CN103965458B

CN103965458B - 聚乙二醇‑氨基酸寡肽‑达沙替尼结合物及其药物组合物

Info

Publication number: CN103965458B
Application number: CN201310241907.2A
Authority: CN
Inventors: 汪进良; 赵宣; 王振国
Original assignee: Tianjin Jenkem Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Jenkem Technology Co Ltd
Priority date: 2013-01-28
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2033-06-18
Also published as: CN103965458A

Abstract

一种由通式I表示的聚乙二醇－氨基酸寡肽－达沙替尼结合物以及包含该结合物的药物组合物。在所述结合物中，PEG代表聚乙二醇类残基；A₁和A₂代表相同或不同的氨基酸残基；m是2‑12的整数；D是与A₂相连的达沙替尼残基。在所述结合物中，每一个聚乙二醇端基通过氨基酸寡肽可以与多个达沙替尼相连，大大提高药物的负载率，增加药物亲水性，改善药物吸收，延长作用时间，从而增加疗效或降低毒副作用。

Description

聚乙二醇-氨基酸寡肽-达沙替尼结合物及其药物组合物

技术领域

本发明涉及聚乙二醇结合物，尤其是聚乙二醇与氨基酸寡肽以及药物达沙替尼的结合物及其药物组合物。

背景技术

慢性粒细胞白血病（CML）是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，可发生于全部年龄，但大多数为中年或老年人群，且男性患者稍微多于女性。在西方人群中，CML患者占全部成人白血病的15%-20%。根据临床意义的性状和研究，慢性粒细胞白血病通常被分为三类。在没有介入因素的情况，通常起始于“慢性期”，之后经过数年后进入“加速期”，最终到“急变期”。急变期是慢性粒细胞性白血病的最终阶段，其病理状况近于急性白血病。如果药物治疗及早，其通常会停止这一累进过程。

在慢性粒细胞性白血病的慢性期阶段中，伊马替尼（Imatinib，商品名为“格列卫”，Gleevec、STI-571、CGP57148B）是首选的酪氨酸激酶抑制剂。此药于2001年经过美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。伊马替尼已经证明可以抑制大多数慢性粒细胞性白血病患者（65-75%）的体内骨质增生疾患（细胞遗传反应）。但由于许多肿瘤细胞BCR-ABL激酶区突变，导致很多患者对伊马替尼产生耐药性。为此，一些新型产品得到推广。其中一种名为达沙替尼（Dasatinib，商品名为“扑瑞赛”），其可以阻断多种致癌蛋白，并于2007年经过FDA的批准用于既往治疗失败或不耐受的CML的所有病期患者，同时还用于治疗对其他疗法耐药或不耐受的费城染色体阳性的ALL成人患者。

达沙替尼结构式如下：

临床试验表明，达沙替尼的疗效超过使用高剂量伊马替尼疗效，且未发现其耐药性，但在使用过程中，仍存在发热、胸膜积液、发热性中性粒细胞减少、胃肠道出血、肺炎、血小板减少、呼吸困难、贫血、腹泻和心脏衰竭等不良反应（FDA,Oncology Drug AdvisoryCommittee,Briefing Document,Dasatinib,NDA21-986.June02,2006），此外，FDA还于2011年10月公告了达沙替尼可能会增加肺动脉高压的风险，并决定将这一风险信息添加到扑瑞赛药品的说明书的警告与注意事项当中（FDA Drug Safety Communication:Sprycel(dasatinib)and risk of pulmonary arterial hypertension(2011-10-11).http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm275155.htm）。因此有必要对达沙替尼进行相应的修饰，以利于增加其疗效，降低可能的毒副作用。

专利WO2006037032公开了一种达沙替尼的酯类前药形式，专利CN101314600公开了一种氨基酸类似物与达沙替尼相连的结构，它们的药效比达沙替尼有所提升。专利WO2010120387则公开了一种聚乙二醇（PEG）通过寡肽与达沙替尼连接的结构，但在这种结构中，每一个聚乙二醇端基只能有一个或两个达沙替尼残基与之相连，药物的负载率受到限制。

