CN105315342A - Ldv修饰的吲哚喹嗪，其制备，纳米结构，活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了下面结构的(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val。公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它的抗肿瘤作用，公开了它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用，阐明了它在医学中的应用。

Description

LDV修饰的吲哚喹嗪，其制备，纳米结构，活性和应用

技术领域

本发明涉及(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val，Leu-Asp-Val的正规简称是LDV。涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的体内外抗肿瘤作用，涉及它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物，制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤并发的炎症、血栓和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90％以上的恶性肿瘤患者都是死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织。

由于现有抗肿瘤药物不具备抗转移作用，所以疗效不理想。发明同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤转移作用的药物是临床的迫切需求。

RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α_Vβ₃的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞粘附活性。Leu-Asp-Val则具备抗肿瘤细胞迁移作用。申请人曾经把RGD四肽与雌激素偶联，制备没有凝血副作用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把RGD四肽与四氢-β-咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β-咔啉-3-羧酸、β-咔啉-3-羧酸及1-位取代的β-咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β-咔啉-3-羧酸或1-位取代的β-咔啉-3-羧酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构类型的代表。尽管发明人付出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤和抗肿瘤转移作用的化合物。

发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将Leu-Asp-Val与(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸偶联，形成的化合物会同时具有抗肿瘤和抗肿瘤转移作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val。

本发明的第二个内容是提供(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val的制备方法，该方法包括：

(1)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；

(2)在三氟乙酸的存在下，在二氯甲烷中1，1，3，3-四甲氧基丙烷和L-色氨酸苄酯缩合为(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(3)在三乙胺的存在下，在丙酮中双乙烯酮和(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯缩合为(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2-乙酰乙酰基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(4)在盐酸水溶液(2M)的存在下，在丙酮中(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2-乙酰乙酰基-2，3，4，9-四氢-B-咔啉-3-羧酸苄酯氧化环合为(6S)-苯基-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸酯；

(5)冰浴下在NaOH的水溶液(2M)和甲醇中，(6S)-苯基-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸酯转化为(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸；

(6)采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺和N-羟基苯骈三氮唑的存在下，在干燥四氢呋喃中反应，得到全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(7)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)中，全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl脱除Boc得Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(8)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基苯骈三氮唑存在下，在无水N，N-二甲基甲酰胺中(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸和Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl缩合为(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(9)冰浴下在NaOH的水溶液(2M)和甲醇中，(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl转化为(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val。

本发明的第三个内容是测定(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val的纳米结构。

本发明的第四个内容是评价(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。

本发明的第五个内容是评价(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val对荷S180小鼠肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第六个内容是评价(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val体外抑制肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用。

附图说明

图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨基酸或甘氨酸。

图2.(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Lys-Glu的合成路线.(i)多聚磷酸，苯甲醇，80℃；(ii)1，1，3，3-四甲氧基丙烷，三氟乙酸，二氯甲烷；(iii)双乙烯酮，三乙胺，丙酮；(iv)盐酸水溶液(2M)，丙酮；(v)NaOH水溶液(2M)，甲醇，0℃；(vi)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，N-羟基苯骈三氮唑，二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺；(vii)NaOH水溶液(2M)，甲醇，0℃；(viii)N-羟基苯骈三氮唑，N，N-二环己基碳二亚胺，N-甲基吗啉，四氢呋喃；(ix)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，0℃。

图3.化合物7在纯水溶液中1×10^-8M浓度下的透射电镜照片。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备L-色氨酸苄酯磷酸盐(1)

将20.4g(100mmol)L-色氨酸、120mmol苯甲醇和120mmol多聚磷酸依次加入500ml茄瓶中，瓶口安装冷凝管，置于油浴中加热至80℃，反应72小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。将反应液冷却至室温，加入30ml无水乙醚，析出白色固体，搅拌2小时，反应液减压过滤，得白色固体，用无水乙醚磨洗3次，得35.4g(90.4％)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e)：393.1[M+H]⁺。

实施例2制备(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)

