CN103864890B

CN103864890B - 咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚、其制备、纳米结构及应用

Info

Publication number: CN103864890B
Application number: CN201210533337.XA
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 李春波; 吴国锋; 王文敬; 崔莹
Original assignee: Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Current assignee: Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN103864890A

Abstract

目前临床应用的抗肿瘤药物大多存在疗效不理想和毒性高的局限性。本发明提供了一种四环吲哚生物碱咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚、其制备方法及应用，在生理pH环境中，所述的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚形成可被肿瘤细胞吸附的纳米结构，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的纳米结构体外抑制肿瘤细胞增殖，进入肿瘤细胞内可诱导肿瘤细胞过度自噬引起肿瘤细胞内自噬体堆积而破裂死亡。本发明的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚是一种具有全新作用机理的纳米抗肿瘤剂，具有广泛的临床应用前景。

Description

咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚、其制备、纳米结构及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说是一种四环吲哚生物碱咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚、制备方法及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病，近20年来，我国肿瘤死亡率上升了29.42％。在35至59岁的中壮年人群中，肿瘤已列居各类死因之首。有数据显示：我国肿瘤发病率约为200/10万人，每年新发病例约220万人以上，在治患者约600万人以上。肿瘤的治疗方法有手术治疗，放射治疗和药物治疗(化学治疗)。目前，化学治疗仍然是临床治疗肿瘤的主要手段。由于临床应用的抗肿瘤药物大多存在疗效不理想和毒性高的局限性，所以寻找新的抗肿瘤药物一直是新药研究的热点之一。

自噬，是细胞自我保护的一种重要手段。正常细胞通过自噬，消化掉胞内出现的有毒代谢产物，维持细胞内的洁净环境。肿瘤细胞无节制繁殖，大量消耗营养物质，细胞时刻处于饥饿状态。通过自噬，肿瘤细胞把胞内的一些不重要组分充当食物消化，维持生存。肿瘤细胞这种自我保护途径，一直被认为是药物抑制肿瘤细胞增殖的潜在靶点。不过，至今没有成功的药物设计例子。一个公知的事实是，巨噬细胞会吞噬外来的有一定尺寸的异物。这种吞噬现象的价值至今没有被药物设计人员认识。

发明人把这种吞噬现象作了合理的延伸，认为可诱导肿瘤细胞自噬的物质应当是可进入细胞的有一定尺寸的物种。于是发明人进一步设想，如果一个化合物能够形成纳米结构，那么这种化合物就具备了一定的尺寸。如果这种化合物的纳米结构能够进入肿瘤细胞内，那么这种化合物就是肿瘤细胞自噬的诱导剂。发明人在纳米结构研究中认识到，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚不仅可以形成纳米结构，而且这种纳米结构可以被肿瘤细胞吸附，从而能够进入肿瘤细胞内。大量这种纳米结构进入肿瘤细胞内便可以诱导肿瘤细胞过度自噬而致死。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米抗肿瘤四环吲哚生物碱，即咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚。

为此，本发明采用如下的技术方案：一种四环吲哚生物碱，即咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚，其结构式如下：

本发明的第二个技术方案是提供上述咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的制备方法，其步骤如下：

1)在稀硫酸催化下，L-色氨酸与甲醛缩合制得3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

2)所述的3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与Boc₂O反应制得3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

3)所述的3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与L-亮氨酸苄酯反应制得3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸苄酯；

4)所述的3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸苄酯先用氯化氢的乙酸乙酯溶液脱Boc，然后与丙酮缩合制得[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸苄酯；

5)所述的[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸苄酯在甲醇中氢解制得[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸；

6)所述的[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸与L-茶氨酸苄酯反应制得咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚。

上述制备方法的合成路线如下：

上述路线中，i)稀硫酸，甲醛；ii)Boc酸酐；iii)DCC，HoBt和L-亮氨酸苄酯；iv)氯化氢的乙酸乙酯(4N)，三乙胺，丙酮；v)Pd/C；vi)DCC，HoBt和L-茶氨酸苄酯。

本发明的第三个技术方案是提供上述咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在制备抗肿瘤剂中的应用，其特征在于，在病理生理pH环境下，所述的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚形成可被肿瘤细胞吸附的纳米结构，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的纳米结构体外抑制肿瘤细胞增殖，大量进入肿瘤细胞内可诱导肿瘤细胞过度自噬引起肿瘤细胞内自噬体堆积而破裂死亡。

