CN108727208A - 一种连接子化合物、聚乙二醇-连接子结合物及其衍生物和聚乙二醇-连接子-药物结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种连接子化合物、聚乙二醇‑连接子结合物及其衍生物和聚乙二醇‑连接子‑药物结合物。所述的连接子化合物及其与聚乙二醇的结合物及其衍生物，可用于修饰药物，且修饰反应简单，容易进行，反应产率较高，修饰药物的适用范围较宽。修饰后的药物在体内从结合物链上逐渐降解，可在病灶(例如患癌)部位停留更长时间，达到缓释和控释的目的，可降低给药频率，大大提高药物的生物利用度和病人的依从性。

Description

一种连接子化合物、聚乙二醇-连接子结合物及其衍生物和聚 乙二醇-连接子-药物结合物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种连接子化合物、聚乙二醇-连接子结合物及其衍生物、聚乙二醇-连接子-药物结合物及其药物组合物和应用。
背景技术
目前，在临床上，很多药物由于不适宜口服等原因(如多肽、蛋白类药物口服给药时，进入消化道后，会受各种蛋白酶、肽酶等水解环境破坏，药效降低甚至丧失，如某些药物对胃部有刺激性或不耐酸，易被胃酸破坏)，其主要给药途径为注射给药，直接注入人体组织或血管，不经过消化系统和肝脏，不会受到消化液的破坏和食物的影响，药物吸收快，血药浓度升高迅速，给药剂量精确，但在临床应用中，由于注射给药后药物常常会迅速分布全身，对病灶部位如肿瘤组织的靶向性较差，生物利用度不高，药效相对不高，且不良反应出现迅速，应对处理相对困难，另外，常常需要多次给药，且给药时需严格遵守无菌操作原则，需专业人士如医生和护士来操作，不利于病人的依从性，因此药物的临床应用常常遭遇瓶颈。
现有技术中科研人员常利用水溶性聚合物如聚乙二醇修饰连接药物，来延长药物的生理半衰期，降低药物的免疫原性和毒性，但药物在体内的释放和药效有时并不理想。实验中发现通过连接子(linker)将水溶性聚合物和药物连接形成聚合物-药物结合物，药物从结合物链上的降解，可以达到缓释和控释的目的，药物在病灶(例如患癌)部位停留更长时间，可降低给药频率，减少患者用药不便。如专利文献CN200680029849.5公开了一种轭合物，其中包括含有可电离氢原子的芳香族部分如芴、间隔部分和水溶性聚合物。
本申请的发明人经过大量的试验和研究，得到一种连接子化合物及其与聚乙二醇的结合物及其衍生物，其用于修饰药物时，修饰反应简单，易进行，反应产率较高，修饰药物的适用范围较宽，且修饰后的药物在体内释放速度和药效理想，可降低给药频率，大大提高药物的生物利用度和病人的依从性。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种连接子化合物。
本发明的另一个目的是提供一种亲水聚合物(如聚乙二醇)与上述连接子的结合物及其衍生物。
本发明的另一个目的是提供一种聚乙二醇-连接子-药物的结合物。
本发明的另一个目的是提供包含上述结合物及其与药学上可接受的载体或添加剂的药物组合物。
本发明的还一个目的是提供一种上述结合物、药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
本发明一方面提供一种连接子化合物L，其具有通式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3的结构：
其中，l为1-5的整数，
Z选自：-H、羟基保护基团，
A选自：氨基酸残基、多肽残基、-(CH2)i-、-NHCO(CH2)i-、-CONH(CH2)i-、-(CH2)iNH-和-CO(CR15R16)iNH-中的一种或多种的组合，i为0-6的整数，
所述氨基酸选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，
R1-7、R9-11独立地选自：-H、-F、-Cl、-Br、-I、C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、C3-6的环烷基、C1-6的烯基、C6-12的芳基、C6-12芳烷基、C3-12芳族或非芳族的杂环基、C3-12的杂环烷基和-(CH2)l-O-Z，
R8和R12独立地选自C1-6的烷基，
R13-16独立地选自：-H、C1-6的烷基，
B为连接基团-B1-B2-，
其中，B1选自：-(CH2)j-、-NHCO(CH2)j-和-CONH(CH2)j-，j为0-6的整数，
B2选自：-C＝O、-C＝S、-O-、-S-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-和-S-S-。
所述的连接子化合物中，所述的l为1、2、3、4或5，优选为1、2或3；更优选为1。
所述的连接子化合物中，本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的羟基保护基团如-CH3、-C(CH3)3、-CH2OCH3、-COCH3、-COC(CH3)3、-CH2CH＝CH2、-Si(CH3)3、 等。
在本发明的一个实施例中，所述的Z为-H。
本发明的一个实施例中，所述的连接子化合物中，所述A为氨基酸残基，所述氨基酸优选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸，更优选自：甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸。
本发明的另一个实施例中，所述的连接子化合物中，所述A为优选为本发明的一个具体实施例中，所述的A为
在本发明的另一个实施例中，所述的连接子化合物中，所述的A为-(CH2)i-、-(CH2)iNH-和-CO(CR15R16)iNH-中的一种或多种的组合。
优选地，所述的连接子化合物中，所述的R1-7、R9-11独立地选自：-H、-F、-Cl、-Br、-I、C1-6的烷基、C1-6的烷氧基和-(CH2)l-O-Z；更优选自：-H、-F、-Cl、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-OCH3和-(CH2)l-O-Z；进一步优选自：-H、-F、-Cl、-CH3、-OCH3和-(CH2)l-O-Z。
在本发明的一个实施例中，所述的R1-4均为-H。
在本发明的一个实施例中，所述的R5-7均为-H。
在本发明的一个实施例中，所述的R9-11均为-H。
优选地，所述的连接子化合物中，所述R8和R12独立地选自C1-4的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基；更优选地，所述R8和/或R12为甲基。
优选地，所述的连接子化合物中，R13-16独立地选自：-H、C1-3的烷基(如甲基、乙基、正丙基、异丙基)。
优选地，所述R15为-H，R16选自：-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。
在本发明的一个实施例中，所述的R13和/或R14为-H。
优选地，所述的连接子化合物中，i为0-3的整数，如0、1、2或3。
优选地，所述的连接子化合物中，j为0-3的整数，如0、1、2或3。
在本发明的一个实施例中，式Ⅰ-1中，所述A为-COCH2NH-、-COCH(CH3)NH-、-COCH(CH(CH3)2)NH-。
优选地，B2选自：-C＝O、-O-、-S-、-C(O)O-、-C(O)S-和-S-S-。
在本发明的一个实施例中，所述的B2为-C(O)O-或-O-。
在本发明另一个实施例中，所述的B为-(CH2)jO-，j为0-3的整数，如0、1、2或3。
在本发明的一个实施例中，上式Ⅰ-2、Ⅰ-3中，所述-B-A-为-OCH2CH2NH-。
在本发明的一个实施例中，所述连接子化合物具有如下结构：
本发明另一方面还提供一种聚乙二醇-连接子结合物，其具有如下结构：
PEG-X-L
(Ⅱ)
其中，L为本发明上述连接子，
PEG为聚乙二醇残基，
