CN105693818A - 甘氨酸-l-半胱氨酸-l-苯丙氨酸三肽及其在脑卒中药物制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的物质甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒中药物中的用途,属于医药领域。动物实验表明上述三肽通过静脉给药方式,透过血脑屏障,进入大脑组织和细胞,明显改善大鼠脑梗死体积,起到治疗脑卒中的作用,甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽实现常规静脉给药,作用明显优于现有临床使用药物。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体来说涉及甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸(Gly-L-Cys-L-Phe,简称GCF)三肽在脑卒中药物制备中的应用。
背景技术
脑卒中(stroke),是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病,临床上表现为一次性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑卒中按其性质分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。脑卒中是严重危害人类生命安全的难治性疾病,具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点,在2008年我国卫生部公布的死因顺位中,脑卒中在城市中排名第三位,在农村中为第二位的致死原因,其中缺血性脑卒中占卒中病人综述的75%-85%。因此,研发出一种抗缺血性脑卒中的药物具有广阔的医学应用前景。
目前临床上缺血性脑卒中治疗方式有以下几类:(1)溶栓药物。在急性超早期即复流时间窗内,如果患者的条件符合溶栓的要求,可使用溶栓药物进行溶栓,这在临床上是缺血性脑卒中急性期采取的最有效治疗措施之一。但是,溶栓药物的剂量以及有效时间窗等研究仍然不成熟,还有待于进一步的探索研究。(2)神经保护药物。大多数的神经保护药物是在细胞损伤瀑布级联效应启动前阻断神经元损伤或凋亡的多个环节发挥保护作用,或对神经元具有营养作用能够促使神经元的修复。近年来关于神经保护药物的研究主要集中在已上市药物依达拉奉,NMDA受体阻断剂和Ca2+通道阻断剂等。几乎所有这些神经保护药物在动物实验中都被证明具有神经保护作用,但是临床试验却被证实无效或者是效果很差,甚至有些药物具有明显的毒副作用,产生患者无法忍受的中枢神经系统不良反应或其他脏器毒性,使得神经保护的研究停滞不前。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题,提供了一种新的化合物甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽,简称GCF,它是由甘氨酸,半胱氨酸,苯丙氨酸三种天然氨基酸为原料脱水缩合而成,其结构式为:
本发明的目的之二是提供甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在脑卒中药物制备中的应用。
本发明用培养12天的原代皮层神经元作为实验对象,用不同浓度GCF处理神经元后,用cck8的方法评价细胞活力,从而判断GCF细胞毒性;检测Akt磷酸化水平(p-Akt)判断GCF对神经细胞是否具有保护作用,Akt磷酸化水平越高保护作用越强。
结果可见,用不同浓度GCF处理神经元12h,GCF浓度低于10mM时,GCF对于神经元具有保护作用,并且随着GCF浓度增大保护作用愈加明显;当浓度在10mM水平时保护作用最强。同时,用细胞外液(ECS)处理原代神经元1h,目的是降低细胞内p-Akt基础表达水平,再用不同浓度GCF处理神经元,收集细胞蛋白用western比较各组之间Akt磷酸化程度,发现GCF浓度高于200μM时p-Akt表达增加,并且当GCF浓度在800μM水平时,Akt磷酸化水平最高,具有统计学意义(***p<0.01)。(见附图2)
本发明用SD大鼠作为实验对象,采用脑中动脉阻断法(MCAo)制备脑缺血大鼠模型,缺血3小时后静脉注射药物,1小时后取脑,脑组织冰冻切片,在荧光显微镜下观察脑片中荧光物质强度。
采用静脉注射FITC(异硫氰酸荧光素,紫外激发可发绿色荧光;8μmol/kg)标记大鼠脑神经细胞,结果可见未缺血大鼠脑组织中未见荧光标记的神经细胞;缺血大鼠脑组织中镜下可见极少量FITC标记的绿色荧光神经细胞;脑缺血后注射FITC-GCF(8μmol/kg),镜下可见大量荧光标记的神经细胞,并且荧光强度高(见附图3),表明GCF在大鼠缺血情况下,可以通过静脉注射方式透过血脑屏障进入大脑。