本发明的咔啉并咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯是一种具有全新作用机理的纳米抗肿瘤剂，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1为咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的透射电镜照片。如图所示，浓度为5μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在pH 5.0和5.4(各种肿瘤组织的pH)及pH7.4(各种正常组织的pH)三种缓冲液中均为纳米球，直径为14-895nm。可见，在病理生理pH环境下，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚以纳米球存在。

图2为咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的扫描电镜照片。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在pH 5.0和5.4(各种肿瘤组织的pH)及pH7.4(各种正常组织的pH)三种缓冲液中均为纳米球。可见，在正常生理及病理生理pH环境下，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚以纳米球的形态存在。

图3为咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚与鼠血浆的溶液晾干后的扫描电镜照片。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在鼠血浆中仍以纳米球的形态存在。

图4为咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对A549(人肺腺癌)、A549/Taxo(人肺腺癌紫杉醇耐药株)、U87(人神经胶质瘤细胞)、Bel-7402(人肝癌细胞)、正常细胞Cos 7(非洲绿猴肾成纤维细胞)和正常细胞HaCa T(人皮肤角质细胞)增殖的抑制活性。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚抑制肿瘤细胞增殖的活性强，而抑制正常细胞增殖的活性非常弱。

图5为咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在0.1μmol/kg，0.5μmol/kg，1.0μmol/kg，2.0μmol/kg，4.0μmol/kg和8.0μmol/kg六种剂量下抑制S180荷瘤小鼠的肿瘤生长活性。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在0.5μmol/kg剂量下开始显示抗肿瘤活性，随着剂量升至1.0μmol/kg和2.0μmol/kg抗肿瘤活性逐步增强。剂量再升至4.0μmol/kg和8.0μmol/kg时抗肿瘤活性进入平台区，不显示差异。

图6为不处理的A549(人肺腺癌)细胞及A549/Taxol(人肺腺癌紫杉醇耐药株)和用浓度为20μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育6h的A549细胞及A549/Taxol细胞的扫描电镜照片。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可使A549细胞及A549/Taxol细胞形态改变、立体感消失、细胞变扁平、成团状物并碎裂。

图7为不处理的A549(人肺腺癌)细胞和用浓度为50μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育6h的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可进入A549细胞内，使细胞形态改变并碎裂。

图8为不处理的A549(人肺腺癌)细胞用浓度为50μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育6h的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可以纳米结构(绿色荧光)进入A549细胞，促使细胞形成并释放囊泡(蓝色荧光)，进而碎裂致死。(从左到右依次为可见光视野的照片，激发波长405nm的荧光视野的照片，激发波长488nm的荧光视野的照片，合并两种荧光视野的照片和合并可见光和荧光视野的照片)。

图9为不处理的及A549/Taxol(人肺腺癌紫杉醇耐药株)用浓度为50μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育的激光共聚焦显微镜照片。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可以纳米结构(绿色荧光)进入A549细胞，促使细胞形成并释放囊泡(蓝色荧光)，进而碎裂致死。(从左到右依次为可见光视野的照片，激发波长405nm的荧光视野的照片，激发波长488nm的荧光视野的照片，合并两种荧光视野的照片和合并可见光和荧光视野的照片)。

图10为不处理的及A549/Taxol(人肺腺癌紫杉醇耐药株)用浓度为20μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育6h、12h和24h的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚使细胞中的微丝(红色)和微管(绿色)发生了比较明显的变化。从6h开始，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育便导致细胞内的微丝发生断裂并形成聚集和结节，微丝和微管成团向细胞外释放。可见，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育破坏了A549(人肺腺癌)细胞的骨架。

图11为A549(人肺腺癌)细胞用浓度为20μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育6h的激光共聚焦显微镜照片扫描电镜照片。如图所示，两种照片都显示咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲孵育可破坏A549细胞内的微丝和微管，使之成团并向细胞外释放。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

将200mL水置于250mL的圆底烧瓶中，缓慢加入0.1mL浓硫酸。往得到的稀硫酸溶液中加入2.52g(12.4mmol)L-色氨酸并超声振荡至L-色氨酸完全溶解。往得到的溶液中加入5mL浓度为37-40％的甲醛溶液。反应混合物室温搅拌6小时，薄层层析监测到L-色氨酸消失，终止反应。往反应溶液中缓慢滴加浓氨水，调反应混合物至pH 6，静置30分钟。减压滤出的生成的沉淀用水及丙酮反复淋洗3次，得到2.64g(99％)标题化合物，为无色粉末。