聚乙二醇修饰技术是近年来迅速发展起来的一项新型技术，即将聚乙二醇活化后链接到药物分子或表面。聚乙二醇修饰后得到的聚乙二醇-药物衍生物在体内又会缓慢释放出药物小分子而产生疗效。药物小分子经过聚乙二醇修饰后，主要具有以下优点：1、增加药物的水溶性；2、降低毒性；3、延长药物循环半衰期，减少用药次数，提高病人依从性，提高生活质量，降低治疗费用；4、减少酶降解作用，提高生物利用度。与聚乙二醇链接后，药物的药代动力学发生了改变，进而改变药效学。特别是聚乙二醇能使血药浓度维持或接近目标浓度的时间延长，保持药物的药效得以充分地发挥。

聚乙二醇修饰技术已经广泛应用于蛋白质药物的修饰上。目前处于临床前研究的聚乙二醇修饰的蛋白药有几十种，处于临床试验的有超氧化物歧化酶（即将上市，Enzon公司）、白介素-2（II期，Chiron公司）等。随着大量聚乙二醇新型衍生物的不断研制成功，聚乙二醇修饰技术不仅可以用于蛋白质、多肽等大分子药物改良，也逐渐被人们用于小分子的增溶减毒以及提高疗效作用方面。目前，聚乙二醇修饰的小分子药物在国际市场还没有批准上市，但是几个产品已经进入二、三期临床，如Nektar公司的NKTR-102和NKTR-118。

达沙替尼虽然药效不错，但为提高相关疾病的治疗效果，减少毒副作用，仍需要进行相应的修饰。本发明主要是为提高达沙替尼的抗肿瘤效果，在过去工作的基础上，尤其是在专利ZL 2004 10048016.6和ZL 02 106691.4的基础上，提供一种新型的聚乙二醇-氨基酸寡肽-达沙替尼结合物。在这种结合物中，每一个聚乙二醇端基通过氨基酸寡肽可以与至少三个达沙替尼残基相连，药物的负载率大大提高，可以进一步提高达沙替尼抗肿瘤的临床效果。

发明内容

本发明的一个方面提供一种由通式I表示的聚乙二醇－氨基酸寡肽－达沙替尼结合物：

其中：

PEG代表聚乙二醇类残基；

A₁和A₂代表相同或不同的氨基酸残基；

m是2-12的整数；

D是与如式II所示的与A₂相连的达沙替尼残基。

在本发明的一些实施方案中，所述PEG为直链、Y型或多分支聚乙二醇类残基。其中，所述PEG为具有如下结构III的直链聚乙二醇类残基；

或者，所述PEG为具有如下结构IV的直链的甲氧基聚乙二醇类残基；

或者，所述PEG为具有如下结构V的Y型聚乙二醇类残基；

或者所述PEG为具有如下结构VI的多分支聚乙二醇类残基；

其中，R为季戊四醇，甲基葡萄糖苷，蔗糖，二甘醇，丙二醇，甘油或聚甘油等的羟基去除H的残基；

以上式III到VI中i都是10-1,500的整数。

在本发明的一些实施方案中，所述PEG的数均分子量为20,000-40,000道尔顿,特别地，在一些实施方案中，所述PEG的数均分子量为20,000道尔顿。

在本发明的一些实施方案中，所述氨基酸中，A₁为天冬氨酸或谷氨酸，A₂为甘氨酸，丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸等。

在本发明的一些实施方案中，所述的结合物中，m为整数2。

在本发明的另一些实施方案中，所述的结合物中，m为整数3。

在本发明的一些实施方案中，所述结合物中包括2个谷氨酸和3个缬氨酸。

在本发明的另一些实施方案中，所述结合物中包括3个谷氨酸和4个缬氨酸。

在本发明的一些实施方案中，所述结合物选自式VII到式IX所示结构组成的组：

以及

其中，式VII到式IX中的i是200-1,000的整数。

本发明的另一个方面提供包含上述结合物以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、栓剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、膏剂、贴剂、洗剂、滴剂、擦剂、喷雾剂等剂型。所述药物组合物可以应用于制备抗肿瘤药物。其中，所述抗肿瘤药物可以应用于以下病症：白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、慢性淋巴性白血病、急性淋巴性白血病、脊髓发育不良、多发性骨髓瘤、何杰金氏病或非何杰金氏病、小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌或结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌或胰腺癌。

本发明通过提供一种新型聚乙二醇－氨基酸寡肽－达沙替尼结合物，使每一个聚乙二醇端基通过氨基酸寡肽可以与至少三个达沙替尼残基相连，药物的负载率大大提高，从而进一步提高达沙替尼抗肿瘤的临床效果。