本发明用SD大鼠作为实验对象,静脉注射给予GCF(10mg/kg)、依达拉奉(临床脑卒中治疗药物;6mg/kg),采用MCAo脑缺血大鼠模型,缺血后5h,静脉一次性注射上述药物。24h后,处死动物,取脑,后TTC染色,梗死体积用([(VC-VL)/VC]表示,VC是对照半球体积,,VL是损伤半球非梗死体积)。
结果可见,注射生理盐水的脑缺血大鼠,梗死体积0.3369±0.023;给予10mg/kgGCF,梗死体积0.023±0.004;注射6mg/kg依达拉奉,梗死体积为0.1373±0.021;相对于静脉给生理盐水和依达拉奉组,给GCF三肽药组有更低的梗死体积,并且有统计学意义(p<0.05)(见表1,附图4)。
本发明提供的三肽可以通过常规静脉给药方式,透过血脑屏障,进入大脑组织和细胞,明显改善大鼠脑梗死体积,起到治疗脑卒中的作用,该三肽作用明显优于现有临床使用药物。
附图说明
图1:甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽的HPLC图谱以及质谱图,该三肽由本实验室自主合成。
图2:GCF对皮层神经元存活的影响。
图3:FITC-GCF在大鼠脑缺血情况下,透过血脑屏障,进入大脑。
图4:缺血大鼠静脉注射GCF,可明显改善缺血大鼠脑梗死体积,发挥脑保护作用。
具体实施方式
通过结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽(Gly-Cys-Phe)的制备过程如下:
一、复合物IFmoc-L-Phe-树脂的合成:
本专利三肽用固相合成的方法,称取取代度为0.4mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂(2-ChlorotritylChlorideResin)10.7g,将树脂放入多肽反应管中,加入二氯甲烷(DCM)160.5ml,震荡30分钟;通过沙芯抽滤掉DCM溶剂,加入12mmol的Fmoc-L-Phe-OH氨基酸,再加入40mmol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA),最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解,振荡1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。加160.5ml20%哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中),5分钟后抽掉哌啶,再次加入160.5ml20%哌啶,等15分钟后抽掉哌啶溶液,从管中取反应后的树脂十几粒,用乙醇洗三次,加入茚三酮,氰化钾溶液,苯酚溶液各一滴,105℃-110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应,说明Fmoc-L-Phe-OH与树脂联接成功,形成复合物IFmoc-L-Phe-树脂。
二、复合物IIFmoc-Cys(Trt)-L-Phe-树脂的合成:
多肽反应管分别用160.5mlDMF洗两次,160.5ml甲醇洗两次,160.5mlDMF再洗两次;后在Fmoc-L-Phe-树脂复合物上联接第二个氨基酸,在反应管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-Cys(Trt)-OH和12mmol苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU),后立即加入N-甲基吗啉(NMM)40mmol,反应30min,反应管分别用160.5mlDMF洗一次,160.5ml甲醇洗两次,160.5mlDMF再洗两次。加160.5ml20%哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中),5分钟后抽掉哌啶,再次加入160.5ml20%哌啶,等15分钟后抽掉哌啶溶液,从管中取反应后的树脂十几粒,用乙醇洗三次,加入茚三酮,氰化钾溶液,苯酚溶液各一滴,105℃-110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应,说明Fmoc-Cys(Trt)-OH与Fmoc-L-Phe-树脂联接成功,形成新的复合物IIFmoc-Cys(Trt)-L-Phe-树脂。
三、复合物IIIFmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-树脂的合成:
