％，用氯化氢-乙酸乙酯溶液(4M)脱Boc不再纯化，直接用于制备反应。总产率为42％。

实验例1评价化合物10的细胞毒作用

将化合物10用PBS配置，共评价了它们对A549(人肺腺癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、K562(人肝癌细胞)、U2OS(人骨肉瘤细胞)、HCT-116(人结肠癌细胞)、S180(小鼠肉瘤细胞)和HaCaT(人正常皮肤细胞)6株肿瘤细胞和1株正常细胞的抑制作用。分别将生长状态良好、处于对数生长期的A549、MCF-7、K562、U2OS、HCT-116、S180和HaCaT细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板上，每孔加入100μL含细胞的培养液，在37℃、含5％CO₂培养箱中培养4小时，按照预设的浓度梯度加入待测、经灭菌处理的样品，每孔加入25μL10，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃、含5％CO₂培养箱中继续孵育4小时，小心去除上清液(悬浮细胞离心后除去上清液)。随后每孔加入100μL DMSO溶液，振荡约10min使沉淀完全溶解。立即在酶标仪上以波长570nm检测O.D.值。实验平行重复3次。

抑制率按照公式计算，以抑制率对化合物浓度作图，计算本发明化合物10的IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。结果列入表1。结果表明本发明的10对A549、MCF-7、U2OS、HCT-116、K562、S180等肿瘤细胞和正常永生化HaCaT细胞没有细胞毒作用。

表1 10对A549等8株细胞增殖的影响(IC₅₀，μM)

n＝3

实验例2用Transwell小室实验评价10抗A549细胞侵袭活性

将冻存在-20℃冰箱中的的matrigel放置于4℃冰箱过夜，等待变成matrigel液态后，吸取180μL Matrigel，加入720μL无血清DMEM培养基混匀。将配制好的Matrigel溶液加入至Transwell小室中的上室，每室加入100μL。之后放入37℃、含5％CO₂培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μL的1640培养基，37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min。将生长状态良好、处于对数生长期的A549细胞消化离心，无血清A549培养基冲洗3次，配置成密度为5×10⁵个/mL的细胞悬液，每孔加入100μL细胞悬液，同时每室加入25μL10，使其终浓度为20μM；在下室加入600μL含10％血清胎牛血清的1640培养基，在37℃含5％CO₂培养箱中孵育48小时。用棉签小心擦去上室内的细胞；加入4％的多聚甲醛孵育30min将细胞固定。吸除固定液，用PBS洗涤3次；用0.1％结晶紫染色液染色30min，随后吸除染色液，用PBS洗涤3次。侵袭数以每个小室选取6个大致相同的视野观察，拍照，计数。细胞数以表示，重复3次，统计均采用t检验。结果列入图3。结果表明本发明的化合物10抗细胞侵袭的能力显著高。

实验例3用Transwell小室实验评价10抗A549细胞迁移能力

将生长状态良好、处于对数生长期的A549细胞消化离心，无血清A549培养基冲洗3次，配置成密度为5×10⁵个/mL的细胞悬液，每孔加入100μL细胞悬液，同时每室加入25μL10，使其终浓度为20μM；在下室加入600μL含10％血清胎牛血清的1640培养基，在37℃含5％CO₂培养箱中孵育48小时。用棉签小心擦去上室内的细胞，加入4％的多聚甲醛孵育30min将细胞固定。吸除固定液，用PBS洗涤3次。用0.1％结晶紫染色液染色30min，随后吸除染色液，用PBS洗涤3次。迁移数以每个小室选取6个大致相同的视野观察，拍照，计数；细胞数以表示，重复3次，统计均采用t检验。结果列入图4。结果表明本发明的化合物10抗细胞迁移的能力显著高。

实验例4评价化合物10的抗肿瘤活性

测定前将本发明的化合物10加吐温80助溶，溶于生理盐水。无菌条件下取接种于ICR小鼠7-10天的S₁₈₀肉瘤，加入适量生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为2×10⁷/mL，接种于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2mL 10a-d的水溶液，连续给药7天，剂量为1μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以阿霉素(腹腔注射剂量为2μmol/kg)作阳性对照。实验进行至第8天，称小鼠体重，并剖取各组小鼠的肿瘤称重，以瘤重表示化合物的活性，数据列入表2。实验观察到，在1μmol/kg的剂量下化合物10显示出了良好的抗肿瘤活性，而姜黄素仅有微弱的抗肿瘤活性。

表2 10对荷S180小鼠肿瘤重量的影响^a

a)与生理盐水，姜黄素及姜黄素+The+RGDS物理混合比p＜0.01；n＝15.