具体实施方式

达沙替尼结构中包含有羟基，可以通过酯基、碳酸酯基、酰胺酯基等方式与已经过端基改性的聚乙二醇结合，以达到对达沙替尼分子的有效保护和合理利用。特别地，酯基在生物体中可以通过生物降解的方式释放出药物活性成分。通过本方法改进后的药物水溶性良好，起效快，持续时间长，能够有效的起到治疗的作用。

本发明的结合物按如下方法制备：对亲水性聚合物聚乙二醇进行改性，引入活性官能团羧基，与氨基酸寡肽键合，同时达沙替尼上的羟基与氨基酸上的羧基反应成酯，然后氨基酸寡肽上的羧基再与达沙替尼氨基酸上的氨基结合。这种反应方式既保证了达沙替尼在体内的活性，又可使反应物产率和纯度最大化。

本发明的寡肽不是直链结构的，寡肽中的一些酰胺键是在某些氨基酸的侧链上形成的。组成寡肽的氨基酸为天然氨基酸和合成氨基酸，优选为谷氨酸、甘氨酸。

本发明的结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物形式进行给药，可采用任何可接受的给药方式或用于类似的用途的试剂进行。因此，采用的给药方式可选择通过口、鼻内、非肠道、局部、透皮或直肠方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，例如，片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、栓剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、膏剂、贴剂、洗剂、滴剂、擦剂、喷雾剂等。优选采用适用于精确剂量的简单给药的单元剂量形式。组合物可包含常规药用载体或赋形剂和作为活性成分（一种或多种）的本发明的结合物，此外，还可包含其它药剂、载体、辅剂等。

通常，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1至约99重量％的本发明结合物、以及99至1重量％的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5至75重量％的本发明结合物，其余为适宜的药用赋形剂。

可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物（约0.5至约20％）和选择性存在的药用辅剂溶解、分散于载体中，载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。

如果需要的话，本发明的药物组合物还可包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、抗氧化剂等，例如：柠檬酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。

以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明。

实施例

实施例中所用的达沙替尼从南京安格医药化工有限公司购得，L-(+)-谷氨酸从北京化学试剂公司购得，对甲苯磺酸、苯甲醇及二环己基碳二亚胺(DCC)从国药集团化学试剂有限公司购得，4-二甲基氨基吡啶（DMAP）及1-羟基苯并三氮唑（HOBt）从上海共价化学科技有限公司购得，N-叔丁氧羰基缬氨酸及N-叔丁氧羰基-L-谷氨酸-5-苄酯从四川同晟氨基酸有限公司购得，其余为市售试剂。

实施例1

单甲氧基聚乙二醇（数均分子量20000）－氨基酸五肽－达沙替尼结合物（DSR-1）的制备

L-(+)-谷氨酸29.4g（0.2mol）、对甲苯磺酸40g（0.23mol）、苯甲醇80mL溶于甲苯500mL中，氮气保护下回流分出11mL水，继续回流3h，蒸除150mL。冷却到50℃，将反应液倒入盛有600mL石油醚的烧杯中，搅拌1h，过滤收集沉淀。滤饼用95%乙醇280mL加热溶解后，停止加热，冷却过夜。过滤收集沉淀真空干燥，制得L-(+)-谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸盐61g。

谷氨酸二苄酯对甲苯磺酸盐30g（0.06mol）溶于500mL二氯甲烷中，加入叔丁氧羰基-L-谷氨酸-5-苄酯20.86g（0.062mol），DMAP7.55g（0.062mol）、HOBt8.35g（0.07mol），氮气保护下加入DCC14.3g的二氯甲烷溶液。滴毕，密闭体系反应过夜。TLC监测反应完毕。过滤除去溶剂后，浓缩液中加入20mL乙酸乙酯，滤除固体，母液加入石油醚400mL沉淀，过滤得产品N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽15.8g。

N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽（Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl）0.78g溶解在7mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸3mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5%碳酸氢钠溶液调节pH=7-8。萃取分液，有机相用5%碳酸氢钠溶液洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加到反应瓶中，氮气保护下，加入单甲氧基聚乙二醇乙酸(20K)20.0g(1mmol)、DMAP245mg(2mmol)、HOBt135mg(1mmol)。全部溶解后，加入DCC412mg(2mmol)。室温搅拌反应过夜。过滤，旋转蒸发除去溶剂，残余物中添加异丙醇500mL，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于200mL无水甲醇中，加入钯炭1.0g，通入氢气室温反应过夜。过滤除去钯炭，旋转蒸发除去溶剂，残余物中添加异丙醇500mL，过滤，产物真空干燥。得到单甲氧基聚乙二醇－谷氨酸二肽(20K)13.4g。