X为连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aOCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-(CH2)aSO2-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-、-O(CH2)aOCO-、-O(CH2)aNHCO-和-O(CH2)aSO2-中的一种或多种的组合，a为0-10的整数。
在本发明一个实施例中，所述聚乙二醇-连接子结合物具有如下结构：
其中，上式Ⅱ-1～Ⅱ-3中，所述R1-12、l、A、B、Z等具有本发明上述定义。
在本发明的一个实施例中，所述聚乙二醇-连接子结合物中，所述X选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-和-O(CH2)aNHCO-中的一种或多种的组合，优选为-(CH2)a-、-(CH2)aCO-或-(CH2)aNHCO-。
优选地，所述聚乙二醇-连接子结合物中，a为0-5的整数，如0、1、2、3、4或5。
在本发明的一个具体实施例中，所述聚乙二醇-连接子结合物中，所述X为单键、-CH2-、-CO-、-CH2CO-或-NHCO-。
优选地，所述聚乙二醇-连接子结合物中，所述PEG为直链、Y型、多分支的聚乙二醇残基，例如包括单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、直链双端PEG、Y型PEG、4臂支链PEG、6臂支链PEG或8臂支链PEG等。
在本发明一具体实施方式中，所述聚乙二醇-连接子结合物中，所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅲ或Ⅳ所示的结构：
其中，p和q独立地选自1-960的整数，优选为1-480的整数。
在本发明一具体实施方式中，所述聚乙二醇-连接子结合物中，所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅴ或Ⅵ所示的结构：
其中，i和h独立地选自1-480的整数，优选为1-240的整数。
在本发明一具体实施方式中，所述聚乙二醇-连接子结合物中，所述PEG为多分支聚乙二醇残基，具有通式Ⅶ所示的结构：
其中，k是1-320的整数，优选为1-240的整数，
j是3-8的整数，
R是多分支聚乙二醇的核心分子，R选自：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甲基葡萄糖苷、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油和聚甘油的残基；优选地，R选自：季戊四醇、二聚季戊四醇和三聚季戊四醇。
在本发明一个优选实施例中，所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
其中，k是1-320的整数，优选为1-240的整数，
x为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，优选为1-6的整数。在本发明另一个优选实施例中，所述多分支聚乙二醇残基具有如下结构：
其中，k是1-320的整数，优选为1-240的整数，更优选为1-120的整数，
y为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，优选为1-5的整数，更优选为1-3的整数。
在本发明的一个实施例中，所述的PEG的分子量可为1-100KDa，例如1-10KDa(具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10KDa)、10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、40、45、50KDa)、50-100KDa(具体可为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100KDa)等；进一步优选为10-50KDa。
在本发明的一个实施例中，所述聚乙二醇-连接子结合物具有如下结构：
上式Ⅱ-a～Ⅱ-e中，所述PEG、X具有本发明上述定义。
优选地，上式Ⅱ-a～Ⅱ-e中，所述PEG具有本发明上述通式Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ(如Ⅶ-1、Ⅶ-2)的结构。
优选地，上式Ⅱ-a～Ⅱ-e中，所述PEG的分子量为10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、40、45或50KDa)。
优选地，上式Ⅱ-a～Ⅱ-e中，所述X为-CH2CO-、-CO-或-CH2-。
本发明另一方面还提供一种聚乙二醇-连接子结合物衍生物，其具有如下结构：
PEG-X-L-P-Q
(Ⅷ)
其中，L为本发明上述连接子，
PEG为聚乙二醇残基，
X为PEG与L的连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aOCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-(CH2)aSO2-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-、-O(CH2)aOCO-、-O(CH2)aNHCO-和-O(CH2)aSO2-中的一种或多种的组合，a为0-10的整数，
P为L与封端基Q的连接基团，选自：-(CH2)r-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合，r为0-10的整数，
Q为封端基，选自：C1-C6的烷氧基、羟基、氨基、羧基、巯基、酯基、酮基、醛基、邻二硫吡啶基、叠氮基、酰肼基、炔基、硅烷基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基，
R17和R18独立地选自：-H、C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、C3-6环烷基和C4-10亚烷基环烷基。
在本发明一个实施例中，所述衍生物具有如下结构：
上式Ⅷ-1～Ⅷ-3中，所述R1-12、l、A、B、Z、X等具有本发明上述定义。
在本发明的一个实施例中，所述X选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-和-O(CH2)aNHCO-中的一种或多种的组合，优选为-(CH2)a-、-(CH2)aCO-或-(CH2)aNHCO-。
优选地，a为0-5的整数，如0、1、2、3、4或5。
在本发明的一个具体实施例中，所述X为单键、-CH2-、-CO、-CH2CO-或-NHCO-。
优选地，R17和R18独立地选自：-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3和-OCH2CH2CH3，更优选自：-H、-CH3、-OCH3和-OCH2CH3，在本发明一个优选实施例中，R17为H，R18为-CH3、-OCH3或-OCH2CH3，在本发明一个更优选实施例中，R17为H，R18为-CH3。
在本发明的一个实施例中，所述P选自：-(CH2)r-、-(CH2)rCH(CH3)-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合。
优选地，r为0-5的整数，如0、1、2、3、4或5。
在本发明的一个具体实施例中，所述P选自：单键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合。
在本发明的一个实施例中，所述Q为酯基或酮基。
在本发明的一个具体实施例中，所述的Q中，所述酯基选自： 和-SO2CH2CF3。
在本发明的另一个具体实施例中，所述的Q中，所述酮基选自 -COCH3和-COCH2CH3。
在本发明的一个优选实施例中，所述Q为
在本发明一个具体的实施例中，所述衍生物具有如下结构：
所述衍生物中，所述PEG可为直链、Y型、多分支的聚乙二醇残基，例如包括单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、直链双端PEG、Y型PEG、4臂支链PEG、6臂支链PEG或8臂支链PEG等；优选地，所述PEG具有本发明上述式Ⅲ-Ⅶ的结构。