多肽反应管分别用160.5mlDMF洗两次,160.5ml甲醇洗两次,160.5mlDMF再洗两次;后在Fmoc-Cys(Trt)-L-Phe-树脂上联接第三个氨基酸,在反应管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-Gly-OH和12mmolHBTU,后立即加入N-甲基吗啉(NMM)40mmol,反应30min,反应管分别用160.5mlDMF洗一次,160.5ml甲醇洗两次,160.5mlDMF再洗两次。加160.5ml20%哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中),5分钟后抽掉哌啶,再次加入160.5ml20%哌啶,等15分钟后抽掉哌啶溶液,从管中取反应后的树脂十几粒,用乙醇洗三次,加入茚三酮,氰化钾溶液,苯酚溶液各一滴,105℃-110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应,说明Fmoc-Gly-OH与复合物II联接成功,形成新的复合物IIIFmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-树脂。
四、得到粗品肽:
多肽反应管分别用160.5mlDMF洗两次,160.5ml甲醇洗两次,160.5mlDMF再洗两次,抽干10min,配制切割液107ml,配方分别是TFA(三氟乙酸)94.5%;水2.5%;EDT(1,2-乙二硫醇)2.5%;TIS(三异丙基硅烷)1%,将树脂装入烧瓶或者离心管中,倒入切割液,恒温震荡2h,将切割液用氮气尽量吹干,乙醚层析,再用乙醚洗6次,然后常温挥干,得到1g粗品肽Gly-Cys-Phe。
五、纯化粗品肽Gly-Cys-Phe
仪器:LC3000型高效液相色谱仪
柱子:Gemini-NXC1810um120A4.6*250mm
流动相A:0.1%TFAin100%Acetonitrile
流动相B:0.1%TFAin100%Water
根据上述纯化条件,将粗品肽(1g),进入到HPLC内(每次进样100mg),进行分离纯化,收集主峰馏分,放冻干机上冻干(48h),最后得到98%以上的纯品500mg。
图1为甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽的HPLC图谱以及质谱图,HPLC图中可见该三肽纯度为98.2%;质谱图结果可见,[M+H]+326.5,因此该物质分子量为325.5,与甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽理论分子量相符。
【实施例2】GCF对原代皮层神经元的细胞毒性试验
本实施例用培养10天的原代皮层神经元作为实验对象,用不同浓度的GCF处理神经元后cck8去评价细胞的活力,从而判断GCF的细胞毒性,用Akt的磷酸化水平来说明GCF对于神经细胞是否有保护作用。
一、主要实验试剂和仪器
GCF由本实验室合成;Neurobasal,由Gibco公司提供;B27,Gibco公司提供;FBS,由invitrogen公司提供;glutamax,invitrogen公司提供;Glutamicacid,由sigma公司提供;多聚赖氨酸,有sigma公司提供。RIPA裂解液,由北京普力莱基因技术有限公司提供;BCA试剂盒,美国Thermo公司提供;蛋白Marker,美国Thermo公司;甘氨酸,武汉科瑞生物技术有限公司提供;三羟甲基氨基甲烷(Trisbase),武汉科瑞生物技术有限公司;十二烷基硫酸钠(SDS),武汉科瑞生物技术有限公司;丙烯酰胺(Arc),武汉科瑞生物技术有限公司;甲叉双丙烯酰胺(Bis),武汉科瑞生物技术有限公司;β-巯基乙醇,武汉科瑞生物技术有限公司;免疫印迹二抗,武汉科瑞生物技术有限公司;Tween-20,美国Amresco公司;TEMED,美国Amresco公司;过硫酸铵,美国Amresco公司;溴酚兰,美国Amresco公司;脱脂奶粉,内蒙古伊利实业集团股份有限公司;p-Akt,美国CellSignaling公司;t-Akt,美国Cell-Signaling公司;培养箱,来自于SANYO公司,培养条件是37℃,5%CO2;电泳仪,美国Bio-red公司;PH计,杭州奥立龙仪器有限公司;酶标仪,美国Bio-Tek公司;Tanon5200化学发光成像系统,北京原皓平生物技术有限公司;其余部分试剂全为国药集团化学试剂有限公司提供的分析纯试剂。
二、主要溶液的配制
1、HBSS:Hank,S平衡液:NaCl8.0g,KCl0.4g,Glucose1.0g,KH2PO40.06g,Na2HPO40.06g,加双蒸水溶解,用NaHCO3调PH至7.3,定容到1000ml.