将达沙替尼1.95g(4mmol),N-叔丁氧羰基缬氨酸1.11g(4.8mmol)和DMAP714mg（4.8mmol）加到反应瓶中，用40mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，氮气保护下冰浴冷却，再滴入DCC1.03g(5mmol)溶于20mL二氯甲烷的溶液，滴完后自然升温反应过夜。TLC监测反应完全后减压蒸去溶剂，残分用柱层析分离，得N-叔丁氧羰基缬氨酸达沙替尼酯1.7g,收率62%。¹H-NMR(DMSO-d₆)：1.02(d,6H),1.21(s,9H),2.23(s,3H),2.49(s,3H),2.51(m,4H),2.78(m,6H),3.53(m,8H),6.04(s,1H),7.27(m,2H),7.40(m,1H),8.22(s,1H),9.88(s,1H),11.48(s,1H)。

将N-叔丁氧羰基缬氨酸达沙替尼酯1g(1.5mmol)，二氯甲烷50mL，三氟乙酸25mL加到反应瓶中，搅拌下反应3h后减压蒸去溶剂，残分中加入二氯甲烷，减压蒸干，如此重复三次，得缬氨酸达沙替尼酯三氟乙酸盐1.35g，直接往下反应。

将单甲氧基聚乙二醇－谷氨酸二肽（20K,0.5g，0.025mmol），缬氨酸达沙替尼酯三氟乙酸盐140mg(0.15mmol)，HOBt(3.4mg,0.025mmo)和DMAP24.4mg(0.2mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂溶解,氮气保护下冰浴冷却，再滴入DCC36.1mg(0.175mmol)溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升温反应过夜。次日将反应液浓缩，残分用异丙醇重结晶，得直链聚乙二醇（20K）－氨基酸五肽－达沙替尼结合物(DSR-1)0.32g。¹³C-NMR(DMSO-d₆)：16.6,18.8,25.7,27.0,33.7,41.2,51.2,55.2,58.1,66-73,84.0,126.5,127.1,128.8,129.6,133.0,133.8,139.4,141.2,157.5,160.4,162.1,162.8,165.7。

实施例2

Y型聚乙二醇（数均分子量30000）－氨基酸五肽－达沙替尼结合物(DSR-2)的制备

N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽（Boc-Glu(obzl)-Glu(obzl)-obzl）0.78g(实施例1)溶解在7mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸3mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5%碳酸氢钠溶液调节pH=7-8。萃取分液，有机相用5%碳酸氢钠溶液洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加到反应瓶中，氮气保护下，加入Y型聚乙二醇乙酸(30K)40.0g、DMAP245mg(2mmol)、HOBt135mg(1mmol)，全部溶解后，加入DCC412mg(2mmol)。室温搅拌反应过夜。过滤，旋转蒸发除去溶剂，残余物中添加500mL异丙醇，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于200mL无水甲醇中，加入钯炭1.0g，通入氢气室温反应过夜。过滤除去钯炭，旋转蒸发除去溶剂，残余物中添加500mL异丙醇，过滤，产物真空干燥。得到Y型聚乙二醇－谷氨酸二肽(30K)33.4g。

将Y型聚乙二醇－谷氨酸二肽（30K,0.6g，0.02mmol），缬氨酸达沙替尼酯三氟乙酸盐112mg(0.12mmol)，HOBt(2.7mg,0.02mmo)和DMAP24.4mg(0.2mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂溶解,氮气保护下冰浴冷却，再滴入DCC36.1mg(0.175mmol)溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升温反应过夜。次日将反应液浓缩，残分用异丙醇重结晶，得Y型聚乙二醇（30K）－氨基酸五肽－达沙替尼结合物(DSR-2)0.39g。¹³C-NMR(DMSO-d₆)：16.5,18.8,25.7,27.1,33.7,41.2,51.2,55.2,58.1,66-73,84.0,126.5,127.1,128.8,129.6,133.0,133.8,139.4,141.2,157.5,160.4,162.1,162.8,165.7,169.4。实施例3