ESI-MS(m/e)215[M-H]^-。

实施例2制备3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

100mL茄瓶中加入20mL DMF，搅拌下加入2.033g(9.41mmol)3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(化合物1)，得混悬液。冰浴搅拌下往该混悬液中加入2.752g(12.6mmol)Boc₂O，并加三乙胺将反应液pH调至10。反应混合物室温搅拌48小时，薄层层析监测至化合物1消失，终止反应，减压浓缩至干。将得到的油状物用100mL乙酸乙酯溶解，用KHSO₄(5％)水溶液洗涤(10mL×3)。分出合并的乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥2小时，减压过滤。滤液减压浓缩至干，析出无色固体。得到的无色固体与氯仿混合，减压过滤，得到2.23g(75％)标题化合物。ESI-MS(m/e)315[M-H]^-。

实施例3制备3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸苄酯(3)

冰浴下向250mL茄瓶中加入2.243g(7.10mmol)3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)，4.90g(12.4mmol)TosH·Leu-OBzl，1.402g(10.4mmol)HOBt和80mL无水THF，搅拌使溶解，将2.589g(12.6mmol)DCC溶于10mL无水THF，冰浴下缓缓滴加至反应瓶中，充分搅拌5分钟。用NMM调反应混合物pH至8，0℃搅拌4小时，滤除DCU。滤液减压浓缩至干。得到的残余物用150mL乙酸乙酯溶解、置于250ml分液漏斗中、依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗(30mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3)、5％硫酸氢钾水溶液洗(30mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3)、饱和碳酸氢钠水溶液洗(30mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥2小时、过滤、滤液减压浓缩至干，得到淡黄色油状物。加入少量乙醚溶解，水泵减压浓缩至干使固化。得到3.565g(97％)标题化合物，为无色粉末。R_f＝0.65(氯仿∶甲醇＝20∶1)，ESI-MS(m/e)520[M+H]⁺.¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ＝10.822(d，J＝18.9Hz，1H)，8.397(m，1H)，7.293(s，5H)，7.208(m，2H)，6.991(m，2H)，5.104(m，1H)，4.941(m，2H)，4.694(d，J＝18.9Hz，1H)，4.542(m，1H)，3.230(m，1H)，3.040(m，1H)，1.570(m，3H)，1.423(s，9H)，0.839(s，3H)，0.764(s，3H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)：δ＝172.56，172.02，155.54，136.55，136.29，131.10，128.80，128.42，128.22，126.87，121.12，118.83，117.79，111.35，104.41，103.85，80.15，79.99，66.38，53.50，52.23，50.75，50.41，33.83，28.41，24.93，24.59，24.17，23.37，23.17，15.64。

实施例4制备[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸苄酯(4)

将2.147g(4.14mmol)3S-N-Boc-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-L-亮氨酸苄酯(化合物3)置于100mL茄形瓶中，加入5mL乙酸乙酯溶解。冰浴下往得到的溶液中缓慢滴入20mL氯化氢的乙酸乙酯溶液(4N)。反应混合物0℃搅拌2小时，水泵减压浓缩至干。残留物加20mL乙酸乙酯充分搅拌，水泵减压浓缩至干，重复3次。残留物加20mL乙醚充分搅拌，水泵减压浓缩至干，重复3次。得到的无色粉末溶于80mL乙醇和20mL丙酮，用三乙胺调整pH值到9、室温避光搅拌7天，薄层层析监测至化合物3消失，终止反应。反应混合物减压浓缩至干、残留物用200mL乙酸乙酯溶解、溶液置于250mL分液漏斗中并用30mL饱和氯化钠水溶液洗(30mL×8)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥2小时，过滤。滤液减压浓缩至干。残留物用5mL甲醇溶解、静置、过滤、得0.35g(38％)标题化合物，为淡黄色粉末。R_f＝0.32(石油醚∶丙酮，4∶1)，ESI-MS(m/e)460[M+H]⁺；Mp 190-192℃；¹H-NMR(CDCl₃)，300MHz δ＝7.882(s，1H)，7.524(d，J＝8.1Hz，1H)，7.341(m，6H)，7，154(m，2H)，5.204(m，2H)，3.962(m，2H)，3.846(d，J＝13.5Hz，1H)，3.481(m，1H)，3.190(m，1H)，2.769(m，2H)，1.612(m，1H)，1.461(s，3H)，1.245(s，3H)，0.955(m，6H).¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)δ＝171.78，170.62，136.29，135.33，131.02，128.74，128.66，128.51，128.27，127.26，121.75，119.68，118.22，110.68，108.47，78.92，66.87，61.12，57.42，41.60，34.07，29.69，25.65，25.03，23.89，18.87，16.59，11.22.