优选地，所述衍生物中，所述的PEG的分子量可为1-100KDa，例如1-10KDa(具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10KDa)、10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、40、45、50KDa)、50-100KDa(具体可为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100KDa)等；进一步优选为10-50KDa。
在本发明的一个实施例中，所述衍生物具有如下结构：
上式Ⅷ-a～Ⅷ-e中，所述PEG、X具有本发明上述定义。
优选地，上式Ⅷ-a～Ⅷ-e中，所述PEG具有本发明上述通式Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ(如Ⅶ-1、Ⅶ-2)的结构。
优选地，上式Ⅷ-a～Ⅷ-e中，所述PEG的分子量为10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、40、45或50KDa)。
优选地，上式Ⅷ-a～Ⅷ-e中中，所述X为-CH2CO-、-CO-或-CH2-。
本发明另一方面还提供一种聚乙二醇-连接子-药物结合物，其具有如下结构：
(PEG-X-L-Y)n-D
(Ⅸ)
其中，PEG为聚乙二醇残基，
X为PEG与L的连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aOCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-(CH2)aSO2-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-、-O(CH2)aOCO-、-O(CH2)aNHCO-和-O(CH2)aSO2-中的一种或多种的组合，a为0-10的整数，
Y为L与D的连接基团，选自：-(CH2)r-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合，r为0-10的整数，
R17和R18独立地选自：-H、C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、C3-6环烷基和C4-10亚烷基环烷基，
L为本发明上述连接子，
D为含m个胺基的生物学活性剂，m为1-500的整数，
n为整数，且1≤n≤m。
在本发明一个实施例中，所述聚乙二醇-连接子-药物结合物具有如下结构：
上式Ⅸ-1～Ⅸ-3中，所述R1-12、l、A、B、Z、X等具有本发明上述定义。
在本发明的一个实施方式中，所述n＝1，此时通式Ⅸ为PEG-X-L-Y-D。
在本发明的一个实施方式中，所述的D为含胺基的小分子生物学活性剂及其药学上可接受的盐，优选包括：阿霉素、克唑替尼、戈舍瑞林、阿糖胞苷、普鲁卡因、苯佐卡因、氯普鲁卡因、二甲卡因、多巴胺、去甲肾上腺素、克仑特罗、苯乙双胍、达拉匹林、丙舒硫胺、对氨基水杨酸、磺胺嘧啶，及其衍生物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述D为阿霉素或其衍生物，其具有如下结构：
其中，W1选自：-H、-OH、-OCH3和-OCH2CH3；优选为-H或-OCH3，更优选为-OCH3；
W2选自：-H、-OH、-OCO(CH2)5COOH和-OCO(CH2)2NH2；优选为-H或-OH，更优选为-OH；
W3选自：-OH、-OCH3和优选为-OH。
在本发明的一个更具体实施方式中，所述D为阿霉素，具有如下结构：
优选地，所述聚乙二醇-连接子-药物结合物中，所述X选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-和-O(CH2)aNHCO-中的一种或多种的组合，优选为-(CH2)a-、-(CH2)aCO-或-(CH2)aNHCO-。
优选地，所述聚乙二醇-连接子-药物结合物中，a为0-5的整数，如0、1、2、3、4或5。
在本发明的一个具体实施例中，所述聚乙二醇-连接子-药物结合物中，所述X为单键、-CH2-、-CO-、-CH2CO-或-NHCO-。
优选地，R17和R18独立地选自：-H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-OCH3、-OCH2CH3和-OCH2CH2CH3，更优选自：-H、-CH3、-OCH3和-OCH2CH3，在本发明一个优选实施例中，R17为H，R18为-CH3、-OCH3或-OCH2CH3，在本发明一个更优选实施例中，R17为H，R18为-CH3。
在本发明的一个实施例中，所述Y选自：-(CH2)r-、-(CH2)rCH(CH3)-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合。
优选地，r为0-5的整数，如0、1、2、3、4或5。
在本发明的一个具体实施例中，所述Y选自：单键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合。
在本发明的一个具体的实施例中，所述Y为-(CH2)rCO-与单键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合。
在本发明的一个更具体的实施例中，所述聚乙二醇-连接子-药物结合物中，所述Y为-(CH2)rCO-。
在本发明的一个另一个更具体实施例中，所述聚乙二醇-连接子-药物结合物中，所述Y为-CO-。
所述聚乙二醇-连接子-药物结合物中，所述PEG可为直链、Y型、多分支的聚乙二醇残基，例如包括单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、直链双端PEG、Y型PEG、4臂支链PEG、6臂支链PEG或8臂支链PEG等；优选地，所述PEG具有本发明上述式Ⅲ-Ⅶ的结构。
优选地，所述聚乙二醇-连接子-药物结合物中，所述的PEG的分子量可为1-100KDa，例如1-10KDa(具体可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10KDa)、10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、40、45、50KDa)、50-100KDa(具体可为50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100KDa)等；进一步优选为10-50KDa。
在本发明的一个实施例中，所述结合物具有如下结构：
上式Ⅸ-a～Ⅸ-e中，所述PEG、X具有本发明上述定义。
优选地，上式Ⅸ-a～Ⅸ-e中，所述PEG具有本发明上述通式Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ(如Ⅶ-1、Ⅶ-2)的结构。
优选地，上式Ⅸ-a～Ⅸ-e中，所述PEG的分子量为10-50KDa(具体可为10、15、20、25、30、35、40、45或50KDa)。
优选地，上式Ⅸ-a～Ⅸ-e中，所述X为-CH2CO-、-CO-或-CH2-。
优选地，上式Ⅸ-a～Ⅸ-e中，所述D为阿霉素或其衍生物，具有本发明上述通式Ⅹ所示结构；更优选地，所述D为阿霉素，其具有本发明上述通式Ⅹ-1所示结构。
本发明另一方面还提供一种上述聚乙二醇-连接子-药物结合物的药学上可接受的盐、异构体、前药或溶剂化物。
本发明另一方面还提供一种包含上述聚乙二醇-连接子-药物结合物及其药学上可接受的盐、异构体、前药或溶剂化物和药学上可接受的载体或添加剂的药物组合物。