2、分离液:HBSS500ml,Hepes1.78g,Sucrose2.5g,Glucose10.0g,PH调至7.4,最后加入200ml双蒸水,4℃保存。
3、ECS溶液:NaCl8.01g,CaCl20.222g,KCl0.4g,MgCl20.095g,HEPES2.98g,Glucose3.27g,加双蒸水溶解,PH7.4,定容至1000ml,用0.22um的滤膜过滤除菌。
4、Glutamicacid储备液(11.8mM):称0.1736g的谷氨酸用双蒸水溶解,NaOH调PH至7.0,定量到100ml,分装1060μl/tube,贮存在4℃。
5、0.5%FBS培养基:B27取1ml,FBS250ul,glutamax500ul,glutamicacid106μl,用neurobasal定量到50ml,4℃保存。
6、无FBS培养基:B27取1ml,glutamax500μl,用neurobasal定量到50ml,4度保存。
7、0.15M硼酸盐缓冲液:称取28.6g的硼砂,用双蒸水溶解,搅拌3-5min,用HCl调PH至8.4,定容到500ml。
8、多聚赖氨酸:把5mg的多聚赖氨酸固体溶解到500ml的硼酸盐缓冲液中,过滤除菌,-20℃保存。
三、实验动物
动物SPF级ICR雌性小鼠,体重25-30g。武汉大学动物实验中心提供,动物合格证号为No.42000500006525,生产许可证号:SCXK(鄂)2014-0004。
四、实验原理
cck8的原理:该试剂中含有WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐),它在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(Formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比,与细胞毒性成反比。
Akt的磷酸化水平:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt是一种重要的细胞信号作用分子,在如细胞增殖、存活和代谢等一系列过程中发挥功能。Akt磷酸化可调节细胞周期调控蛋白,促进细胞增殖,同时,Akt磷酸化失活促凋亡靶点,起到抗凋亡并促进细胞存活的作用。
五、实验方法
神经元的原代培养:培养前一天晚上用多聚赖氨酸包被培养皿,过夜;第二天早上取出已包被的多聚赖氨酸,接种前用PBS洗2-3遍。取怀孕17-18d的ICR雌性小鼠,颈椎脱臼处死后,取胎鼠大脑,置于分离液中,打开颅腔后取出全脑置于另一盛有分离液的玻璃培养皿中,在解剖镜下分离剥离脑膜,取大脑皮层置另一盛有分离液的玻璃小皿中;用眼科镊夹碎皮层组织成1mm3大小,吸管吸取组织置一15ml的离心管中,静置几秒,让组织沉淀下来,弃去分离液,加入1-2ml的0.5%FBS培养基,用吸管吹打20-30次,液体变浑浊停止,然后再静置10-20秒,使大的组织块下沉,取上清用滤网过滤,过滤后的液体先数细胞,以4*105/ml的细胞密度把细胞接种到已包被的皿中。第二天从各皿中弃一半体积的培养基,换成无FBS的培养基,之后,每三天换一次全培养基,换的都是无FBS的培养基。
细胞处理过程:取培养10天的96孔板的原代神经元,简单划分为6组,分别是control,100μM,500μM,2mM,10mM,20mM组,每组重复5个复孔,每个孔先用PBS洗2-3遍,后对照组加入ECS,各给药组分别加入不同浓度的用ECS配制的GCF药物,放入培养箱,12h后,每孔加入CCK810μl,2h后在450nm处测吸光值。另一个方法就是把神经元接种到3.5cm的皿中,同样培养10天后,也分为6组,分别是control,100μM,200μM,400μM,600μM,800μM组,处理条件是先用PBS洗2-3遍,然后加入ECS洗1h,后弃去,对照再次加入新的ECS,而各给药组分别加入不同浓度的GCF药物20min,后取蛋白,做western,统计结果。
六、实验结果
结果见图2,用不同浓度的GCF处理神经元,比较处理后神经元的存活率,发现GCF的确对神经元有保护作用,可促进神经元的存活,并且神经元存活率与GCF的浓度正相关,但是一旦GCF浓度>10mM时,再增加浓度,GCF对神经元的保护作用会减弱(如图2A所示)。Western结果也进一步印证了GCF对于神经元的保护作用,并且从图2B中可以看到,GCF的有效浓度远低于10mM,即GCF在低剂量下就能发挥保护作用,因此在成药性方面,GCF也具有一定的潜力。