单甲氧基聚乙二醇（数均分子量40000）－氨基酸七肽－达沙替尼结合物（DSR-3）的制备

N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯二肽(实施例1)6.47g（0.01mol）溶解在15mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸6mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5%碳酸氢钠溶液调节pH=7-8。萃取分液，有机相用5%碳酸氢钠溶液洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加到反应瓶中，氮气保护下，加入叔丁氧羰基-L-谷氨酸-5-苄酯3.37g（0.01mol），DMAP1.22g（0.01mol）、HOBt1.35g（0.01mol），完全溶解后滴加DCC2.39g（0.011mol）的二氯甲烷溶液。滴毕，密闭体系反应过夜。TLC监测反应完毕。过滤，依次用10%柠檬酸(30mL*3)、5%碳酸氢钠(30mL*3)、5%饱和氯化钠水溶液(30mL*3)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，除去溶剂后，浓缩液中加入25mL乙酸乙酯，滤除固体，母液加入石油醚400mL沉淀，过滤得产品N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯三肽6.8g。

N-叔丁氧羰基谷氨酸苄酯三肽0.52g(0.5mmol)溶解在8mL二氯甲烷中，加入三氟乙酸4mL，室温反应2h。除去溶剂，加入100mL二氯甲烷，用5%碳酸氢钠溶液调节pH=7-8。萃取分液，有机相用5%碳酸氢钠溶液洗两次，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液直接加入到反应瓶中，氮气保护下，加入单甲氧基聚乙二醇乙酸(40K)20.0g(0.5mmol)、DMAP 122mg(1mmol)、HOBt68mg(0.5mmol)。全部溶解后，加入DCC206mg(1mmol)。室温搅拌反应过夜。过滤，旋转蒸发除去多余溶剂，残余物中添加250mL异丙醇，过滤，产物真空干燥。将该产物溶于100mL无水甲醇中，加入钯炭0.5g，通入氢气室温反应过夜。过滤除去钯炭，旋转蒸发除去多余溶剂，残余物中添加250mL异丙醇，过滤，产物真空干燥。得到单甲氧基聚乙二醇－谷氨酸三肽(40K)15.4g。

单甲氧基聚乙二醇－谷氨酸三肽(40K,1.2g,0.03mmol）、缬氨酸达沙替尼酯三氟乙酸盐224mg(0.24mmol)、HOBt(4mg,0.03mmol)和DMAP 29.3mg(0.24mmol)加到反应瓶中，用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂溶解,氮气保护下冰浴冷却，再滴入DCC43.3mg(0.21mmol)溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升温反应过夜。次日将反应液浓缩，残分用异丙醇重结晶，得到单甲氧基聚乙二醇(40K)－氨基酸七肽－达沙替尼结合物(DSR-3)0.45g。¹³C-NMR(DMSO-d₆)：16.6,18.8,25.7,27.2,33.7,41.2,51.2,55.2,58.1,66-73,84.0,126.5,127.1,128.8,129.6,133.0,133.8,139.4,141.2,157.5,160.4,162.1,162.8,165.7。

实施例4

不同达沙替尼聚乙二醇结合物在K562人慢性髓系白血病皮下瘤模型中的抗肿瘤作用

实验方法：

于NOD/SCID小鼠右侧背部皮下接种K562细胞，建立人慢性髓系白血病异种移植动物皮下模型。当平均肿瘤体积达到130mm³时，将实验小鼠分组，每组8只，静脉注射给药，一周两次。根据相对肿瘤增殖率（T/C%）进行疗效评价。

实验步骤：

（1）细胞培养

K562细胞系在补充了10%胎牛血清，L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI-1640培养基中，在37°C，空气中含5%CO₂的条件下体外培养。肿瘤细胞每周常规传代2次。收集处于指数生长期的肿瘤细胞，悬于等体积的PBS：基质胶混合物中，置于冰上，用于肿瘤接种。

（2）动物分组

实验小鼠于右侧背部皮下接种5×10⁶K562细胞，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均130mm³时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组并开始给药治疗。

（3）实验观察

本研究中根据Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care(AAALAC)批准的指南进行与操作、护理、治疗相关的所有操作。在接种后，每天观察动物的发病与死亡。在日常观察时，注意肿瘤生长对动物正常行为（如运动、进食、饮水、体重增减、眼睛、被毛）的影响以及其他任何异常。记录每组内动物的死亡和临床症状。（4）结果判断