如本文所用，“药学上可接受”一词是指在对人施用后具有生理相容性并且不会引起肠胃失调、诸如头晕的过敏反应或类似反应。添加剂可为赋形剂、崩解剂、粘结剂、润滑剂、悬浮剂、稳定剂等等中的任一种。赋形剂的例子包括乳糖、甘露醇、益寿糖、微晶纤维素、硅化微晶纤维素、粉状纤维素等等。崩解剂的例子包括低取代羟丙基纤维素、交聚维酮、羧基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、淀粉等等。粘结剂的例子包括羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、聚维酮、共聚维酮、预胶凝淀粉等等。润滑剂的例子包括硬脂酸、硬脂酸镁、富马酰硬脂酸钠等等；润湿剂的例子包括聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯蓖麻油衍生物等等。悬浮剂的例子包括羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、聚维酮、共聚维酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素等等。稳定剂的例子包括柠檬酸、富马酸、琥珀酸等等。另外，本发明的药物组合物还可包括阻凝剂、增味剂、乳化剂、防腐剂等等中的任一种。
本发明所述的药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等等)、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂、控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)、气雾剂、膜剂(例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂)、注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)、小药丸、鼻制剂、肺制剂(吸入剂)、眼睛滴剂等等、口服或胃肠外制剂(例如，静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴注、脑内、直肠内等给药形式、给药至肿瘤的附近和直接给药至病变处)。优选地，所述的药物组合物为注射剂。
本发明所述的药学上可接受的辅料优选为药学上可接受的注射剂辅料，例如等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等，或上述盐的混合物)，或干燥的例如是冷冻干燥的组合物，其适当地通过加入无菌水或生理盐水形成可注射溶质。
本发明另一方面还提供一种上述连接子化合物、聚乙二醇-连接子结合物在制备聚乙二醇-连接子结合物衍生物中的应用。
优选地，所述的衍生物为活性酯。
本发明另一方面还提供一种上述连接子化合物、聚乙二醇-连接子结合物及其衍生物在修饰药物中的应用。
优选地，所述的应用为制备聚乙二醇-连接子-药物结合物；
优选地，所述的药物为含胺基的小分子生物学活性剂及其药学上可接受的盐，优选包括：阿霉素、克唑替尼、戈舍瑞林、阿糖胞苷、普鲁卡因、苯佐卡因、氯普鲁卡因、二甲卡因、多巴胺、去甲肾上腺素、克仑特罗、苯乙双胍、达拉匹林、丙舒硫胺、对氨基水杨酸、磺胺嘧啶，及其衍生物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的药物为阿霉素及其衍生物，其具有本发明中上述式Ⅹ的结构；优选为阿霉素，其具有上述式Ⅹ-1的结构。
本发明另一方面还提供一种上述连接子化合物、聚乙二醇-连接子结合物及其衍生物、聚乙二醇-连接子-药物结合物及其药学上可接受的盐、异构体、前药或溶剂化物、药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
本发明中所述的亲水聚合物-连接子结合物及其衍生物及药物结合物中，所述的亲水聚合物均列举为聚乙二醇，但本领域技术人员也可以根据实际需要选择其他富含亲水基团、具有良好生物相容性的有机聚合物，如淀粉、蛋白质等天然高分子、或聚丙烯酸、聚丙二醇等合成高分子，等。
本发明提供的连接子化合物及其与聚乙二醇的结合物及其衍生物，可用于修饰药物，且修饰反应简单，容易进行，反应产率较高，修饰药物的适用范围较宽。修饰后的药物在体内从结合物链上逐渐降解，可在病灶(例如患癌)部位停留更长时间，达到缓释和控释的目的，可降低给药频率，大大提高药物的生物利用度和病人的依从性。本发明所述药物结合物中引入了本发明所述连接子的结构，其与通过其他基团或部分连接的聚乙二醇药物结合物相比，具有更佳的缓释效果和药效(如抗肿瘤活性)。
附图说明
图1所示为本发明实施例13提供的抗肿瘤实验结果。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。本发明中术语“生物学活性剂”、“药理学上活性剂”可互换使用，定义为包括提供一些在体内或体外可证明的药理(通常为有益的)作用的任何化合物及其组合物或混合物，如食品、食品补充剂、营养品、药物、蛋白质、疫苗、抗体、维生素及其他有益物质，还包括在患者中产生局部或全身作用的、任何生理学上或药理学上的活性物质。所述“患者”是指患有或易于患有病症的活的有机体，包括人类和动物。本发明中所述的小分子指分子量小于3500Da的生物学活性剂。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的化合物可以商购，也可以根据公开的制备方法进行制备，其并不限制本发明的范围。
实施例中所用的聚乙二醇及其衍生物由北京键凯科技股份有限公司提供，除非指明，分子量均为20K。其他为市售试剂。
实施例1连接链(L)的合成
将BOC-氨基酸(92.2mmol)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC，23.8g，115.3mmol)加到二氯甲烷(500mL)中，冰水浴冷却，再加入对羟基苯甲醇(11.4g，92.2mmol)，加完后撤去冰浴，室温反应过夜。过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液蒸干得粗品，柱层析纯化后得到产物1。
1a:19.7g，收率76.0％。1H NMR:(CDCl3)：8.75(s,1H),7.22(d,2H),7.05(d,2H),4.87(s,2H),3.74(s,2H),1.52(s,9H)。
1b:20.3g，收率74.8％。1H NMR:(CDCl3)：8.74(s,1H),7.21(d,2H),7.05(d,2H),4.88(s,2H),3.77(m,1H),1.51(s,9H),1.27(d,3H)。
1c:21.6g，收率72.5％。1H NMR:(CDCl3)：8.75(s,1H),7.22(d,2H),7.05(d,2H),4.87(s,2H),3.61(d,1H),2,82(m,1H),1.52(s,9H),1.06(d,6H)。
将化合物1(39.1mmol)溶于二氯甲烷(250mL)中，加入三氟乙酸(50mL)，加完后室温搅拌过夜，浓缩，残分中加入二氯甲烷，再蒸干，反复三次，最后加乙醚沉淀，过滤，得产物L。
L1:11.1g，收率96.7％。
L2:11.6g，收率97.1％。
L3:12.7g，收率96.3％。
实施例2单甲氧基聚乙二醇乙酸与连接链的结合物(mPEG-L(40K))的合成
将单甲氧基聚乙二醇-乙酸(mPEG-CM，40K，5g，0.125mmol)、化合物L(0.25mmol，实施例1制备)
和1-羟基苯并三氮唑(HOBt，16.9mg，0.125mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷溶解，再加入二异丙基乙基胺(45.2mg，0.35mmol)，搅拌均匀，冰浴冷却后分批加入(EDCI，47.9mg，0.25mmol)，加完后体系自然升到室温，反应过夜。次日浓缩后残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥后得产品mPEG-L。
mPEG-L1(40K):4.6g，收率92.4％。
mPEG-L2(40K):4.5g，收率90.8％。
mPEG-L3(40K):4.7g，收率93.7％。
实施例3单甲氧基聚乙二醇-阿霉素结合物(mPEG-L-Dox(40K))的制备
将化合物mPEG-L(0.075mmol，实施例2制备)加到反应瓶中，用二氯甲烷(30mL)溶解，N2保护下冷却，加入琥珀酰亚胺碳酸酯(23.0mg，0.09mmol)，搅拌溶解后再加入三乙胺(10.1mg，0.1mmol)，加完后撤去冷浴，室温反应过夜。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得产品mPEG-L-NHS。