【实施例3】建立大鼠脑缺血模型,静脉注射荧光标记的GCF,从整体上观察GCF透过血脑屏障的能力
一、实验主要试剂及仪器
FITC,武汉明皓生物科技股份有限公司;FITC-GCF,武汉明皓生物科技股份有限公司;OCT胶,北京中杉金桥生物技术有限公司;病理组织切片机,德国Leitz,1512型;荧光显微镜,宁波舜宇仪器有限公司;多聚甲醛,国药集团化学试剂有限公司。
二、实验原理
FITC(异硫氰酸荧光素):为黄色或橙黄色结晶粉末,分子量为389.4,最大吸收光波长为490~495nm,最大发射光波长为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光,是目前应用最广泛的荧光素。
FITC-GCF:就是GCF进行荧光标记,FITC与GCF三肽结合,结合后不影响GCF三肽的结构和功能,通过在荧光显微镜下观察,具有强烈的黄绿色荧光,可用于GCF的定位或定量的检测。
血脑屏障(BloodBrainBarrier):指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障,这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织,维持中枢神经系统正常的生理状态。但是,由于许多治疗中枢神经系统疾病的药物难以透过血脑屏障,限制了它们在临床上的应用。
三、实验结果
结果可见图3,采用静脉注射FITC(8μmol/kg)标记大鼠脑神经细胞,结果可见未缺血大鼠脑组织中未见荧光标记的神经细胞;缺血大鼠脑组织中镜下可见极少量FITC标记的绿色荧光神经细胞;脑缺血后注射FITC-GCF(8μmol/kg),镜下可见大量荧光标记的神经细胞,并且荧光强度高(见附图3),表明GCF在大鼠缺血情况下,可以通过静脉注射方式透过血脑屏障进入大脑。
【实施例4】建立大鼠脑缺血模型,确定GCF对脑缺血后的保护作用
一、实验药品及试剂
GCF,由本实验自主合成;水合氯醛,国药集团化学试剂有限公司;TTC,武汉科瑞生物技术有限公司提供;无菌生理盐水,武汉滨湖双鹤药业有限责任公司;肝素钠注射液,南京新百药业有限公司提供;依达拉奉注射液,国药集团国瑞药业有限公司,30mg/一支。
二、实验动物
动物SPF级SD雄性大鼠,体重240-260g。武汉大学动物实验中心提供,动物合格证号为NO.42000500006247,生产许可证号:SCXK(鄂)2014-0004。鼠饲料,购于武汉大学实验动物中心。
三、实验方法
240-260g的大鼠随机分组:假手术组,缺血组,缺血加药组,假手术组和缺血组静脉都注射400μl的生理盐水,缺血加药组静脉分别注射GCF(10mg/kg)、依达拉奉(6mg/kg),药物溶解在400μl生理盐水中,缺血5h后静脉一次性给予。
动物给药方式的选择:动物的外周给药方式主要有三种,分别是口服,腹腔注射和静脉注射。传统口服药物和腹腔注射药物,药物都需要先由肠道吸收后进入血液,药物在吸收过程中需要一定的时间并且会有一定程度的损耗,进入血液中的药物就少了。而静脉注射药物相对于传统给药方式,药物是直接进入血液,血液中药物浓度100%,并且直接发挥作用。在药物的有效浓度范围内,选择静脉给药所需的药物浓度更低,作用时间更短,副作用小,因此本实验选择静脉给药。
大脑中动脉栓塞(MCAO)模型的制备:首先采用10%的水合氯醛根据动物体重(0.035ml/kg)进行腹腔注射麻醉,麻醉成功后用改良的线栓法制备大脑中动脉缺血模型。选择与SD大鼠体重匹配的线栓,术前先侵泡在盛有肝素的EP管中。在颈外动脉远心端剪一小口后,将前端有圆头的线栓从小口处,调整方向后插入颈内动脉,线栓插入深度为线栓头端到黑色标记处,长约17-19mm。栓塞90min后,再小心将线栓拨出。缝好皮肤,涂抹络合碘,术后放置在电热毯上,对SD大鼠进行保温处理。
假手术建模:进行缺血手术操作,线栓从颈外动脉插入颈内动脉后迅速拔出不留置线栓。
检测指标采用ZeaLonga方法进行神经功能缺失评分:
0分,没有任何神经功能缺失;