实施例5制备[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸(5)

将131mg(0.285mmol)[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸苄酯(化合物4)置于100mL茄瓶中，加入15mL甲醇溶解，搅拌下加入15mg Pd/C，连好三通及氢气袋，水泵减压抽出空气后通入氢气，反复重复2次。保持通入氢气的状态搅拌反应2小时。薄层层析监测至化合物4消失，停止反应，小心滤除Pd/C，滤液减压浓缩至干。得到102mg(97％)标题化合物，为淡黄色粉末。R_f＝0.40(氯仿∶甲醇∶冰醋酸＝20∶1∶0.10)，ESI-MS(m/e)368[M-H]-；Mp 236-237℃； ¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)δ＝10.979(s，1H)，7.356(dd，J₁＝30.3Hz，J₂＝7.6Hz，2H)，6.988(m，2H)，3.928(m，2H)，3.768(d，J＝14.1Hz，1H)，3.416(m，1H)，2.870(m，1H)，1.998(m，2H)，1.657(m，2H)，1.420(s，3H)，1.287(s，3H)，0.930(t，6H)；¹³C-NMR(DMSO-d₆，75MHz)δ＝172.73，171.00，136.53，133.17，127.17，120.94，118.83，117.91，111.41，106.34，78.55，57.23，52.77，47.05，41.77，38.95，33.80，25.81，25.20，24.94，24.90，23.85，23.22，22.77，19.70。

实施例6制备咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚(化合物B)

冰浴冷却下向50mL圆底烧瓶中加入176mg(0.48mmol)[四氢-β-咔啉并(2，2-二甲基-咪唑-4-酮-3-基)]-2-(甲基丙基)-乙酸(5)，65mg(0.48mmol)HOBt，156mg(0.59mmol)TosH·The-OBzl，加入25mL无水THF溶解搅拌。118mg(0.57mmol)DCC溶于5mL无水THF，冰浴冷却下滴加至反应瓶中，充分搅拌5分钟。NMM调反应液PH为8，反应混合物0℃搅拌4小时后TLC检测CKLOH原料点消失，停止反应，抽滤2次滤除DCU，滤液减压浓缩至干。残余物以30mL乙酸乙酯溶解，转移至100mL分液漏斗中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗(10mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(10mL×3)、5％硫酸氢钾水溶液洗(10mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(10mL×3)、饱和碳酸氢钠水溶液洗(10mL×3)、饱和氯化钠水溶液洗(10mL×3)。合并的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥2小时、过滤、滤液减压浓缩至干，得到淡黄色油状物。加入少量石油醚反复磨洗3次，得到269mg(91.8％)标题化合物，为淡黄色粉末。该粉末用氯仿湿法装柱，干法拌样，进行纯化(氯仿∶甲醇＝200∶1)，得178mg(61％)纯标题化合物。Rf＝0.25(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)。ESI-MS(m/e)616[M+H]+；Mp 101-102℃；IR(KBr)：3785，3303，3064，2963，2361，1741，1685，1546，1452，1371，1340，1253，1223，1187，1008，743，698，590，547，489，405；1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δ＝10.86(s，1H)，8.01(d，J＝7.8Hz，1H)，7.79(s，1H)，7.44(d，J＝7.5Hz，1H)，7.30(s，6H)，7.07-6.95(m，2H)，5.10(s，2H)，4.39(s，1H)，3.97-3.93(m，2H)，3.71(d，J＝7.5Hz，1H)，3.48(dd，J＝3.6Hz，J＝9.9Hz，1H)，3.19(s，1H)，3.08-2.98(m，2H)，2.88(s，1H)，2.92(s，1H)，2.18-2.03(m，4H)，195-1.81(m，2H)，1.55(s，1H)，1.37(s，3H)，1.26(s，3H)，1.01-0.84(m，9H).13CNMR(DMSO-d6，125MHz)δ/ppm＝172.27，171.79，171.47，171.07，136.60，136.22，133.00，128.84，128.81，128.45，128.34，127.20，121.00，118.90，117.92，111.41，106.48，79.26，66.55，57.55，55.99，52.34，49.06，41.77，40.88，40.60，40.33，40.05，39.77，39.49，39.21，39.10，33.79，31.69，27.20，25.35，25.03，24.09，23.07，22.75，18.46，15.12.纯度95.6％流动相：CH3OH∶H2O＝80∶20，保留时间：9.36min。