mPEG-L1-NHS(40K):2.6g，收率88.5％。
mPEG-L2-NHS(40K):2.7g，收率89.2％。
mPEG-L3-NHS(40K):2.6g，收率87.9％。
将化合物mPEG-L-NHS(0.06mmol，上述步骤制备)溶于二氯甲烷(25mL)中，N2保护下冷却，加入二异丙基乙基胺(12.9mg，0.1mmol)，搅拌均匀后再加入盐酸阿霉素(52.2mg，0.09mmol)，加完后室温搅拌5小时。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥得红色固体产品。
mPEG-L1-Dox(40K)：2.0g，收率84.9％。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.84(s,1H),8.68(S,1H),7.62(m,1H),7.53(d,1H),7.33(d,2H),7.16(d,3H),5,52(s,2H),5.12(t,1H),4.83(s,2H),4.61(s,2H),4.47(s 2H),4.32(t,1H),4.06(m,1H),3.96(m,1H),3.89(m,1H),3.65(m,3600H),3.41(m,5H),3.27(m,1H),2.28(d,2H),2.05(d,2H)。
mPEG-L2-Dox(40K)：2.1g，收率85.7％。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.82(s,1H),8.67(S,1H),7.62(m,1H),7.53(d,1H),7.33(d,2H),7.16(d,3H),5,52(s,2H),5.12(t,1H),4.83(s,2H),4.59(d,1H),4.47(s 2H),4.32(t,1H),4.06(m,1H),3.96(m,1H),3.89(m,1H),3.65(m,3600H),3.41(m,5H),3.27(m,1H),2.28(d,2H),2.05(d,2H),1.58(d,3H)。
mPEG-L3-Dox(40K)：2.1g，收率84.6％。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.83(s,1H),8.65(S,1H),7.62(m,1H),7.53(d,1H),7.33(d,2H),7.16(d,3H),5,52(s,2H),5.12(t,1H),4.83(s,2H),4.54(d,1H),4.47(s 2H),4.32(t,1H),4.06(m,1H),3.96(m,1H),3.89(m,1H),3.65(m,3600H),3.41(m,5H),3.27(m,1H),2.28(d,2H),2.05(d,2H),1.34(d,3H),1.16(d,6H)。
实施例4聚乙二醇乙酸与连接链L3的结合物(PEG-L3(20K))的制备
将聚乙二醇-乙酸(PEG-CM，20K，5g，0.25mmol)、化合物L3(168.5mg，0.5mmol)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt，67.6mg，0.5mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷溶解，再加入二异丙基乙基胺(193.6mg，1.5mmol)，搅拌均匀，冰浴冷却后分批加入(EDCI，191.7mg，1mmol)，加完后体系自然升到室温，反应过夜。次日浓缩后残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥后得产品PEG-L3(20K)4.8g，收率96.0％。
实施例5聚乙二醇乙酸与连接链L3及阿霉素的结合物(PEG-L3-Dox(20K))的制备
将化合物PEG-L3(2g，0.1mmol，实施例4制备)加到反应瓶中，用二氯甲烷(40mL)溶解，N2保护下冷却，加入琥珀酰亚胺碳酸酯(51.2mg，0.2mmol)，搅拌溶解后再加入三乙胺(30.3mg，0.3mmol)，加完后撤去冷浴，室温反应过夜。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得产品PEG-L3-NHS(20K)1.8g，收率88.5％。
将化合物PEG-L3-NHS(1.6g，0.08mmol，上述步骤制备)溶于二氯甲烷(30mL)中，N2保护下冷却，加入二异丙基乙基胺(19.4mg，0.15mmol)，搅拌均匀后再加入盐酸阿霉素(69.6mg，0.12mmol)，加完后室温搅拌5小时。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥得红色固体产品PEG-L3-Dox(20K)1.3g，收率81.2％。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.81(s,2H),8.68(S,2H),7.62(m,2H),7.53(d,2H),7.33(d,8H),7.16(d,4H),5,52(s,4H),5.12(t,2H),4.83(s,4H),4.54(d,2H),4.32(t,2H),4.06(m,2H),3.96(s,6H),3.71(m,2H),3.67(m,1800H),3.41(s,4H),3.27(m,2H),2,97(m,2H),2.39(S,4H),2.28(d,4H),2.05(d,4H),1.34(d,6H),1.16(d,12H)。
实施例6 4arm-PEG-乙酸-L3(20K)的制备
将4arm-PEG-乙酸(20K，5g，0.25mmol)、化合物L3(674mg，2.0mmol)和1-羟基苯并三氮唑(HOBt，135.1mg，1mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷溶解，再加入二异丙基乙基胺(129.1mg，1.0mmol)，搅拌均匀，冰浴冷却后分批加入(EDCI，191.7mg，1mmol)，加完后体系自然升到室温，反应过夜。次日浓缩后残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥后得产品4arm-PEG-乙酸-L3(20K)：4.7g，收率94.0％。
实施例7 4arm-PEG-乙酸-L3-Dox(20K)的制备
将化合物4arm-PEG-乙酸-L3(2g，0.1mmol，实施例6制备)加到反应瓶中，用二氯甲烷(40mL)溶解，N2保护下冷却，加入琥珀酰亚胺碳酸酯(1.02g，0.4mmol)，搅拌溶解后再加入三乙胺(60.6mg，0.6mmol)，加完后撤去冷浴，室温反应过夜。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得产品4arm-PEG-乙酸-L3-NHS(20K)1.8g，收率90.0％。
将化合物4arm-PEG-乙酸-L3-NHS(1.5g，0.075mmol，上述步骤制备)溶于二氯甲烷(30mL)中，N2保护下冷却，加入二异丙基乙基胺(77.5mg，0.6mmol)，搅拌均匀后再加入盐酸阿霉素(261mg，0.45mmol)，加完后室温搅拌5小时。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥得红色固体产品4arm-PEG-乙酸-L3-Dox(20K)1.3g，收率86.7％。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.82(s,4H),8.67(s,4H),7.62(m,4H),7.53(d,4H),7.33(d,8H),7.16(d,12H),5,51(s,8H),5.12(t,4H),4.83(s,8H),4.55(t,4H),4.33(m,12H),4.06(m,4H),3.95(s,12H),3.67(m,1800H),3.55(t,8H),3.47(s,4H),3.28(m,4H),3.08(m,4H),2.27(d,8H),2.04(m,8H),1.68(t,8H),1.42(d,12H),1.16(d,24H)。