1分,明显可见SD大鼠左前肢内收,前爪不能外展;
2分,明显可见SD大鼠向左侧未缺血侧成追尾状地转圈;
3分,明显可见SD大鼠向左侧未缺血侧成倾倒状;
4分,明显可见SD大鼠的意识障碍,无自主行走。
该检测指标用于评价SD大鼠MCAO缺血模型是否成功,缺血动物选择1-2分作为实验动物。
另一指标为TTC染色:TTC染料参与正常组织中的琥珀酸脱氢反应呈红色。缺血组织内蛋白变性坏死,脱氢酶活性显著下降,无法发生琥珀酸脱氢反应,因此不呈现红色而呈白色。TTC染色可以检测哺乳动物组织的缺血梗死程度。
染色步骤如下:
1.冰上快速提取完整的脑组织放入一次性细胞培养皿中。
2.将组织放入-20℃冰箱中20min。
3.将组织放在室温中数秒,等待脑组织的硬度稍微变软
4.用刀片在冠状面截取8等分的脑片,每片2mm。
5.将TTC染料倒入培养皿中,使脑片悬浮在液体中,脑片上表面和下表面都需接触TTC液体。
6.放入37℃恒温箱中15min-20min(避光)。
7.取出后倾倒染料,用生理盐水漂洗后换上4%PFA4℃固定过夜。
8.第二天取出用扫瞄仪进行数据图像采集并采用ImageJ软件分析梗死体积(梗死体积=[(VC-VL)/VC],VC是对照半球体积,,VL是损伤半球非梗死体积)。
四、实验结果
结果可见图4,注射生理盐水的脑缺血大鼠,梗死体积为0.3369±0.023;注射GCF10mg/kg,梗死体积是0.023±0.004;注射6mg/kg依达拉奉,梗死体积为0.1373±0.021;相对于静脉给生理盐水和依达拉奉组,给GCF三肽药组有更低的梗死体积,并且有统计学意义(p<0.05)。表明GCF三肽可改善脑卒中,且作用明显优于临床用药依达拉奉(见表1,附图2)。
表1GCF三肽对缺血大鼠的保护作用及与依达拉奉的比较
组别 | 剂量mg/kg | n | 梗死体积 |
模型组 | 6 | 0.3369±0.023 | |
模型+GCF组 | 10 | 6 | 0.023±0.004*** |
模型+依达拉奉组 | 6 | 6 | 0.1373±0.021* |
与模型组相比,***P<0.01,*P<0.05。
【实施例5】甘氨酸--L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽注射液制备
甘氨酸--L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽注射液,100g甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽冻干粉分装到1000个已灭菌的管制冻干瓶中,真空封瓶,储存于-20或-80℃,每瓶含甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽100mg,用氯化钠注射液或5%葡萄糖溶解,静脉缓慢滴注。
Claims (5)
1.甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽,其特征在于,三肽的结构式为
2.权利要求1所述的甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒中的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒中的药物中的应用,其特征在于,甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽的动物给药量为4mg/kg·d~300mg/kg·d。
4.根据权利要求2或3所述的甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒中的药物中的应用,其特征在于,所述的治疗脑卒中的药物为注射剂。
5.根据权利要求4所述的甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒中的药物中的应用,其特征在于,其中甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在用于治疗脑卒中时采用静脉给药的方式给药。
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