将250mlCH₂Cl₂加入500ml茄瓶中，冰浴下依次加入15ml1，1，3，3-四甲氧基丙烷和14ml三氟乙酸，搅拌0.5小时，加入20.0g(68mmol)L-色氨酸苄酯，室温搅拌120小时，反应结束。冰浴搅拌下向反应液中缓慢加入饱和Na₂CO₃水溶液，剧烈搅拌，至水层pH为7，分离二氯甲烷层，二氯甲烷层用5％NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液萃洗3次，二氯甲烷层用无水Na2SO₄干燥，减压过滤，滤液减压浓缩至干，残留物经硅胶柱层析纯化(石油醚∶丙酮＝3∶1)，得9.38g(35％)目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：395.2[M+H]⁺。

实施例3制备(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2-乙酰乙酰基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(3)

将9.38g(23.8mmol)(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯溶于200ml丙酮，冰浴搅拌下加入2.89ml双乙烯酮和1.81ml三乙胺，室温搅拌18小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。冰浴搅拌下加入10ml蒸馏水，搅拌1小时，减压浓缩除去丙酮，残留物用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，依次用5％NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液萃洗3次，二氯甲烷层用无水Na₂SO₄干燥，减压过滤，滤液减压浓缩至干，残留物经硅胶柱层析纯化(石油醚∶丙酮＝4∶1)，得8.88g(78％)目标化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/e)：479.2[M+H]⁺。

实施例4制备(6S)-苯基-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸酯(4)

将8.88g(18.6mmol)(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2-乙酰乙酰基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯溶于200ml丙酮，冰浴搅拌下加入2.83ml盐酸水溶液(2M)，室温搅拌24小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。冰浴搅拌下缓慢滴加饱和NaHCO₃水溶液调节pH至7，减压浓缩除去丙酮，残留物用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯层，依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液、5％NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液各萃洗3次，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，减压过滤，滤液减压浓缩至干，残留物经硅胶柱层析纯化(石油醚∶丙酮＝4∶1)，得3.98g(52％)目标化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：413.1[M+H]⁺。

实施例5制备(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸(5)

将3.98g(9.66mmol)(6S)-苯基-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸酯溶于100ml甲醇，冰浴搅拌下缓慢滴加NaOH水溶液(2M)调节pH至12，冰浴搅拌96小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。冰浴搅拌下缓慢滴加饱和KHSO₄水溶液调节pH至7，减压浓缩除去甲醇，残留物加5ml蒸馏水稀释，冰浴搅拌下缓慢滴加饱和KHSO₄水溶液调节pH至3，析出黄色固体，减压过滤，蒸馏水冲洗滤饼，晾干得2.43g(78％)目标化合物，为黄色固体。

Mp：205.3-207.1℃；；IR(KBr)：3319，3061，2291，2927，2586，1743，1656，1587，1546，1496，1438，1425，1363，1330，1284，1236，1201，1145，1111，1029，972，852，781，746，624，567cm^-1；ESI-MS(m/e)：323.1[M+H]⁺；¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.92(s，1H)，8.17(d，J＝8.0Hz，1H)，7.67(d，J＝7.5Hz，1H)，7.44(d，J＝10.0Hz，1H)，7.28(t，J＝6.0Hz，1H)，7.09(t，J＝6.0Hz，1H)，6.85(d，J＝8.0Hz，1H)，5.96(d，J＝6.0Hz，1H)，3.32(dd，J₁＝9.5Hz，J₂＝24.5Hz，2H)，2.55(s，3H).HPLC：检测波长254nm，4.6×250mmC₁₈色谱柱，流动相CH₃OH∶H₂O＝3∶2，流速：0.6mL/min，纯度95.8％。

实施例6制备HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

1)制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

将2.5g(7.74mmol)Boc-Asp(OBzl)溶于干燥四氢呋喃，冰浴搅拌下依次加入1.25g(9.29mmol)N-羟基苯骈三氮唑和干燥四氢呋喃溶解的1.91g(9.29mmol)N，N-二环己基碳二亚胺，搅拌0.5小时，得到反应液。将3.08g(8.13mmol)Tos·Val-OBzl溶于干燥四氢呋喃，用N-甲基吗啉调节pH至8，加入刚刚得到的反应液中，用N-甲基吗啉调节pH至9，室温搅拌6小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。反应液减压过滤，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液、5％NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液各萃洗3次。乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，减压过滤，滤液减压浓缩至干，残留物经硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)，得3.37g(85.1％)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e)：513.5[M+H]⁺。