实施例8 8arm-PEG-L4-NHS(20K)的制备
8-arm-PEG-N3(20K，2g，0.1mmol)、化合物L4(参照中国专利申请CN201510354709.6中所述方法制备，220mg，1mmol)、维生素C(440mg，2.5mmol)加到N，N-二甲基甲酰胺(20mL)中，快速搅拌使其溶解，然后加入五水合硫酸铜(250mg，1mmol)的水溶液(4.4mL，2.2mL/g PEG)，室温反应过夜，用异丙醇沉淀得到1.8g产物。
将化合物8arm-PEG-L4(2g，0.1mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷(40mL)溶解，N2保护下冷却，加入琥珀酰亚胺碳酸酯(1.02g，0.4mmol)，搅拌溶解后再加入三乙胺(60.6mg，0.6mmol)，加完后撤去冷浴，室温反应过夜。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得产品8arm-PEG-L4-NHS(20K)1.7g，收率85％。
实施例9 8arm-PEG-L4-Dox(20K)的制备
将化合物8arm-PEG-L4-NHS(20K，1.5g，0.075mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，N2保护下冷却，加入二异丙基乙基胺(77.5mg，0.6mmol)，搅拌均匀后再加入盐酸阿霉素(261mg，0.45mmol)，加完后室温搅拌5小时。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥得红色固体产品8arm-PEG-L4-Dox(20K)1.4g，收率93.3％。
实施例10连接链L5的制备
化合物(2)的合成
3,4-二羟基苯甲醛(10g，72.5mmol)溶于乙腈(150mL)中，加入碳酸氢钠(8g，94.3mmol)，升温至60℃，加入溴苄(12.4g，72.5mmol)，然后升温至80℃搅拌过夜。浓缩除去乙腈，残分中加入10％盐酸水溶液(200mL)，用乙酸乙酯萃取(150mL*3)，合并后干燥，过滤，浓缩，残分用柱层析纯化得灰白色固体10g(收率60％)。1H NMR:(CDCl3)：δ9.82(s,1H),7.48-7.40(m,7H),7.05(m,1H),6.02(s,1H),5.21(s,2H)。
化合物(3)的合成
化合物(2)(5g，21.9mmol)溶于DMF(80mL)中，加入碳酸钾(7.6g，54.75mmol)，碘化钾(0.73g，4.38mmol)，搅拌10分钟，加入ATN-1(9g，28.47mmol)，升至70℃搅拌过夜。后处理，往反应液中加入氯化铵饱和溶液(400mL)，用乙酸乙酯萃取(150mL*3)，合并后干燥，过滤，浓缩，残分用柱层析纯化得白色固体5g(收率61％)。1H NMR:(CDCl3)：δ9.85(s,1H),7.47-7.36(m,7H),7.03(m,1H),5.24(s,2H),5.07(s,1H),4.17(m,2H),3.59(m,2H),1.46(s,9H)。
化合物(4)的合成
将化合物(3)(5g，13.5mmol)溶于四氢呋喃(100mL)中，室温加入硼氢化钠(0.77g，20.25mmol)，室温搅拌2小时后冷却到0℃，加入醋酸(2mL)淬灭反应，减压浓缩除去溶剂，残分用柱层析纯化，得无色油状物4g(收率80％)。1H NMR:(DMSO-d6)：δ7.38-7.05(m,8H),6.80(m,1H),5.09(s,2H),5.06(m,1H),4.40(m,2H),3.98(m,2H),3.31(m,2H),1.38(s,9H)。
化合物(5)的合成
化合物(4)(1g，2.7mmol)溶于甲醇(8mL)中，加入Pd/C(10％，0.3g)，再通入氢气反应过夜。过滤，滤液浓缩，残分用柱层析纯化，得产品0.6g(收率78％).1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.37(s,1H),7.09(s,1H),6.71(s,1H),6.65(d,1H),6.56(d,1H),4.45(s,2H),3.89(m,2H),3.31(m,2H),1.38(s,9H)。
化合物(6)的合成
将化合物(5)(0.6g，2.1mmol)溶于丙酮(7mL)，加入碳酸钾(0.58g，4.2mmol)，体系冷却到0℃，加入醋酸酐(235mg，2.3mmol)，缓慢升至室温反应3小时。后处理，加入氯化铵水溶液(30mL)，乙酸乙酯萃取，合并干燥浓缩，过柱得产物0.5g(收率73％)。1H NMR:(DMSO-d6)：δ7.12(s,1H),6.89(s,1H),6.65(d,1H),6.56(d,1H),4.45(s,2H),3.89(m,2H),3.31(m,2H),2.14(s,3H),1.38(s,9H)。
化合物(L5)的合成
将化合物(6)(0.5g，1.5mmol)溶于二氯甲烷(7mL)中，加入三氟乙酸(4ml),室温搅拌1小时。浓缩除去溶剂，残分中加入乙醚，有固体析出，过滤，干燥得固体产物0.3g，收率86％。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.30(s,1H),6.89(s,1H),6.65(d,1H),6.56(d,1H),4.45(s,2H),3.85(m,2H),3.29(m,2H),2.12(s,3H)。
实施例11单甲氧基聚乙二醇乙酸与连接链的结合物(mPEG-L5-NHS(20K))的合成
mPEG-L5的合成
将mPEG(20K)-CM-NHS(2g，0.1mmol)溶于无水二氯甲烷中，低温冷却至0℃，加入DIPEA(78mg，0.6mmol)，然后加入化合物L5，缓慢升至室温搅拌过夜。反应液浓缩后残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥后得产品mPEG-L5(1.8g，90％)。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.10(s,1H),6.85(s,1H),6.72(d,1H),6.65(d,1H),5.34(s,2H),4.20(m,2H),3.65(m,1800H),3.51(m,2H),3.24(s,3H),2.78(m,4H),2.12(s,3H)。
mPEG-L5-NHS的合成
将化合物mPEG-L5(1g，0.05mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷(6mL)溶解，N2保护下冷却，加入琥珀酰亚胺碳酸酯(19.0mg，0.075mmol)，搅拌溶解后再加入DIPEA(12.9mg，0.1mmol)，加完后撤去冷浴，室温反应过夜。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得产品mPEG-L5-NHS(20K)。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.10(s,1H),6.85(s,1H),6.72(d,1H),6.65(d,1H),4.65(s,2H),4.15(m,2H),3.65(m,1800H),3.29(m,2H),3.24(s,3H),2.12(s,3H)。
实施例12 4arm PEG-L5-Dox(20K)的制备
4arm PEG-L5的合成
将4arm PEG(20K)-CM-NHS(2g，0.1mmol)溶于无水二氯甲烷中，低温冷却至0℃，加入DIPEA(78mg，0.6mmol)，然后加入化合物L5，缓慢升至室温搅拌过夜。反应液浓缩后残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥后得产品4arm PEG-L5(1.8g，90％)。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.11(s,4H),6.86(s,4H),6.74(d,4H),6.65(d,4H),5.35(s,8H),4.20(m,8H),3.66(m,1800H),3.52(m,4H),3.24(s,6H),2.78(m,8H),2.13(s,6H)。