在整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm³)=0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)。根据实验组和对照组肿瘤体积大小，计算RTV和T/C比值。RTV是指相对肿瘤体积。T/C比值是指在结束治疗后某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值，反映不同治疗组的抗瘤药效作用。

（5）统计分析

所有实验结果以平均瘤体积±SE（标准误差）表示，统计分析时，相对肿瘤体积数据在统计时方差不齐，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett T3多重比较方法对各组间进行相对肿瘤体积显著性差异的比较，p<0.05为差异显著。

实验结果：

各治疗组和溶剂对照组肿瘤生长情况见表1和表2。

表1.各治疗组（5mg/kg）肿瘤体积T/C%值（与溶剂对照组比较）

表2.各治疗组（5mg/kg）肿瘤体积T/C%值（与达沙替尼组比较）

K562人慢性髓系白血病皮下瘤模型由于肿瘤生长迅速，溶剂对照组在分组治疗后第14天因平均肿瘤体积（2447mm³）超过2000mm³而结束。在分组治疗后第14天，阳性药达沙替尼（5mg/kg）药效与溶剂对照组在统计学上有显著性差异（p<0.001），平均肿瘤体积为311mm³，相对肿瘤增殖率（T/C%）为12.4%；受试药物DSR-1,DSR-2和DSR-3（5mg/kg）药效与溶剂对照组在统计学上均有显著性差异（p<0.001），平均肿瘤体积分别为39.2mm³，178.6mm³，和137mm³，相对肿瘤增殖率（T/C%）分别为1.6%,7.3%,和5.8%。

在分组治疗后第21天，达沙替尼（5mg/kg）组的平均肿瘤体积为391mm³，受试药物DSR-1,DSR-2和DSR-3（5mg/kg）药效与之相比在统计学上均有显著性差异（p<0.001），平均肿瘤体积分别为176mm³，203mm³和258mm³，相对肿瘤增殖率（T/C%）分别为45%，52%和66%

与溶剂对照组相比，阳性药物达沙替尼（5mg/kg）、受试药物DSR-1,DSR-2和DSR-3（5mg/kg）的相对肿瘤增殖率（T/C%）分别为12.4%，1.6%,7.3%,和5.8%，提示所有化合物均有显著的抗K562肿瘤生长作用（p均<0.001）,与达沙替尼（5mg/kg）相比，相同剂量的DSR-1,DSR-2和DSR-3（5mg/kg）的抗肿瘤作用更加显著（p均<0.001）。

实施例5

不同达沙替尼聚乙二醇结合物对PC-3人前列腺癌皮下瘤模型的药效学研究

实验方法：

于Balb/c nude小鼠右侧背部皮下接种PC-3细胞，建立人前列腺癌异种移植动物皮下模型。当平均肿瘤体积达到160mm³时，将实验小鼠分组，每组8只，静脉注射给药，一周两次。根据相对肿瘤增殖率（T/C%）进行疗效评价。

实验步骤：

（1）细胞培养

PC-3细胞系在补充了10%胎牛血清，L-谷氨酰胺(2mM)的Ham's F12K培养基中，在37°C，空气中含5%CO₂的条件下体外培养肿瘤细胞每周常规传代2次。收集处于指数生长期的肿瘤细胞，悬于等体积的PBS：基质胶混合物中，置于冰上，用于肿瘤接种。

（2）动物分组

实验小鼠于右侧背部皮下接种5×10⁶PC-3细胞，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均160mm³时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组并开始给药治疗。

（3）实验观察

在整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm³)=0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)。根据实验组和对照组肿瘤体积大小，计算RTV和T/C比值。RTV是指相对肿瘤体积。T/C比值是指在结束治疗后某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值，反映不同治疗组的抗瘤药效作用。实验结束时，按以下两种方式对肿瘤进行照片记录：1.每组动物经CO₂安乐死后，荷瘤一面朝上，按组别分别拍照记录；2.肿瘤取下后，先称量肿瘤重量，计算T/C（治疗组和对照组肿瘤重量的百分比值），然后各组肿瘤按顺序同时摆放并拍照记录。

（5）统计分析

所有实验结果以平均瘤体积±SE（标准误差）表示，统计分析时，相对肿瘤体积数据使用单因素方差分析（one-way ANOVA）及LSD多重比较方法对各组间进行相对肿瘤体积显著性差异的比较，p<0.05为差异显著。