2)制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

将3.00g(5.86mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl置于250ml茄瓶中，冰浴搅拌下加入100ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)，瓶口加干燥管，冰浴搅拌1小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。减压抽干反应液，加少量干燥乙酸乙酯，再抽干，重复3次；加少量无水乙醚，减压抽干，重复3次，得2.54g(96.4％)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e)：413.1[M+H]⁺。

3)制备Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl的制备方法，由1.35g(5.83mmol)Boc-Leu、2.50g(5.56mmol)HCl.Asp(OBzl)-Val-OBzl、0.90g(6.67mmol)N-羟基苯骈三氮唑和1.37g(6.67mmol)N，N-二环己基碳二亚胺反应，经硅胶柱层析纯化(石油醚∶丙酮＝3∶1)，得3.02g(86.9％)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e)：626.3[M+H]⁺。

4)制备HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl的制备方法，由3.00g(4.80mmol)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl和50ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)反应，得2.57g(95.3％)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e)：526.3[M+H]⁺。

实施例7制备(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl(6)

将0.322g(1.00mmol)(S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸溶于3ml无水N，N-二甲基甲酰胺，冰浴搅拌下加入0.162g(1.20mmol)N-羟基苯骈三氮唑，将0.273g(1.20mmol)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于3ml二氯甲烷，滴加N-甲基吗啉调节pH至7，加至上述反应液中，搅拌0.5小时得到反应液，将0.590g(1.05mmol)HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl5ml二氯甲烷，冰浴搅拌下滴加N-甲基吗啉调节pH至8，加入刚刚得到的反应液中，缓慢滴加N-甲基吗啉调节pH至9，室温搅拌20小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。冰浴搅拌下加入20ml饱和NaCl水溶液，反应液用二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，依次用饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO₄水溶液、饱和NaCl水溶液、5％NaHCO₃水溶液和饱和NaCl水溶液各萃洗3次，二氯甲烷层用无水Na₂SO₄干燥，减压过滤，滤液减压浓缩至干，经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇＝35∶1)，得0.317g(38.2％)目标化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：830.7[M+H]⁺。

实施例8制备(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val(7)

将0.300g(0.36mmol)(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-酰基-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于15ml甲醇，冰浴搅拌下滴加NaOH水溶液(2M)调节pH至12，冰浴搅拌24小时，TLC显示原料完全消失，反应结束。冰浴搅拌下滴加饱和KHSO₄水溶液调节pH至7，减压浓缩除去甲醇，残留物加3ml蒸馏水，冰浴搅拌下滴加饱和KHSO₄水溶液调节pH至3，析出黄色固体，减压过滤，得0.209g(89.1％)目标化合物，为黄色固体。Mp：253.9-256.1℃；；IR(KBr)：3305，3061，2962，2875，1720，1666，1589，1544，1504，1431，1363，1330，1280，1242，1215，1151，1109，1028，970，783，742，702cm^-1；ESI-MS(m/e)：650.2[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝11.83(s，1H)，8.44(dd，J₁＝7.8Hz，J₂＝23.1Hz，1H)，8.15(d，J＝4.8Hz，2H)，8.09-8.00(m，1H)，7.62-7.47(m，1H)，7.41(d，J＝6.6Hz，1H)，7.25(t，J＝7.2Hz，1H)，7.10-7.03(m，1H)，6.83(t，J＝7.5Hz，1H)，6.08-5.99(m，1H)，4.61-4.35(m，1H)，4.21-4.02(m，2H)，3.77-3.63(m，1H)，3.44-3.28(m，1H)，2.55(s，3H)，2.04-1.92(m，1H)，1.55-1.40(m，2H)，1.29-1.21(m，1H)，0.88-0.62(m，10H)，0.21-0.17(m，1H).HPLC：检测波长254nm，4.6×250mmC₁₈色谱柱，流动相CH₃OH∶H₂O＝7∶3，流速：0.6mL/min，纯度96.5％。