实施例7测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的透射电镜

为了描述咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的纳米结构，将咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚溶于pH分别为7.4、5.4和5.0的磷酸盐缓冲溶液，配成浓度为5μM的溶液。然后将溶液滴在铜网上，37℃挥发7天至干，然后按标准操作(20eV能量窗口，6000-400,000倍)在透射电镜(JSM-6360LV，JEOL，Tokyo，Japan)下拍摄纳米照片。这些透射电镜照片显示在图1中。如图所示，浓度为5μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在pH为5.4和5.0(各种肿瘤组织的pH)及pH7.4(各种正常组织的pH)的磷酸盐缓冲溶液中均形成纳米球，直径为14-895nm。可见，在病理生理pH环境下，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚以纳米球存在。

实施例8测定咔啉并咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯的扫描电镜

为了描述咔啉并咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯的纳米结构，将咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在pH为5.4和5.0(各种肿瘤组织的pH)及pH7.4(各种正常组织的pH)的磷酸盐缓冲溶液，配成浓度为5μM的溶液。然后将溶液滴在玻璃片上，37℃挥发至干溶后按标准操作(15eV能量窗口，6000-400,000倍)在扫描电镜(SEM，JEM-1230LV，JEOL，Tokyo，Japan)下拍摄纳米照片。这些扫描电镜照片显示在图2中。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在pH为5.4和5.0(各种肿瘤组织的pH)及pH7.4(各种正常组织的pH)三种缓冲液中均为纳米球存在。可见，在病理生理pH环境中，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚以纳米球存在。

实施例9测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的在鼠血浆中的扫描电镜

为了描述咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在血浆中的纳米结构，将咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚溶于鼠血浆，配成浓度为5μM的溶液。然后将溶液滴在玻璃片上，37℃挥发至干溶后按标准操作(15eV能量窗口，6000-400,000倍)在扫描电镜(S EM，JEM-1230LV，JEOL，Tokyo，Japan)下拍摄纳米照片。这些扫描电镜照片显示在图3中。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在鼠血浆中为纳米球。可见，在血浆中咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚以纳米球存在。

实施例10测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚抑制肿瘤细胞增殖的活性

咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚用含0.25％DMSO的1640培养基或者DMEM培养基配制成所需浓度。所涉及的肿瘤细胞购自美国标准菌种收藏所(A TCC)。PBS缓冲液，RPMI-1640和DMEM培养基溶液购自Gibco公司。胎牛血清购自Hyclone公司，0.25％胰酶溶液购自Hyclone公司，青霉素和链霉素购自solarbio公司。四噻唑蓝(MTT)购自solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤除菌后使用，避光保存。

将生长状态良好，处于对数生长期的对A549(人肺腺癌)、A549/Taxo(人肺腺癌紫杉醇耐药株)、U87(人神经胶质瘤细胞)、Bel-7402(人肝癌细胞)和两株正常细胞Cos 7(非洲绿猴肾成纤维细胞)、HaCa T(人皮肤角质细胞)按5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL。37℃下96孔板置于5％CO₂培养箱中培养12小时待贴壁。细胞按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的含0.25％DMSO的1640培养基配制成的所需浓度的溶液，每孔25μL，对照孔加入等体积的含相同浓度DMSO的培养基，平行6孔。37℃下96孔板置于5％CO₂培养箱中培养48小时。之后每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4小时。小心吸出上清液，每孔加入100μL DMSO溶解紫色残留物(甲瓒)，平板振荡10分钟使沉淀全部溶解，于540nm酶标仪上测定O.D.值(吸光度)，波长570nm。