4arm PEG-L5-NHS的合成
将化合物4arm PEG-L5(1.5g，0.075mmol，上步制得)加到反应瓶中，用二氯甲烷(30mL)溶解，N2保护下冷却，加入琥珀酰亚胺碳酸酯(68.0mg，0.3mmol)，搅拌溶解后再加入DIPEA(51.6mg，0.4mmol)，加完后撤去冷浴，室温反应过夜。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，得产品4armPEG-L5-NHS(1.4g，93％)。1H NMR:(DMSO-d6)：δ8.12(s,4H),6.85(s,4H),6.72(d,4H),6.65(d,4H),4.65(s,8H),4.15(m,8H),3.65(m,1800H),3.29(m,8H),3.24(s,12H),2.12(s,9H)。
4arm PEG-L5-Dox的合成
将化合物4arm PEG-NHS(1g，0.05mmol，上步制得)加到反应瓶中，用二氯甲烷(20mL)溶解，N2保护下冷却，加入二异丙基乙基胺，搅拌均匀后再加入盐酸阿霉素(348.8mg，0.3mmol)，加完后室温反应过夜。反应液浓缩，残分用异丙醇结晶，抽滤，干燥得棕红色固体产品4arm PEG-L5-Dox(0.84g，84％)。1HNMR:(DMSO-d6)：δ8.81(s,4H),8.67(s,4H),7.63(m,4H),7.53(d,4H),7.34(d,8H),7.17(d,12H),5,52(s,8H),5.12(t,4H),4.83(s,8H),4.55(t,4H),4.33(m,12H),4.06(m,4H),3.95(s,12H),3.67(m,1800H),3.55(t,8H),3.47(s,4H),3.28(m,4H),3.09(m,4H),2.26(d,8H),2.05(m,8H),1.66(t,8H),1.43(d,12H),1.17(d,24H)。
实施例13HCT116肿瘤异位移植小鼠模型中肿瘤生长抑制研究
实验目的：
检测药物对HCT116肿瘤异位移植小鼠模型的肿瘤生长抑制作用。
药物分组：
G1：溶媒；
G2：阳性药物阿霉素(市售)；
G3：4arm PEG-L5-Dox(实施例12制备)。
实验方法：
细胞培养：
收到HCT116细胞(市售)后吸除原培养液，加入10mL新鲜的培养液。当细胞达到～90％的汇合时收集细胞，进行传代。移除培养液后加入10mL EDTA/PBS溶液，室温放置5min，吸去EDTA/PBS溶液，将3mL 0.25℅的胰酶(37℃)混匀铺在细胞表面，然后立即吸除并将已无介质的培养瓶放入培养箱直至细胞从培养瓶壁分离(5min)。加入20mL含10％FBS的DMEM并轻轻吹打将细胞混匀。用计数板记数并用10％FBS的DMEM稀释，将40mL细胞悬液转移至150mm的细胞培养皿，然后放于培养箱。隔天换液，当细胞达到～80％的汇合后传代，传代方法同上。
接种细胞悬液制备：
细胞接种当天检查细胞达到～80％的汇合，提前换液。3小时后用吸量管移去培养液后，每个皿加入20mLEDTA/PBS溶液，室温放置5min，吸去EDTA/PBS溶液，将3mL 0.25℅的胰酶(37℃)混匀铺在细胞表面，然后立即吸除并将已无介质的培养瓶放入培养箱直至细胞从培养瓶壁分离(5min)。加入20mL含10％FBS的DMEM并轻轻吹打将细胞混匀。将细胞悬液转移将离心管室温离心5min后，移去上清，再加入无血清的DMEM轻轻混匀，,再次离心，移去上清，加入少量冰冷PBS轻轻混匀。用计数板记数并用PBS稀释至2×107细胞/Ml，放置于冰上直至接种。
肿瘤接种：
小鼠右前腋皮下接种HCT116细胞，每只动物接种200μLPBS细胞悬液，总共接种30只动物，接种后每周测量2次肿瘤体积，当平均肿瘤体积达100-200mm3时挑选18只肿瘤大小接近的动物，随机分为3组，每组6只动物。分组后24内小时开始给药，每次给药前称量动物体重以调整给药量。最后一次给药以后继续观察测量动物，每周测量2次体重及肿瘤大小，肿瘤体积(mm3)计算按公式：V＝0.5(a×b2)，其中a代表长径，b代表宽径。某组动物肿瘤平均体积大于2000mm3即处死改组动物。组间肿瘤大小的差异将使用t检验比较，P<0.05将视为统计学意义上的差异。
实验结果：
实验结果如图1所示，阳性药物阿霉素和化合物4armPEG-L5-Dox均有明显的抗肿瘤效果，并且化合物4arm PEG-L5-Dox的效果比阿霉素更佳，且随着给药时间延长，效果差距更大，这很可能与化合物4armPEG-L5-Dox中阿霉素以聚乙二醇为载体，可使药物在肿瘤部位停留更长时间并可达到缓释控释效果有关。给药过程中动物体重下降可以接受，该化合物有进一步研究的价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (23)

1.一种连接子化合物L，其具有通式Ⅰ-1、Ⅰ-2或Ⅰ-3的结构：
其中，l为1-5的整数，
Z选自：-H、羟基保护基团，
A选自：氨基酸残基、多肽残基、-(CH2)i-、-NHCO(CH2)i-、-CONH(CH2)i-、-(CH2)iNH-和-CO(CR15R16)iNH-中的一种或多种的组合，i为0-6的整数，
所述氨基酸选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，
R1-7、R9-11独立地选自：-H、-F、-Cl、-Br、-I、C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、C3-6的环烷基、C1-6的烯基、C6-12的芳基、C6-12芳烷基、C3-12芳族或非芳族的杂环基、C3-12的杂环烷基和-(CH2)l-O-Z，R8和R12独立地选自C1-6的烷基，
R13-16独立地选自：-H、C1-6的烷基，
B为连接基团-B1-B2-，
其中，B1选自：-(CH2)j-、-NHCO(CH2)j-和-CONH(CH2)j-，j为0-6的整数，
B2选自：-C＝O、-C＝S、-O-、-S-、-C(O)O-、-C(O)S-、-C(S)O-和-S-S-。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述A为氨基酸残基，所述氨基酸选自：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸，优选自：甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸；或，
所述A为或
所述的A为-(CH2)i-、-(CH2)iNH-和-CO(CR15R16)iNH-中的一种或多种的组合。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，式Ⅰ-1中，所述A为-COCH2NH-、-COCH(CH3)NH-、COCH(CH(CH3)2)NH-；和/或，式Ⅰ-2或Ⅰ-3中，所述-B-A-为-OCH2CH2NH-。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述连接子化合物具有如下结构：
5.一种聚乙二醇-连接子结合物，其具有如下结构：
PEG-X-L
(Ⅱ)
其中，L为权利要求1-4任一项所述的连接子化合物，
PEG为聚乙二醇残基，
X为连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aOCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-(CH2)aSO2-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-、-O(CH2)aOCO-、-O(CH2)aNHCO-和-O(CH2)aSO2-中的一种或多种的组合，a为0-10的整数。
6.如权利要求5所述的结合物，其特征在于，所述X为单键、-CH2-、-CO-、-CH2CO-或-NHCO-。