实验例5评价10的抗肿瘤转移活性

取接种8-10天生长良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，颈椎脱臼，用75％乙醇浸泡消毒10min，在超净工作台上剥离瘤体，选择生长良好的瘤组织，在无菌平皿中剪碎，放置于玻璃组织匀浆器内，按瘤块重(g)∶生理盐水体积(mL)为1∶3的比例加入4℃预冷的生理盐水轻轻研磨，制成细胞悬液，过200目尼龙网制成单细胞悬液，用生理盐水调整细胞浓度至1.5×10⁷/mL。取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75％乙醇消毒小鼠右前肢腋窝皮肤，右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液0.2mL(含肿瘤细胞数约为1.5×10⁷/mL)。接种后8-10天可以生长成4-5mm大小的肿瘤。测量肿瘤体积，按肿瘤平均体积将小鼠随机分组。从接种肿瘤第9天开始给药，治疗组小鼠每日腹腔注射0.2mL 10的水溶液，连续给药11天，剂量为0.1μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以Arg-Gly-Asp-Ser和姜黄素(腹腔注射剂量为10μmol/kg)作阳性对照。每隔两天测量并记录肿瘤体积和体重。在第22天测量瘤体积后，称取小鼠体重，摘眼球取血并脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定住小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离肿瘤并称重，以瘤重表示化合物的活性，数据列入表3。实验观察到，腹腔给与0.1μmol/kg10可有效抑制小鼠肿瘤转移(p＜0.05)，而且与10μmol/kg Arg-Gly-Asp-Ser的活性相当(p＞0.05，有效剂量下降了100倍)。数据还表明10在抑制肿瘤转移的同时能够抑制原发肿瘤生增长，与生理盐水相比具有显著性差异(p＜0.05)，而且与10μmol/kg姜黄素的活性相当(p＞0.05，剂量下降了100倍)。

表3 10对Lewis肺癌小鼠原发瘤瘤重及肿瘤转移的影响

a)与生理盐水相比p＜0.05，与RGDS相比p＞0.05；b)与生理盐水相比p＜0.05，与姜黄素相比p＞0.05；n＝12。

实验例6评价10的抗炎症活性

ICR雄性小鼠105只，体重18-22g，随机分为10a-d，阿司匹林组和空白对照组，每组 12只。治疗组小鼠腹腔注射0.2mL 10的水溶液，剂量为1μmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以阿司匹林(口服给药剂量为1100μmol/kg)作阳性对照。给药30分钟后，在小鼠左耳朵耳廓内侧均匀涂抹30μL二甲苯，2小时后乙醚麻醉颈椎脱臼处死小鼠，分别将左、右两耳外耳廓剪下并重合叠放在一起，用直径7mm的打孔器在同一位置打取圆形耳片，称重并记录并计算两耳重量差并进行统计；鼠耳肿胀度(mg)＝左耳片重-右耳片重。数据列入表4。实验观察到，10在1μmol/kg剂量下可有效地抗炎，活性是阿司匹林的110倍。

表4腹腔注射10对小鼠炎症的影响

a)与生理盐水及110μmol/kg阿司匹林比p＜0.01；n＝12。

实验例7评价10的抗血栓活性

SD雄性大鼠105只，体重180-220g，随机分组，阿司匹林组、姜黄素组和空白对照组，每组12只。治疗组小鼠腹腔注射0.2mL 10的水溶液，剂量为1nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL生理盐水。以阿司匹林(口服给药剂量为167μmol/kg)作阳性对照。给药30分钟后，各组大鼠以20％乌拉坦麻醉，分离出颈总动脉和颈总静脉，以大鼠颈总动脉-静脉插管旁路循环丝线法造成大鼠动脉血栓模型；循环15分钟，取出旁路管中的带栓的丝线，拭去表面浮血，称量带栓丝线湿重，减去丝线重量后，即得形成血栓的湿重，记录数据并进行统计。实验观察到，1nmol/kg 10能抑制血栓形成，活性与167μmol/kg阿司匹林相当(p＞0.05，剂量比阿司匹林下降了167000倍)。姜黄素在这个剂量下没有血栓抑制活性。数据列入表5。

表5腹腔注射10对大鼠血栓的影响

a)与生理盐水相比p＜0.01，与阿司匹林比p＞0.05；n＝12。

Claims

1.下式的姜黄素与寡肽N^ω-The-Lys-Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物

2.权利要求1的姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物的制备方法，该方法包括：

(1)制备6位4-羟基-3-甲氧基苯基取代的己-5-烯-2，4-二酮；

(2)制备4-乙酸苄酯氧基-3-甲氧基苯甲醛；

(3)由步骤1和2的产物制备4-乙酸苄酯氧基姜黄素；

(4)将4-乙酸苄酯氧基姜黄素在4N NaOH水溶液中脱去苄酯基，得到4-乙酸氧基姜黄素；

(5)将4-乙酸氧基姜黄素与N^ω-Boc-Lys-OBzl缩合得到4-乙酰-N^ω-Boc-Lys-OBzl氧基姜黄素；

(6)将4-乙酰-N^ω-Boc-Lys-OBzl氧基姜黄素在冰浴下用4N氯化氢-乙酸乙酯溶液脱除Boc保护基，得到4-乙酰-Lys-OBzl氧基姜黄素；

(7)将4-乙酰-Lys-OBzl氧基姜黄素与Boc-The缩合得到4-乙酰-N^ω-Boc-The-Lys-OBzl氧基姜黄素；

(8)将4-乙酰-N^ω-Boc-The-Lys-OBzl氧基姜黄素在2N NaOH水溶液中脱去甲酯保护基，得到4-乙酰-N^ω-Boc-The-Lys氧基姜黄素；

(9)将4-乙酰-N^ω-Boc-The-Lys氧基姜黄素与N端游离的侧链最小保护的Arg-Gly-β-羧基-OBzl-Asp-Ser-OBzl缩合，制备化合物9；

(10)冰浴下先用4N NaOH水溶液中脱去苄酯保护基，再用4N氯化氢-乙酸乙酯溶液脱除Boc保护基，制备化合物10。

3.权利要求1的姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物在制备抗肿瘤药物中的作用。

4.权利要求1的姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物在制备抗癌转移药物中的作用。

5.权利要求1的姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物在制备抗炎症药物中的作用。

6.权利要求1的姜黄素与寡肽Arg-Gly-Asp-Ser的偶联物在制备抗肿瘤药物的作用。