实验平行重复3次，按照公式“相对生存率＝(D含药-D空白)/(D对照-D空白)×100％”计算每一个样品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率。以抑制率对咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的浓度作图，计算咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对各株细胞的IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。实验结果用图4表示。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对A549细胞及A549/Taxol细胞具有选择性的抑制作用，IC₅₀值在14-18μM之间，抑制正常细胞增殖的活性非常弱。

实施例11测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚抑制S180荷瘤小鼠肿瘤生长活性

无菌条件下抽取接种7天后生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶3)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按细胞浓度＝(4大方格内活细胞数/4)×10⁴稀释倍数＝细胞数/mL和细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞浓度和细胞存活率。

ICR雄性小鼠(清洁级，体重为20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每12只小鼠一组。将S180活细胞存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1.5×10⁷个/mL的细胞悬液，于ICR雄性小鼠腋皮下接种(0.2mL/只)，造成荷S180实体瘤小鼠并接受治疗。咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚用含0.1％DMSO的生理盐水配至所需浓度(对应的剂量为8.0μmol/kg，4.0μmol/kg，2.0μmol/kg，1.0μmol/kg，0.5μmol/kg和0.1μmol/kg)。空白对照为含0.1％DMSO的生理盐水(剂量均为3ml/kg)。每天腹腔注射1次，连续给药7天。治疗至第8天，称小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，并剖取各组小鼠的肿瘤及各主要脏器称重，最后统计各组药物的瘤体比及脏体比。瘤体比＝瘤重(mg)/处死前体重(g)。本实验数据统计均采用t检验和方差分析。实验结果用图5表示。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在0.5μmol/kg剂量下开始显示抗肿瘤活性，随着剂量升至1.0μmol/kg和2.0μmol/kg抗肿瘤活性逐步增强。剂量再升至4.0μmol/kg和8.0μmol/kg时抗肿瘤活性进入平台区，不显示差异。在2.0μmol/kg剂量下咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的抗肿瘤作用与阿霉素没有差异(p＞0.05)。

实施例12测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的急性毒性

ICR雄性小鼠(清洁级，体重为20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，每10只小鼠一组。腹腔注射0.2ml的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的生理盐水溶液，剂量为100μmol/kg，对照组腹腔注射等量的生理盐水，连续观察14天，于第15天称重后断头取血，并取心、肝、脾、肾、脑称重，统计给药组和溶媒对照组的差异。观察表明，在高达100μmol/kg剂量下(为有效剂量的200倍)腹腔注射咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚没有引起小鼠出现烦躁不安的神经症状、没有引起小鼠死亡、没有看到小鼠体重和脏器发生明显变化(表1)。

表1生理盐水和咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚治疗小鼠体重和脏器重

NS代表生理盐水，B代表咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚，重量用表示

实施例13测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的肿瘤细胞的扫描电镜

为了揭示咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对A549(人肺腺癌)细胞及A549/Taxol(人肺腺癌紫杉醇耐药株)细胞形成并释放囊泡促进细胞碎裂致死，将A549细胞及A549/Taxol细胞接种到圆形玻璃片上，培养12h后加浓度为20μM的咔啉并咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯。孵育6h后，弃去培养液，加戊二醛固定，经临界点干燥仪干燥，在扫描电镜下观察。作为对照，也观察了未经咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的的A549细胞及A549/Taxol细胞扫描电镜照片。结果用图6表示。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可使A549细胞及A549/Taxol细胞形态改变、立体感消失、细胞变扁平、成团状物并碎裂。

实施例14测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的A549死细胞的激光共聚焦显微镜

为了揭示咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对A549(人肺腺癌)细胞形成并释放囊泡促进细胞碎裂致死化的细节，根据咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚本身具有荧光的特点，利用激光共聚焦显微镜观察了它在肿瘤细胞中的作用位置。将A549细胞接种到激光共聚焦显微镜(co nfocal)专用培养皿上，培养12h后加浓度为50μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚。孵育6h后，弃去培养液，加多聚甲醛室温固定20min，弃去多聚甲醛并用PBS吹洗细胞3次，加PBS后上机检测，激发光405nm，发射光接受波段为450-500nm。结果用图7表示。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可进入A549细胞内(其荧光在-在黑白图中显示为白色)，使细胞形态改变并碎裂。