7.如权利要求5所述的结合物，其特征在于，所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅲ或Ⅳ所示的结构：
其中，p和q独立地选自1-960的整数，优选为1-480的整数；
或，
所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅴ或Ⅵ所示的结构：
其中，i和h独立地选自1-480的整数，优选为1-240的整数；
或，
所述PEG为多分支聚乙二醇残基，具有通式Ⅶ所示的结构：
其中，k是1-320的整数，优选为1-240的整数，
j是3-8的整数，
R是多分支聚乙二醇的核心分子，R选自：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甲基葡萄糖苷、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油和聚甘油的残基；优选地，R选自：季戊四醇、二聚季戊四醇和三聚季戊四醇。
8.如权利要求7所述的结合物，其特征在于，所述的PEG的分子量为1-100KDa，优选为10-50KDa。
9.如权利要求5-8任一项所述的结合物，其特征在于，所述结合物具有如下结构：
10.一种聚乙二醇-连接子结合物衍生物，其具有如下结构：
PEG-X-L-P-Q
(Ⅷ)
其中，L为权利要求1-4任一项所述的连接子化合物，
PEG为聚乙二醇残基，
X为PEG与L的连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aOCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-(CH2)aSO2-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-、-O(CH2)aOCO-、-O(CH2)aNHCO-和-O(CH2)aSO2-中的一种或多种的组合，a为0-10的整数，
P为L与封端基Q的连接基团，选自：-(CH2)r-、(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合，r为0-10的整数，
Q为封端基，选自：C1-C6的烷氧基、羟基、氨基、羧基、巯基、酯基、酮基、醛基、邻二硫吡啶基、叠氮基、酰肼基、炔基、硅烷基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基，
R17和R18独立地选自：-H、C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、C3-6环烷基和C4-10亚烷基环烷基。
11.如权利要求10所述的衍生物，其特征在于，所述的Q为酯基或酮基；
优选地，所述酯基选自： 和-SO2CH2CF3；
优选地，所述酮基选自：-COCH3和-COCH2CH3。
12.如权利要求10所述的衍生物，其特征在于，所述X为单键、-CH2-、-CH2CO-或-NHCO-；和/或，
所述P选自：单键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH(CH3)-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rSH-、 中的一种或多种的组合；和/或，
所述Q为
13.如权利要求10所述的衍生物，其特征在于，所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅲ或Ⅳ所示的结构：
其中，p和q独立地选自1-960的整数，优选为1-480的整数；
或，
所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅴ或Ⅵ所示的结构：
其中，i和h独立地选自1-480的整数，优选为1-240的整数；
或，
所述PEG为多分支聚乙二醇残基，具有通式Ⅶ所示的结构：
其中，k是1-320的整数，优选为1-240的整数，
j是3-8的整数，
R是多分支聚乙二醇的核心分子，R选自：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甲基葡萄糖苷、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油和聚甘油的残基；优选地，R选自：季戊四醇、二聚季戊四醇和三聚季戊四醇。
14.如权利要求13所述的结合物，其特征在于，所述的PEG的分子量为1-100KDa，优选为10-50KDa。
15.如权利要求10-14任一项所述的衍生物，其特征在于，所述衍生物具有如下结构：
16.一种聚乙二醇-连接子-药物结合物，其具有如下结构：
(PEG-X-L-Y)n-D
(Ⅸ)
其中，PEG为聚乙二醇残基，
X为PEG与L的连接基团，选自：-(CH2)a-、-(CH2)aCO-、-(CH2)aOCO-、-(CH2)aNHCO-、-NH(CH2)aCO-、-(CH2)aSO2-、-O(CH2)a-、-O(CH2)aCO-、-O(CH2)aOCO-、-O(CH2)aNHCO-和-O(CH2)aSO2-中的一种或多种的组合，a为0-10的整数，
Y为L与D的连接基团，选自：-(CH2)r-、-(CH2)rO-、-(CH2)rCO-、-(CH2)rNH-、-(CH2)rCONH-、-(CH2)rNHCO-、-(CH2)rSH-、
中的一种或多种的组合，r为0-10的整数，
R17和R18独立地选自：-H、C1-6的烷基、C1-6的烷氧基、C3-6环烷基和C4-10亚烷基环烷基，
L为权利要求1-4任一项所述的连接子化合物，
D为含胺基的生物学活性剂，m为1-500的整数，
n为整数，且1≤n≤m。
17.如权利要求16所述的结合物，其特征在于，所述的D为含胺基的小分子生物学活性剂及其药学上可接受的盐，选自：阿霉素、克唑替尼、戈舍瑞林、阿糖胞苷、普鲁卡因、苯佐卡因、氯普鲁卡因、二甲卡因、多巴胺、去甲肾上腺素、克仑特罗、苯乙双胍、达拉匹林、丙舒硫胺、对氨基水杨酸、磺胺嘧啶，及其衍生物；
优选地，所述D为阿霉素或其衍生物，其具有如下结构：
其中，W1选自：-H、-OH、-OCH3和-OCH2CH3；
W2选自：-H、-OH、-OCO(CH2)5COOH和-OCO(CH2)2NH2；
W3选自：-OH、-OCH3和
更优选地，所述D为阿霉素，其具有如下结构：
18.如权利要求16所述的结合物，其特征在于，所述X为单键、-CH2-、-CH2CO-或-NHCO-；和/或，所述的Y为-CO-；和/或，所述n为1。
19.如权利要求16所述的结合物，其特征在于，所述PEG为直链聚乙二醇残基，具有通式Ⅲ或Ⅳ所示的结构：
其中，p和q独立地选自1-960的整数，优选为1-480的整数；
或，
所述PEG为Y型聚乙二醇残基，具有通式Ⅴ或Ⅵ所示的结构：
其中，i和h独立地选自1-480的整数，优选为1-240的整数；
或，
所述PEG为多分支聚乙二醇残基，具有通式Ⅶ所示的结构：
其中，k是1-320的整数，优选为1-240的整数，
j是3-8的整数，
R是多分支聚乙二醇的核心分子，R选自：季戊四醇、寡聚季戊四醇、甲基葡萄糖苷、蔗糖、二甘醇、丙二醇、甘油和聚甘油的残基；优选地，R选自：季戊四醇、二聚季戊四醇和三聚季戊四醇。
20.如权利要求19所述的结合物，其特征在于，所述的PEG的分子量为1-100KDa，优选为10-50KDa。
21.如权利要求16-20任一项所述的结合物，其特征在于，所述衍生物具有如下结构：
22.一种包含权利要求16-21任一项所述的聚乙二醇-连接子-药物结合物或其药学上可接受的盐、异构体、前药或溶剂化物的药物组合物。
23.一种权利要求1-4任一项所述的连接子化合物、权利要求5-9任一项所述的聚乙二醇-连接子结合物、权利要求10-15任一项所述的聚乙二醇-连接子结合物衍生物、权利要求16-21任一项所述的聚乙二醇-连接子-药物结合物或权利要求22所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
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