实验结果：

各治疗组和溶剂对照组肿瘤生长情况见表3和表4。

表3.各治疗组（10mg/kg）肿瘤体积T/C%值（与溶剂对照组比较）

表4.各治疗组（10mg/kg）肿瘤体积T/C%值（与达沙替尼组比较）

PC-3人前列腺癌皮下瘤模型肿瘤生长迅速并且导致小鼠体重随肿瘤负荷增加而降低，溶剂对照组在分组治疗后第22天因平均肿瘤体积（2462mm³）超过2000mm³而结束。在分组治疗后第22天，阳性药达沙替尼（10mg/kg）药效与溶剂对照组在统计学上有显著性差异（p<0.01），平均肿瘤体积为1752mm³，相对肿瘤增殖率（T/C%）为73%；受试药物DSR-1,DSR-2和DSR-3（10mg/kg）药效与溶剂对照组在统计学上均有显著性差异（p<0.001），平均肿瘤体积分别为1187mm³，1380mm³和1439mm³，相对肿瘤增殖率（T/C%）分别为47%，57%和56%。

在分组治疗后第25天，达沙替尼（10mg/kg）组的平均肿瘤体积为1868mm³，受试药物DSR-1,DSR-2和DSR-3（10mg/kg）药效与之相比在统计学上均有显著性差异（p<0.05,p<0.05和p<0.01），平均肿瘤体积分别为1200mm³,1406mm³和1449mm³，相对肿瘤增殖率（T/C%）分别为61%,75%和72%。

与溶剂对照相比，阳性药物达沙替尼（10mg/kg）、受试药物DSR-1,DSR-2和DSR-3（10mg/kg）的相对肿瘤增殖率（T/C%）分别为73%，47%,57%和56%，提示所有化合物均有统计学显著的抗PC-3肿瘤生长作用（p均<0.01）。与达沙替尼（10mg/kg）相比，相同剂量的DSR-1,DSR-2和DSR-3（10mg/kg）的抗肿瘤作用更加显著（p<0.05）。

Claims

1.一种由通式Ⅰ表示的聚乙二醇－氨基酸寡肽－达沙替尼结合物：

其中：

PEG代表聚乙二醇类残基；所述PEG的数均分子量为20,000-40,000道尔顿；A₁和A₂代表相同或不同的氨基酸残基；

所述氨基酸中，A₁为天冬氨酸或谷氨酸，A₂为丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸或蛋氨酸；

m是2-12的整数；

D为具有如下结构Ⅱ的与A₂相连的达沙替尼残基：

2.如权利要求1所述的结合物，其中，所述PEG为直链、Y型或多分支聚乙二醇类残基。

3.如权利要求2所述的结合物，其中，所述PEG为具有如下结构Ⅲ的直链聚乙二醇类残基：

其中，i是10-1,500的整数。

4.如权利要求2所述的结合物，其中，所述PEG为具有如下结构Ⅳ的直链的甲氧基聚乙二醇类残基：

其中，i是10-1,500的整数。

5.如权利要求2所述的结合物，其中所述PEG为具有如下结构Ⅴ的Y型聚乙二醇类残基：

其中，i是10-1,500的整数。

6.如权利要求2所述的结合物，其中所述PEG为具有如下结构Ⅵ的多分支聚乙二醇类残基：

其中，R为季戊四醇，甲基葡萄糖苷，蔗糖，二甘醇，丙二醇，甘油或聚甘油的羟基去除H的残基；

i是10-1,500的整数。

7.如权利要求2所述的结合物，其中，所述PEG的数均分子量为20,000道尔顿。

8.如权利要求1所述的结合物，其中，m为整数2。

9.如权利要求1所述的结合物，其中，m为整数3。

10.如权利要求8所述的结合物，其中，所述结合物中包括2个谷氨酸和3个缬氨酸。

11.如权利要求9所述的结合物，其中，所述结合物中包括3个谷氨酸和4个缬氨酸。

12.如权利要求8到11中任一项所述的结合物，其中，所述结合物选自式Ⅶ到式Ⅸ所示结构组成的组：

以及

其中，式Ⅶ到式Ⅸ中的i是200-1,000的整数。

13.包含如权利要求1-12之任一项所述的结合物以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、栓剂、注射剂、溶液剂、混悬剂、膏剂、贴剂、洗剂、滴剂、擦剂、喷雾剂剂型。

15.如权利要求14所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。