实施例15测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的A549活细胞的激光共聚焦显微镜

为了进一步揭示咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对A549(人肺腺癌)细胞形成并释放囊泡促进细胞碎裂致死化的细节，根据咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚本身具有荧光的特点，利用激光共聚焦显微镜观察了它在肿瘤细胞中的作用位置。将A549细胞接种到激光共聚焦显微镜(Confocal)专用培养皿上，培养12h后加浓度为50μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚。孵育6h后，弃去培养液，加入含有细胞膜绿色荧光染料(Di o)的PBS缓冲液，避光染色20min，弃去溶液后加入新鲜培养基，在激光共聚焦显微镜下观察。作为对照，也观察了未经咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片。结果用图8表示。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可以纳米结构(绿色荧光-在黑白图中显示为白色)进入A549细胞，促使细胞形成并释放囊泡(蓝色荧光-在黑白图中显示为白色)，进而碎裂致死。

实施例16测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的A549/Taxol活细胞的激光共聚焦显微镜

为了进一步揭示咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对A549/Taxol(人肺腺癌紫杉醇耐药株)细胞形成并释放囊泡促进细胞碎裂致死化的细节，根据咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚本身具有荧光的特点，利用激光共聚焦显微镜观察了它在肿瘤细胞中的作用位置。将A549/Taxol细胞接种到激光共聚焦显微镜(Confocal)专用培养皿上，培养12h后加浓度为50μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚。孵育6h后，弃去培养液，加入含有细胞膜绿色荧光染料(D io)的PBS缓冲液，避光染色20min，弃去溶液后加入新鲜培养基，在激光共聚焦显微镜下观察。作为对照，也观察了未经咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的A549/Taxol细胞的激光共聚焦显微镜照片。结果用图9表示。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚可以纳米结构(绿色荧光-在黑白图中显示为白色)进入A549/Taxol细胞，促使细胞形成并释放囊泡(蓝色荧光-在黑白图中显示为白色)，进而碎裂致死。实施例17测定咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的A549细胞骨架的激光共聚焦显微镜

为了揭示咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚对A549(人肺腺癌)细胞骨架的破坏细节，根据咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚本身具有荧光的特点，将A549细胞接种到激光共聚焦显微镜(Confocal)专用培养皿上，培养12h后加浓度为20μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚。孵育6，12，24h后，弃去培养液，加多聚甲醛室温固定20min，弃去多聚甲醛并用PBS吹洗细胞3次，加入终浓度为10％的triton的PBS溶液，室温打孔10min，弃去溶液，加PBS吹洗3次，加终浓度为0.4μg/ml的罗丹明123标记鬼笔环肽PBS溶液，避光室温染色20min，弃去染色液，加入PBS吹洗3次，加入终浓度为1μg/ml的DAPI的PBS溶液，避光染色15min，弃去染色液，加PBS吹洗3次，加入FITC标记的抗α-tublin的PBS溶液，避光染色30min，弃去染色液，PBS清洗3次后上机检测。结果用图10表示。如图所示，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚使细胞中的微丝(红色-在黑白图中显示为白色)和微管(绿色-在黑白图中显示为白色)发生了比较明显的变化。从6h开始，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育便导致细胞内的微丝发生断裂并形成聚集和结节，微丝和微管成团向细胞外释放。可见，咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育破坏了A549细胞的骨架。

实施例18对比咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚处理的A549细胞骨架的激光共聚焦显微镜和扫描电镜照片

为了加深对咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育破坏了A549细胞的骨架的认识，对比了浓度为20μM的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育6h的A549细胞的激光共聚焦显微镜照片和扫描电镜照片。结果用图11表示。如图所示，两种照片都显示咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚孵育可破坏A549细胞内的微丝和微管，使之成团并向细胞外释放。

Claims

1.一种四环吲哚生物碱，即咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚，其结构式如下：

2.权利要求1所述咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的制备方法，其包括如下步骤：

3.权利要求1所述的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的纳米球，所述纳米球由咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚在pH5.0或pH5.4或pH7.4磷酸盐缓冲溶液中形成。

4.根据权利要求3所述的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的纳米球，其特征在于，在pH＝5.0的环境中纳米球的直径为100-895nm，在pH＝5.4的环境中纳米球的直径为17-100nm，在pH＝7.4的环境中纳米球的直径为26-57nm。

5.根据权利要求1所述的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚或权利要求3所述的咪唑异丙乙酰茶氨酸苄酯并吡啶并吲哚的纳米球在制备治疗肺腺癌、紫杉醇耐药肺腺癌和S180瘤药物中的用途。