实验例1测定化合物血药浓度下的透射电镜照片

将化合物7按照1×10^-8M的浓度配置纯水溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质。得到的照片如图2。结果表明，化合物7在水中可形成纳米颗粒，直径为40-90nm。

实验例2测定化合物7对肿瘤细胞的细胞毒作用

1)本发明的化合物7用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为HL60(人白血病细胞)，A549(人肺癌细胞)，HeLa(人宫颈癌细胞)，HCT-8(人结肠癌细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，SH-sy5y(人神经母细胞瘤细胞)，Haca-T(人永生化表皮细胞)和S180(小鼠腹水瘤细胞)。

3)实验方法HL60、A549、HeLa、HCT-8、MCF-7、S180细胞选用RPMI-1640培养基；SH-sy5y、Haca-T选用DMEM培养基。培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

贴壁细胞A549、HeLa、HCT-8、MCF-7、SH-sy5y、Haca-T和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好、处于对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物7与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的二甲基亚砜，振荡约15分钟溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

悬浮细胞HL60的培养：将生长状态良好、处于对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物7与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。3000转离心15分钟，小心吸出上清液，每孔加入100μL的二甲基亚砜溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

按下式求出各个浓度下化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性：

细胞增殖(％)＝(化合物7组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

4)结果见表1-2。结果表明，化合物7对HL60细胞增殖有一定抑制作用，IC₅₀值为63.69μM，对A549，HeLa，HCT-8，MCF-7，SH-sy5y，Haca-T和S180等7株肿瘤细胞无明显细胞毒作用。

表1.化合物7对HL60、A549、HeLa和HCT-8细胞增殖的影响(IC₅₀，均值±SDμM)

n＝15

表2.化合物7对MCF-7、SH-sy5y、Haca-T和S180细胞增殖的影响(IC₅₀，均值±SDμM)

n＝15

实验例3评价化合物7的体内抗肿瘤活性

1)本发明的化合物7含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素和阿糖胞苷用生理盐水溶解作为阳性对照，含吐温80的生理盐水作为阴性对照；

2)化合物7和含吐温80的生理盐水均灌胃给药，化合物7的给药剂量为0.1μmol/kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0.2mL/20g，连续给药10天，共给药10次；阿霉素腹腔给药，给药剂量为2μmol/kg，连续给药10天，共给药10次；阿糖胞苷腹腔给药，给药剂量为8.2μmol/kg，连续给药10天，共给药10次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组15只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日口服化合物7，剂量为0.1μmol/kg。空白组小鼠每日口服0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素和阿糖胞苷，剂量为2μmol/kg和8.2μmol/kg。实验进行至第11天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物7组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以表示。结果见表3。由表3可以看出，在0.1μmol/kg的口服剂量下，化合物7治疗组小鼠的瘤重与生理盐水组相比具显著性差异，抑瘤率为51.1％。

表3.化合物7的体内抗肿瘤活性

n＝15；a)与生理盐水组相比P<0.01，与阿糖胞苷组相比P>0.05。

实验例4评价化合物5和7的体外抗肿瘤细胞粘附活性

1)化合物5和7用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)Fn(人纤维连接蛋白)。

4)实验方法

用PBS将Fn配制成浓度为100μg/mL的溶液，按100μL/孔加入96孔培养板中，将培养板置于4℃冰箱过夜。次日，吸除未包被Fn溶液，用PBS洗1次，每孔加入含2％FBS的PBS溶液30μL封板，在37℃和5％CO₂的培养箱中孵育3小时，弃去各孔溶液。将生长状态良好、处于对数生长期的HCCLM3细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于包被Fn的96孔板中，每孔100μL，同时加入25μL化合物5或7的溶液，使其终浓度为20nM，在37℃和5％CO₂培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测O.D.(吸光度)值。粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率(％)＝[1-(化合物7组细胞的OD值/空白组细胞的OD值)]×100％；实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以均值±SD表示。

5)结果见表4。由表4可以看出，化合物7在20nM浓度下明显抑制HCCLM3细胞与Fn粘附，粘附抑制率为40.18％。与发明人公开的Leu-Asp-Val在抑制SACC-LM细胞与ECM及血小板粘附的有效浓度为1μM相比，化合物7的有效浓度降低了50倍。

表4.化合物7的体外抗肿瘤细胞粘附活性

n＝15；a)与化合物5组比P<0.01.

实验例5评价化合物5和7的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

1)化合物5和7用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)基质胶为matrigel。

4)实验方法

将冻存于-20℃冰箱的基质胶matrigel4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μLMatrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个，放入37℃和5％CO₂培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50μLDMEM培养基，37℃和5％CO₂培养箱中孵育30min。

HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物5或7的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养48小时。

弃去上室培养液，用磷酸缓冲液清洗3次，弃去磷酸缓冲液。另取一96孔板，每孔加入150μL预热的细胞消化液，将上室置于其上，37℃和5％CO₂培养箱中培养30分钟，期间轻轻前后震摇几次，确保细胞完全脱离，将其与下室对应孔内细胞混合。将Lysis/Dye染液加入上述含有细胞的96孔板中，每孔50μL，室温避光静置15分钟。每孔吸取150uL至荧光专用96孔板中，用酶标仪于480/520nm波长上读取O.D.值，并按如下公式计算药物对细胞的侵袭抑制率：

侵袭抑制率＝[空白对照组O.D.值-给药组O.D.值]/空白对照组O.D.值×100％。

实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭抑制率以均值±SD表示。

5)结果见表5。可以看出，化合物7在20nM浓度下可抑制HCCLM3细胞对ECM的侵袭，抑制率为51.19％。与发明人公开的与发明人公开的Leu-Asp-Val在抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度为1μM相比，化合物7的有效浓度降低了50倍。

表5.化合物7的体外抗肿瘤细胞侵袭活性

n＝15；a)与化合物5组比P<0.01.

实验例6评价化合物5和7的体外抗肿瘤细胞迁移活性

1)化合物5和7用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100μM的溶液。

2)细胞为HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)实验方法

HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL。每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL同时加入25μL化合物5或7的溶液，使其终浓度为20nM。空白对照加25μL含0.1％DMSO的DMEM培养基配制的溶液。下室加入600μL无血清DMEM培养基，在37℃和5％CO₂培养箱中培养6小时。

用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4％的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液，用PBS洗3次，用0.1％的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。

在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭的细胞数以均值±SD表示。

4)结果见表6。可以看出，化合物7在20nM浓度下可抑制HCCLM3细胞迁移，抑制率为41.18％。与发明人公开的Leu-Asp-Val在抑制SACC-LM细胞迁移的有效浓度为1μM相比，化合物7的有效浓度降低了50倍。

表6.化合物7的体外抗肿瘤细胞迁移活性

n＝15；a)与化合物5组比P<0.01。

Claims (5)

1.下面结构的(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val。

2.权利要求1的(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val的制备方法，该方法由以下步骤构成：

(1)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；

(2)在三氟乙酸的存在下，在二氯甲烷中1，1，3，3-四甲氧基丙烷和L-色氨酸苄酯缩合为(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(3)在三乙胺的存在下，在丙酮中双乙烯酮和(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯缩合为(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2-乙酰乙酰基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；

(4)在盐酸水溶液(2M)的存在下，在丙酮中(3S)-1-(2，2-二甲氧乙基)-2-乙酰乙酰基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯氧化环合为(6S)-苯基-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸酯；

(5)冰浴下在NaOH的水溶液(2M)和甲醇中，(6S)-苯基-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸酯转化为(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸；

(6)采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺和N-羟基苯骈三氮唑的存在下，在干燥四氢呋喃中反应，得到全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(7)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)中，全保护多肽序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl脱除Boc得Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(8)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基苯骈三氮唑存在下，在无水N，N-二甲基甲酰胺中(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-羧酸和Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl缩合为(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(9)冰浴下在NaOH的水溶液(2M)和甲醇中，(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl转化为(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Va。

3.权利要求1的(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val的纳米结构。

4.权利要求1的(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.权利要求1的(6S)-3-乙酰基-4-氧代-4，6，7，12-四氢吲哚[2，3-a]喹嗪-6-甲酰-Leu-Asp-Val在制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。